20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.. software Muestreador automático Cromatograma 20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez

CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTORDE ESPECTROMETRÍA DE MASAS:

GC-MS

20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

software

Muestreador automático

Cromatograma


Funcionamiento del GC: la columna cromatográfica

5% diphenyl dimethylpolysiloxane

La elevada resolución en GC capilar, evita el tener que usar muchas columnas de diferentes selectividades.


Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Impacto Electrónico (EI)

Ionización “dura”, produce gran fragmentación


Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Impacto Electrónico (EI)

• La EI es muy reproducible, incluso entre equipos de distintos fabricantes

• Posibilidad de LIBRERÍA DE ESPECTROS DE MASAS . “HUELLAS DACTILARES DE LAS MOLECULAS”

• El software de los equipos GCMS permite comparar los espectros de masas con los que proporciona la librería suministrada para identificar compuestos desconocidos

(en el SIC la librería es la NIST-08)


Funcionamiento del MS: la fuente de ionización por Ionización Química Positiva (CI)

Ionización blanda, proporciona información del PESO MOLECULAR DEL COMPUESTO

MeOH


Funcionamiento del MS: el analizador de masas (Trampa de Iones)

Full Scan, SIM o Ms/Ms

Separa los iones por sus masas y después los cuenta



De espectro de masas a cromatograma



• Análisis TIC Full Scan: el cromatograma (señal vs tiempo) es de todos los iones.

• Análisis SIM: el cromatograma (señal vs tiempo) es de uno o unos pocos iones.

• Análisis Ms/Ms: el cromatograma (señal vs tiempo) es de los iones “hijo” procedentes de la fragmentación de un ion “padre” previamente seleccionado.20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

Funcionamiento del MS: El Software. La librería NIST 08

-15-14

NIST 08: 220.460 espectros

NIST 14: 276.248 espectros


CUANDO USAR GC-MS

Según las características de la investigación

• Compuestos desconocidos (identificación o información estructural)• Compuestos conocidos (screening o cuantitativo)


1. Compuestos desconocidos: metabolitos de pesticidas.

OxyfluorfenTebuconazol Muestra inicial

Muestra a los 30 díasDisminución clara de Oxyfluorfenpero no de Tebuconazol

Oxifluorfen Inicial

A los 30 días


OxyfluorfenTebuconazol Muestra inicial

Muestra a los 30 díasDisminución clara de Oxyfluorfenpero no de Tebuconazol

RH-35451

RH-120162

RH-35450

Metabolitos de Oxifluorfen tras estudiar los espectros de fragmentación. No se tienenlos patrones puros ni aparecen en la librería.

1. Compuestos desconocidos: metabolitos de pesticidas.


2. Compuestos desconocidos:Presencia de Salicilato de Hexilo en plantas de olivo infectadas con E. Olivina

Planta no infectada

Planta infectada

Salicilato de metilo

Salicilato de hexilo

Planta no infectada

Planta infectada


3. Compuestos conocidos: análisis de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PHAs) por SIM

naftaleno

C1-naftalenos

C2- naftalenos

C3- naftalenos

fenantreno

BTEX


Patrón con 90 pesticidas (método desarrollado para 130)

4. Compuestos conocidos:Análisis de pesticidas por Ms/Ms

El MS separa lo que no separa el GC: máximo poder de confirmación.


Muestra con 90 pesticidas (método desarrollado para 130)

4. Compuestos conocidos:Análisis de pesticidas por Ms/Ms. Cuantitativo con patrón interno (P.I.)

Clorpirifosr2 0,997719RSD 7,179%

Etofenproxr2 0,997033RSD 7,751%

Tetraconazolr2 0,998165RSD 9,252%

Entre 10 y 100 ppb (ng/ml)20-02-2015 Dr. Rafael Núñez Gómez.

CUANDO USAR GC-MS

Según las características de

la matriz

• Gases permanentes (nuevo equipo microGC)• Compuestos volátiles (HS, SPME, nuevo ITEX-2)• Soluciones acuosas (SPME con o sin derivatización)• Soluciones orgánicas (inyección líquida)• Otras matrices requieren de extracción previa


• Compuestos desconocidos (identificación o información estructural)• Compuestos conocidos (screening o cuantitativo)


Nuevo equipamiento: análisis de gases permanentes mediante MicroGC


Nuevo equipamiento: análisis de gases permanentes mediante MicroGC


Análisis de compuestos volátiles: el automuestreador con Head Space

20-02-2015Dr. Rafael Núñez Gómez.

• Extracción-Cocentración-Análisis, todo automatizado y en línea con el GC

• Muy sensible (ppt)• Análisis de volátiles• Análisis de sólidos (Head Space)• Análisis de soluciones acuosas (Head

Space o Inmersión)

Análisis de compuestos volátiles: el automuestreador con SPME

20-02-2015Dr. Rafael Núñez Gómez.

Análisis de volátiles en Plantas con SPME.


Análisis de volátiles en Plantas con SPME.


Ejemplo de análisis de volátiles en Plantas.Identificación de volátiles en plantas de tomate

Muestra problema Posible compuesto CAS number Formula

Inyecc. Planta L8 (1) 1-28-

2013 3-04-47

Tiempo Retencion

Indice de Retencion

Indice de Retencion

Teorico (NIST)

13,278 936,3 alfa pinene 7785-70-8 C10H16 948

15,212 969,1 1,3,5-Cycloheptatriene, 3,7,7-trimethyl 3479-89-8 C10H14 1010

16,197 986,3 beta pinene 127-91-3 C10H16 943

16,694 995,0 2-Carene 554-61-0 C10H16 948

17,014 1000,7 γ-Terpinene 99-85-4 C10H16 998

17,582 1010,9 α-Terpinen 99-86-5 C10H16 998

18,298 1023,8 limonene 138-86-3 C10H16 1018

19,202 1040,4 1,3,6-Octatriene, 3,7-dimethyl-, (Z,E) 13877-91-3 C10H16 976

21,106 1076,3 α-Terpinolen 586-62-9 C10H16 1052

32,859 1326,8 sesquiterpeno 1 C15H24

33,097 1332,4 δ-Elemene 20307-84-0 C15H24 1377

35,4 1388,2 β-Elemene 515-13-9 C15H24 1398

36,76 1422,2 β-Caryophyllene 87-44-5 C15H24 1494

37,03 1429,0 γ-Elemene 339154-91-5 C15H24 1465


38,194 1458,9 α-Caryophyllene 6753-98-6 C15H24 1579

39,22 1485,8 Germacrene D 23986-74-5 C15H24 1515


43,23 1595,8 Caryophyllene oxide 1139-30-6 C15H24O 1507


Nuevo equipamiento: el Automuestreador con ITEX-2


Análisis de soluciones acuosas con SPME:Degradación de dicloroanilina por hongos.

Inmersión

Directa para poco

volátiles

Espacio en

Cabeza para

volátiles

DOS OPCIONES DE MUESTREO

SOLUCIÓN ACUOSA


Análisis de soluciones orgánicas: inyección de líquidos.

Se inyecta 1-2µl normalmente


Patrón Fame MixSupelco 47885-U.

Ionización EI.

Patrón Fame MixSupelco 47885-U.

Ionización CI.

Ácido C18:0 como ester metílicoMW=158

No hay fragmentación, solo ión molecular M+1 =

m/z 159

Fragmentos típicos de los ácidos grasos (fames).El ión molecular m/z 158 apenas se observa

?

Análisis de soluciones orgánicas: ácidos grasos con EI y CI.Derivatizados como ésteres metílicos (fames)


Análisis de soluciones orgánicas: aminoácidos en extracto de aceite de oliva (derivatizados como TBDMS).

Ala Gl

y

Val

Leu

i-Leu

Pro

Met Ser

Thre

Phe

Asp. Acid

Cys

Glu. Acid

Arg

Lys HisTyr

Tryptophan

P.I.

Patrón de 500pmoles/µl (derivatizados TBDMS)

Muestra real


Análisis de azúcares en tomate Cherry (derivados TMSO).

Glucosa 1

Glucosa 2 + Galactosa 2

Fructosa 1Fructosa 2

SacarosaAprox. 8ppm

Inositol

Análisis de azúcares (derivados TMSO) en 67mg de Tomate Cherry


Otras matrices requieren de extracción previa:

SecadoLiofilizadoHomogeneizadoExtracción por Líquido/Líquido, Ultrasonidos, Soxhlet, Columnas SPE, etc.ConcentraciónAclarado Adición de Patrón InternoDerivatización…

Lo debe realizar el usuario con nuestra

supervisión


CUANDO USAR GC-MS


la molécula

• Peso molecular <500 u.m.a.• Polaridad baja o media (derivatización)• Fácilmente volatilizable (<300°C)• No ionizada• Siempre fragmenta

Ácidos grasos Aminoácidos Monosacáridos y disacáridos Alcanos PHAs Aldehidos, cetonas y alcoholes simples Volátiles en plantas Pesticidas y metabolitos Ácidos fenólicos Gases permanentes


• Compuestos desconocidos (exclusivamente por GCMS)• Compuestos conocidos (screening o cuantitativo)


la matriz

• Gases permanentes (nuevo equipo microGC)• Compuestos volátiles (HS, SPME, nuevo ITEX-2)• Soluciones acuosas (SPME con o sin derivatización)• Soluciones orgánicas (inyección líquida)• Otras matrices requieren de extracción previa


Qué es la derivatización.

Es un proceso que permite:

1. El análisis de compuestos con poca volatilidad o estabilidad.

2. Mejorar el comportamiento cromatográfico o la detectabilidad.

Se realiza modificando químicamente los grupos funcionales (-OH, -COOH, -NH, -SH) para hacerlos más apolares e inertes.


Qué es la derivatización.

1. Sililación:

R-OH R-O-Si(CH3)3 ; derivados TMS (uso general).R-OH R-O-Si(CH3)2C(CH3)3 ; derivados TBDMS (para aa).

2. Acilación:

R-OH R-O-COCH3

3. Alquilación:

R-COOH R-COOCH3 ; derivados FAME (para ácidos grasos).


ANALISIS DE MUESTRAS MARCADAS CON ISOTOPOS ESTABLES 13C, 15N, 2H, 18O

Muestra natural Muestra marcada 13C 30%Muestra marcada 13C 99%

Fame C14:0MW 242

Fame C15:0MW 256

Fame C16:0MW 270

Fame C18:0MW 298

Fame 13C14:0MW 242+14=256

Fame 13C16:0MW 270+16=286

Fame 13C18:0MW 298+18=316

243

257

271

299

243252

271 282

300 310

257

287

317


GraciasY recuerda…


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