생체시료분석법_밸리데이션_해설서(2010.6.)

행정간행물 등록번호

생체시료분석법 밸리데이션 해설서Guideline for the Validation of Bioanalytical Method

2010. 6.

머 리 말

생물학적동등성시험결과의 신뢰성을 확보하기 위해서는 생체시료분석에

이용된 분석법을 적절하게 Validation하는 절차가 필수적입니다.

지난 2003년 국립독성연구원에서는 미국 FDA의 가이드와 기타자료 등을

참조하여, 생체시료 분석법 Validation에 필수적인 항목을 가이드로 제시한 바

있으나, 제약업계와 생동성시험기관에서 실제 적용 가능한 구체적인 세부지침

마련의 필요성이 제기되었습니다.

이에, 실무작업반 회의를 통해 (안)을 마련하고, 학계, 제약업계 및

생동성시험기관 등의 의견을 수렴하여「생체시료분석법 밸리데이션

해설서」를 마련하게 되었습니다. 본 해설서는 생체시료분석법 밸리데이션

항목에 대한 정의 및 의의, 구체적인 시험방법 및 이에 대한 예시, 판정기준,

검증된 분석법의 적용방법 및 적합기준에 대한 상세한 설명 등을 수록하고

있습니다.

이번 해설서가 생체시료분석을 수행하는 시험기관의 활용에 실질적인

도움이 되어 생물학적동등성시험의 효율성이 제고되고, 나아가 국내

생물학적동등성시험의 신뢰성 향상에 도움이 되기를 기대합니다.

2010. 6.

의약품안전국장 장 병 원

본 해설서는 생체시료 분석법 밸리데이션에 대해 현실성 있고 가장

적절한 운영 방안을 제시한 것입니다.

이것은 현재까지의 경험과 과학적 사실에 근거한 것이므로 새로운 과학적

근거가 있을 경우 언제든지 개정될 수 있으며 이러한 사항이 있을 경우

식품의약품안전청에 의견을 제시하여 주시기 바랍니다.

또한, 본 해설서는 법적인 책임을 가지지 않으며 단지 생체시료 분석법

밸리데이션에 대한 식품의약품안전청의 최근 입장을 기술하고 있는

것으로서 특별하게 규정하거나 법적으로 요구하고 있는 사항은 아니며

단지 권고사항입니다. 이 가이드라인에서 사용하는 용어는 제안한다거나

권고한다는 것을 의미하며 반드시 요구하는 것은 아닙니다.

※이 가이드라인에 대한 의견이 있을 경우 식품의약품안전청 의약품심사부 약효

동등성과로 문의하시기 바랍니다.

전화번호 : 02-380-1414, 1415

팩스 : 02-383-8321

목 차

I. 서 론 ·······························································································································1

Ⅱ. 분석법 밸리데이션의 배경 및 종류 ····································································2

1. 전체 밸리데이션 ·············································································································3

2. 부분 밸리데이션 ·············································································································3

3. 표준품 ·······························································································································5

4. 분석법 개발 : 화학적 시험 ··························································································5

4.1. 특이성 ······················································································································5

4.2. 정확성, 정밀성과 회수율 ·····················································································8

4.3. 검량선 ····················································································································10

4.3.1. 최저정량한계 ·······························································································11

4.3.2. 검량선/표준곡선/농도 대 반응 ······························································11

4.4. 안정성 ····················································································································12

4.4.1. 냉․해동 안정성 ·························································································13

4.4.2. 단기 온도 안정성 ·······················································································13

4.4.3. 장기 안정성 ·································································································14

4.4.4. 표준원액 안정성 ·························································································14

4.4.5. 조제 후 안정성 ···························································································14

4.5. 분석법 밸리데이션 시 유의할 사항 ································································15

4.6. 분석법 밸리데이션에 관한 특별 권장사항 ····················································16

5. 밸리데이션된 분석법의 적용 ·····················································································18

5.1. 분석 과정의 적합 기준 ······················································································24

6. 서류 ·································································································································26

6.1. 요약 정보 ··············································································································26

6.2. 분석법 확립에 관한 문서작성 ··········································································26

6.3. 일상적인 약물 분석에의 적용 ··········································································28

6.4. 기타 정보 ··············································································································29

Ⅲ. 용어해설 ······················································································································30

Ⅳ. 참고문헌 ······················································································································33

부록 1. 기타 밸리데이션 항목 ···················································································34

부록 2. 분석법 변경시 요구되는 밸리데이션 시험 항목 예시 ··························37

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Ⅰ. 서 론

본 가이드는 임상시험용의약품, 신약 및 후발의약품 등의 허가신청을 위하여 인체를

대상으로 한 임상약리시험, 생체이용률시험, 생물학적동등성시험 시 사용된 생체시료

분석법의 밸리데이션 절차 및 방법에 관한 정보를 제공한다.

본 가이드의 정보는 일반적으로 가스크로마토그래피 (Gas Chromatography; GC),

고속액체크로마토그래피 (High-Pressure Liquid Chromatography; LC), GC 혹은 LC

와 질량분석기 (Mass Spectrometer; MS)의 조합, 예를 들어 LC-MS, LC-MS-MS,

GC-MS 그리고 GC-MS-MS에 의한 전혈, 혈청, 혈장 또는 뇨와 같은 생체시료 중의 약

물이나 그 대사체를 정량하는 생체시료 분석과정에 적용된다.

본 가이드는 생체시료 분석법 밸리데이션을 위한 일반적인 권장사항이며, 권장사항

은 사용되는 분석법의 형태에 따라 변형될 수 있다.

- 2 -

Ⅱ. 분석법 밸리데이션의 배경 및 종류

약물과 대사체를 정량 평가하기 위한 선택적이고 감도가 우수한 분석법을 확립

하는 것은 전임상시험과 생물약제학적 그리고 임상약리학적 연구를 성공적으로

수행하는 데 중요하다. 생체시료 분석법 밸리데이션은 전혈, 혈장, 혈청 혹은 뇨와

같은 생체시료중의 분석물질을 정량 분석하는 데에 사용되는 특정 방법이, 믿을만

하고 재현성이 있다는 것을 증명하는 모든 과정을 포함한다. 이러한 밸리데이션을

위한 기본적인 요소 (Parameters)로는 정확성, 정밀성, 선택성, 감도, 재현성과 안

정성이 포함된다. 분석법 밸리데이션은 특정 실험실에서, 특정 분석법이 적합하고

신뢰할 만하다는 것을 문서화하는 과정을 포함하며, 분석결과를 채택하기 위해서

는 분석법 밸리데이션 기준에 적합해야 한다.

공인된 분석방법은 실제 시험을 수행시 실험실의 특성에 적합하도록 종종 변경

되고, 이러한 변경된 분석법이 적합하다는 것을 보증하기 위하여 밸리데이션되어

야 한다. 이미 밸리데이션된 분석법을 변경하는 경우 분석자는 부가적인 밸리데이

션이 어느 정도로 필요한 지를 판단하여야 한다. 약물을 개발하는 과정에서 설정

된 생체시료 분석법은 수차례 변경되는데, 이러한 변경 이력과 여러 수준의 분석

법 밸리데이션을 통해 시험의 타당성이 입증된다. 밸리데이션의 종류와 수준은 다

음과 같이 분류되어진다.

해설 및 예시

○ 생체시료 분석법 밸리데이션 시 적합성을 평가하기 위한 기본적인 요소는 정확성,

정밀성, 특이성, 감도, 재현성, 그리고 안정성이다.

○ 생체시료 분석방법은 구체적이고 자세하게 기술되어야 한다. 이는 프로토콜, 시험

안, 보고서 혹은 표준작업지침서의 형태가 될 수 있다.

○ 시료 채취에서 분석까지 생체시료 내 분석물질을 측정하는데 영향을 줄 수 있는 환

경적, 생체시료, 물질, 혹은 과정상의 변동요인들의 범위를 결정하기 위하여 시험의 각

단계별로 조사되어져야 한다.

- 3 -

2. 부분 밸리데이션

부분 밸리데이션은 이미 밸리데이션 되어진 생체시료 분석법을 변경한 경우에 실시

한다. 부분 밸리데이션은 단지 일내 정확성 및 정밀성 시험만 필요한 경우에서 거의 전

체 밸리데이션까지 필요한 경우가 있다. 다음과 같은 경우 부분 밸리데이션을 실시하

나, 이에 한정되는 것은 아니다.

실험실 또는 시험자의 변경

분석법의 변경 (예. 검출기 변경)

생체시료 채취시 항응고제의 변경

같은 종에서 생체시료의 변경 (예. 사람 혈장에서 사람 뇨로 변경)

시료의 전처리 과정의 변경

같은 생체시료의 종간 변경 (예. 랫드 혈장에서 마우스 혈장으로 변경)

해당 농도 범위의 변경

기기 혹은 소프트웨어 제어장치의 변경

시료 용량이 제한된 경우 (예. 소아과 연구)

희귀한 생체시료인 경우

타 약물의 공존 시 분석물질의 특이성을 증명하는 경우

특정 타 대사체의 존재 하에 분석물질의 특이성을 증명하는 경우

○생체시료분석법은 목적에 맞게 밸리데이션 되어야 하며, 분석법 밸리데이션에 대한

이의 제기나 결론을 도출하는데 사용된 모든 시험 내용은 보고서에 기술되어야만 한다.

(분석법 밸리데이션 보고서)

1. 전체 밸리데이션

전체 밸리데이션은 다음과 같은 경우에 실시한다.

생체시료 분석법 최초 개발 시

신약 개발 시

약물 대사체에 대한 분석이 이미 밸리데이션 된 정량시험법에 추가되는 경우

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분석법이 변경되는 경우 변경 정도를 고려하여 분석법 밸리데이션 수준을 결정해야

한다. 변경 정도에 따라 요구되는 분석법 밸리데이션 수준의 예시는 본 가이드의 별첨 1

에 수록하였으므로 참고한다. 사람의 생체이용률, 생물학적동등성, 약물동태학 그리고

약물 상호작용시험을 위한 생체시료 분석법은 생물학적동등성시험기준 등에 적합해야

한다. 분석 실험실에는 완벽한 품질관리와 보증 체계를 입증하기 위해 표준작업지침서

(Standard Operating Procedure; SOP)을 비치해야 한다. 표준작업지침서에는 시료가

채취되어 실험실에 도착할 때부터 분석 결과가 보고될 때까지의 모든 내용이 수록되어

야 한다. 표준작업지침서에는 또한 기록보존, 시료 보안 및 보관과정, 시료 전처리와 분

석 기법이 포함되어야 한다. 분석 기법이란 분석방법, 용매, 장비, 기기, 품질관리 및 결

과 확인 절차 등을 말한다.

특정 생체시료분석법을 개발하고 밸리데이션한 후 일상적인 시료분석에 이용하는

과정은 다음 세 가지로 나누어 볼 수 있다. (1) 표준액 조제과정, (2) 생체시료분석법의

개발과 수행과정의 확립, (3) 밸리데이션 된 생체시료분석법을 일상적인 약물 분석과

분석배치 (Analytical Run or Batch)에 대한 적합 기준에 적용. 이 세 가지의 과정은 다

음 장에서 기술하기로 한다.

해설 및 예시

○생체시료 분석법 밸리데이션으로서 부분밸리데이션을 실시하는 경우에는 보고서에

전체 밸리데이션의 결과와 부분밸리데이션의 결과를 모두 기재하는 것이 바람직하다.

○매 시험의 시료분석 전마다 전체 밸리데이션을 실시해야 하는 것은 아니다. 이미 전

체 밸리데이션 되어 있는 분석법을 시료분석에 적용할 수 있다. 전체 밸리데이션되어

있는 분석법을 부분적으로 변경하는 경우 부분밸리데이션을 한 후 시료분석에 적용할

수 있다. 이때, 부분밸리데이션 수준 및 평가결과의 타당성을 검토하여야 한다.

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3. 표준품

생체시료중의 약물과 그 대사체 분석 시 검량선용 표준물질을 가한 시료 (Calibration

Standards)와 품질관리시료 (Quality Control Samples)를 이용하여 분석한다. 표준물

질을 첨가한 생체시료 (Spiked Samples)를 만드는데 사용하는 표준물질의 순도는 시험

결과에 영향을 미치므로, 동일성과 순도가 인증된 표준물질을 가지고 기지 농도의 표준

액을 조제해야 한다. 가능하다면 표준물질이 분석물질 (Analyte)과 동일해야 한다. 이

것이 불가능하면 순도가 확인된 화학 형태 (산․염기가 제거된 형태, 염 혹은 에스테르

형태)를 사용할 수 있다. 일반적으로 세 가지 종류의 표준물질이 사용된다. (1) 공인된

표준물질 (예. USP 표준물질), (2) 평판 좋은 회사로부터 구입한 시판되는 표준물질, (3)

분석시험실 혹은 다른 비영리 단체에 의해 주문 합성된 순도가 입증된 기타 물질. 각 표

준물질마다 제조원, 제조번호, 유효기한, 가능한 경우 성적서, 그리고 (혹은) 내부적 혹

은 외부적으로 입증된 확인시험 및 순도시험자료가 구비되어야 한다.

4. 분석법 개발 : 화학적 시험

생체시료의 분석법 밸리데이션을 위한 기본적인 요소들로는 정확성, 정밀성, 특이성,

감도, 재현성, 그리고 안정성이다. 생체시료 내 분석물질별 측정 방법이 밸리데이션되

어야 한다. 또한, 생체시료 내 분석물질의 안정성이 평가되어야 한다. 생체시료 분석법

을 개발하고 확립하는 과정에서 일반적으로 다음과 같은 사항에 대한 평가가 포함된다.

(1) 특이성, (2) 정확성, 정밀성, 회수율, (3) 검량선, (4) 시료 내 분석물질의 안정성.

4.1. 특이성

특이성은 생체시료 내 다른 물질의 공존 시 해당 분석물질을 분리하고 정량하는 분석

능력을 말한다. 특이성 평가 시 적당한 생체시료 (혈장, 뇨 등)의 공시료 분석을 최소 6

가지 서로 다른 기원의 생체시료 (예. 여섯 사람에서 채취한 생체시료)를 이용하여 수행

하여야 한다. 각 공시료에 대해서는 간섭시험을 수행하여야 하며, 특이성 평가는 최저

정량한계에서 수행되어야 한다.

생체시료내 존재 가능한 간섭물질로는 내인성물질, 대사체, 분해산물 등이 있으며,

실제 연구 시에는 병용투여 약물과 다른 외인성물질 등도 존재할 수 있다. 만약 해당 분

석법이 한 가지 이상의 분석물질을 정량하고자 하는 경우 각 분석물질별로 간섭물질이

없음을 입증하여야 한다.

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해설 및 예시

○ 시료의 생리적인 특성 때문에 생체시료의 다양성을 고려하는 것이 중요하다.

LC-MS-MS로 분석하는 경우에는, 분석법 적용 시 생체시료로 인한 영향이 없다는 것을

보증하기 위해 적절한 작업 단계가 수행되어야 한다. 특히 생체시료가 분석법 밸리데이

션 시험동안 사용한 생체시료와 다른 경우 더욱 그러하다.

○가능한 한 분석하고자 하는 시료의 생체시료와 동일한 생체시료를 분석법 밸리데이

션시에도 사용해야 한다. (골수와 같이 쉽게 얻기가 힘든 생체시료의 경우는 이와 생리

적으로 가장 유사한 생체시료를 대체하여 사용할 수 있다.)

○시험 방법의 특이성은 동일한 생체시료로 최소 6 가지 서로 다른 기원의 생체시료를

이용하여 평가한다. 질량분석기를 검출기로 이용한 방법인 경우 (예. GC-MS, LC-MS)

6 가지 시료로 간섭시험을 수행하는 것이 중요하지 않을 수도 있다. LC-MS와

LC-MS-MS로 분석하는 경우, 정밀성 및 특이성, 감도에 별다른 영향이 없음을 증명하

기 위하여 생체시료의 영향을 조사하여야 한다. 분석법의 특이성은 분석법을 개발하고

밸리데이션하는 전 과정 동안 평가되어야 하고, 그 분석법을 실제 시험에 적용하는 전

과정 동안 평가되어야 한다.

○ 특이성은 최소 6 가지 서로 다른 기원의 생체시료(예. 공혈장, 공뇨 등)를 전처리한

시료, 풀링(Pooled)한 생체시료에 분석표준물질만을 첨가하여 전처리한 시료, 생체시

료에 내부표준물질만을 첨가하여 전처리한 시료, 최저정량한계농도로 전처리한 시료

(내부표준물질포함), 최고정량한계농도로 전처리한 시료(내부표준물질포함) 등을 분

석하여 분석물질의 피크유지시간에서의 간섭에 대하여 평가한다.

○ 분석물질의 피크유지시간에서 간섭물질이 있을 경우, 피크반응으로부터 간섭여부

를 평가할 수 있다. 크로마토그래프법의 경우, 최저정량한계 피크반응의 20% 이하1)로

서 특이성을 평가할 수 있다.

1) The AAPS Journal, 9(1) Article 11, E109-E114, 2007

EMEA, GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS (DRAFT), 2009

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○ 두 가지 이상의 성분을 분리하거나(예. 대사체 분석), 또는 구조가 비슷한 내부표준

물질 및 동위원소 내부표준물질을 사용한 LC-MS-MS 분석에서 비슷한 유지시간을 갖

는 같은 분자량 또는 같은 딸이온(Daughter Ion)의 경우, 크로스-토크(Cross-talk) 현상

이 나타나 정확한 정량에 문제가 될 수 있으므로 분석법 개발 초기에 확인해야 한다. 이

는 먼저 LC로 분리하고자 하는 성분들을 최대한 겹치지 않게 잘 분리하고, 한 성분에

대해 최고정량한계 농도의 시료를 LC-MS-MS로 분석하고 동시에 분석하고자 하는 다

른 물질의 MS-MS 채널의 시그널을 확인함으로써 알 수 있다.

예를 들어, 동위원소 치환체 내부표준물질을 사용하는 LC-MS-MS 분석에서 내부표준

물질의 유연물질로 함유된 분석물질의 반응이 나타나는 경우에는 특이성 기준(예.

LLOQ의 20% 이하)에 적합하도록 내부표준물질의 농도를 조절하여 사용하는 것이 바

람직하다.

Figure 1. 크로스-토크 현상에 대한 예시 크로마토그램: Cross-talk observed in glucuronide transition

when no glucuronide was present. Sample; standard mixture containing only parent drug and

internal standard. (Rapid Commun Mass Spectrum, 15, 313-319, 2001)

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4.2. 정확성, 정밀성과 회수율

분석법의 정확성은 분석물질의 참값 (농도)에 대한, 분석법에 의해 얻어진 평균 시험

결과의 근접성을 의미한다. 정확성은 기지량의 분석물질을 함유한 시료를 반복적으로

분석함으로써 구해진다. 정확성 평가 시 각 농도에 대해 최소 5번의 시험을 실시해야 한

다. 예측 농도 범위 내에서 최소 3가지 농도에 대해 시험하도록 권장한다. 평균값은 최

저정량한계를 제외하고는 실측값의 15%이내여야 하고, 최저정량한계에서도 20%를 넘

어서는 안 된다. 참값으로부터의 평균치의 오차 정도로서 정확성을 평가한다.

분석법의 정밀성은 하나의 균질화된 생체시료로부터 취한 여러 개의 등분체

(Aliquots)로 반복 분석하였을 때 분석물질에 대한 개개 측정치의 근접성을 의미한다.

정밀성 평가 시 각 농도마다 최소 5번의 시험을 실시해야 한다. 예측 농도 범위 내에서

최소 3가지 농도에 대해 시험하도록 권장된다. 각 농도별로 측정된 정밀도는 변동계수

(Coefficient of Variation; CV)가 15%를 초과해서는 안 되며, 최저정량한계에서는 변동

계수가 20%를 넘지 않도록 한다. 정밀성은 더욱 세분화되어 한 분석배치 시험 시 정밀

성을 평가하기 위한 시험 내 (Within-run), 분석배치 내 (Intra-batch) 정밀성 혹은 재현

성과, 시간 경과 시 정밀성을 평가하기 위한 시험 간 (Between-run), 분석배치 간

(Inter-batch) 정밀성 혹은 재현성으로 나뉘어 진다. 이때, 다른 시험자, 다른 장비, 다른

용매, 그리고 실험실간의 정밀성도 포함되도록 시험해야 한다.

분석물질의 회수율은 생체시료에 분석물질을 가한 후 추출하여 얻어진 시료의 검출

반응과 기지 농도의 순수 표준물질의 검출반응을 비교한 값이다. 회수율은 분석법의 추

출효율과도 관계된다. 회수율이 100%가 될 필요는 없지만 분석물질과 내부표준물질의

회수율은 일정하고 정밀하고 재현성이 있어야 한다. 회수율 시험은 세 가지 농도 (저,

중, 고농도)에서 추출한 시료의 분석결과와 100% 회수를 의미하는 추출하지 않은 표준

물질의 분석결과를 비교하여 수행한다.

해설 및 예시

○ 생체시료분석법이 유효한 것으로 간주되기 위해서는 특정 적합기준이 미리 결정되

어야 하고, 검량선 전범위에 걸친 품질관리 시료가 정확성과 정밀성에 대한 적합기준에

도달해야 한다.

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○ 분석물질이 첨가된 생체시료로 만든 검량선용 표준시료와 밸리데이션용 품질관리

시료의 적부 기준은 분석물질의 이론 농도를 기준으로 설정해야 한다. 특정 기준을 미

리 설정하여 검량선 전범위에서 정확성과 정밀성에 대한 기준에 도달되도록 하는 것이

더욱 바람직하다.

○ 생체시료 분석법의 밸리데이션을 위해 정확성과 정밀성은 공시료를 제외하고 농도

별로 최소 5 개의 시료를 이용하여 평가한다. 평균값은 최저정량한계를 제외하고 이론

값 (참값)의 ±15%이내이어야 하고, 최저정량한계에서는 ±20%를 넘지 않아야 한다. 평

균값에 대한 정밀성은 최저정량한계를 제외하고는 변동계수가 ±15%이내이어야 하고

최저정량한계에서는 ±20%를 넘지 않아야 한다. 정확성과 정밀성을 평가하는 다른 방

법도 이러한 조건을 만족하면 인정 가능하다.

○ 생체시료 내 기지 농도의 주성분이 정확하고 정밀하게 분석됨을 입증해야 한다. 이

는 동일한 생체시료로 기지 농도의 분석시료 (품질관리 시료)를 수차례 분석함으로써

수행한다. 검량선 범위 전역을 포함하는 최소 3 가지 농도에서 평가한다. (1) 최저정량

한계의 3 배 정도의 농도 (저농도 품질관리 시료), (2) 검량선의 중간 정도의 농도 (중농

도 품질관리 시료), (3) 검량선의 최고정량한계의 농도 (고농도 품질관리 시료). 중농도

값은 최저정량한계와 최고정량한계농도의 기하평균값 또는 예상되는 최고혈중농도

(Cmax)값으로 할 수 있다. 고농도 품질관리 시료는 보통 최고정량한계부근의 농도값(예.

최고정량한계 시료농도의 85%)을 설정할 수 있다.

○보고된 분석법 밸리데이션 결과와 정확성 및 정밀성 평가 시, 모든 이상치 (Outliers)

가 포함되어야 한다. 하지만, 통계적으로 이상치로 설정된 값을 제외하고 정확성 및 정

밀성을 계산하여 함께 보고할 수는 있다.

○ 한 농도에 대해 5번의 시험이란, 밸리데이션 정도관리시료를 각 농도별로 최소 n=5

로 하여 측정하고, 평균 측정값 및 변동계수를 결정한다. 평균 측정값을 이용하여 이론

치 (기지농도)와의 상대오차 (% Relative Error: % RE)를 구한다. 개별 측정값이 분산되

어 있는 정도인 변동계수 (Coefficient of Variation, % CV)를 구한다.

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○ 회수율(Total Recovery), 추출효율(Extraction Efficiency 또는 Recovery)은

보통 다음의 식에 의해 계산한다.

회수율(%) =× 100

추출효율(%) =× 100

A: 공시료에 분석표준물질을 첨가한 후 추출한 액의 반응, B: 공시료를 추출한 후

분석표준물질을 첨가한 액의 반응, C: 추출하지 않은 분석표준물질 용액의 반응

4.3. 검량선

검량선은 기기의 반응과 분석물질의 기지농도와의 관계를 나타낸다. 검량선은 시료

중의 각 분석물질에 대해 작성되어야 한다. 농도와 반응간의 상관 관계를 결정하기 위

해서 충분한 수의 표준시료가 사용되어야 한다. 검량선은 분석하고자하는 시료와 동일

한 생체시료에 기지농도의 분석물질을 가한 것을 시료로 하여 작성한다. 검량선을 작성

하는 데에 사용되는 표준시료의 수는 분석치의 예상 범위와 분석물질-반응 상관관계에

따라 결정된다. 표준시료의 농도는 각각의 연구에서 예상되는 농도 범위에 근거하여 선

택해야 한다. 검량선은 공시료 (내부표준물질 없이 시험한 생체시료), 제로시료 (내부표

준물질만을 넣고 시험한 생체시료), 그리고 최저정량한계를 포함해서 정량 범위이내의

6～ 8 가지 농도에 내부표준물질을 가한 시료로 구성된다.

해설 및 예시

○분석물질이 검출되는 농도범위는 그 범위 내 표준시료의 실측치와 표준편차를 포함

하여 평가한 후 생체시료분석법 상에 기술되어야 하며, 이를 검량선이라 한다.

○농도와 반응의 상관관계를 적절하게 나타내기 위해서는 충분한 수의 표준시료가 사

용되어야 한다. 농도-반응 관계가 지속적이고 재현성이 있음이 증명되어야 한다. 표준

시료의 수는 농도-반응 관계의 특성과 범위에 영향을 미친다. 많은 경우, 검량선 작성

시 공시료를 제외하고 6～ 8 가지 농도가 사용된다. 비직선성을 보이는 경우 더 많은 수

의 표준시료 농도를 사용한다.

- 11 -

○ 생체시료인 경우, 최소 6 가지 농도의 표준시료(공시료 제외)를 가지고 농도별로 한

개 이상의 시료를 분석하여 검량선을 작성한다. 검량선에는 예상되는 농도 전 범위가

포함되어야 한다.

4.3.1. 최저정량한계 (Lower Limit of Quantification, LLOQ)

다음의 조건이 충족될 때 검량선의 최저표준시료농도를 정량한계로 한다.

최저정량한계에서 분석물질의 반응이 공시료의 반응과 비교할 때 최소 5배 이상이다.

분석물질의 피크(반응)는 확인 가능하고 분리되어 있으며, 20%이내의 정밀성과 80～

120%의 정확성을 가진다.

해설 및 예시

○최저정량한계는 허용되는 정확성과 정밀성 기준에 적합한 검량선의 최저 농도이다.

표준시료(n=5 이상)를 이용하여 변동계수 (CV) 및/또는 적절한 신뢰구간을 정하여 최

저정량한계를 설정한다. 최저정량한계는 검량선의 최저농도를 말하며 검출한계나 저

농도 품질관리 시료와 혼동해서는 안 된다. 최고 표준시료농도를 해당 분석법의 최고정

량한계 (ULOQ)라고 한다.

4.3.2. 검량선/표준곡선/농도 대 반응

검량선으로는 농도와 반응의 관계를 적절히 기술하는 가장 간단한 모델이 사용되어

야 한다. 가중치를 두거나 복잡한 회귀방정식을 사용할 때는 타당성을 입증해야 한다.

검량선을 작성할 때는 다음 조건을 충족해야 한다.

최저정량한계에서 이론치와의 편차 20%이내

최저정량한계이외의 농도에서 이론치와의 편차 15%이내

최저정량한계와 최고정량한계를 포함하여 6 개의 표준시료농도 중 최소 4 개의 농도

가 위 기준에 적합해야 한다. 범위를 벗어난 표준시료농도 측정치를 제외하고 검량선을

작성하였을 때 그 회귀모델2)이 변경되어서는 안 된다.

2) 2003년 “생체시료분석법 Validation”에서는 “회귀방정식”으로 되어 있었으나, FDA CDER “Guidance for Industry :

Bioanalytical Method Validation” 원문상의 “model”을 그대로 사용함.

- 12 -

4.4. 안정성

생체시료중의 약물의 안정성은 저장조건, 약물의 화학적 특성, 생체시료, 그리고 저

장체계 등에 따라 결정된다. 특정 생체시료나 저장체계에서 분석물질의 안정성은 그 생

체시료와 저장체계에만 관련되며, 다른 생체시료나 저장체계와는 연관시키지 않아야

한다. 안정성시험 과정은 장기보관 (설정된 보관 온도에서 냉동)과 단기보관 (실험대위,

실온)한 후 및 냉․해동 주기 (Freeze-Thaw Cycle)를 거친 후 시료를 채취하고 취급하

는 동안 분석 물질의 안정성과 분석하는 동안 분석물질의 안정성에 대해 평가해야 한

다. 안정성 시험 조건은 실제로 시료를 취급하여 분석하는 동안 발생할 수 있는 상황이

반영되어야 한다. 또한 표준원액 내 분석물질의 안정성에 대해서도 평가되어야 한다.

안정성 평가 시에는 즉시 만든 표준원액을 다른 분석물질과 간섭물질이 없는 생체시료

에 가해서 만든 하나의 시료 세트를 사용해야 한다. 안정성 평가 시 표준원액은 분석물

질을 적절한 용매로 녹여 기지 농도로 조제해야 한다.

해설 및 예시

○검량선의 핏팅 (Fitting)은 최적의 적합성 (Goodness of Fit)을 위해 적절한 가중치를

준 후 통계적 시험을 거쳐 농도-반응 관계를 가장 적절하게 규명할 수 있는 가장 간단한

모델에 적용함으로써 결정된다.

○최저정량한계와 최고정량한계를 포함하여 6 개의 표준시료농도 중 최소 4 개의 농도

가 위 기준에 적합해야 한다. 범위를 벗어난 표준시료농도 측정치를 제외하고 검량선을

작성하였을 때 그 회귀모델이 변경되어서는 안 된다. 표준시료농도의 개수가 6개 이상

일 때에는 적절한 판정기준을 설정하여야한다.

해설 및 예시

○안정성 평가 기준은 표준작업지침서 등에서 미리 정한 후 안정성 시험을 수행하여야

한다.

- 13 -

○시료 채취와 저장기간 동안 생체 시료 내 분석물질(약물과 대사체)의 안정성에 대한

평가가 수행되어야 하는데 시료분석 이전에 실시하도록 권장한다.

4.4.1. 냉․해동 안정성

분석물질 안정성은 냉동과 해동 과정을 3 차례 거친 후 결정한다. 저농도와 고농도

각각 최소 3 개의 등분체를 설정된 저장온도에서 24 시간동안 저장하고 실온에서 보

조기구 없이 해동한다. 완전히 녹았으면, 다시 같은 조건으로 12 ～ 24 시간동안 동결

한다. 냉․해동 과정을 2 회 반복한 다음 분석한다. 만약 분석물질이 설정된 저장 온도

에서 불안정한 경우 3 회의 냉․해동 과정 시 -70℃에서 동결한다.

4.4.2. 단기 온도 안정성

저농도와 고농도 각각 3 개의 등분체를 실온에서 해동하고 실온에서 4～ 24 시간동

안 방치한 다음 분석한다. 실온에서 방치하는 시간은 해당 연구 과정에서 시료가 실온

에서 방치되는 시간을 고려하여 결정한다.

해설 및 예시

○설정된 저장온도에서 생체시료 내 주성분의 안정성이 확인되어야 한다. 냉․해동 과

정으로 인한 영향을 조사해야 한다. (최소 2가지 농도에 대해 각각 3개의 시료를 3번의

냉․해동 과정을 거친다.)

○실온에서 생체시료 내 주성분의 안정성은 일반적인 시료 조제 및 시료 처리, 그리고

분석배치 시험 시 소요되는 기간과 동일한 일정 기간동안 평가해야 한다. 여기서 실온

은 일반적인 실험실 온도를 의미한다.

○단기온도 안정성 - ‘실온에서 방치하는 시간’은 해당 연구과정에서 시료가 실온에서

방치되는 시간을 고려하여 결정하되, 시료의 처리는 해당 연구기간동안 안정성을 확보

한 시간 동안 수행한다.

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4.4.3. 장기 안정성

장기 안정성에서의 저장 기간은 초회 시료 채취일로부터 시료 분석 종료일까지의

기간보다 길어야 한다. 장기 안정성은 저농도와 고농도 각각 최소 3 개의 등분체를 시

험시료와 동일 조건하에서 저장하여 평가한다. 시료의 용량은 3 회 분석하는데 충분

한 량이어야 한다. 안정성 시료의 농도는 장기 안정성 시험을 시작한 첫날 얻어진 해

당 농도별 측정치의 평균값과 비교한다.

4.4.4. 표준원액 안정성

약물과 내부표준물질의 표준원액의 안정성은 적어도 6 시간 동안 실온에서 평가한

다. 만약 원액이 해당 기간동안 냉장 혹은 냉동 보관된다면 이에 대한 안정성 평가도

문서화되어야 한다. 원하는 저장기간이 지나면 새로 제조한 표준원액과 기기 반응을

비교하여 안정성을 평가한다.

4.4.5. 조제 후 안정성

자동주입기내에 있는 기간을 포함해서 전처리 시료의 안정성이 증명되어야 한다.

약물과 내부표준물질의 안정성은 밸리데이션 시료에 대해 예상 소요 시간 동안 시험

한 후 원검량선을 토대로 농도를 계산하여 평가한다.

해설 및 예시

○ 표준원액 안정성 - ‘약물과 내부표준물질의 표준원액의 안정성은 적어도 6 시간 동

안 실온에서 평가한다.’는 약물이 실온에서 6시간동안 안정하지 않을 경우, 안정성이 확

보된 온도 및 시간 조건에서 분석이 수행되어야 함을 의미한다.

○ 조제 후 안정성 - 원검량선(Original Calibration Curve)은 일반적인 분석 원칙을 따

라 만들어야 한다(예) 매일 새로 만들어야 하며, 실험 배치마다 각각의 검량선이 만들어

져야 한다).

- 15 -

4.5. 분석법 밸리데이션 시 유의할 사항

생체시료 분석법 밸리데이션 시 적합성을 평가하기 위한 기본적인 요소는 정확성,

정밀성, 특이성, 감도, 재현성, 그리고 안정성이다.

생체시료 분석방법은 구체적이고 자세하게 기술되어야 한다. 이는 프로토콜, 시험

안, 보고서 혹은 표준작업지침서의 형태가 될 수 있다.

시료 채취에서 분석까지 생체시료 내 분석물질을 측정하는데 영향을 줄 수 있는 환

경적, 생체시료, 물질, 혹은 과정상의 변동요인들의 범위를 결정하기 위하여 시험의

각 단계별로 조사되어져야 한다.

시료의 생리적인 특성 때문에 생체시료의 다양성을 고려하는 것이 중요하다.

LC-MS-MS로 분석하는 경우에는, 분석법 적용 시 생체시료로 인한 영향이 없다는 것

을 보증하기 위해 적절한 작업 단계가 수행되어야 한다. 특히 생체시료가 분석법 밸리

데이션 시험동안 사용한 생체시료와 다른 경우 더욱 그러하다.

생체시료분석법은 목적에 맞게 밸리데이션 되어야 하며3), 분석법 밸리데이션에 대

한 이의 제기나 결론을 도출하는데 사용된 모든 시험 내용은 보고서에 기술되어야만

한다. (분석법 밸리데이션 보고서)

가능한 한 분석하고자 하는 시료의 생체시료와 동일한 생체시료를 분석법 밸리데이

션 시에도 사용해야 한다. (골수와 같이 쉽게 얻기가 힘든 생체시료의 경우는 이와 생

리적으로 가장 유사한 생체시료를 대체하여 사용할 수 있다.)

검채 채취와 저장기간 동안 생체 시료 내 분석물질 (약물과 대사체)의 안정성에 대

한 평가가 수행되어야 하는데 시료분석 이전에 실시하도록 권장한다.

매우 불안정한 대사체인 경우 투약한 피험자로부터 채취한 생체시료 내 분석물질의

안정성에 대해 확인해야 한다.

내인성 물질, 대사체 및 알려진 분해생성물에 대해 생체시료 내 분석법의 정확성, 정

비록 본 가이드에는 저장시료와 새로 조제한 시료의 분석결과를 비교하는 전형적인

방법을 제시하고 있으나, 생체시료 내 분석물질의 안정성을 평가하기 위해 다른 통계

학적 방법을 사용할 수도 있다. 표준작업지침서에는 사용된 통계학적 방법과 규칙이

상세하게 기술되어야 한다. 약물을 투여한 피험자로부터 채취한 시료에 관한 조사 등

을 포함한 부가적 밸리데이션이 요구될 수도 있다.

- 16 -

밀성, 재현성, 반응함수 (Response Function)와 특이성이 확인되어야 한다. 특이성의

경우 정량되는 물질이 분석하고자 하는 분석물질임을 증명하여야 한다.

분석물질이 검출되는 농도범위는 그 범위 내 표준시료의 실측치와 표준편차를 포함

하여 평가한 후 생체시료분석법 상에 기술되어야 하며, 이를 검량선이라 한다.

농도와 반응의 상관관계를 적절하게 나타내기 위해서는 충분한 수의 표준시료가 사

용되어야 한다. 농도-반응 관계가 지속적이고 재현성이 있음이 증명되어야 한다. 표준

시료의 수는 농도-반응 관계의 특성과 범위에 영향을 미친다. 많은 경우, 검량선 작성

시 공시료를 제외하고 6～ 8 가지 농도가 사용된다. 비직선성을 보이는 경우 더 많은

수의 표준시료 농도를 사용한다.

표준 검량선의 최고정량한계 이상의 농도를 희석하는 기술은 분석법 밸리데이션에

있어서 정확성과 정밀성에 의해 증명된다.

다중송신 (Multiplexing), 다중컬럼 (Multicolumn), 그리고 병렬시스템 (Parallel

Systems) 등을 포함한 고속처리분석법 (High Throughput Analyses)을 사용하는 경

우 분석법이 적절하게 관리되고 있음을 입증하기에 충분한 수의 품질관리 시료가 사

용되어야 하며, 그 품질관리 시료의 수는 시험규모에 따라 결정되어진다. 시험 중 품

질관리 시료의 시험 순서는 합리적으로 결정한다.

생체시료분석법이 유효한 것으로 간주되기 위해서는 특정 적합기준이 미리 결정되

어야 하고, 검량선 전범위에 걸친 품질관리 시료 밸리데이션 시 정확성과 정밀성에 대

한 적합기준에 도달해야 한다.

4.6. 분석법 밸리데이션에 관한 특별 권장사항

생체시료인 경우, 최소 6 가지 농도의 표준시료(공시료 제외)을 가지고 농도별로 한

개 이상의 시료를 분석하여 검량선을 작성한다. 검량선에는 예상되는 농도 전 범위가

포함되어야 한다.

검량선의 핏팅 (Fitting)은 최적의 적합성 (Goodness of Fit)을 위해 적절한 가중치를

준 후 통계적 시험을 거쳐 농도-반응 관계를 가장 적절하게 규명할 수 있는 가장 간단

한 모델에 적용함으로써 결정된다.

3) 2003년 “생체시료분석법 Validation”에서는 “생체시료분석법은 사용 용도에 대해서 Validation되어야 하며”로 되어

있었으나, FDA CDER “Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation” 원문상의 “A bioanalytical

method should be validated for the intended use or application”로 원문을 좀 더 자연스럽게 해석함.

- 17 -

최저정량한계는 허용되는 정확성과 정밀성 기준에 적합한 검량선의 최저 농도이다.

표준시료(n=5 이상)를 이용하여 변동계수 (CV) 및/또는 적절한 신뢰구간4)을 정하여

최저정량한계를 설정한다. 최저정량한계는 검량선의 최저농도를 말하며 검출한계나

저농도 품질관리 시료와 혼동해서는 안 된다. 최고 표준시료 농도를 해당 분석법의 최

고정량한계 (ULOQ)라고 한다.

생체시료 분석법의 밸리데이션을 위해 정확성과 정밀성은 공시료를 제외하고 농도

별로 최소 5 개의 시료를 이용하여 평가한다. 평균값은 최저정량한계를 제외하고 이

론값 (참값)의 ±15%이내이어야 하고, 최저정량한계에서는 ±20%를 넘지 않아야 한다.

평균값에 대한 정밀성은 최저정량한계를 제외하고는 변동계수가 ±15%이내이어야

하고 최저정량한계에서는 ±20%를 넘지 않아야 한다. 정확성과 정밀성을 평가하는 다

른 방법도 이러한 조건을 만족하면 인정 가능하다.

생체시료 내 기지 농도의 주성분이 정확하고 정밀하게 분석됨을 입증해야 한다. 이

는 동일한 생체시료로 기지 농도의 분석시료 (품질관리 시료)를 수차례 분석함으로써

수행한다. 검량선 범위 전역을 포함하는 최소 3 가지 농도에서 평가한다. (1) 최저정량

한계의 3 배 정도의 농도 (저농도 품질관리 시료), (2) 검량선의 중간 정도의 농도 (중

농도 품질관리 시료), (3) 검량선의 최고정량한계의 농도 (고농도 품질관리 시료).

보고된 분석법 밸리데이션 결과와 정확성 및 정밀성 평가 시, 모든 이상치 (Outliers)

가 포함되어야 한다. 하지만, 통계적으로 이상 치로 설정된 값을 제외하고 정확성 및

정밀성을 계산하여 함께 보고할 수는 있다.

설정된 저장온도에서 생체시료 내 주성분의 안정성이 확인되어야 한다. 냉․해동

과정으로 인한 영향을 조사해야 한다. (최소 2 가지 농도에 대해 각각 3 개의 시료를 3

번의 냉․해동 과정을 거친다.)

실온에서 생체시료 내 주성분의 안정성은 일반적인 시료 조제 및 시료 처리, 그리고

분석배치 시험 시 소요되는 기간과 동일한 일정 기간동안 평가해야 한다.

기기 고장인 경우 분석배치를 재분석할 것인지를 결정하기 위해서 재주입시의 재현

성을 평가한다.

시험 방법의 특이성은 동일한 생체시료로 최소 6 가지 서로 다른 기원의 생체시료를

이용하여 평가한다. 질량분석기를 검출기로 이용한 방법인 경우 (예. GC-MS, LC-MS)

6 가지 시료로 간섭시험을 수행하는 것이 중요하지 않을 수도 있다. LC-MS와

LC-MS-MS로 분석하는 경우, 정밀성 및 특이성, 감도에 별다른 영향이 없음을 증명하

기 위하여 생체시료의 영향을 조사하여야 한다. 분석법의 특이성은 분석법을 개발하

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고 밸리데이션하는 전 과정동안 평가되어야 하고, 그 분석법을 실제 시험에 적용하는

전 과정동안 평가되어야 한다.

분석물질이 첨가된 생체시료로 만든 검량선용 표준시료와 밸리데이션용 품질관리

시료의 적부 기준은 분석물질의 이론 농도를 기준으로 설정해야 한다. 특정 기준을 미

리 설정하여 검량선 전범위에서 정확성과 정밀성에 대한 기준에 도달되도록 하는 것

이 더욱 바람직하다.

5. 밸리데이션 된 분석법의 적용

생체시료 내 분석물질에 대한 모든 시료분석은 안정성이 확보된 기간 내에 완료되

어야 한다. 일반적으로 생체시료가 해당 분석법의 밸리데이션 결과에서 확인된 바와

같이 적합한 변동범위를 가진다면 두 번 이상 분석하지 않고 단 회만 측정하여 분석할

수 있다. 이는 정밀성과 정확성의 변동범위가 통상적으로 허용한계이내인 시험과정

인 경우에 적용된다. 불안정한 분석물질을 가지고 시험하여 높은 정밀성과 정확성의

기준에 도달하기 어려운 시험인 경우, 보다 정확한 분석치를 얻기 위해 2 회, 심지어 3

회 정도 분석해야 할 수도 있다. 각각의 분석배치 내 시료를 분석하기 위해 각 분석물

질별로 검량선을 작성하고 시험하는 미지 시료 내 분석물질의 농도를 계산하는데 사

용되어야 한다. 표준물질을 가한 생체시료는 한 개 이상의 분석물질을 포함할 수도 있

다. 하나의 분석배치는 다음과 같이 구성된다.5) (1) 품질관리 시료, (2) 검량선용 표준

시료, (3) 한 배치로서 분석될 모든 전처리 시료, 혹은 한 연구에서 한 명 이상의 지원

자로부터 채취하여 전처리한 미지 시료로 구성된 배치. 검량선에는 최저정량한계의

검량 시료뿐만 아니라, 미지 시료의 예상농도범위를 포함해야 한다. 검량선의 최저정

량한계 미만으로 또는 최고정량한계를 초과하여 외삽해서 미지의 시료 농도를 계산

해서는 안 된다6). 그 대신 검량선을 재작성하거나, 고농도의 시료인 경우 희석하여 다

시 분석해야 한다. 모든 분석시료를 한번에 분석하는 것이 바람직하다.

4) 2003년 “생체시료분석법 Validation”에서는 “변동계수(CV)와 적절한 신뢰구간”으로 되어 있었으나, FDA CDER

“Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation” 원문상의 “coefficient of variation and/or

appropriate confidence interval”을 그대로 해석함.

5) 2003년 “생체시료분석법 Validation”에서는 “분석시 시료는 다음의 세 가지로 구성된다.”로 되어 있었으나, FDA

CDER “Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation” 원문상의 “An analytical run can consist of

~”을 그대로 해석함.

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해설 및 예시

○ 분석법의 정확성을 신뢰하기 위해서는 생체시료의 냉/해동 안정성 및 실온안정성,

조제 후 안정성, 표준원액과 내부표준원액의 냉장안정성 및 실온안정성 등이 확보되어

야 하며 모든 실험 조작은 안정성시험의 보관기간 시간 내에 이루어져야 한다. 또한 생

체시료 냉동안정성은 최초의 시료 채취 시점부터 분석 종료 시점까지의 기간보다 긴 기

간 동안 확보되어야 한다.

○ " 불안정한 분석물질을 가지고 시험하여 높은 정밀성과 정확성의 기준에 도달하기

어려운 시험인 경우, 보다 정확한 분석치를 얻기 위해 2 회, 심지어 3 회 정도 분석해야

할 수도 있다."에서 분석은 재분석이 아니라 반복분석을 의미한다.

○검량선의 범위를 초과하는 농도에서는 정밀성 및 정확성을 신뢰할 수 없으므로 검량

선을 외삽하는 것은 허용되지 않는다.

최고정량한계를 초과하는 시료는 동일한 생체시료로 희석하여 정량한 후 희석배수를

곱하여 농도를 산출하는 것이 바람직하다. 그러나 이 경우에도 희석하는 과정의 오차가

추가적으로 발생하므로 시료의 희석분석이 예상된다면 정량법 밸리데이션에서 희석분

석의 정밀성, 정확성을 확인하여야 한다.

생물학적동등성시험의 경우에는 시험 전에 최고혈장농도를 예측할 수 있으므로 분석

법의 개발 시에 개체차를 고려한 충분한 검량범위를 설정하는 것이 바람직하다. 그러나

통상 검량범위가 넓어질수록 정밀성과 정확성이 저하되므로 충분한 검량범위를 설정

할 수 없는 경우에는 정확성과 정밀성이 확보되는 검량범위를 설정하고 희석분석의 정

확성과 정밀성을 검정하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 특히 투여용량의 범위가

넓은 독성동태시험이나 임상약동학 시험에서 넓은 검량범위가 필요할 수 있으며 이 경

우에는 희석분석 방법을 응용할 수 있다.

최저정량한계 미만으로 측정되는 시료는 반응의 선택성, 정밀성, 정확성, 생체시료효

과 등을 신뢰할 수 없다.

6) 2003년 “생체시료분석법 Validation”에서는 “검량선의 최저정량한계 이하나 최고정량한계 이상으로 외삽해서 미지의

검체 농도를 계산해서는 안된다.”로 되어 있었음.

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일상적인 사용 목적으로 분석법이 일단 밸리데이션 되기만 하면 해당 분석법이 만

족할 정도로 수행되고 있음을 입증하기 위하여 정확성 및 정밀성에 대해 정기적으로

검토해야 한다. 이를 위해서는 분석 시료의 개수를 토대로 품질관리 시료의 개수를 정

한 후 각각 조제한 품질관리 시료를 일정 간격으로 두고 전처리한 시험시료와 함께 분

석해야 한다. 품질관리 시료는 각 농도 당 2 개씩, 3 가지 농도 (최저정량한계 근처의 최

저정량한계의 3 배 농도, 중간 농도, 최고정량한계 근처의 농도)로 준비해서 각 시험 과

정에 포함되어야 한다. 품질관리 시료의 수는 시험과정의 총 분석시료 수에 따라 결정

한다. 품질관리 시료의 시험 결과에 따라 그 시험의 적합 여부가 결정된다. 6 개의 품질

관리 시료 중 최소 4 개가 각 이론값의 15%이내여야 한다. 6 개의 품질관리 시료 중 2 개

는 각 이론값의 15%를 벗어날 수는 있지만 동일 농도에서 모두 벗어나서는 안 된다.

해설 및 예시

○ 하나의 분석배치에서 측정하여야 하는 품질관리 시료의 수는 최소 6개 이상이거나

미지 농도 시료의 5% 이상 중 많은 수이어야 한다.

○ 품질관리 시료를 간격을 두고 측정하는 목적은 하나의 분석배치 내에서 발생할 수

있는 분석 감도 변화를 검출하는데 있다. 분석기기의 반응이 분석배치 전반에 걸쳐서

일정하게 유지되지 않는다면 그 정확성은 신뢰할 수 없다. 그러므로 간격을 두고 지속

적으로 정확성을 확인하는 것이 매우 중요하다.

- 21 -

생체시료분석법을 일상적인 약물 분석에 적용 시 다음과 같은 사항이 권장된다.

생체시료에 근거한 검량선은 공시료를 제외하고 전범위에 걸친 최소 6 가지 표준시

료농도로 1회 혹은 반복측정7) 분석하여 작성한다.

반응 함수 : 일반적으로 시료분석 전 밸리데이션 동안에 정한 검량선 핏팅, 가중치와

최적의 적합성은 해당 실제 시험의 검량선에도 동일하게 사용되어야 한다. 반응 함

수는 밸리데이션 과정 동안 얻어진 표준시료의 실측치를 바탕으로 적절한 통계학적

시험을 통해 결정된다. 시료분석 전 밸리데이션과 시료분석 과정의 밸리데이션 시8)

반응함수가 달라진 경우, 시험법 상에 잠재적인 문제가 있음을 의미한다.

품질관리 시료는 해당 시험의 적합 여부를 평가하는데 사용된다. 이러한 품질관리

시료는 분석물질을 생체시료에 첨가한 것이다.

시스템 적합성 : 분석물질 및 분석법 별로 사용된 시스템이 최적의 상태로 작동되고

있음을 입증하기 위한 해당 표준작업지침서(혹은 시료)가 있어야 한다.

시료 희석이 필요한 경우 유사한 생체시료를 사용함으로써 본 시험 도중 희석 시 사

용한 생체시료로 만든 품질관리 시료를 분석할 필요가 없도록 한다.

해설 및 예시

○ 분석기기의 분석물질과 내부표준물질에 대한 반응은 일정하고 재현성이 있어야 한

다. 그러므로 밸리데이션 시료 또는 시료를 분석하기 전에 시스템의 적합성을 확인하는

절차가 필요하다. 크로마토그래프법에 의한 분석에서는 유지시간(Retention Time), 피

크형태(Peak Shape), 기기반응(Response, 피크면적 또는 피크면적 비율) 등을 평가함

으로써 이를 확인할 수 있다. 이러한 평가요소들은 분석물질의 종류나 분석기기, 컬럼

등에 따라 일정 범위의 변동값을 나타내므로 그 평가 방법을 표준작업지침서 또는 시험

계획서에 규정하여야 한다. 기기의 상태를 확인할 수 있는 표준시료가 정해진 기기도

있다. 예를 들어 표준용액과 내부표준용액의 혼합용액이나 고농도 품질관리 시료를 반

복 측정하여 평가할 수 있다.

7) 2003년 “생체시료분석법 Validation”에서는 “1 회 이상”로 되어 있었으나, FDA CDER “Guidance for Industry :

Bioanalytical Method Validation” 원문상의 “either single or replicate”를 그대로 해석함.

8) 2003년 “생체시료분석법 Validation”에서는 “예비시험 Validation시와 실제 시험 Validation시”로 되어 있었으나,

FDA CDER “Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation” 원문상의 “prestudy validation and

routine run validation”을 좀 더 명확하게 해석함.

- 22 -

재분석 : 재분석과 적합 기준에 대한 표준작업지침서 혹은 지침을 설정하는 것이 중

요하다. 이 표준작업지침서 또는 지침에는 시료의 재분석 사유가 서술되어 있어야

한다. 재분석 사유로는 허가와 관련된 임상 혹은 전임상 시료의 재분석, 반복 분석

결과의 불일치, 정량범위를 벗어나는 시료, 시료 처리과정의 문제, 기기 고장, 좋지

않은 크로마토그램, 그리고 약물동력학적 결과의 불일치 등을 들 수 있다. 시료용량

이 충분하다면 재분석은 3 회 실시한다. 재분석에 대한 이론적 설명과 재분석에 대

한 보고는 명확하게 문서화되어야 한다.

시료 데이터의 재적분 : 시료 데이터의 재적분에 관한 표준작업지침서 혹은 지침이

확립되어야 한다. 이 표준작업지침서 혹은 지침은 재적분 사유 및 방법이 서술되어

있어야 한다. 재적분에 대한 이론적 설명은 명확하게 기술되고 문서화되어야 한다.

원래의 데이터와 재적분 데이터가 모두 보고되어야 한다.

해설 및 예시

○재분석, 재적분에 관해서는 합리적이고 객관적인 표준작업지침서를 마련한다.

○ 재분석 대상의 선별기준과 재분석의 시기 그리고 최초 분석과 재분석 중 어떤 분석

값을 사용할 것인가가 표준작업지침서에 규정되어 있어야 하며 재분석은 약동력학적

분석이나 통계분석 이전에 완료하는 것이 바람직하다.

○표준작업지침서에 재분석을 규정할 때에는 재분석 대상을 선정하는 기준과 함께 합

리적인 사유를 기재하는 것이 좋다. 또한 재분석을 실시한 경우에는 재분석을 실시한

사실과 그 사유 및 재분석한 시료의 내역을 결과보고서에 기재하고, 재분석 실시 사유

를 기재한 문서를 재분석 전에 작성하여 최초분석 결과 및 재분석 결과와 함께 시험기

초자료로 보관하는 것이 필요하다.

○ 반복분석의 반응 평균치를 이용하여 농도를 계산하는 반복분석법(Replicate

Analysis)에서도 반복분석 반응의 변동 값이 과도하게 크다면 재분석할 필요가 있다.

비록 반복분석 반응의 평균치를 사용한다 하더라도 밸리데이션에서 나타난 변동 값보

다 큰 변동값을 나타낸다면 밸리데이션에서 평가한 정밀성, 정확성을 신뢰할 수 없기

때문이다.

- 23 -

○ 검량선의 외삽은 허용되지 않으므로 최고정량한계를 초과하는 시료는 희석분석 하

여야 한다.

○시료 전처리과정의 문제는 주로 품질관리 시료의 역산농도 편차, 내부표준물질 피크

면적 등으로부터 인지할 수 있으며 그 방법과 기준은 표준작업지침서에 정할 수 있으나

기준의 합리성을 유지하는 것이 중요하다.

○기기의 고장에 의해 전처리시료가 주입되지 않았다면 기기의 문제를 해결한 후 조제

후 안정성이 확보된 기간 내에 재주입하여 분석하거나 또는 다른 분주시료를 처리하여

재분석할 수 있으며, 그 방법은 표준작업지침서에 명시되어 있어야 한다.

○ 좋지 않은 크로마토그램의 형태는 테일링(Tailing), 숄더(Shoulder), 갈라짐

(Splitting) 등 다양하게 나타날 수 있으나 그 정도에 따른 재분석 여부의 결정은 표준작

업지침서에 적절히 규정되어 있어야 한다.

○약동학적 불일치에 의한 재분석이란 분석과정의 문제를 발견할 수 없으나 개체 내의

농도-시간 프로필이나 군 평균에서 크게 벗어나는 시료의 재분석을 의미한다. 다른 사

유에 의한 재분석의 경우에는 분석과정의 문제가 발견되어 최초 분석 값을 신뢰할 수

없는 데 비해 약동력학적 불일치에 의한 재분석의 경우에는 분석과정의 문제를 발견할

수 없기 때문에 재분석의 실시 여부 결정은 신중히 고려해야 한다.

○재분석을 3회 실시하는 목적은 보다 정확한 값을 얻는 데 있다.

○재분석에서 주의할 점은 덮어쓰기(Over-write)는 허용되지 않으며 최초분석과 재분

석 결과가 모두 보고되어야 한다는 것이다.

- 24 -

5.1. 분석 과정의 적합 기준

다음과 같은 적합 기준이 분석과정의 적부 평가를 위해 고려되어야 한다.

표준원액의 안정성과 정확성이 확인된다면, 표준시료와 품질관리 시료는 동일한 표

준원액으로부터 조제할 수 있다. 또한 특이성이 확인된다면 한 가지 기원의 생체시료

를 사용해서 평가해도 된다.

검량선용 표준시료와 공시료, 품질관리 시료, 시험 시료가 시험하는 동안 적절하게

배치되도록 고안한다.

한 분석배치 내 표준시료와 품질관리 시료의 분석 순서는 시험하는 동안의 분석 동

향을 파악할 수 있도록 고안한다.

생체시료 내 검량선용 표준시료 : 검량선으로부터 역계산 했을 때 최저정량한계를

제외한 검량선용 표준시료의 75% 혹은 최소 6 가지 표준시료는 이론값의 ±15%이내

여야 하고(최고정량한계를 포함), 최저정량한계에서는 ±20%이어야 한다. 이러한 한

도를 벗어나는 값은 설정된 모델을 변경시키지 않는 한 제외할 수 있다.

“분석법 밸리데이션에 관한 특별 권장사항”에서 제시한 정확성과 정밀성의 적합 기

준은 일내 및 분석배치 내 시험 모두에 적용된다.

품질관리 시료 : 품질관리 시료는 최소 3가지 농도 (최저정량한계의 3배 정도 농도,

중간범위 농도, 최고정량한계 근처 농도)로 구성되며, 매 분석시마다 수차례 (최소 1

회) 이를 포함하여 분석해야 한다. 품질관리 시료의 분석 결과는 시험과정의 적부 평

가에 대한 근거가 된다. 품질관리 시료 중 최소 67% (6 개 중 4 개)가 예상되는 이론값

과 15%이내이어야 하고, 33%는 이론값의 ±15%를 벗어날 수 있다. 단, 동일 농도에서

두 시료 모두 벗어나서는 안 된다. 정확성과 정밀성을 평가하기 위해 신뢰구간을 이용

하는 것도 적절한 대체 방법이다.

품질관리 시료는 세 가지 농도가 한 세트로 구성되는데, 최소 품질관리 시료의 수는

미지 시료 수의 최소 5%이상 또는 총 6 개 중 많은 수9)이어야 한다.

여러 가지 분석물질이 포함된 시료에서 한 분석물질이 적합 기준에 부적합하다고

해서 부적합으로 평가되지는 않는다.

부적합한 시험으로부터 얻은 결과는 문서화할 필요는 없지만 그 분석이 부적합으로

평가된 사실과 그 부적합 사유는 보고되어야 한다.

9) 2003년 “생체시료분석법 Validation”에서는 “미지 검체 수의 최소 5%이거나, 총 6 개 이상”으로 되어 있었으나,

FDA CDER “Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation” 원문상의 “at least 5% of the number

of unknown samples or six total QCs, whichever is greater”를 그대로 해석함.

- 25 -

해설 및 예시

○분석배치는 해동에서 전처리까지 일괄 처리되어 같은 검량선을 사용하게 되는 시료

의 세트이다. 시험 시료 분석 시에는 검량선 시료와 적절한 수의 품질관리 시료를 같이

배치하여 수행한다. 이때 검량선용 표준시료, 품질관리 시료, 시험 시료, 품질관리 시료

와 같은 수순으로 배열하여 기지농도의 품질관리 시료(Known Sample)를 통해 미지시

료인 시험 시료(Unknown Sample)의 측정에 대해 신뢰할 수 있도록 설계한다.

○분석배치의 검량선은 밸리데이션에서 검증된 농도범위 및 기준을 적용한다. 검량선

은 양호한 상관관계계수(r 혹은 r2 값)을 가져야 한다. 검량선을 구성하는 각 표준시료의

측정값은 상대오차 (% RE) 로서 최저정량한계는 ± 20 % 이내, 그 이외에는 ± 15 % 이내

이어야 한다. 표준시료의 75%가 허용범위 내에 있어야 한다.

○품질관리 시료는 검량선 범위 내에서 저, 중, 고 3개 농도를 선정한 다음 배치의 전후

로 최소 3개씩 배치한다. 품질관리 시료의 적합기준은 당일 검량선의 회귀식으로 계산

하였을 때 이론값에 대한 편차가 ±15%이내이어야 한다. 품질관리 시료의 2/3이상이 적

합하여야 하고, 같은 농도에서 50%를 초과하여 부적합한 경우는 품질관리 시료의 2/3

가 적합이더라도 부적합한 것으로 판정10)한다.

○여러 가지 분석불질이 포함된 시료에서 한 분석물질이 적합 기준에 부적합하다고 해

서 부적합으로 평가되지는 않지만 동시정량의 경우에는 문제가 될 수 있으므로 이에 대

하여 타당한 사유를 보고해야 하며 내부에서 별도의 표준작업지침서를 마련하고 따라

야 한다.


EMEA, GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS (DRAFT), 2009

- 26 -

6. 서류

분석법의 타당성은 실험실적 연구를 통해 확립되고 증명되어야 하며, 그 연구의 성

공적 수행에 관한 문서는 분석법 밸리데이션 보고서의 형태로 제출되어야 한다. 공통

및 특정 표준작업지침서와 우수한 기록물 관리 작업은 분석법 밸리데이션 작업에 있

어 필수적인 부분이다. 생체시료 분석법 확립과정에서 발생된 결과 및 품질관리 시료

에 대한 결과는 문서화하여 데이터 감사나 실사 시 확인 가능해야 한다. 정부기관에

제출되는 문서에는 다음과 같은 사항들이 포함되어야 한다. (1) 요약 정보, (2) 분석법

개발과 확립, (3) 일상적 시료 분석에 사용된 모든 분석법의 생체시료 분석 결과, 그리

고 (4) 분석법 개발과 확립 또는 일상적 시료 분석에 적용되는 기타 정보

6.2. 분석법 확립에 관한 문서작성

분석법의 개발과 확립에 관한 문서에는 다음 사항이 포함되어야 한다.

분석법 작업 절차에 관한 기술

분석법 밸리데이션 실험에 사용한 약물 표준품 및 대사체 표준품, 내부표준물질의

6.1. 요약 정보

요약 정보에는 다음과 같은 사항을 포함해야 한다.

분석법 밸리데이션 및 부분적 재밸리데이션 보고서를 포함한 모든 밸리데이션 보고

서 요약표. 이 표는 연대순으로 기록하고 시험법 확인 코드, 시험 형태와 새로운 방법

혹은 부가 밸리데이션 (예. 최저정량한계를 낮추는 것)에 대한 사유를 포함시킨다.

프로토콜별로 사용된 시험법 목록이 기재된 요약표. 이 표에는 프로토콜의 수, 프로

토콜 제목, 시험 형태, 시험법 확인 코드와 생체시료분석 보고서 코드가 제시되어야

한다.

여러 가지 시험법 확인 코드를 상호 참조할 수 있도록 한 요약표. (예. 동일 시험법에

대해 시험방법, 밸리데이션 보고서, 생체시료분석보고서의 코드가 서로 다를 경우, 특

히 제조처와 그 용역 실험실이 동일 시험에 대해 서로 다른 코드를 부여하는 경우)

- 27 -

순도와 확인에 대한 입증 자료

안정성 연구에 관한 기술과 그 증빙 자료

정확성, 정밀성, 회수율, 특이성, 정량한계, 검량선 (방정식 및 사용된 경우 가중치 함

수 포함)을 평가하기 위해 수행된 실험에 관한 기술과 관련 결과

일내 및 일간 시험의 정확성과 정밀성에 관한 문서화

해당되는 경우, 명확하게 주석을 기재한 크로마토그램과 질량 스펙트로그램

표준작업지침서, 프로토콜, 혹은 GLP (해당되는 경우)에서 벗어난 경우 이탈 사항

및 정당화 방법

- 28 -

6.3. 일상적인 약물 분석에의 적용

밸리데이션된 생체시료분석법을 일상적 약물 분석에 적용 시 관련 문서에는 다음과

같은 사항 등이 포함되어야 한다.

일상적 분석을 수행하는 동안 사용한 약물 표준품, 대사체 표준품과 내부표준물질

의 순도와 확인에 관한 입증 자료

시료 전처리와 보관에 관한 정보를 포함한 요약표. 이 표에는 시료명, 채취일, 배송

전 보관, 배송 로트에 관한 정보와 분석전의 보관에 관한 사항이 포함되어야 한다. 이

러한 정보에는 날짜, 시간, 시료 조건과 프로토콜에서 벗어난 이탈 사항이 포함된다.

임상 혹은 전임상 시료 분석에 관한 요약표. 이 표에는 시험법명, 분석일자, 분석시

간, 시험법, 시험자, 시작과 종료시간, 기간, 장비 및 시료의 대변경, 그리고 확립된 분

석법의 잠재적 문제나 이탈 사항이 포함되도록 한다.

결과를 역계산하는데 사용한 등식

시료분석에 사용한 검량선 결과표와 검량선 요약결과

분석배치 시험 과정의 적부 평가 시 사용된 품질관리 시료의 일내/일간 분석값과

검량선으로부터의 일내/일간 정확성과 정밀성에 관한 데이터의 요약 정보. 기초자료

와 통계처리에 대한 요약뿐만 아니라 품질관리 그래프 및 추이 분석에 대해 기술하도

록 권장한다.

임상 혹은 전임상 시료의 분석 결과표. 이 표에는 시험법명, 시료명, 기초자료와 역

계산된 결과, 데이터 적분 확인 코드 또는 기타 보고서 확인 코드가 포함된다.

시료 분실 사유

재분석에 관한 문서화. 이 문서에는 초회 분석 결과와 재분석의 결과, 보고된 결과,

시험법명, 재분석 사유, 재분석 요청자, 그리고 재분석 승인자에 관한 내용이 포함되

어야 한다. 임상 혹은 전임상 시료의 재분석은 반드시 사전에 설정된 표준작업지침서

에 따라 수행되어야 한다.

데이터 재적분 데이터에 관한 문서화. 이 문서에는 초회 적분 결과 및 재적분 결과,

재적분시 사용된 방법, 보고된 결과, 시험법명, 재적분 사유, 재적분 요청자, 그리고 재

적분 승인자에 관한 내용이 포함되어야 한다. 임상 혹은 전임상 시료의 재적분은 반드

시 사전에 설정된 표준작업지침서에 따라 수행되어야 한다.

분석 프로토콜 혹은 표준작업지침서에서 이탈된 경우 그 사유 및 정당화 방법

- 29 -

6.4. 기타 정보

분석법 개발과 확립 또는 일상적인 시료 분석에 적용되는 기타 정보로는 다음과 같

은 사항이 포함된다.

약어 및 시료 조건 코드, 데이터 적분 코드, 보고서 코드 등을 포함한 기타 코드 목록

참고문헌 목록과 참고문헌 사본

다음과 같은 영역에 관련된 표준작업지침서 혹은 프로토콜

- 검량선용 표준시료의 적부 기준

- 검량선의 적부 기준

- 품질관리 시료와 시험의 적부 기준

- 시료를 2회 분석시 보고된 결과의 채택 기준

- 임상 혹은 전임상 시료 코드와 생체시료분석용 시료 코드를 포함한 시료 코드번호

부여 체계

- 배치 분석을 위한 임상 혹은 전임상 시료의 배정 방법

- 시료채취, 조작과정과 보관방법

- 시료의 재분석

- 시료의 재적분

- 30 -

Ⅲ. 용어해설

검량선 (Calibration Curve) : 실험적 반응 수치와 분석물질의 농도간의 상관관계

검량선용 표준시료 (Calibration Standard) : 기지 농도의 분석물질을 첨가한 생체시

료. 검량선용 표준시료는 검량선을 작성하는데 사용되고, 이 검량선으로부터 품질관리

시료 및 미지 시료 내 분석물질의 농도가 결정된다.

검출 한계 (Limit of Detection : LOD) : 생체시료분석법과정으로 배경 노이즈와 확실

하게 구분되어지는 분석물질의 최저 농도

내부표준물질 (Internal Standard) : 목표로 하는 분석물질의 정량을 돕기 위해 기지의

일정 농도로 검량선용 표준시료와 미지시료에 첨가하는 시험 물질 (예. 구조적으로 유

사한 유도체, 안정하다고 알려진 물질)

분석배치 (Analytical Run or Batch) : 밸리데이션을 위해 적절한 수의 검량선용 표준

시료와 품질관리 시료 및 분석 시료의 완전한 한 세트. 수 개의 배치가 하루에 분석될 수

도 있고, 한 배치가 수일에 걸쳐 분석될 수도 있으며 분석배치의 시료 (unknown

sample)는 해동에서 전처리까지 일괄 처리되어 같은 검량선을 사용하게 되는 시료의

세트이다.

분석법 밸리데이션 (Validation) :

전체 밸리데이션 (Full Validation) : 분석물질별로 생체시료분석법에 대한 시료 분석시

적용되는 모든 밸리데이션 파라메타들을 확립하는 경우 실시

부분 밸리데이션 (Partial Validation) : 이미 밸리데이션된 생체시료분석법에서 변형

되었지만 전체 재밸리데이션이 불필요한 경우 실시

분석물질 (Analyte) : 측정되는 특정 화학 물질로서, 생체시료 내 약물자체이거나 생분

자, 유도체, 대사체, 분해산물이 될 수 있다.

- 31 -

생체시료 (Biological Matrix) : 재현성이 있게 시료를 채취하여 전처리할 수 있는 생체

기원에서 분리된 물질. 예를 들면, 전혈이나 혈청, 혈장, 뇨, 변, 타액, 객담, 기타 다양한

분리 조직

생체시료영향 (Matrix Effect) : 시료 내 존재하는 분석하고자 의도하지 않은 분석물질

혹은 기타 방해인자로 인해 직․간접적으로 해당 반응이 변경되거나 방해받는 것

특이성 (Selectivity) : 존재할지도 모르는 구성성분 (대사체, 불순물, 분해산물 혹은 생

체시료 구성성분)의 존재 하에 분석물질을 측정하고 구별해내는 생체시료 분석법의 능

력

시료 (Sample) : 대조시료 (Control), 공시료 (Blank), 미지시료, 그리고 전처리시료 등

을 포함한 일반적인 용어

공시료 (Blank) : 분석시료를 가하지 않은 생물학적 모시료로서 생체시료분석법의 특

이성을 평가하는데 사용

미지시료 (Unknown) : 분석대상이 되는 생물학적 시료

품질관리 시료 (Quality Control Sample) : 생체시료에 분석물질을 첨가한 시료로서

생체시료분석법의 성능을 검사하고 각각의 분석배치에서 분석되는 미지시료 분석 결

과의 타당성 평가에 사용

전처리시료 (Processed Sample) : 다양한 기법 (예. 추출, 희석, 농축)으로 처리된 시료

로 기기분석 전의 최종 추출물

시스템 적합성 (System Suitability) : 분석 배치를 시험하기 전에 표준물질을 분석함

으로써 기기 성능 (예. 감도, 피크유지시간 등)을 평가

시험법 (Method) : 시료 분석에 사용한 모든 절차에 관한 포괄적인 기술

안정성 (Stability) : 주어진 기간동안 특정 조건하에서 주어진 생체시료 내 분석물질의

화학적 안정성

- 32 -

재현성 (Reproducibility) : 두 실험실간의 정밀성. 또한, 단기간동안 동일 조작 조건 하

에서의 시험법의 정밀성으로도 표현된다.

정량범위 (Quantification Range): 농도-반응 관계를 이용해서 정확도와 정밀도를 가

지고 신뢰성있고 재현성있게 정량할 수 있는 농도 범위로서 최고정량한계와 최저정량

한계를 포함한다.

정밀성 (Precision) : 설정된 조건 하에서 균질화된 동일 시료로부터 수차례 시료 채취

하여 얻은 분석 결과치 사이의 일치 정도 (분산정도)

정확성 (Accuracy) : 설정된 조건하에서 실측된 값이 이론값, 즉 이미 알고 있는 참값에

근접한 정도

최고정량한계 (Upper Limit of Quantification, ULOQ) : 정밀성과 정확성을 가지고

정량될 수 있는 시료 내 분석물질의 최고 농도

최저정량한계 (Lower Limit of Quantification, LLOQ) : 적합한 정밀성과 정확성으로

정량적으로 실측될 수 있는 시료 내 분석물질의 최저량

회수율 (Recovery) : 분석과정의 추출 효율로서 기지 량의 분석물질에 대해 해당 시험

법의 시료 추출과 처리 과정을 모두 거친 후 얻은 분석치의 기지량에 대한 퍼센트 (%)

- 33 -

Ⅳ. 참고문헌

1. Surendra Bansal et al., Key Elements of Bioanalytical Method Validation for Small

Molecules, The AAPS Journal, 9(1) Article 11, E109-E114 (2007)

2. Leslie Romanyshyn et al., Ultra-fast gradient vs. fast isocratic chromatography in

bioanalytical quantification by liquid chromatography/tamdem mass

spectrometry, Rapid Commun Mass Spectrum, 15, 313-319 (2001)

3. C.T. Viswanathan et al., Workshop/Conference Report - Quantitative

Bioanalytical Methods Validation and Implementation: Best Practices for

Chromatographic and Ligand Binding Assays, The AAPS Journal, 9(1) Article 4,

E30-E42 (2007)

4. B.K. Matuszewski et al., Strategies for the Assessment of Matrix Effect in

Quantitative Bioanalytical Methods Based on HPLC-MS/MS, Anal Chem, 75,

3019-3030 (2003)

5. Nicola C. Hughes et al., Determination of Carryover and Contamination for Mass

Spectrometry-Based Chromatographic Assays, The AAPS Journal, 9(3) Article 42,

E353-E360 (2007)

6. FDA, Guidance for Industry : Bioanalytical Method Validation (2001)

7. EMEA, GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS

(DRAFT) (2009)

8. ICH, VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND

METHODOLOGY Q2(R1) (2005)

9. ICH, NOTE FOR GUIDANCE ON GOOD CLINICAL PRACTICE (2005)

10. 식약청, 의약품 등 시험방법 밸리데이션에 대한 가이드라인 적용을 위한 해설서

(2008)

- 34 -

부록 1. 기타 밸리데이션 항목

이외에도 밸리데이션 시험항목으로는 생체시료효과 (Matrix Effect), 재주입재

현성 (Reinjection Reproducibility), 캐리오버 (Carry-over), 희석 (Dilution), 시스

템적합성 (System Suitability) 등이 있다.

○ 생체시료효과(Matrix effect)라 함은 생체시료 성분이 분석물질 또는 내부표준물질

의 반응에 영향을 미침으로써 생체시료 성분의 개체 간의 차이가 정량의 정확성, 정밀

성에 미치는 영향을 말한다. 생체시료효과 시험에서는 특정 개체의 생체시료 성분이 정

량의 정확성과 정밀성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 일반적으로 6개의 독립적 공

생체시료(6 Blank matrix from independent source)를 이용하여 조제한 1개 농도의 기

지농도 시료를 측정한다. 생체시료효과는 변동계수 15% 이내11)로서 평가할 수 있다.

생체시료효과는 대부분 시료처리 방법, 분석조건 변경 등을 통해 감소시킬 수 있다. 보

통, 다음의 식에 의해 계산할 수 있다.

생체시료효과(%) =× 100

B: 공시료를 추출한 후 분석표준물질을 첨가한 액의 반응, C: 추출하지 않은 분석표

준물질 용액의 반응

Figure 2. 생체시료효과에 대한 예시 크로마토그램: Precision of the assay determined in a single plasma

lot and in five different plasma lots using the ion spray interface. (Anal Chem, 75,3019-3030, 2003)


ICH, GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS (DRAFT), 2009

- 35 -

○재주입재현성(Reinjection Reproducibility)이라 함은 처리시료의 일정 조건, 일정 기

간 보관이 정량의 정확성, 정밀성에 미치는 영향을 말한다. 조제 후 안정성은 보관기간

동안의 농도 감소 정도를 의미하는 데 비하여 재주입 재현성은 검량선용 표준시료와 품

질관리 시료 또는 시료의 상대적 농도 변화의 차이를 의미한다. 즉, 검량선용 표준시료

와 품질관리 시료의 농도가 동일한 비율로 감소하였다면 재주입 측정값은 최초주입 측

정값과 동일할 것이므로 재주입재현성이 적합한 것으로 평가된다. 조제 후 안정성 시험

에서는 새로 조제한 검량선용 표준시료로부터 작성된 검량선을 이용하여 보관된 품질

관리 시료의 농도를 계산한다. 이와 달리 재주입 재현성 시험에서는 같이 보관된 검량

선용 표준시료로부터 작성된 검량선을 이용하여 보관된 품질관리 시료의 농도를 계산

한다12).

○캐리오버(Carry-over)라 함은 시료의 연속 측정 시, 직전에 주입된 시료로부터 분석

기기 내에 잔류된 분석물질 또는 내부표준물질이 다음 시료 주입 시에 나타내는 반응을

말한다. 캐리오버 시험에서는 최고정량한계 농도 검량선용 표준시료 또는 고농도 품질

관리 시료 주입 직후에 용매(Reagent Blank) 또는 공 생체시료(Blank Matrix) 처리시료

를 주입하여 분석물질 및 내부표준물질 반응을 측정한다. 캐리오버는 최저정량한계 피

크면적으로 20%이하13)로서 평가할 수 있다.

Figure 3. 캐리오버에 대한 예시 크로마토그램: Memory effect due to chromatographic peak tailing: (a)

ULOQ sample magnified to show peak tailing; (b) peak tailing from ULOQ (a) causes memory effect

in blank sample that follows; (c) modification of chromatographic conditions for ULOQ; (d) no

memory effect in blank that follows ULOQ (c). ULOQ indicates upper limit of quantitation. (The AAPS

Journal, 9(3) Article 42, E353-E360, 2007)



- 36 -

○ 희석(Dilution) 정량이라 함은 최고정량한계 농도를 초과하는 시료 또는 시료량이

부족한 시료를 동일한 공 생체시료로 희석한 후 희석 과정의 오차가 포함된 정량의 정

확성, 정밀성 측정을 말한다. 최고정량한계 초과시료(Over-the-curve Sample)의 희석

정량에서는 적절한 배수의 희석정량용 품질관리 시료를 조제하고 공 생체시료로 동일

한 배수로 희석하여 정량한 후 희석배수를 곱하여 농도를 계산한다. 희석정량은 정확성

은 상대오차 ±15%이내, 정밀성은 변동계수 ±15%이내14)로서 평가할 수 있다.

○ 분석기기의 분석물질과 내부표준물질에 대한 반응은 일정하고 재현성이 있어야 한

다. 그러므로 밸리데이션 시료 또는 시료를 분석하기 전에 시스템의 적합성을 확인하는

절차가 필요하다. 크로마토그래프법에 의한 분석에서는 유지시간(Retention Time), 피

크형태(Peak Shape), 기기반응(Response, 피크면적 또는 피크면적 비율) 등을 평가함

으로써 이를 확인할 수 있다. 이러한 평가요소들은 분석물질의 종류나 분석기기, 컬럼

등에 따라 일정 범위의 변동값을 나타내므로 그 평가 방법을 표준작업지침서 또는 시험

계획서에 규정하여야 한다. 기기의 상태를 확인할 수 있는 표준시료가 정해진 기기도

있다. 예를 들어 표준용액과 내부표준용액의 혼합용액이나 고농도 품질관리 시료를 반

복 측정하여 평가할 수 있다.

○기기 고장인 경우 분석배치를 재분석할 것인지를 결정하기 위해서 재주입시의 재현

성을 평가한다.

○ 표준 검량선의 최고정량한계 이상의 농도를 희석하는 기술은 분석법 밸리데이션에

있어서 정확성과 정밀성에 의해 증명된다.

14) EMEA, GUIDELINE ON VALIDATION OF BIOANALYTICAL METHODS (DRAFT), 2009

The AAPS Journal, 9(1) Article 11, E109-E114, 2007

- 37 -

부록 2는 부분 밸리데이션 시 요구되는 시험항목을 좀 더 구체화하여 합리적으로

마련한 것입니다.

이는 권고사항으로서, 시험기관에서 분석 시 활용하기 쉽도록 제시하는 것이며

반드시 요구하는 것은 아닙니다. 각 항목에 대해 타당한 사유가 있을 경우 권고

사항과 다르게 수행할 수 있습니다.

변경 항목특이성

직선성

일내a

일간a

감도

회수율

안정성

비고

1. 절차

시약 :

1. 재용해 용매 변경 ○ ○ △ △ × ○ ○

2. 재용해 용매량 변경 ○ ○ △ △ ○ ○ ×

3. 표준원액 제조 시 사용된 용매 변경 × × × × × × ○

4. 상용 표준액 조제 시 사용 용매 변경 ○ ○ △ △ × × ○

5. 내부표준액의 농도나 첨가량 변경 ○ ○ △ △ × × ×

6. 시약 조제 방법 변경 × × × × × × ×

7. 고체상 추출카트리지의 활성화액, 세척액, 용출

액의 변경○ ○ △ △ ○ ○ ○

8. 단백침전 과정에 첨가되는 시약 ○ ○ △ △ ○ ○ ○

9. 액상추출과정에 첨가되는 용매 및 시약의 변경 ○ ○ △ △ ○ ○ ○

10. 유도체화 시약의 변경 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ×

방법 :

1. 질소 증발 건고 방법 변경 × × × × × × ×

2. 질소와 진공 증발건고 방법간의 변경 ○ ○ △ △ × × ×

3. 증발 건고 온도 변경 ○ ○ △ △ × × ×

4. 혼합 방법 변경 (흔듦, 진탕혼합, 회전 등) ○ ○ △ △ × × ×

5. 상분리를 위한 원심분리 용기 또는 가속도

(설정치의 이내)× × × × × × ×

6. 상분리를 위한 원심분리 용기 또는 가속도

(설정치의 미만 )○ ○ △ △ × × ×

7. 원심분리 온도 (설정치의 이내) × × × × × × ×

8. 원심분리 온도 (설정치의 미만) ○ ○ △ △ × × ×

- 38 -

부록 2. 분석법 변경시 요구되는 밸리데이션 시험 항목 예시

○ 전체 밸리데이션되어 있는 분석법을 부분적으로 변경하는 경우 부분 밸리데이션을

한 후 시료분석에 적용할 수 있다. 이때, 부분 밸리데이션 수준 및 평가결과의 타당성을

검토하여야 한다.

9. 고체상 추출카트리지의 용출 방법 변경 ○ ○ △ △ × × ×

10. 액-액 추출법(LLE) 추출 용매의 변경 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

11. 유도화제를 중성화하거나 제거 ○ ○ △ △ × × ×

12. 수동 및 자동 절차간의 변경 ○ ○ △ △ × × ×

13. 추출 전 시료의 원심분리 추가 ○ ○ △ △ × × ×

14. 주입 전 추출액을 원심분리하거나 여과하는 과

정 추가○ ○ △ △ × × ×

15. 액상 추출 (액체-액체)과 고체상 추출 간의 변경 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

시간 :

1. 증발 건고 시간 ○ ○ △ △ × × ×

2. 추출 (혼합) 시간 ○ ○ △ △ × ○ ×

3. 원심분리 시간 ○ ○ △ △ × × ×

a. 일내 /일간 시험의 정확성 및 정밀성으로 ○: 5 배치,△: 3 배치*○: 평가 항목, ×: 면제 항목

- 39 -

해설 및 예시

○여기서 ‘절차’는 생체시료의 전처리 과정을 뜻한다.

○여기서 ‘시약’은 전처리에 사용되는 시약을 뜻하며, 표준원액 제조 시 사용되는 용매도 포함된다. ‘방법’은 추출을

위한 혼합, 상 분리를 위한 원심분리 등 전처리의 방법을 뜻한다. ‘시간’은 전처리 중 증발 건고 시간, 추출(혼합)시간

등을 뜻한다.

○ ‘시약’ 중

1) ‘1. 재용해 용매 변경’은 증발건고 후 잔사의 재용해에 사용하는 용매의 변경을 뜻한다.

시험항목 : 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 회수율, 조제 후 안정성

‘ 재용해 용매 변경’은 증발건고 후 잔사의 재용해에 사용하는 용매의 변경을 뜻한다. 재용해 용매는 회수율의 재현

성, 조제 후 안정성, 공시료 크로마토그램, 피크 모양, MS 검출기의 경우 검출기의 반응성 변화에 의한 직선성, 정확

성, 정밀성에 영향을 줄 수 있다.

2) ‘2. 재용해 용매량 변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도, 회수율

재용해 용매량의 변경은 회수율의 재현성, 공시료 크로마토그램에 영향을 줄 수 있으며 주입량이 동일한 경우 선택

성과 감도에 영향을 줄 수 있으므로 선택성, 감도, 회수율의 재현성 시험이 필요하다. 주입량이 다른 경우 피크 모양,

MS 검출기의 경우 검출기의 반응성 변화에 의한 직선성, 정확성, 정밀성에 영향을 줄 수 있다. 주입량 변경의 경우

는 2. 시스템-기기 5에서 예시하고 있다.

- 40 -

3) ‘3. 표준원액 조제 시 사용된 용매 변경’

시험 항목 : 표준원액의 실온 안정성, 장기 냉장 안정성

표준원액이 검량선용 표준시료의 조제에 직접 사용되는 경우에는 1. 절차-시약 4. 상용 표준액의 용매 변경의 예시에

따라야 한다. 반면 표준원액이 검량선용 표준시료의 조제에 직접 사용되지 않는 경우에는 표준원액의 실온 안정성

과 장기 냉장 안정성 시험이 필요하다.

4) ‘4. 상용 표준액 조제 시 사용 용매 변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 안정성 (표준원액 안정성 시험으로 대체 가능)

공 생체시료에 소량(통상 1.0% 이하)의 상용 표준액을 가하여 검량선용 표준시료를 조제하였다면 생체시료의 성질

이 유지되었다고 간주할 수 있다. 그러나 5~10%의 상용 표준액을 가하여 조제하였다면 검량선용 표준시료와 시료

의 성질이 동일하다고 보기 어려우며, 이 경우 상용 표준액 용매의 변경은 선택성, 직선성, 정밀성, 정확성에 영향을

줄 수 있다. 상용 표준액의 용매가 표준원액의 용매와 동일한 경우 표준용액 실온 안정성, 장기 냉장 안정성 시험은

표준원액 실온 안정성, 장기 냉장 안정성 시험으로 대체할 수 있다.

5) ‘6 시약 조제 방법 변경’은 암실조건, 조제실 온도, 습도 등 주변 환경의 변경을 뜻한다.

6) ‘ 7. 고체상 추출카트리지의 활성화액, 세척액, 용출액의 변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성 , 감도, 회수율, (조제 후 안정성)

생체시료의 고체상 추출카트리지의 활성화액, 세척액, 용출액의 변경은 선택성, 감도, 회수율, 직선성, 정확성, 정밀

성에 영향을 줄 수 있다. 특히 용출액을 직접 주입하는 경우에는 조제 후 안정성도 확인되어야 한다. 다만 용출액을

건고하여 재용해하는 방법에서 건고 시 잔류되는 성분이 용출액에 첨가되지 않았다면 조제 후 안정성은 불필요하

다.

7) ‘8. 단백침전 과정에 첨가되는 시약 ’

시험항목 : 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도, 회수율, (조제 후 안정성)

생체시료의 단백침전 과정에서 첨가되는 시약의 변경은 선택성, 감도, 회수율, 직선성, 정확성, 정밀성 및 조제 후 안

정성에 영향을 줄 수 있다. 그러므로 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도, 회수율, 조제 후 안정성 시험

이 필요하다. 다만, 단백침전 상등액을 건고하여 재용해하는 방법에서 건고 시 잔류되는 성분이 첨가되지 않았다면

조제 후 안정성은 불필요하다.

8) ‘9. 액상추출 과정에 첨가되는 용매 및 시약의 변경’


생체시료의 액상추출 과정에서 첨가되는 시약의 변경은 선택성, 감도, 회수율, 직선성, 정확성, 정밀성 및 조제 후 안

정성에 영향을 줄 수 있다. 그러므로 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도, 회수율, 조제 후 안정성 시험

이 필요하다. 다만, 건고하여 재용해하는 방법에서 건고 시 잔류되는 성분이 첨가되지 않았다면 조제 후 안정성은 불

필요하다.

- 41 -

9) ‘10. 유도체화 시약의 변경 ’


유도체화 방법에서 유도체화 시약의 변경은 안정성을 제외한 모든 시험 항목에 영향을 줄 수 있으므로 안정성을 제

외한 전체 밸리데이션이 필요하다.

○ ‘방법’ 중

1) '1. 질소 증발 건고 방법 변경‘은 건고시간, 질소기류의 양의 변경을 뜻한다.

2) ‘6. 상 분리를 위한 원심분리 용기 또는 가속도 ’

시험 항목: 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성

원심분리의 가속도 범위를 벗어나거나 (가령, 설정치의 80% 미만) 모양이나 직경이 다른 용기를 사용하는 경우에는

동일한 가속도가 주어진다 하더라도 상 분리 정도가 동일하다고 볼 수 없으므로 원심분리 용기의 변경에는 특이성,

직선성, 정확성, 정밀성의 시험이 필요하다.

3) ‘10. 액-액 추출법 (LLE) 추출용매의 변경’

시험 항목: 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도, 회수율, 안정성

4) ‘15. 액상 추출(액체-액체)과 고체상 추출 간의 변경’

시험 항목: 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 회수율, 감도, 조제 후 안정성

추출 방법의 변경은 안정성을 제외한 모든 시험 항목에 영향을 줄 수 있으므로 안정성을 제외한(단, 조제 후 안정성

은 포함) 전체 밸리데이션이 필요하다.

○ ‘시간’ 중

1) '2. 추출 (혼합) 시간‘

시험 항목: 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 회수율(회수율이 동등하지 않을 경우 안정성을 제외한 전

체 밸리데이션이 필요)

추출 시간의 변경은 분석물질과 내부표준물질의 회수율에 영향을 줄 가능성이 크다. 회수율이 최초 밸리데이션 시

와 동등하지 않다면 추출은 평형에 도달하지 않았다고 볼 수 있으므로, 만일 변경 전의 추출률이 크다면 변경 전의

추출시간을 사용하여야 하며 변경 후의 추출률이 크다면 안정성을 제외한 전체 밸리데이션이 필요하다.

변경 항목

특

이

성

직

선

성

일

내a

일

간a

감

도

회

수

율

안

정

성

비고

2. 시스템

기기 :

1. 검출기 변경 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

2. 분석기기 변경 (예. LC에서 GC로의 변경) ○ ○ ○ ○ ○ × ×

3. 측정 파라메타 변경 ○ ○ △ △ ○ × ×

4. 기기 변경 ○ ○ △ △ ○ ○ ×

5. 주입량 변경 ○ ○ △ △ ○ × ×

6. 실린지 세척액 변경 시스템

적합성 평가

7. 주입포트 라이너/처리/Septum 시스템

적합성 평가

8. 분석 시간 변경 ○ ○ △ × × × ×

컬럼 :

1. 이동상변경(예. 조성 또는 비율) ○ ○ △ △ ○ ○ ×

2. 캐리어가스 변경 ○ ○ △ △ ○ × ×

3. 컬럼 온도나 온도 램프 파라메타의 변경 ○ ○ △ × ○ × ×

4. 컬럼 충전물 변경 또는 동일 형태의 컬럼의 제조

처 변경○ ○ ○ ○ ○ ○ ×

5. 컬럼 직경 또는 길이의 변경 ○ ○ △ × ○ × ×

6. 입자크기 변경 ○ ○ △ △ ○ ○ ×

7. 필름두께 변경 ○ ○ △ × ○ × ×

데이터 처리 (인식) :

1. 질량분석기에 대한 데이터인식 파라메타 변경 ○ ○ △ △ ○ × ×

2. 크로마토그래프법에 대한 데이터인식 파라메타

변경재계산

3. 데이터처리 하드웨어나 소프트웨어 변경 재계산

a. 일내 /일간 시험의 정확성 및 정밀성으로 ○: 5 배치,△: 3 배치

*○: 평가 항목, ×: 면제 항목

- 42 - - 43 -

해설 및 예시

○ ‘시스템’ 중

1) 분석물질의 시료 내 회수율과 안정성 부분은 시스템의 변경에 따라 변화하는 항목이 아니므로 (물질의 특성) 전처

리법이 동일한 경우 시스템 변경부분에서는 생략될 수 있다.

2) ‘1. 검출기 변경’

검출기가 변경되면 특이성, 감도, 직선성, 범위 등에 영향을 미치므로 이에 대한 평가를 다시 해야 한다.

3) ‘2. 분석기기 변경 (예. LC에서 GC로의 변경)’

시험항목: 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도(LOD, LOQ)

시료의 모든 전처리 등의 방법이 동일 할 경우, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 감도(LOD, LOQ), 범위에 영향을 미

치므로 이에 대한 평가를 다시 해야 한다. 다만 회수율과 안정성은 시료 자체에 대한 기본적인 문제이므로 생략될 수

있다.

4) ‘3. 측정 파라메타 변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도(LOD, LOQ)

예를 들어, 검출 조건, 피크인식 조건, 분무가스 온도, 유량 등 기기 설정 변경이 있을 경우 전 항목(특이성, 직선성, 일

내/일간 정확성 및 정밀성, 감도(LOD, LOQ), 범위)에 영향을 미치므로 재 밸리데이션 해야 한다. 다만 회수율과 안

정성은 시료 자체에 대한 기본적인 문제이므로 생략될 수 있으며 Mass 이온의 소수점 자리 변경 등과 같은 기기 상

태에 의한 변경 항목은 직선성과 적합성을 확인함으로 평가할 수 있다.

5) ‘ 4. 기기 변경’

시험항목: 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 회수율, 감도

기기에 따라 동일한 제조업체일지라도 타 모델은 물론, 동일한 모델에서 감도 등이 달라지므로 안정성을 제외한 밸

리데이션 전 항목을 재평가하여야 한다.

6) ‘5. 주입량 변경’

시험항목: 특이성, 직선성, 감도, 일내/일간 정확성 및 정밀성

주입량을 변경할 시에 피크형태가 완전히 달라지므로 감도, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 범위, 선택성 등에 영향을

끼칠 수 있다. 따라서 주입량 변경의 경우 안정성과 회수율을 제외한 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성,

감도를 시험해야 한다.

7) ‘ 6. 실린지 세척액 변경’

이 경우는 변경된 세척액이 제대로 작용을 하는 지만을 평가하면 된다. 즉, 범위 중 가장 높은 농도를 주입하여 분석

한 후 변경된 세척방법으로 실린지를 세척하여 세척 정도를 변경 전과 변경 후에 대하여 비교 평가한다. ‘실린지 세

척액 변경’은 시스템 적합성 평가에 해당함.

- 44 -

8) ‘8. 분석 시간 변경’

시험 항목: 선택성, 특이성, 직선성, 일내 정확성 및 정밀성

분석시간을 줄이는 경우 미처 용출 되지 않은 성분이 다음 분석 시 겹쳐 나올 수 있고 분석 시간을 늘리는 경우 뒤에

있는 피크가 앞에 있는 피크와 겹쳐 나올 수 있다. 따라서 분석 시간 변경 시 선택성, 특이성, 직선성, 일내 정확성 및

정밀성을 시험해야 한다. 이때 품질관리 시료를 여러 번 반복 주입하여 확인해야 한다.

○ ‘컬럼’ 중

1) ‘1. 이동상변경(예. 조성 또는 비율)’

시험항목: 특이성, 직선성, 감도, 회수율, 일내/일간 정확성 및 정밀성

이동상의 조성 또는 비율 변경 시 안정성을 제외한 전체 밸리데이션을 수행한다. 마이너 용매의 양은 상대비로서 ±

30 %, 절대비로서 ± 2 % 중 더 큰 범위까지 조정할 수 있으며, 용매의 모든 조정은 전체 이동상에 대한 절대비로서 ±

10 %를 초과할 수 없다.

2) ‘2. 캐리어가스 변경’

시험 항목: 특이성, 직선성, 감도, 일내/일간 정확성 및 정밀성

캐리어가스의 종류를 변경하면 특이성, 감도(LOD, LOQ), 범위에 대해 영향을 미칠 수 있으므로 이에 대한 재평가를

해야 한다.

3) ‘3. 컬럼 온도나 온도 램프 파라메타의 변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 감도, 일내 정확성 및 정밀성

± 10% 이내에서 필요에 따라 변경 가능하고 이 범위를 벗어나면 특이성, 감도(LOD, LOQ), 범위 등에 대해 재평가를

해야 한다.

4) ‘4. 컬럼 충전물 변경 또는 동일 형태의 컬럼의 제조처 변경’

시험항목 : 특이성, 회수율, 직선성, 감도, 일내/일간 정확성 및 정밀성

컬럼 충전물의 입자 크기 또는 관능기가 다르거나 동일 형태의 컬럼의 제조처가 변경되는 경우 방법 전체에 대해 재

검토가 이루어져야 하므로 안정성을 제외한 전체 밸리데이션 시험이 요구된다.

5) ‘ 5. 컬럼 직경 또는 길이변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 감도, 일내 정확성 및 정밀성 시험

컬럼의 길이가 변경 되면 피크유지시간이 달라지고 컬럼 직경이 변경되면 분리능이 감소될 수 있으므로 선속도를

조절해야 한다. 따라서 특이성, 직선성, 감도 일내 정확성 및 정밀성 시험이 요구된다.

6) ‘6. 입자크기 변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 감도 , 회수율, 일내/일간 정확성 및 정밀성

최대한 50 %까지 축소가능하고, 증가는 허용되지 않는다.

7) ‘7. 필름두께 변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 일내 정확성 및 정밀성, 감도

GC의 경우, 필름두께가 두꺼워지면 피크의 형태가 넓어지며 감도가 떨어지므로 특이성, 직선성, 일내 정확성 및 정

밀성, 감도시험을 수행하여야 한다.

- 45 -

○ ‘데이터 처리(인식)’ 중

1) ‘1. 질량분석기에 대한 데이터인식 파라메타 변경’

시험항목: 특이성, 직선성, 일내/일간 시험의 정확성 및 정밀성, 감도

데이터 인식 파라메타란, 시그널을 얻을 때까지의 파라메타 또는 측정 파라미터를 의미한다. 특이성, 직선성, 정확

성, 정밀성, 감도(LOD, LOQ), 범위 등의 항목에 영향을 미칠 수 있으므로 이에 대한 재평가를 한다.

2) ‘2. 크로마토그래프법에 대한 데이터인식 파라메타 변경’

적분법, 면적-높이 데이터 처리방법의 변경과 같은 재계산을 의미한다. (밸리데이션 세트와 실제 시료 세트에 있어

피크유지시간, 대사체의 존재 유무 등의 이유로 적분법을 변화 시켜야하는 경우) 변경 사유를 문서화 하고 실험 후라

면 데이터를 재처리하여 재계산한다. 단, 변경된 파라메타는 분석 전 과정에 걸쳐서 동일하게 적용 되어야 한다.

3) ‘3. 데이터처리 하드웨어나 소프트웨어 변경’

하드웨어의 변경은 상관없으나 (단, 소프트웨어의 정상 설치 및 작동을 확인) 소프트웨어의 변경(Version Upgrade)

은 데이터인식 파라메타의 변경과 같은 것으로 변경 사유를 문서화 하고 실험 후라면 데이터를 재처리하여 재계산

한다. 단, 변경된 파라메타는 분석 전 과정에 걸쳐서 동일하게 적용 되어야 한다.

변경 항목

특

이

성

직

선

성

일

내a

일

간a

감

도

회

수

율

안

정

성

비고

3. 규격

1. 칼리브레이션 범위 변경

i) 범위 확대 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

ii) 범위 축소○

시스템

적합성 평가

2. 회귀분석법 변경 재계산

3. 내부표준물질-외부표준물질 상호간 변경 재계산

4. 면적-높이 상호간 변경 재계산

5. 다분석대상물질-단독분석대상물질 상호간 변경 × × × × × × ×

6. 환경요소 (빛, 온도 등) × × × × × × ○



- 46 -

해설 및 예시

○ ‘규격’ 중

1) ‘1. 칼리브레이션 범위 변경’

시험항목 : 범위를 확대하는 경우 - 전체 밸리데이션

범위를 축소하는 경우 - 직선성, 적합성

범위를 확대하는 경우에는 전체 밸리데이션을 해야 하지만 범위를 축소하는 경우는 직선성과 적합성을 확인함으로

서 평가할 수 있다. 가령, 혈액 중 약물 농도를 측정할 때 시험 범위를 넓게 설정한 다음 범위를 점점 줄여서 측정한다

면 이 경우를 범위 축소의 예로 들 수 있다.

2) ‘2. 회귀분석법 변경’

회귀분석모델(예. 가중치)를 변경 할 경우, 재계산 하여 재평가를 실시한다.

3) ‘5. 다분석대상물질-단독분석대상물질 상호간 변경’

다분석대상물질에서 단독분석대상물질로 변경할 때에는 별도의 밸리데이션이 필요하지 않다.

변경 항목

특

이

성

직

선

성

일

내a

일

간a

감

도

회

수

율

안

정

성

비고

4. 생체시료

기원 :

1. 공급업체 변경 시료

스크리닝

2. 종 변경 (예. 사람에서 랫트) ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

3. 형태 변경 (혈장, 혈청, 뇨 등) ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

4. 유사생체시료 변경 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

처리 :

1. 보존제 변경 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

2. 항혈액응고제 변경 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

3. 항혈액응고제에 대한 카운터 이온 변경

(헤파린나트륨에서 헤파린리튬)× × × × × × ×

4. 채취 방법 변경 × × × × × × ×

5. 채취 용기 변경 × × × × × × ×

6. 보관 용기 변경 × × × × × × ×

7. 보관 온도를 높게 변경 × × × × × × ○

8. 보관 온도를 낮게 변경 × × × × × × ×

9. 열처리 × × × × × × ○



- 47 -

해설 및 예시

○ ‘기원’ 중

1) ‘ 2. 종변경(예. 사람에서 랫트)

시험항목 : 특이성, 회수율, 직선성, 감도, 안정성, 일내/일간 정확성 및 정밀성

예를 들면, 시험 종이 랫트에서 사람으로 변경 될 경우, 혈중 약물의 농도 범위가 크게 달라지므로(동물의 혈중 농도

가 사람의 혈중 농도 보다 상대적으로 높음) 검량선 범위 변경이 생길 수 있으며, 생체시료효과가 발생하므로 전체

밸리데이션이 요구된다.

변경 항목

특

이

성

직

선

성

일

내a

일

간a

감

도

회

수

율

안

정

성

비고

5. 시약 및 재료

1. 시약 제조처 변경 × × × × × × ×

2. 시약 등급 품질의 상향 변경 × × × × × × ×

3. 시약 등급 품질의 하향 변경 ○ ○ △ △ × × ×

4. 내부표준물질 변경 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○

5. 표준물질의 제조원 변경 ○ ○ △ △ × × × 간섭시험

6. 시험법에 사용된 마개의 변경 (플러그 대 스크류) × × × × × × ×

7. 튜브 구성성분의 변경 (플라스틱 대 유리) ○ ○ △ △ × × ×

8. 초자류 관리방법 변경 ○ ○ △ △ × × ×

9. 고체상추출카트리지 (SPC)의 로트번호 변경 × × × × × × ×

10. 고체상추출카트리지의 제조처 변경 ○ ○ △ △ × × ×

11. 고체상추출카트리지의 정지상 변경 ○ ○ △ △ × × ×

12. 고체상추출카트리지에 충전물질의 양 변경 ○ ○ △ △ × × ×

- 로딩 가능한 시료(혈장, 혈청, 뇨 등)의 양 변경인 경

우○ ○ ○ ○ ○ ○ ○



- 48 -

2) ‘3. 형태 변경(혈장, 혈청, 뇨 등)’

시험항목: 특이성, 회수율, 직선성, 감도, 안정성, 일내/일간 정확성 및 정밀성

같은 물질을 분석하더라도 생체시료의 형태(혈장, 혈청, 뇨 등)에 따라 전처리 방법이 달라지는 경우가 많다(혈장의

경우에는 재단백, 뇨의 경우에는 LLE). 따라서 전체 밸리데이션이 요구된다.

3) ‘ 4. 유사생체시료 변경’

시험 항목 : 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도, 회수율, 안정성

‘유사생체 시료의 변경‘이라 함은 밸리데이션을 수행하기에 충분한 시료를 얻을 수 없는 경우 이를 대신할 만한 다른

형태의 생체시료를 이용함을 뜻한다. 예를 들면 신장 투석 액에서 약물 농도를 구하고자 할 때 시료의 양이 부족하므

로 혈액이 그와 동일하다는 가정 하에 혈액 내에서 약물 농도를 구할 수 있다. 유사 생체 시료로 변경하는 경우, 생체

시료 내에서의 안정성, 생체시료효과 등이 다르게 나타나 분석법에 영향을 줄 수 있으므로 전체 밸리데이션을 수행

해야 한다.

○ ‘처리‘ 중 ’1. 보존제 변경‘ 과 ’2. 항혈액 응고제 변경‘에 대해서는 생체시료 형태 변경에 준한 밸리데이션을 수행

하는 것이 바람직하다.

- 49 -

해설 및 예시

○ 5. 시약 및 재료 중

1) '4. 내부표준물질 변경'

시험항목: 특이성, 직선성, 일내/일간 정확성 및 정밀성, 감도, 회수율, (내부표준물질의 안정성)

내부표준물질 변경은 내부표준물질의 농도 변경 또는 내부표준물질 종류의 변경을 의미한다. 전자의 경우 특이성,

직선성, 정확성, 정밀성, 감도, 회수율 시험이 요구되며 후자의 경우에는 추가적으로 내부표준물질의 안정성 시험이

요구된다.

2) ‘5. 표준물질의 제조원 변경’

표준물질의 제조원 변경 시에는 순도, 염 등이 바뀔 수 있으므로 간섭시험이 포함되어야한다. 간섭시험이란, 분석물

질이 피크유지시간에서 내부표준 물질 및 기타 혈장성분들과 잘 분리되며, 간섭물질의 영향을 받지 않음을 확인하

는 시험을 말한다.

3) ‘7. 튜브 구성성분의 변경(플라스틱 대 유리)’

여기서 튜브라 함은 시료와 직접 접촉하는 용기를 말한다.

4) '11. 고체상추출카트리지의 정지상 변경'

시험항목: 특이성, 직선성, 일내/일간 시험의 정확성 및 정밀성

이 경우 분석물질의 안정성 등에 관한 시험은 따로 요구되지 않으며 특이성, 직선성, 일내/일간 시험의 정확성 및 정

밀성 시험이 요구된다.

5) ‘12. 고체상추출카트리지에 충전물질의 양 변경’

시험항목 : 특이성, 직선성, 일내/일간 시험의 정확성 및 정밀성

이 경우 분석물질의 안정성 등에 관한 시험은 따로 요구되지 않으며 특이성, 직선성, 일내/일간 시험의 정확성 및 정

밀성 시험이 요구된다. 그러나 로딩 가능한 시료(혈장, 혈청, 뇨 등)의 양 변경을 의미하는 경우에는 전체 밸리데이션

이 요구된다.

- 50 -

번호 행정간행물 제목 발행

연도 행정간행물번호 발행부서

1의약품 잔류용매기준

가이드라인2003

-(의약품평가지침 1)

의약품안전국

2 의약품 명명법 가이드라인 2003-

(의약품평가지침 2)의약품본부

(의약품규격팀)

3의약품등 분석법의

밸리데이션에 대한 가이드라인2004

11-1470000-000519-14(의약품평가지침 3)

의약품본부(마약신경계의약품팀)

4마약류진단키트의 기준 및 시험방법 작성 가이드라인

200411-1470000-000533-14


(마약신경계의약품팀)

5경구용의약품의 용출규격

설정 가이드라인2005

11-1470000-000843-14(의약품평가지침 5)


6의약품의 성상표기에 대한 가

이드라인2006

11-1470000-0000929-01(의약품평가지침 6)


7피임제에 대한

임상시험평가지침2006


의약품본부(기관계용의약품팀)

8호르몬대체요법제에 대한




9 가교시험 질의 및 응답 2006-


(기관계용의약품팀)

10 체중조절약의 임상평가지침 2006-


(기관계용의약품팀)

11 항암제 임상시험평가지침 2006-


(항생항암의약품팀)

12우울증치료제에 대한 임상시험평가지침

200611-1470000-001230-01(의약품평가지침 12)


13알츠하이머형 치매 치료제에

대한 임상시험평가지침 2007

11-1470000-001231-01(의약품평가지침 13)


14간질치료제에 대한 임상시험평가지침

200711-1470000-001232-01(의약품평가지침 14)


15범불안장애치료제에 대한


11-1470000-001233-01(의약품평가지침 15)


16서방성진통제 개발 및 심사에 대한 질의응답집

200711-1470000-001422-01(의약품평가지침 16)


의약품평가지침 간행물 목록

- 51 -

17 서방성진통제 평가가이드라인 200711-1470000-001423-01(의약품평가지침 17)


18 의약품첨가제 평가가이드라인 200711-1470000-001424-01(의약품평가지침 18)


19의약품 국제공통기술문서 작성 가

이드라인-III.품질2007

11-1470000-001430-01(의약품평가지침 19)

의약품본부생물의약품본부


20소아를대상으로 하는 임상시험

평가지침2007



21경구용 혈당강하제에 대한

임상시험 평가지침 2007



22임상시험에 사용되는 의약품의

품질평가가이드라인2007



23소아용의약품의 비임상 안전성

평가지침2007

11-1470000-001606-01(의약품평가지침 23)

의약품본부국립독성과학원


24 고지혈증치료제에 대한 임상시험 평가지침 2007

11-1470000-001612-01(의약품평가지침 24)

의약품본부(의약품규격팀)

25 2007 의약품우수심사기준 200711-1470000-001631-01


(의약품규격팀)

26항생제에 대한


11-1470000-001636-01(의약품평가지침 26)

의약품본부(항생항암의약품팀)

27의약품등의

안전성․유효성심사에 관한 규정 해설서

200711-1470000-001637-01(의약품평가지침 27)

의약품본부(항생항암의약품팀)

28정신분열병치료제에 대한


11-1470000-001644-01(의약품평가지침 28)

의약품안전국(마약신경계의약품과)

29폐경후여성 골다공증의 예방

및 치료제에 대한 임상시험평가지침

200811-1470000-001665-01(의약품평가지침 29)

의약품안전국(기관계용의약품과)

30신장애 환자를 대상으로 하는



의약품안전국(기관계용의약품과)

31의약품 국제공통기술문서 가이드라인 해설서-Ⅲ. 품질

200811-1470000-001696-01(의약품평가지침 31)


32

의약품 등 시험방법 밸리데이션에 대한

가이드라인 적용을 위한 해설서

200811-1470000-001693-01(의약품평가지침 32)


- 52 -

33 의약품등의 의존성 평가지침 200811-1470000-001715-01(의약품평가지침 33)


34 가교자료평가가이드라인 200811-1470000-001719-01(의약품평가지침 34)


35용량-반응 시험의 설계 및

평가를 위한 가이드라인2008

11-1470000-001750-01

(의약품평가지침 35)

의약품안전국

(기관계용의약품과)

36우수 의약품 개발

가이드라인2008

11-1470000-001694-01


의약품안전국

(마약신경계의약품과)

37의약품의 품질 위해관리

가이드라인2008

11-1470000-001695-01


의약품안전국

(마약신경계의약품과)

38

항암제의 임상시험계획승인신

청(IND) 및 품목허가승인신청

(NDA)을 위한 비임상시험자

료 심사 지침

2008-


의약품안전국

(항생항암의약품과)

39

『의약품등의

품목허가·신고·심사 규정』중

'의약품등의 안전성·유효성

심사 관련 해설서‘

200811-1470000-001797-01


의약품안전국

(항생항암의약품과)

40 의약품동등성심사 해설서 2008 (의약품평가지침 40)의약품안전국

(품질동등성평가팀)

41생물학적동등성시험기준

해설서2008

11-1470000-001741-01


의약품안전국

(생물학적동등성평가

과)

42 2008 의약품우수심사기준 2008-


의약품안전국

(의약품기준과)

43

의약품

국제공통기술문서(CTD)작성

해설서

200911-1470000-002410-01


의약품안전국

(소화계의약품과)

44고혈압치료제에 대한

임상시험 평가지침2009

11-1470000-002419-01


의약품안전국

(순환계의약품과)

45소화성궤양 치료제에 대한

임상시험 평가지침2010

-


의약품안전국

(소화계의약품과)

- 53 -

46 항생제 임상시험평가지침 201011-1470000-002440-01


의약품안전국

(종양약품과)

47생체시료 분석법 밸리데이션

해설서2010

-


의약품안전국

(약효동등성과)/

신약연구팀

※ 위 간행물들은 국가기록원, 국립중앙도서관, 식약청 정보자료실에 배포 및 보관되어

있으며, 식약청 홈페이지(http://www.kfda.go.kr) 식약청 자료실에서 직접 다운 받

아 보실 수 있습니다.

의약품 평가지침 47

생체시료분석법 밸리데이션 해설서

발 행 일 2010월 6월 일

발 행 인 식품의약품안전청장노연홍

발행위원 식품의약품안전청의약품안전국약효동등성과

장병원, 이선희, 정수연, 김소희, 임환미, 오은경, 박상애, 송영미,

이경신, 윤경은, 이승경, 백주현, 서현옥, 김보연, 김민정, 김정현,

우나리, 서희원, 강다혜, 이윷모

식품의약품안전평가원신약연구팀

김인규, 한의식, 정주연, 이이다, 송윤경, 조일영

생체시료분석법실무작업반위원

발 행 처 식품의약품안전청의약품안전국의약품심사부약효동등성과

식품의약품안전청 의약품안전국 의약품심사부 약효동등성과

Tel : 02-380-1414~5, Fax : 02-383-8321

Documents

생체시료분석법_밸리데이션_해설서(2010.6.)