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©Jornada Internacional de Tratamiento y Reutilización en Aguas Residuales. I Congreso Hispano-Francés de Protistología (2008), Sevilla, Spain.
Control del proceso de cloración en un episodio de bulking filamentoso
mediante el seguimiento de protozoos ciliados
Andrés Zornoza 1,2, Tatiana Montoya 1, José Luís Alonso3, María José Tárrega 1
1AVSA-EGEVASA. EDAR Quart-Benáger, 46014 Valencia, Spain. E-mail: [email protected], [email protected], [email protected] Entidad Pública de Saneamiento de Aguas Residuales de la Comunidad Valenciana (EPSAR), Álvaro de Bazán 10 Entlo, 46010 Valencia, Spain. 2Asociación Científica Grupo Bioindicación Sevilla (GBS). Apartado postal 7279, 41080 Sevilla, Spain. 3Instituto Universitario de Investigación de Ingeniería del Agua y Medio Ambiente. Universitat Politècnica de València. Camino de Vera, s/n, 46022 Valencia, Spain. E-mail: [email protected] 1. INTRODUCCIÓN Los microorganismos filamentosos son miembros junto con protozoos y metazoos de la microfauna de las plantas de tratamiento de aguas residuales por fangos activos, desempeñando un papel esencial en la formación flocular (Madoni et al., 2000). El crecimiento excesivo de bacterias filamentosas en los fangos activos genera serios problemas de explotación. Esta descompensación a nivel macroestructural da origen a problemas de bulking filamentoso. Este es el resultado de un elevado crecimiento bacteriano longitudinal, generando de esta forma puentes interfloculares, o por otro lado la presencia de bacterias que tienden a generar estructuras floculares abiertas. En ambos casos queda impedida la correcta agregación de los flóculos dando como resultado un aspecto esponjado del licor mezcla y una deficiente sedimentación en el clarificador secundario. Aunque en estos episodios puedan alcanzarse buenos rendimientos de eliminación de la materia orgánica soluble, la
consecuencia de una mala separación ocasiona una pérdida sobre el control de sólidos debido a escapes de biomasa a través de los clarificadores.
Existen distintas estrategias generales para el control del bulking y mejorar la decantabilidad del licor mezcla, entre ellas, se encuentra la aplicación de métodos físicos y químicos (Eikelboom, 2006). Dentro de los métodos químicos utilizados como biocida se encuentran: la adición de peróxido de hidrógeno, ozono y cloro, siendo este último el más ampliamente empleado en países como Estados Unidos, Alemania, Australia, Gran Bretaña entre otros. Las principales ventajas del uso del cloro frente a los demás son: la disponibilidad del producto, el poder desinfectante y el bajo coste.
Los puntos más recomendados para la aplicación del cloro en las EDAR son: directamente en el tanque de aireación, en una corriente paralela que bombea fango del tanque de aireación y lo retorna al mismo y el mas utilizado, en la corriente de recirculación (Jenkins et al., 2004). La importancia de mantener una buena mezcla del cloro con el fango activo, se debe a la rápida reacción de
2 Seguimiento de protozoos ciliados en un episodio de cloración
este con los compuestos orgánicos e inorgánicos, de nos ser así, pueden consumirse elevadas cantidades de reactivo sin llegar incluso a controlar el bulking.
El cloro al ser un biocida no selectivo afecta en mayor o menor grado sobre toda la biocenosis del fango activo. La adición de éste es efectiva cuando la dosis aplicada es suficiente para atacar al organismo causante del episodio sin poner en peligro la población de bacterias formadoras de floculo (Kim et al., 1994), de protistas y micrometazoos. Por ello se hace necesario ajustar una dosis y un seguimiento del tratamiento. Las técnicas empleadas hasta el momento para el control del efecto del cloro sobre las bacterias filamentosas se basan en: la observación microscópica tanto del flóculo como del estado del filamento, el control de la evolución de la turbidez del efluente y el Índice Volumétrico de Fango (IVF). La única utilización del IVF conlleva riesgos importantes debido a que la modificación de los valores no se produce inmediatamente después de la dosificación, es decir, dependiendo del organismo filamentoso la inercia al cambio podrá ser mayor o menor. Por otro lado, como veremos más adelante, el IVF puede ofrecer en determinados momentos datos sesgados si exclusivamente se correlaciona con la población filamentosa. Todo esto junto con la falta de información a corto plazo que ofrece el IVF sobre el grado de resistencia del organismo al cloro, puede ocasionar un gasto innecesario de reactivo e incluso comprometer la estabilidad del sistema por sobreexposición.
Por otro lado, existen ensayos fisiológicos generales para determinar la actividad de los microorganismos como son: la tasa de absorción de oxígeno, contenido de ATP y actividad deshidrogenasa (sales de tetrazolio: INT, CTC). En los resultados obtenidos mediante estos métodos no se logra
diferenciar la actividad metabólica de las bacterias del flóculo y de las bacterias filamentosas.
El desarrollo de nuevos fluorocromos ha facilitado la evaluación rápida de la fisiología bacteriana en poblaciones de biopelículas y plancton sin la necesidad de realizar un cultivo (Lisle et al., 1999). El Live/Dead® BacLight (BL) Viability kit permite diferenciar las células vivas de las muertas por medio de la integridad de la membrana (Haugland, 1996) mediante dos fluorocromos que tiñen el ácido nucleico.
Escasa atención se le ha prestado a los efectos que sobre la comunidad de protozoos ciliados genera la introducción en el sistema de cloro como biocida para el control del bulking filamentoso. Los ciliados son un grupo de protozoos diverso y muy común dentro de las comunidades de los reactores biológicos (Curds and Cockburn, 1970a; Madoni, 1991) que tienen una contribución esencial en los procesos de depuración, ya que están involucrados en la transferencia de compuestos orgánicos e inorgánicos a través de las redes tróficas (Dive, 1973; Small, 1973; Ansderson, 1988; Cairos and Pratt, 1988; Curds, 1992; Madoni, 1994b; Sommer, 1996; Mas-Acebes, 2007) y en la eliminación de materia orgánica disuelta (Güde, 1979) o floculada (Ratsak et al., 1994). Además, la actividad predadora de los ciliados bacterívoros controla las poblaciones de bacterias dispersas (Curds and Fey, 1969; Curds, 1975; Mas-Acebes, 2007) estimulando de esta forma el crecimiento de bacterias formadoras de floculo y contribuyendo también a la reducción de bacterias patógenas (Curds and Fey, 1969). Adicionalmente, la bioagregación debida a la actividad de los ciliados ha sido descrita (Watson, 1945; Curds, 1963; Arregui et al., 2007). Por lo tanto, la presencia de estos organismos juega un papel importante en la
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clarificación del efluente (Curds and Vandyke, 1966; Curds et al., 1968; Curds, 1975; Ratsak et al., 1994).
La presencia y abundancia de ciliados en las EDAR depende de una serie de factores ambientales cuyos cambios inducen tambien modificaciones en la estructura de la comunidad. Algunos estudios experimentales han demostrado el valor indicador de los ciliados en diferentes hábitats (Bick, 1963; Cairos, 1978; Al-Shahwani and Horan, 1991). Los ciliados han sido establecidos como bioindicadores del rendimiento de los reactores biológicos (Curds, 1969; Curds and Cockburn, 1970b; Foissner, 1988; Madoni, 1982, 1988, 1994a, c; Foissner and Berger, 1996; Martin-Cereceda et al., 1996).
El objetivo de este estudio fue llevar a cabo el seguimiento de la población de protozoos ciliados, estableciendo las modificaciones producidas dentro de la comunidad y el grado de resistencia de las distintas especies presentes durante el proceso de cloración para el control del bulking.
2. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. Muestreo y descripción de la planta El proceso de dosificación de cloro para el control del bulking fue realizado en una
planta de fangos activos situada en la provincia de Valencia (España). La planta recibe una mezcla de agua residual doméstica e industrial. El tratamiento secundario consta de cuatro reactores biológicos con una zona anóxica (20x10x4.5 m) en cada uno de ellos y una zona óxica (20x65x4.5 m), con difusores como sistema de aireación, seguidos de cuatro clarificadores con recirculación externa al reactor biológico. Los principales parámetros de diseño de la planta aparecen en la tabla 1.
El seguimiento de la comunidad de protozoos ciliados se llevó a cabo desde el mes de enero a marzo de 2008 y fueron procesadas un total de 25 muestras de licor mezcla, influente al reactor y efluente final.
2.2. Aplicación de Cloro Para la aplicación del cloro como biocida se siguieron las recomendaciones descritas en Jenkins et al., (2004) y Ramírez et al., (2001), estableciéndose el punto de dosificación en la mezcla de agua influente con el efluente de la recirculación. El cloro reactivo se aplicó en forma de hipoclorito sódico comercial. La dosificación de biocida se realizó en períodos cortos controlados bajo la modalidad de “dosificación-descanso” hasta la normalización del IVF y estabilización del sistema.
Tabla 1. Parámetros de diseño EDAR.
Características Caudal medio diario (m3/d) 60.000 Volumen total zona anóxica (m3) 3.600 Volumen total zona óxica (m3) 23.400 Carga másica (Kg DBO5/Kg SSVLM.d) 0,20-0,25 Carga volumétrica (Kg DBO5/ m3) 0,65-0,75 Tiempo retención hidráulico medio en el reactor (h) 11 Tiempo retención hidráulico medio en el decantador secundario (h) 4,37 Media diaria SST influente (mg/L) 425 Media diaria DQO influente (mg O2/L) 880 Media diaria DBO5 influente (mg O2/L) 450
4 Seguimiento de protozoos ciliados en un episodio de cloración
2.3. Identificación y enumeración de protozoos ciliados El análisis microscópico se llevo a cabo inmediatamente a la toma de muestras usando iluminación de contraste de fases. Para la estimación de la densidad de protozoos ciliados se examinaron dos réplicas tomándose un volumen de 25 µl (Madoni, 1988), en el caso de los ciliados sésiles coloniales se realizaron dos recuentos más para obtener mayor representatividad.
Debido a las variaciones que se producen de SSLM durante los episodios de bulking, y que pueden llevar a comparaciones poco fiables si se contemplan en términos absolutos (ind/ml), el número de individuos se expresó como densidad relativa (ind/SSLM). Durante el período de seguimiento el nivel mínimo de SSLM fue de 1160 mg/l y el máximo 2645 mg/l. Los protozoos ciliados fueron identificados usando las claves de Foissner et al., (1991, 1992, 1994, 1995) y siguiendo las guías de Isac et al., (2006) y Serrano et al., (2008).
2.4. Parámetros físico-químicos y operacionales
Las determinaciones analíticas de SSLM,
SSVLM, IVF, DQO y DBO5 fueron realizadas siguen los métodos normalizados (APHA, 1998). El Índice Volumétrico de Fanfo Diluido (IVFD) se determinó según Jenkins et al., (2004). Las medidas de oxígeno disuelto se tomaron de los registros de medición en continuo en los tanques de aireación. El parámetro operacional carga másica se calculó según Metcalf & Eddy (2006), estableciéndose un promedio de los dos últimos días antes del recuento para su comparación con la población de ciliados
(Salvadó & Gracia, 1993).
2.5. Identificación de la bacteria filamentosa y determinación de la viabilidad celular
La identificación de la bacteria filamentosa
se realizó siguiendo las claves de identificación de morfotipos propuestas por Eikelboom (2000, 2006) y mediante técnicas moleculares, como la hibridación con fluorescencia in situ (FISH). Esta técnica utiliza sondas específicas marcadas con fluorocromos para la detección de bacterias filamentosas en fangos activos, basándose en secuencias de nucleótidos específicas de las bacterias o grupos de bacterias que se quieren identificar. En este estudio se han utilizado las sondas G123T, que permite identificar las bacterias filamentosas del género Thiothrix, y la sonda G2M específica de T. eikelbomii (grupo Thiothrix-021N).
Para realizar el control de la cloración se empleó el Live/Dead® BacLight (BL) Viability kit, (Molecular Probes Inc. 1998) siguiendo la técnica descrita por Ramírez et al., 2000. Se tomó una muestra de fango de 1 ml y se le añadió 3 µl de la mezcla de Syto 9 y yoduro de propidio con una proporción 1:1. El fluorocromo Syto 9 es una molécula pequeña que puede penetrar membranas intactas y el fluorocromo más grande (yoduro de propidio) penetra solo las membranas dañadas (Defives et al., 1999). Estos se excitan a 480 nm y a 490 nm respectivamente. La muestra con los fluorocromos fue incubada 15 minutos en oscuridad y agitación. Los filamentos con todas las células verdes se consideran vivos y los filamentos con todas las células rojas muertos. Existe un estado intermedio en el que los filamentos tienen células vivas y muertas, estos filamentos se cuentan como dañados.
Zornoza et al 5
3. RESULTADOS En la figura 1 se muestran las hibridaciones realizadas con la sonda G123T, empleada para la identificación a nivel de género
Thiothrix (a), y la sonda G2M empleada para la detección de la especie T. eikelboomii (b).
Figura 1. (a) sonda G123. Microscopía de fluorescencia, 600x. (b) sonda G2M. Microscopia de fluorescencia, 600x (c) morfología celular grupo Thiothrix-021N. Contraste de fases, 1000x. (d) formación de puentes interfloculares. Contraste de fases, 100x. (e) ensayo de viabilidad celular día 1. Microscopia de fluorescencia, 400x. (f) ensayo de la V30.
a
d
b
c
E F
e f
e d
6 Seguimiento de protozoos ciliados en un episodio de cloración
La bacteria filamentosa se caracterizó por su morfología celular cuadrada y discoidal (c), presentó un diámetro entre 1.5-2.0 µm y una
longitud > 200 µm formando puentes interfloculares e invadiendo de forma masiva el espacio interflocular (d).
En el ensayo de viabilidad (e) celular realizado el día 1 (muestra control) se observa como la membrana celular se encuentra en buen estado (bacteria viable, color verde). Así mismo en el análisis de la decantabilidad realizado se aprecia el aspecto esponjado del licor mezcla (f).
Tras haber modificado los parámetros operacionales y comprobar la persistencia del bulking, se decidió iniciar un tratamiento con cloro controlado mediante el seguimiento del IVFD, protozoos ciliados y viabilidad celular, para normalizar la decantabilidad del licor mezcla.
En la figura 2 se muestra la evolución del IVFD, dosificación de cloro y densidad de ciliados totales durante el estudio. El cloro fue aplicado durannte tres períodos: el primero (2-4) y el segundo (10-12) con una dosis que oscilaba entre 6-9 Kg Cl/SSVLM.d, y el tercero (30-31) con una dosis entre 6-7 Kg Cl/SSVLM.d. Entre los períodos de
aplicación se respetaron unos días de descanso para evitar la sobreexposición del sistema y dar tiempo suficiente para la recuperación de la población de ciliados. Las cargas másicas promedio durante los períodos de dosificación fueron: 0.56, 0.64 y 0.32 Kg DBO5/SSVLM.d. Por tanto, es comprensible que las dosis efectivas fueran distintas, y según estos datos que la dosis efectiva del segundo período de dosificación fuera menor, además la presencia de otros compuestos como nitratos y nitritos (Jenkins et al., 2004) reaccionan con el cloro reduciendo la dosis efectiva. En la figura se puede apreciar como dicha población cae en el momento que se cumplen 24 horas de dosis (en el segundo período 48 h). Existe un período entre la segunda y tercera aplicación en el que tanto el IVFD como el número total de ciliados se incrementa notablemente.
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IVFD Cloro Ciliados Figura 2. Evolución del IVFD y número total de ciliados frente a la dosis de cloro.
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Un total de 16 especies de ciliados fueron observados en los 23 recuentos realizados durante el período de seguimiento de la cloración. En la tabla 2 se muestran las especies identificadas: la primera columna corresponde a las especies de ciliados con densidad media-alta (>200 ind/mg SSLM) y que serán las que se representen en las figuras siguientes, y la segunda, corresponde a especies cuya frecuencia fue ocasional (<200 ind/mg).
La especie Epistylis balatonica es considerada sinónimo de Epistylis
chrysemidis (Foissner, 1992), ambas especies tienen claros rasgos diferenciadores. Por este motivo en el presente estudio se han cuantificado por separado.
Para mayor visualización y compresión de los resultados obtenidos se ha divido el seguimiento en cuatro períodos: tres corresponden a los períodos de dosificación y uno entre la segunda y tercera dosificación (17-29).
Tabla 2. Densidad de taxones observados durante el período de cloración.
Taxones observados > 200 ind/mg SSLM
Taxones observados < 200 ind/mg SSLM
Uronema nigricans (1) Opercularia coarctata (3)
Aspidisca cicada (2) Acineria uncinata (2)
Trochilia minuta (2) Vorticella microstoma (complejo) (3)
Opercularia microdiscum (3) Litonotus lamella (1)
Epistylis balatonica (3) Euplotes affinis (2)
Epistylis plicatilis (3) Chilodonella sp.(2)
Epistylis chrysemydis (3) Gastronauta membranaceus (2)
Vorticella aquadulcis (complejo) (3)
Vorticella convallaria (complejo) (3)
(1) ciliados nadadores, (2) ciliados reptantes., (3) ciliados pertrícos sésiles.
3.1. Primer período (1-8)
La figura 3 muestra la evolución de los distintos grupos de ciliados durante la primera aplicación de cloro. Se observa como la densidad de población de ciliados reptantes y ciliados nadadores decrece en un 90 y 71 % respecto al recuento realizado el día 1 (utilizado como control), mientras que el grupo de los ciliados peritricos sésiles siguió la tendencia ascendente de la carga másica. Una vez fuera de la influencia de la cloración
los distintos grupos tienden a estabilizar sus poblaciones.
La figura 4 muestra la evolución de las distintas especies de ciliados nadadores y reptantes. Uronema nigricans, Aspidisca cicada y Trochilia minuta reducen su población en un 71, 88 y 90 %. Hay que destacar la baja densidad de población de esta última una vez fuera del alcance del biocida, incluso manteniéndose los mismos niveles de carga másica que en el día 1.
8 Seguimiento de protozoos ciliados en un episodio de cloración
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C. NADADORES C. REPTANTES C.P. SÉSILES DOSIS CLORO C. MÁSICA *10 Figura 3. Evolución de los distintos grupos de ciliados durante la primera aplicación de cloro.
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Uronema nigricans Aspidisca cicada Trochilia minutaDOSIS CLORO C. MÁSICA *10
Figura 4. Evolución de las distintas especies de ciliados nadadores y reptantes durante la primera aplicación de cloro.
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La figura 5 muestra la evolución de las distintas especies de ciliados peritricos sésiles. V. aquadulcis manifiestó una reducción importante al inicio del proceso de cloración, siguiendo después una ligera tendencia ascendente paralela a la carga másica. E. plicatilis apareció una vez cumplido el segundo día de dosificación (día 3), llegando a alcanzar la densidad más alta
de todos los ciliados sésiles en los momentos de mayor carga másica. E. Chrysemydis y E. balatonica manifiestan comportamientos opuestos durante la dosificación: la densidad de E. balatonica disminuye mientras que la de E. Chrysemydis asciende hasta quedar próximas fuera de la influencia del cloro (día 8).
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E. plicatilis E.Chrysemydis E.balatonica V. aquadulcisDOSIS CLORO C. MÁSICA *10
Figura 5. Evolución de las distintas especies de ciliados peritricos sésiles durante la primera aplicación de cloro.
El día 4 se realizó el ensayo de viabilidad celular para determinar el grado de ataque del biocida a la bacteria causante del episodio y así decidir si se continuaba con el tratamiento. La población de ciliados había disminuido notablemente (69 %). En la figura 6 se presentan los resultados obtenidos en el ensayo de viabilidad celular y microscopia con contraste de fases. Se puede observar claramente en la imagen (a) como el
filamento queda dañado, aspecto visible por el color rojo. En las imágenes (c) y (d) se aprecia la fragmentación de los filamentos y la pérdida celular. Mediante esta técnica también fue posible detectar cómo algunos flóculos presentaban agregados de bacterias formadoras de flóculo dañadas (b). Por esta última razón y por la baja densidad de ciliados se decidió interrumpir la aplicación de hipoclorito sódico.
10 Seguimiento de protozoos ciliados en un episodio de cloración
Figura 6. (a) y (b) ensayo de viabilidad celular, células rojas (dañadas). Microscopía de fluorescencia, 400x. (c) T. eikelboomii dañada y fragmentada libre en el espacio interflocular. Contraste de fases, 400x. (d) T. eikelboomii dañada, perdida celular. Contraste de fases, 1000x.
En la figura 7 se puede apreciar los efectos del cloro sobre los ciliados. Numerosos individuos de las especies Aspidisca cicada y Trochilia minuta se manifestaban inmóviles en la observación microscópica (a) y (b). También se observaron multitud de formas enquistadas, posiblemente de V. aquadulcis (c). Algunas colonias de Epistylis chrysemydis manifestaban contracción del zooide, un tamaño de vacuola pulsátil mayor de lo habitual y perdida de individuos en la colonia (e) y (f). Por el contrario Epistylis plicatilis no manifestaba rasgos aparentes de alteración (d).
3.2. Segundo período (8-17) En la figura 8 se presentan los distintos grupos de ciliados durante la segunda dosificación de cloro.
Se observa como el grupo de los ciliados nadadores (representado exclusivamente por U. nigricans) y reptantes (representado principalmente por A. cicada) se comportan de forma similar al período anterior, ambos se reducen en un 87 % (día 11). El grupo de los ciliados peritricos sésiles manifiesta una tendencia descendente contraria a la del primer período (reducción del 52 %).
a b
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Figura 7. Efectos del biocida sobre la población de ciliados. (a) Trochilia minuta. Contraste de fases, 400x. (b) Aspidisca cicada. Contraste de fases, 400x. (c) quiste (probablemente de V. aquadulcis). Contraste de fases, 400x. (d) colonia de E. plicatilis. Contraste de fases, 100x. (e) y (f) Epistylis chrysemydis. Contraste de fases, 100x y 200x.
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C. NADADORES (Uronema nigricans) C. REPTANTES (Aspidisca cicada)C.P. SÉSILES DOSIS CLOROC.MÁSICA*10
Figura 8. Evolución de los distintos grupos de ciliados durante la segunda aplicación de cloro.
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E. plicatilis E.chrysemydis E.balatonica DOSIS CLORO C.MÁSICA*10 Figura 9. Evolución de las distintas especies de ciliados peritricos sésiles durante el segundo aplicación de cloro.
Zornoza et al 13
En la figura 9 se presentan las distintas especies de ciliados sésiles. E. chrysemydis y E. balatonica continúan manifestando comportamientos opuestos durante la dosificación, llegando incluso a no cuantificarse esta ultima en el día 11, mientras que E. plicatilis reduce su población.
En la figura 10 se presentan los resultados de viabilidad celular antes de iniciar el segundo período (día 9) y después de tres
días de dosificación (día 12). De manera cualitativa se observó que el daño producido a la bacteria es menor por el número inferior de filamentos de color rojo observados respecto al primer periodo, posiblemente debido a que se alcanzan los valores de carga másica más altos de todo el estudio reduciendo la dosis efectiva. El IVFD, contrariamente a lo esperado, comenzó a subir a partir del día 11 (figura 2).
Figura 10. (a) ensayo viabilidad celular día 9. Microscopía de fluorescencia, 400x (b) ensayo viabilidad celular día 12. Microscopía de fluorescencia, 400x.
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IVFD Cloro C.MASICA*10 Figura 11. Evolución de la carga másica frente al IVFD.
a b
14 Seguimiento de protozoos ciliados en un episodio de cloración
3.3. Tercer período (17-29)
Lo más destacado de este tercer período (figura 11) es el gran aumento que sufre el IVFD tras la situación de sobrecarga (10-12) de 0,55-0,70 Kg DBO5/SSVLM.d, que coincide con niveles bajos de ciliados (figura 2). La carga másica sigue una tendencia similar al IFVD. Esta situación remite sobre el día 29, entrando en el último período de dosificación.
Para el análisis de ciliados se han dividido en dos grupos: grupo I (figura 12), que engloba aquellas especies que manifiestan alta densidad en momentos de máxima carga másica (día 19), y grupo II (figura 13), aquellas que manifiestan máxima densidad cuando comienza a disminuir la carga másica (a partir del día 22).
En la figura 14 se presenta la evolución del aspecto del flóculo. En la imagen (a) se muestra el aspecto antes de entrar en el período de máxima carga másica, en los momentos de máxima carga (b), en los
momentos de altos valores de IVFD (c) y tras remitir la subida de IVFD que coincide a su vez con valores de carga másica más constantes.
Los elevados valores de carga másica junto con la baja densidad de ciliados en los días 10-12 (figuras 2 y 8) ocasionó un estado de sobrecarga en el que los valores de oxígeno se situaron por debajo de 2 mg/l, generándose abundante crecimiento disperso y posteriormente agregados bacterianos en el flóculo (14b). El día 19 el aspecto del flóculo, en los momentos de mayor IVFD, presentaba un aspecto completamente distinto al día 11 (figura 14a) es decir, sin núcleo anóxico característico y con abundante zona aerobia bacteriana (figura 14c). Este tipo de flóculo tiene una velocidad de sedimentación menor que aquellos que muestran núcleos anóxicos bien compactos. Esta pudo ser la razón del incremento de IVFD ya que cualitativamente no se observó un crecimiento importante de T. eikelboomii.
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Car
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a *1
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BO
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LM.d
)
E. plicatilis V. aquadulcis O. microdiscum Uronema nigricansAspidisca cicada IVFD (mL/g) C. MÁSICA * 10
Figura 12. Representación de ciliados (grupo I).
Zornoza et al 15
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Tiempo (días)
Cili
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l/SSV
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E.Chrysemydis E.balatonica V. convallaria IVFD (mL/g) C. MÁSICA * 10
Figura 13. Representación de ciliados (grupo II).
Figura 14. Aspecto del flóculo. Contraste de fases, 100x. (a) día 5 (b) día 11 (c) día 19 (d) día 29.
a b
c d
16 Seguimiento de protozoos ciliados en un episodio de cloración
El hecho de que se produjera unos días después de la situación de sobrecarga es debido a que el flóculo tiene mayor inercia al cambio que los ciliados. Por todo ello, no se decidió aplicar cloro tomando como medida de actuación la retención de SSLM. El día 29 se recuperó el aspecto inicial y típico (figura 14d), mejorándose así la sedimentabilidad.
Analizando los bioindicadores que aparecieron durante este cuarto período se puede apreciar como hay un primer grupo de especies constituido por E. plicatilis, V. aquadulcis, O. microdiscum, A.cicada y U. nigricans (figura 12), que sigue la tendencia de la carga másica, siendo éstas típicas de estados transitorios con elevado crecimiento disperso. Aspidisca cicada, que se encuentra presente en un amplio rango de condiciones y calidad del efluente (Paoole, 1984), al ser un ciliado reptante, pudo estar asociado al incremento de biopolímero y bacterias formadoras de flóculo de las cuales se alimenta. El segundo grupo de especies
constituida por E. chrysemidis, E. balatónica y V. Convallaria (figura 13), se incrementan cuando a partir del día 21 comienzan a bajar el IVFD y la carga másica, siendo especies típicas de situaciones más estables con menor crecimiento bacteriano disperso. Durante este cuarto período el oxigeno se mantuvo en un 80-90 % con niveles mayores de 2 ppm. 3.4. Cuarto período (29-45)
En la figura 15 se muestra como los C.P. sésiles, grupo principal que coloniza el sistema, sufre un descenso del 37 % tras el primer día de dosificación permaneciendo constante a partir de este. En este período no se observaron ciliados nadadores y los ciliados reptantes, principalmente representados por Aspidisca cicada, fueron escasos y presentaron una reducción del 83 %.
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.d)
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)
C. REPTANTES C.P. SÉSILES C. MASICA * 10 DOSIS CLORO Figura 15. Evolución de los distintos grupos de ciliados durante la tercera aplicación de cloro.
Zornoza et al 17
En la figura 16 se observa como E. Chrysemydis y E. balatonica continúan manifestando comportamientos opuestos igual que en las anteriores dosificaciones. Epistylis plicatilis incrementa ligeramente su población durante el día 29-30, a partir de este último desaparece completamente. V. aquadulcis incrementa su población mientras que V. convallaria se reduce en un 41 %.
En la figura 17 se muestra el grado de afección de la bacteria filamentosa en el
último análisis de viabilidad celular practicado el día 31 (a), quedando algunos flóculos dañados íntegramente (b). El IVF comienza a disminuir a partir de los dos días de recibir el último tratamiento (figura 2), normalizándose hasta alcanzar el día 45 los valores típicos de IVF, 120 ml/g (c). El tipo de flóculo correspondiente a esta situación muestra ausencia total de la bacteria filamentosa T. eikelboomii (d).
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g C
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E. plicatilis E.Chrysemydis E.balatonica V. aquadulcisV. convallaria C. MASICA * 10 DOSIS CLORO
Figura 16. Evolución de las distintas especies de ciliados peritricos sésiles durante la tercera aplicación de cloro.
A
18 Seguimiento de protozoos ciliados en un episodio de cloración
Figura 17. (a) y (b) análisis de viabilidad celular (día 31); microscopía de fluorescencia, 400x (c) ensayo V30 (día 45) (d) aspecto del flóculo (día 45); contraste de fases, 100x.
4. CONCLUSIONES
El seguimiento de la población de ciliados sésiles nos ha llevado a observar las fluctuaciones producidas durante la aplicación del biocida en el tratamiento del bulking. Los cambios repentinos producidos en intervalos cortos de tiempo así como la comprobación de la afección del cloro en el sistema mediante la técnica de viabilidad celular, nos hacen pensar que las dosis de
cloro empleadas tuvieron un efecto directo sobre la densidad de población de ciliados, mostrando una serie de comportamientos que a continuación detallamos.
De los tres grupos de ciliados (nadadores, reptantes y sésiles), el grupo de ciliados reptantes presentó menor resistencia reduciendo su población inicial entre un 85-90 %. No se observaron diferencias significativas de reducción entre sus representantes Aspidisca cicada y Trochilia
a b
c d
Zornoza et al 19
minuta, ambas parecen tener sensibilidad similar a la presencia del biocida. El grupo de los ciliados nadadores, representado principalmente por Uronema nigricans, se redujo entre un 70-90 %, igual que las anteriores parece mostrar sensibilidad al biocida. Respecto al grupo de los ciliados peritricos sésiles encontramos distintos comportamientos debido a que es un grupo muy diverso.
Dentro del grupo de los ciliados peritricos sésiles, Vorticella aquadulcis, tiende a incrementar su población durante los períodos de tratamiento por lo que parece mostrar resistencia al biocida. Epistylis plicatilis no presentó ninguna tendencia a lo largo de las dosificaciones del biocida. E. Chrysemydis y E. balatonica presentaron comportamientos opuestos durante las dosificaciones. E. balatonica se muestra sensible al cloro mientras que E. chrysemydis parece ser más resistente. Este comportamiento da mayor solidez a la idea de que ambas podrían tratarse de especies distintas, además E. balatónica, a diferencia de E. chrysemydis, tiene un tamaño menor, no tiene el pedúnculo “hueco” que se adhiere frecuentemente a otros de algunas especies de peritrícos como E. plicatilis, E. chrysemydis, O. articulata y Carchesium polypinum.
La densidad de ciliados se redujo en los tres períodos de dosificación: en el primero un 69 %, en el segundo un 75 % y en el tercero un 42 %. Los dos primeros correspondientes a una dosis de 6-9 Kg Cl/SSVLM.d durante tres días y el tercero con una dosis menor de 6-7 kg durante dos días. No se debe correlacionar las reducciones de ciliados totales con la dosis aplicadas por dos motivos: el primero por que las distintas especies de ciliados presentan diferentes respuestas frente al cloro y el
segundo motivo por se desconoce cual es realmente la dosis efectiva.
Lo más importante de este estudio fue el comportamiento que sufrieron las distintas especies presentes ante la introducción de cloro como biocida. De esta forma, nos podemos hacer una idea previa a la dosificación de cloro de cual podría ser el comportamiento de las poblaciones y sobre todo a la hora de elegir el momento idóneo para iniciar y regular el tratamiento.
AGRADECIMIENTOS
Queremos agradecer a la EPSAR y AVSA-EGEVASA su apoyo continuo a la investigación y respaldo a nuestro trabajo. REFERENCIAS
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