Upload
others
View
14
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
pH-ul optim
https://biochemianzunited.wordpress.com/
https://www2.estrellamountain.edu/faculty/
farabee/biobk/BioBookEnzym.html
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2.5.1. Factori care guvernează
activitatea catalitică
pH-ul optim
http://cbc.chem.arizona.edu/classes/bioc462/462
a/NOTES/ENZYMES/enzyme_kinetics3.html
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
pH-ul optim vs stabilitate
Prazeres, J. N.dos, Cruz, J. A. B., & Pastore, G. M. (2006).
Characterization of alkaline lipase from Fusarium oxysporum
and the effect of different surfactants and detergents on the enzyme
activity. Brazilian Journal of Microbiology, 37(4), 505-509
pH optim – albastru
Interval pH stabilitate – roșu
Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology
Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
pH-ul optim vs stabilitate
Activitatea enzimatică a pepsinei vs
stabilitatea pepsinei
D W Piper and B H Fenton,
Gut, 6, 506-508, 1956
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate
Influența solventului
Ibrahim, A.S.S. et al., Enhancement of Alkaline Protease Activity and
Stability via Covalent Immobilization onto Hollow Core-Mesoporous
Shell Silica Nanospheres, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(2), 184
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate
Influența tăriei ionice
Influența tăriei ionice asupra activității tioesterazei
Wei, J. , Kang, H. W., Cohen, D.E.
Biochemical Journal, Jul 15, 2009,
421 (2) 311-322;
Influența tăriei ionice asupra activității
ribonucleazei (wt, K41R si K7A/R10A/ K66A)
Park, C. și Raines. R.T.,
J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11472-11479
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate
Influența soluției tampon
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate
Influența soluției tampon
Anionul fosfatul inhibă
Carboxipeptidazele
Fumarazele
Carboxilaze
Fosfoglucomutaza
Tris (Tris(hidroxi-metil)aminometan), ACES, BES, TES
Leagă ionii de Cu
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate
Influența soluției tampon
Mohan, C., A guide for the preparation and use of buffers in biological
systems, EMD, San Diego, California
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Influența temperaturii
slideplayer.com/slide/8444574/ Fox, P. F. et al., Heat-Induced Changes in Milk,
Dairy Chemistry and Biochemistry, pp 345-375
Lipaza, fosfataza alcalină termolabile
Fosfatza acidă - relativ stabilă
Lapte praspăt ↔ Lapte pasteurizat
https://drjockers.com/
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici anorganici
www.sharinginhealth.ca
personalpages.manchester.ac.uk
Situs activ al TBP aldolazei
Gavin J. Williams et al.
PNAS 2003;100:6:3143-3148
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici anorganici
Legarea Mg2+ se face la substrat
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici anorganici
Situs activ al endonucleazei
FEMS Microbiology Review
2001; 25:5, 583-613
Funcții
endonucleaze
replicare
recombinare
reparare ADN
Benedik, M.and Strych, U. (1998),
Serratia marcescens and its extracellular nuclease
FEMS microbiology letters, 165, 1-13
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici anorganici
Carter, E. L. et al. (2009),
Interplay of metal ions and urease
Metallomics, 1, 207-221
Hille, R. (2002),
Molybdenum and tungsten in biology
TiBS, 27(7), 360-367
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici
FAD DAAO Lipoamid
dehidrogenaza
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici
Din punct de vedere structural coenzimele - 4 clase:
• coenzime de natură alifatică;
• coenzime de natură aromatică;
• coenzime cu structura nucleozidică;
• coenzime cu structura nucleotidică.
Coenzime de natură alifatică: GSH, acidul lipoic, acidul ascorbic
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici
Coenzime de natură alifatică: GSH
glutation-homocistin-transdehidrogenaza
Acidul lipoic - reacții transacilare
amit1b.wordpress.com
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici
Coenzime de natură alifatică: acidul ascorbic
Biosinteze dependente de vitamina C
Sinteza carnitinei
Hidroxilarea prolinei (colagen)
http://www.chemistryviews.org/details/ezine
Sinteza Tyr din Phe
Sinteza noradrenalinei din dopamina
Sinteza serotoninei din triptofan
Amidarea peptidelor
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici
http://chem.libretexts.org
/
Substratul Produsul Enzima
Acetil-CoA Malonil-CoA Acetil-CoA carboxilaza
Piruvat Oxaloacetat Piruvat carboxilaza
Propionil-CoA Metilmalonil-CoA Propionil-CoA carboxilaza
Malonil-CoA Propil-CoA Malonil-CoA-carboxitransferaza
Izovaleril-CoA β-metil-crotonil-CoA β-metil-crotonil-CoA carboxilaza
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici
Piridoxal-fosfatul şi piridoxamino-fosfatul - cofactori ai enzimelor ce
catalizează transferul grupărilor aminice:
2. Transaminazele
Reactia glutamatului cu piruvatul - formarea alaninei
Reactia glutamatului cu oxaloacetatul - formarea aspartatului.
1. Decarboxilazele aminoacizilor
3. Racemazele - catalizează formarea DL-alaninei din D-sau L-alanină.
4. Dezaminazele (pentru serină şi treonină).
Piridoxal-fosfatul este transportat cu ajutorul albuminei serice
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici – piridoxal fosfatul
TGO: forma citozolica forma mitocondriala
Aspartat-aminotransferaza (TGO)
Legarea PLP la situsul activ al transaminazelor
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici – piridoxal fosfatul
https://fet-ev.eu/mediatoren-histamin/
https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001559
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care
guvernează activitatea
catalitică
Cofactorii enzimatici
organici – THF
Metilarea uracilului
http://watcut.uwaterloo.ca/
5-fluoro-uracilul
inhibă activitatea
tiamidilat sintetazei
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici – nucleozid-fosfații
Kinaze – reacții de transfosforilare
http://www.wikiwand.com/en/Nucleoside-diphosphate_kinase
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici – NAD+ și NADP+
Rol metabolic coenzime
NAD+
NADP+
NAD+ Reactii de scindare
NADP+ Reactii de biosinteza
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică
Cofactorii enzimatici organici – NAD+ și NADP+
Localizare
NAD+ - intramitocondrial
NADP+ - citozol
http://www.maac10.com/science/Michan, S. and Sinclair, D.
Biochem. J. 2007;404:1-13
https://bitesizebio.com/6478/
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
1U - cantitatea de enzimă care transformă 1 mol de substrat / minut
1Kat - cantitatea de enzimă care transformă 1 mol de substrat / secundă
c =A
l ·
legea Lambert-Beer
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Activitatea enzimatica =modificari
timp=
c
min=
A
min · l ·
Activitatea pe litru serVolumul total din cuva
Volumul de enzima=
A
min · l · ·
Act. enzimatica din ser - U/L
Act. enzimatica - µmol min-1 L-1
X 1000
2.5. Monitorizarea activității enzimatice
2. Purificarea enzimei
2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice
Fluorimetric
Colorimetric