2000-Augusto-Rango Lineal de Una Curva de Calibracion

C h e m k e y s - L i b e r t a d p a r a a p r e n d e r

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* Autor de contacto

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Rango Lineal de Una Curva de Calibración

Fábio Augusto

Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química

Creado en Junio de 1997Actualizado en Marzo de 2000

Datos experimentalesCurva de calibraciónTécnicas de análisis

Regresión linealTécnicas numéricasEstructuras lineales

Rango lineal

Para las técnicas analíticas consideradas clásicas (ej.: gravimetría y volumetría), el resultado de la determinación analítica proviene de la combinación de medidas de masas y/o volúmenes y de consideraciones sobre la estequiometría de los procesos químicos en cuestión. Para las llamadas “técnicas instrumentales”, es necesario medir alguna propiedad físico-química de la muestra, que pueda ser correlacionada con su composición. La naturaleza de la medida efectuada depende de la técnica empleada, tal como la luz absorbida o emitida (métodos espectrofotométricos), la corriente, el potencial o la resistencia eléctrica (métodos electroanalíticos) y el área o la altura de picos cromatográficos (métodos cromatográficos), entre otros.

P a r á m e t r o s d e u n a c a l i b r a c i ó n l i n e a l

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I n f o r m a c i o n e s

Histórico del Artículo

Palabras Clave

R e s u m e n

Los sistemas lineales son extremadamente útiles en la representación de los datos experimentales, siendo que las curvas de calibración son las más conocidas. En estos casos, los desvíos de la linealidad son generalmente atribuidos a los efectos químicos y físicos que no fueron tomados en cuenta inicialmente y que se convierten en agentes que complican el análisis matemático de los datos. Las técnicas numéricas usadas para evaluar el comportamiento de sistemas lineales y establecer el rango lineal serán abordadas en el texto a continuación.

En las técnicas clásicas, la existencia de relaciones matemáticas bien definidas entre las medidas y la masa o la concentración de la substancia a ser cantificada, provenientes de la estequiometría de las reacciones, simplifica los cálculos. Eso no ocurre con las técnicas instrumentales. La correlación entre la señal medida (luz absorbida o emitida, corriente eléctrica, área de picos cromatográficos, etc.) y la masa o la concentración de la substancia a ser cantificada dificilmente es conocida a priori. En la mayoría de los casos, la relación matemática entre la señal y la concentración o masa de la substancia de interés debe ser determinada empiricamente a partir de las señales medidas para masas o concentraciones conocidas de esta substancia. Esa relación matemática,

Rogério Custodio *João Carlos de Andrade

Traducido porLarisse Montero Schiemann

C h e m k e y s - L i b e r t a d d e a p r e n d e r�


U s o d e l a r e g r e s i ó n l i n e a l

muchas veces, puede ser exprimida como una recta por

S=aQ+b Ecuación 1

donde S es la señal medida, Q la masa o la concentración de la substancia a ser cantificada y a y b los coeficientes angular y lineal de la recta, respectivamente. Estas rectas son conocidas por curvas de calibración. Matematicamente, la estimativa de los coeficientes de una curva de calibración a partir de un conjunto de medidas experimentales puede ser efectuada usando el método matemático conocido por regresión lineal [1-3]. Además de los coeficientes de regresión a y b, es posible también calcular a partir de los puntos experimentales el coeficiente de correlación r2 (ou r). Este parámetro permite una estimativa de la calidad de la curva obtenida, pues cuanto más próximo de la unidad, mayor la precisión del conjunto de puntos experimentales y menor la incertidumbre de los coeficientes de regresión estimados.

La regresión lineal [2] hace parte del repertorio básico de cualquier estudiante del área de Ciencias Exactas. Las calculadoras científicas más comúnes traen, pre-programado, el algoritmo para este cálculo. Sin embargo, aún siendo operacionalmente simple, ciertos aspectos del uso de la regresión lineal merecen una discusión adicional y uno de ellos es el rango lineal dinámico. En cualquier técnica instrumental, la relación lineal simple descrita por la Ecuación 1 solamente es válida hasta una determinada masa o concentración de la substancia medida. Por ejemplo, en el caso de la espectrofotometría de absorción, la Lei de Beer, que establece una relación lineal entre concentración de la substancia absorbente y la absorbancia, solamente es válida hasta una concentración límite. Cualquier incremento adicional en la concentración arriba de este límite causa una desviación en el valor de la absorbancia medida, en relación a lo que sería esperado por una curva de calibración estimada teoricamente o usando medidas efectuadas con concentraciones menores. En la Figura 1 puede ser vista una curva de calibración, donde son correlacionadas las concentraciones de soluciones acuosas de KMnO4 y sus absorbancias.

El intérvalo de masas o concentraciones dentro del cual se puede construir una curva de calibración lineal es el rango lineal dinámico. Mismo que las causas para la pérdida de linealidad sean características de cada técnica, este es un fenómeno que puede ocurrir con cualquier conjunto de datos. Así, el cálculo de los coeficientes de

regresión de una curva de calibración debe ser seguido de una cuidadosa inspección, para verificar si todos los puntos que serán utilizados están dentro del rango lineal dinámico correspondiente.

Figura 1 - Curva de absorbancia a 545 nm en función de la concentración, para soluciones de KMnO4. Hasta la concentración

límite (indicada por la flecha), la absorbancia medida (puntos) coincide con la curva de calibración lineal (linea cerrada). A partir de esta concentración límite (40 mg L-1), la relación lineal ya no es más

obedecida.

R a n g o l i n e a l

No existe una definición universal para el establecimiento correcto del rango lineal ni mucho menos un procedimiento sistemático bien establecido para su determinación. Su evaluación es generalmente basada en dos parámetros, calculados a partir de dos puntos experimentales disponibles para la construcción de la curva: [a] Resíduos de interpolación, dados por:

Ecuación 2

donde el resíduo de interpolación para el i-ésimo punto experimental, Ri, es calculado como la diferencia percentual entre la señal medida Si y la correspondiente señal interpolada en la curva <S>i.

Dentro del rango lineal dinámico y en la hipotética ausencia de errores indeterminados (o sea, con r2 = 1), todos los puntos tendrían Ri = 0 %. En la práctica, siempre existen errores experimentales y entonces Ri 0 % para cualquier punto experimental usado en la construcción



de la curva. Si es construído un gráfico de los Ri en función de las masas o concentraciones, dentro del rango lineal se va a observar que los resíduos se distribuirán aleatoriamente entre valores positivos y negativos. Sin embargo para masas o concentraciones mayores que el límite del rango lineal, generalmente la señal medida es menor que la señal interpolada a partir de la curva de calibración. De esta manera, del final del rango lineal en adelante, la tendencia general es de que todos los valores de Ri sean negativos. La Figura 2 contiene los resíduos de interpolación obtenidos con los datos empleados en la construcción de la Figura 1.

Figura 2 - Resíduos de la interpolación, en función de la concentración. Hasta el límite del rango lineal, la distribución de los resíduos entre valoresnegativos y positivos es aleatoria; después del

final del rango lineal, la tendencia geeral es de Ri<0.

La inspección de gráficos de resíduo en función de la masa o de la concentración puede ayudar el usuário a establecer el rango lineal de sus datos.

[b] Cuocientes (Señal / Masa), o (Señal / Concentración), definidos por:

Ecuación 3

donde el cuociente señal/masa o señal/concentración para el i-ésimo punto de la curva analítica, (S/Q )i, es calculado a partir de la correspondiente señal medida, Si, de la masa o concentración Qi correspondiente al de la interceptación de la curva de calibración b. La definición exacta de los valores S y Q dependerá de la técnica analítica que esté siendo estudiada. En el caso de la espectrofotometría de absorción, las curvas de calibración son construídas a partir del par absorbancia (que corresponde a S en la Ecuación 3) y concentración (correspondiente a Q ). Para cada técnica analítica, serán usados los parámetros equivalentes: en potenciometria, potencial de celda y concentración; en cromatografia, área del pico cromatográfico y masa, etc.

En ausencia de errores indeterminados (o sea, con r2 = 1) y dentro del rango lineal, se puede demostrar que (S/Q )i = a, para todos los pares de valores experimentales usados para construir la curva. En presecia de errores indeterminados (r2 < 1) y dentro del rango lineal, (S/Q )i aa. Si (S/Q )i << a o (S/Q )i >> a, entonces se puede asumir que el dato esté fuera del rango lineal. En esta discusión serán considerados dentro del rango lineal los valores de (S/Q )i dentro del intérvalo (1,00 ± 0,05)a, o sea, puntos cuyos cuocientes señal/masa o señal/concentración no difieran más del 5% del coeficiente angular de la recta. Este intervalo de tolerancia fué sugerido con base en las normas de la IUPAC para Cromatografia [4], y aquí será propuesto como una regla general, aplicable a curvas de calibración de cualquier técnica analítica.

S i s t e m á t i c a i n t e r a c t i v a

La sistemática iterativa propuesta para el cálculo de una curva de calibración, con determinación simultanea del rango lineal, está basada en el examen de los valores de Ri y (S/Q )i, y puede ser descrita por las siguientes etapas:

Inspección preliminar. Poner en un gráfico los puntos experimentales disponibles y verificar visualmente si existe alguna desviación de linealidad y aproximadamente a partir de que valor ésta se manifiesta.Estimativa de la curva de calibración para la parte lineal. Calcular los coeficientes a, b y r para una curva de calibración, descartando los puntos preliminarmente eliminados en la etapa anterior. Calcular también los límites inferior (LI) y superior (LS) a partir de los cuales los cuocientes (señal / masa) o (señal / concentración) indiquen que un punto está fuera del rango lineal LI = 0,95a y LS= 1,05a, respectivamente.Cálculo de los resíduos de interpolación y los cuocientes señal / masa o señal / concentración. Con los coeficientes a y b preliminarmente calculados en [b], calcular todas las masas o concentraciones disponibles, incluso las preliminarmente descartadas, los resíduos de interpolación y los cuocientes (señal / masa) o (señal / área). Construir gráficos de los resíduos en función de las masas o de las concentraciones y de los cuocientes señal / masa o señal / concentración en función de las masas o concentraciones.Convalidación del límite del rango lineal. Inspeccionar los valores calculados en [c] y verificar si existe algún punto preliminarmente incluso en la curva de calibración que, por comparación con

a.

b.

c.

d.



los límites de corte calculados en [b] debería de ser excluído (o sea, si el correspondiente cuociente (señal / masa) o (señal / concentración) es menor que LI o mayor que LS) o si algun punto inicialmente excluído debería de ser considerado para el cálculo de la curva de calibración. Inclusión o exclusión de nuevos valores en la curva. Si el examen hecho en [d] indica que todos los puntos de la curva preliminarmente incluídos (o excluídos) lo han sido correctamente, el procedimiento está terminado. En caso contrario, habrá que repetir las etapas de [b] a [d], incluyendo o excluyendo los puntos necesarios, hasta que ningún valor sea rechazado o considerado para el cálculo de la curva de calibración.

Este tipo de sistemática puede ser facilmente implementado en planillas de cálculo electrónicas. Los programas de planillas como Lotus 1-2-3, Excel y Quattro Pro son comumente asociados a aplicaciones contables y financieras. Sin embargo, estos programas tienen recursos que permiten la solución de problemas científicos de manera bastante simple y conveniente. Ellos son especialmente adecuados cuando se tratan de cálculos repetitivos, donde el uso de calculadoras electrónicas es trabajoso y pasible de errores de operación. Los programas de planillas incorporan la mayor parte de las funciones matemáticas y estadísticas comunes. Operaciones de análisis de datos más complejas, como por ejemplo el análisis de la variancia y cálculos matriciales, pueden ser realizadas por paquetes de rutinas pre-programadas que los acompañan. Además de ello, es posible la construcción directa de gráficos por los programas de las planillas. Otra ventaja de estos programas es que, una vez construida una planilla para la solución de un determinado problema, con la simple inserción de nuevos datos, los resultados y gráficos construidos son automáticamente actualizados, dispensando nueva digitación de fórmulas. Estas aplicaciones científicas incluyen el cálculo y la evaluación de curvas de calibración analíticas [5, 6], el modelamiento y la predicción del comportamiento de sistemas analíticos [7, 8] y la adquisición y el procesamiento de datos en tiempo real [9], entre otras.

e.

E m p l e o d e p l a n i l l a s – t u t o r i a l

Se demostrará en seguida el uso del programa de planilla electrónica Microsoft Excel 5.0 para Windows en la implementación de la sistemática de cálculo para la determinación de una curva de calibración. Los datos de este ejemplo (Tabla 1) provienen de experimentos con un

Cromatógrafo a Gás con Detector por Emisión Atómica en Plasma de Hélio Inducido por Microondas (CG-PIM) [10], y refiérense a áreas de picos cromatográficos de n-decano. En Cromatografia a Gás, las curvas de calibración correlacionan el área de los picos con la masa de substancia eluída que llega al detector. Sin embargo, el procedimiento adoptado en este ejemplo es válido para cualquier curva de calibración lineal.

Tabla 1 - área A de los Picos Cromatográficos, en unidades, en función de las masas de n-decano (en ng) para un sistema CG-PIM.

m A5,66 13917011,33 26590716,99 37976722,66 52160728,32 62682733,99 70749739,65 80586745,32 823577

Para la construcción de la curva de calibración (A = am + b) los datos listados deben ser inicialmente inseridos en una planilla de cálculos vacía. La Figura 3 contiene el aspecto de la planilla después de inseridos los datos. Las masas han sido puestas en la columna A de la planilla, en el conjunto de celdas de A3 a A10, y las áreas correspondientes en la columna B, en el conjunto de celdas de B3 a B10. Fíjese que en las celdas A2 y B2 fueron digitadas leyendas para las columnas de datos correspondientes. Aunque no sea estrictamente necesaria para los cálculos subsecuentes, se recomienda esta operación para tornar más clara y comprehensible la planilla en construcción.

Figura 3 - Aspecto de la planilla para cálculo de la curva de calibración después de la inserción de los datos.

Después de la entrada de los datos, el paso siguiente es una inspección visual, a través de un gráfico de área x Masa, construído en la misma planilla. En esta primera verificación, se pueden detectar los posibles puntos



discrepantes (“outliers”) del conjunto, además de hacerse una evaluación inicial de la linealidad de la curva. La Figura 4 contiene el gráfico de área x Masa, construído por la planilla con los datos anteriores.

Figura 4 - Gráfico de Área x Masa para inspección inicial de los datos.

Queda claro en esta primera evaluación que el área no varía linealmente con la masa en todo el rango definido por los datos. Como visiblemente los últimos puntos no se comportan linealmente, algunos datos deben de ser rechazados.

T u t o r i a l

[1] A través del gráfico de área x Masa construído, verificar cuales puntos del conjunto pueden, con cierta seguridad, ser incluídos en el rango lineal. Por la Figura 4, se percibe que la curva es aparentemente lineal hasta el cuarto par de puntos área-masa (A = 521607 unidades; m = 22,66 ng).

[2] Estímanse los coeficientes de regresión para una recta cubriendo este rango seleccionado de puntos. La sintaxis de las fórmulas para cálculo de los coeficientes angular a, lineal b y de correlación r (o r2), en las versiones en inglés del programa de planillas Excel es:

coeficiente angular: = SLOPE (Valores de Y; valores de X);coeficiente lineal: = INTERCEPT (Valores de Y; valores de X) ycoeficiente de correlación: = CORREL (Valores de Y; valores de X) donde Valores de Y y Valores de X refiérense, respectivamente, al conjunto de celdas que contienen las áreas y las masas. Para calcular los coeficientes de regresión para los cuatro primeros puntos experimentales (masa en las celdas A3 a A6 y áreas en las celdas B3 a B6), las fórmulas anteriores deben ser digitadas en celdas vacías de la planilla: = SLOPE (B3..B6;A3..A6); = INTERCEPT (B3..

•

•

•

B6;A3..A6) y = CORREL (B3..B6;A3..A6). En este ejemplo, han sido utilizadas las celdas B13, B14 y B15 para contener estos coeficientes.

Observación: En las versiones en portugués del programa Excel, los equivalentes de las funciones mencionadas arriba son, respectivamente, = INCLINAÇÃO (...), = INTERCEPTAÇÃO (...) e = CORREL (...). La forma de uso y sintaxis de estas funciones es la misma de la versión en inglés.

[3] Calcúlanse las áreas interpoladas <A> usando los coeficientes de regresión estimados anteriormente para todos los valores experimentales diponibles. En la planilla, inicialmente se calcula <A> para el primer punto de la curva digitándose, en la celda vacía inmediatamente a la derecha de las usadas para los datos (C3), la fórmula =$B$13*A3+$B$14 ($B$13 = celda con el coeficiente angular a, $B$14 = coeficiente lineal b y A3 = masa para el primer punto). Para los demás puntos, se copia el contenido de la celda C3 para el conjunto de celdas C4 a C10. No olvidar que una celda cuyas direcciones son digitadas entre “$” (por ejemplo, $B$13) es asumida por la planilla como constante. Se puede entonces obtener la curva de calibración provisoria (Figura 5).

Figura 5 - Gráfico de Área x Masa y curva de calibración antes de la definición del rango lineal.

[4] Estímanse los resíduos de interpolación para todos los valores experimentales. En la celda a la derecha de la usada para el primer valor de <A> (D3), digítase =B3-C3, y se copia esta celda para el conjunto de celdas correspondiente a los demás valores (D4 a D10).

[5] Calcúlanse los cuocientes área / masa para todos los puntos experimentales: en la celda E3, calcúlase A/m para el primer punto, a través de =(B3-$B$14)/A3 y se copia para el conjunto de E4 a E10.



[6] Determínanse los límites inferior y superior de tolerancia para el cuociente A/m a través de las ecuaciones =0.95*$B$13 (límite inferior) y =1.05*$B$13 (límite superior). Aquí se han utilizado las celdas F13 y F14 para estas fórmulas, respectivamente. La Figura 6 contiene el aspecto de la planilla, después de la inserción de las fórmulas anteriores. También han sido inseridas, en celdas adecuadas, las leyendas para los valores calculados, conforme discutido anteriormente.

Figura 6 - Planilla después del cálculo de los coeficientes de la regresión (B13, B14 y B15), de los límites para el intervalo de

tolerancia de los cuocientes A/m (F13 y F14), de las áreas interpoladas <A> (C3 a C10), de los resíduos de interpolación (D3 a D10) y de los

cuocientes A/m (E3 a E10).

[7] Prepárase un histograma (gráfico de columnas) de los residuos de interpolación (calculados en el conjunto de celdas de D3 a D10). La Figura 7 exibe el gráfico para este ejemplo.

Figura 7 - Histograma de los resíduos de interpolación, antes de la definición del Rango Lineal.

[8] Prepárase un gráfico de los cuocientes A/m (E3 a E10) y de los límites del rango de tolerancia (F13 y F14), en función de la masa (Figura 8)

Figura 8 - Cuocientes A/m (•) y límites superior e inferior del límite de tolerancia para los cuocientes A/m (líneas ), antes de la redefinición del

rango lineal.

[9] A través de estos dos gráficos, se verifica si existen más puntos que pueden ser adicionados o deben de ser excluídos de la recta. El cuociente A/m del quinto punto de la secuencia (A = 626827 unidades; m = 28,32 ng) se encuentra dentro del rango admitido por los límites de tolerancia calculados, lo que indica que este punto puede ser incluido en la recta. El histograma de los resíduos está de acuerdo con esta evaluación. Hasta este punto, la distribución de los resíduos tiende a ser aleatoria alrededor del cero, pero a partir del sexto punto los resíduos muestran claramente un estándar típico de no-linearidad.

[10] En el caso de que algún punto deba ser incluído o excluído del rango usado en los cálculos, editar las fórmulas de los coeficientes de regresión (celdas B13, B14 y B15), de manera que los conjuntos de celdas referidas en estas fórmulas incluyan (o excluyan) los puntos seleccionados en la etapa anterior. Por ejemplo, la celda B13, que contiene la fórmula =SLOPE (B3..B6;A3..A6) debe ser alterada para SLOPE (B3..B7;A3..A7), para incluir el quinto par área/masa (que está contenido en A7 a B7) en el cálculo del coeficiente angular.

Cuando alteradas las fórmulas de los coeficientes de regresión, la tabla de cálculos (Figura 9) otra vez calula automaticamente todos los valores que dependen de estos coeficientes: áreas interpoladas, resíduos, cuocientes área/masa y límites de tolerancia para A/m. Los gráficos de los resíduos de interpolación (Figura 10) y de los cuocientes A/m (Figura 11) también son corregidos para los nuevos valores, sin intervención del usuario.



Figura 9 - Planilla después de la inserción del punto #5 en el cálculo e los coeficientes de regresión.

Figura 10 - Histograma de los resíduos de interpolación, después de la inserción del punto #5 en el cálculo de los coeficientes de regresión.

Figura 11 - Cuocientes A/m (•) y límites superior e inferior del límite de tolerancia para los cuocientes A/m (línea ), después de la inserción

del punto #5 en el cálculo de los coeficientes de regresión.

[11] Se repite continuamente la evaluación hecha en [9] con los valores recalculados, hasta que ningún punto más deba ser inserido o excluído de los cálculos. En este ejemplo, después de la primera alteración (adición del quinto punto experimental a los cálculos), ningún valor más debe de ser incluído: los cuocientes A/m de los puntos #6 a #8 están bastante distantes del intervalo de tolerancia, y por el histograma de los resíduos se percibe una tendencia pronunciada a la no-linealidad a partir de estos puntos. De esta manera, la curva de calibración determinada ha sido A = 21730 m + 17413, con r = 0,9992, válida para las masas de n-decano entre 5,66 ng y 28,32 ng (Figura 12).

Figura 12 - Gráfico área x masa y curva de calibración, después de la defiición del Rango Lineal.

R e f e r e n c i a s

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