Fluoreszcens mérőkészüléka fluoreszcencia-dinamika

kiszajú mérésére kis festék (bead) koncentrációk esetére

2011. November 4.

Zelles Tivadar, Offenmüller Katalin, Maák Pál

Az áramlásos fehérjekötés-erősség mérés elve

Beadek leszakadnak

Idő (s)

Mulvaney et al., Biosensors-Bioelectronics 23, pp. 191-200, 2007

L

r

r

MFF ssk 2

7.1

vrFs 6

Ahol Fs a Stokes erő, Ms a forgatónyomaték

Kötési erő:

ss FrM 62.0v az áramlási sebesség, r a bead sugara

r

Feszítőerő Fk

Kötés hossza L

Ms

Fs

Áramlás v sebessége

Fluoreszcencia-mérésen alapuló fehérjekötés-erősség mérő berendezés

Érzékelő

FényforrásFénykábel

Gerjesztés

Fluoreszcencia Lemosó folyadék

Motoros adagoló

Állvány mozgatóval

Minta

víz lemosódik

Állítható sebesség

A berendezés egyedi fejlesztésű erősítő és kiolvasó elektronikát tartalmaz

Léghűtéses lézer

Detektoregység az interferencia- szűrővel

Áramlási cella mozgatható állványon

Kevert optikai y kábel

Az összeépített berendezés

A detektor árama illetve feszültségea megvilágító fényintenzitással lineáris

S 9269 erősítővel közös tokba foglalt fotodetektor

A tok tartalma - detektor és erősítő – nagy erősítéssel

A fluoreszcencia-érzékelő detektor gyári paraméterei

Érzékenység (abszolút) 10nW

Referencia érzékenység (abszolút) 1 µW

A/D átalakítás 16 bit

Tápegység +12 V, hálózati adapter

Kimenet USB illetve LCD beépítve

Optikai bemenet kábelhez adaptálva, szűrőtartóval

Érzékelőfejek Egy nagyérzékenységű fluo: S9269Referencia detektor, külső: BPX66

A megvalósított áramkör paraméterei

A lézer hőmérsékleti stabilizálása

hőmérséklet

teljesítmény

Sikeres stabilizálás

Stabilizálatlan lézer ingadozása

Fluoreszcencia-spektrumok lézeres gerjesztéssel és PMT spektrométerrel

A kimutathatókoncentráció határa 10-4 mg/mlamely 7*10-11 g festék gerjesztése

ez 2,1*10-13 mól

Várhatóan ennél nagyobb koncentráció lesz a beadekkel

Hullámhossz (nm)

Tipikus spektrum interferenciaszűrőnélkül, 10-1 mg/ml koncentrációnál

Itt a folyadék nem áramlik!

Fluoreszcencia-spektrumok különböző hígítású beadekkel

1000-es hígítás

10000-es hígítás

Fluoreszcencia csúcs

-400 -200 0 200 400

-400

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

200µm

x(µm)

y(µ

m)

-400 -200 0 200 400

-400

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

200µm

x(µm)

y(µ

m)

Z=-1200 µm Z=-800 µm Z=-600 µm

A végleges mintában reményeink szerint a 10 000 hígításnakmegfelelőnél jóval több beadet sikerül megkötni

A mérési módszer validálása: különböző koncentrációjú festékek befecskendezése

Befecskendezések kezdete

Befecskendezések vége

10-2 mg/ml

10-1mg/ml Sima víz

Drasztikusan más a jel, ha a kamrában áramlik a folyadék, vagy ha áll!Egyenletes áramlási sebességet kell biztosítani!

Látszik jelkülönbség a különböző koncentrációk hatására, de a mérés kiértékelhetetlen

Programozható adagoló – 20 ml fecskendőkkel

Beállítható áramlási mennyiség – ezáltal beállítható áramlási sebesség a kamrában

beáramlás

kiáramlás

10-4 mg/ml

Egyenletesen áramló víz, de nem kontrollált sebességű festék-hozzákeverés – az egyidejűleg fluoreszkáló anyag-tartalom elég bizonytalan

Kézi nyomású fecskendővel kevertük hozzá az áramló vízhez a különbözőkoncentrációjú festékeket – a kisebbik koncentrációt nem sikerült egyenletesen nyomni

A mérési módszer validálása: egyenletes vízáramlási sebességKézi befecskendezés

Vízről egy adott koncentrációjú - 10-4 mg/ml – (70 pikogram – 2,1*10-13 mól festék egyszerre) oldatra váltás ugyanazon áramlási sebesség mellett

Bár a jel a kis koncentráció miatt kicsi, a jel/zaj viszony 5-ös körül vanA várható bead-koncentráció-értékek ennél magasabbal lesznek

A mérési módszer validálása: váltás egyenletes vízáramlásról ugyanazon sebességű festék-áramlásra és vissza

Festékoldat

Víz

Nagyobb koncentrációval – 10-3 mg/ml:

A jelszint sokkal nagyobb, a jel-zaj viszony

Átkapcsolási tranziens

Köszönöm a figyelmet!