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201103 Guia de Laboratorio 2015

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Guía de componente práctico curso de bioquímica 201103

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA

GUÍA DE PRÁCTICA DE LABORATORIO

BIOQUÍMICA 201103

ALBERTO GARCÍA JEREZ Docente - Director

Bucaramanga

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1111 ContenidoContenidoContenidoContenido

2 INTRODUCCIÓN................................................................................................................ 5

3 PRE INFORME DE LABORATORIO .................................................................................. 6

3.1 Portada ......................................................................................................................... 6

3.2 El Índice General .......................................................................................................... 6

3.3 Introducción .................................................................................................................. 6

3.4 Revisión bibliográfica .................................................................................................... 6

3.5 Materiales y Métodos ................................................................................................... 6

3.6 Plan de Trabajo ............................................................................................................ 6

3.7 Nomenclatura ............................................................................................................... 7

3.8 Referencias .................................................................................................................. 7

3.9 Anexo ........................................................................................................................... 7

4 INFORME DE LABORATORIO .......................................................................................... 8

4.1 Portada ......................................................................................................................... 8

4.2 Resumen ...................................................................................................................... 8

4.3 El Índice General .......................................................................................................... 8

4.4 Introducción .................................................................................................................. 8

4.5 Revisión bibliográfica .................................................................................................... 8

4.6 Materiales y Métodos ................................................................................................... 8

4.7 Resultados ................................................................................................................... 8

4.8 Discusión ...................................................................................................................... 8

4.9 Conclusiones ................................................................................................................ 9

4.10 Recomendaciones..................................................................................................... 9

4.11 Revisión bibliográfica ................................................................................................ 9

4.12 Referencias ............................................................................................................... 9

4.13 Anexo ........................................................................................................................ 9

5 Practica 1. SEGURIDAD Y NORMAS DE LABORATORIO ............................................. 10

5.1 NORMAS PERSONALES .......................................................................................... 10

5.2 NORMAS PARA LA UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS ............................ 10

5.3 NORMAS PARA LA UTILIZACIÓN DE INSTRUMENTACIÓN ................................... 11

5.4 NORMAS DE EMERGENCIA ..................................................................................... 11

5.5 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS. ....................................................................... 12

6 Practica 2: PROPIEDADES BIOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS. ........................... 13

6.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO .......................................................................... 14

6.2 REACCIÓN CON LA NINHIDRINA ............................................................................ 15

6.3 REACCIÓN DE BIURET ............................................................................................ 16

6.4 REACCION XANTOPROTEICA. ................................................................................ 16

6.5 REACCION DE MILLON ............................................................................................ 17

6.6 REACCION DE SAKAGUCHI..................................................................................... 18

6.7 PREGUNTAS: ............................................................................................................ 19

7 Practica 3. BIOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS ............................................................ 20

7.1 PROCEDIMIENTO Y MATERIALES .......................................................................... 21

7.2 REACCIÓN DE BIURET ............................................................................................ 22

7.3 REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS ......................................................... 22

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7.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE BRADFORD. ........................................................................................................................ 23

7.5 PREGUNTAS: ............................................................................................................ 25

8 Práctica 4: IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS ..................................................... 26

8.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO. ......................................................................... 29

8.2 PRUEBA DE BENEDICT ............................................................................................ 29

8.3 REACCIÓN DE FEHLING .......................................................................................... 30

8.4 REACCIÓN DE MOLISCH ......................................................................................... 30

8.5 PRUEBA DE TOLLENS ............................................................................................. 31

8.6 REACCIÓN DE LUGOL (YODO)................................................................................ 32

8.7 PREGUNTAS ............................................................................................................. 33

9 Practica 5. CARACTERÍSTICAS DE LOS ÁCIDOS GRASOS ......................................... 34

9.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO. ......................................................................... 34

9.2 SOLUBILIDAD EN LÍPIDOS ....................................................................................... 35

SAPONIFICACIÓN ........................................................................................................... 35

9.3 REACCIÓN CON EL SUDÁN III ................................................................................. 36

9.4 PREGUNTAS: ............................................................................................................ 36

10 BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 37

Tablas Tabla 1 Clasificación de los aminoácidos. ............................................................................... 13 Tabla 2 Aminoácidos proteicos con nomenclatura clásica sistema de tres letras y sistema de una sola letra, impuesto en genética molecular. ...................................................................... 13 Tabla 3 Pruebas bioquímicas para identificar aminoácidos. .................................................... 14 Tabla 4 Materiales y reactivos. ................................................................................................ 14 Tabla 5 Procedimiento a realizar para la reacción de ninhidrina. ............................................ 15 Tabla 6 Procedimiento a realizar para la reacción de Reacción de Biuret. ............................. 16 Tabla 7 Procedimiento a realizar para la reacción Xantoprotéica. ........................................... 16 Tabla 8 Procedimiento a realizar para la reacción de millón. .................................................. 17 Tabla 9 Procedimiento a realizar para la reacción de Sakaguchi. ........................................... 18 Tabla 10 Resumen de las reacciones de aminoácidos en las diferentes técnicas. ................. 19 Tabla 11 Descripción de reactivos y métodos. ........................................................................ 20 Tabla 12 Materiales y Materiales y reactivos. .......................................................................... 21 Tabla 13 Procedimiento a realizar para la reacción de Biuret. ................................................ 22 Tabla 14 Reacción De Aminoácidos Azufrados, Grupos SH. .................................................. 22 Tabla 15 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta. ............... 24 Tabla 16 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta ................ 24 Tabla 17 Diferentes ensayos para reconocimiento en carbohidratos. ..................................... 27 Tabla 18 Materiales y reactivos. .............................................................................................. 29 Tabla 19 Prueba de Benedict (detecta la presencia de azúcares reductores)......................... 29 Tabla 20 Reacción de Fehling (detecta la presencia de azúcares reductores) ....................... 30 Tabla 21 Reacción de Molisch. ................................................................................................ 30 Tabla 22 Prueba De Tollens. ................................................................................................... 31 Tabla 23 Reacción de almidones con lugol (yoduro potásico). ................................................ 32

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Tabla 24 Clasificación de lípidos. ............................................................................................ 34 Tabla 25 Materiales y Materiales y reactivos. .......................................................................... 34 Tabla 26 Determinación de solubilidad en lípidos. .................................................................. 35 Tabla 27 Ensayo de Saponificación. ....................................................................................... 35 Tabla 28 Tinción: Reacción con el Sudán III. .......................................................................... 36 Ilustraciones Ilustración 1 Clasificación de carbohidratos. ............................................................................ 26

Ilustración 2 Molécula de glucosa. ........................................................................................... 28

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2 INTRODUCCIÓN

La guía de prácticas de laboratorio introduce al estudiante en los procedimientos experimentales más ampliamente usados en bioquímica. Incluye análisis de macromoléculas como carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. El estudiante también se familiarizará de las instalaciones y los equipos usados en las prácticas de bioquímica. Es de gran importancia la lectura y compresión del documento con anterioridad a la asistencia de las prácticas, además del desarrollo de las consultas que permitan entender cada procedimiento. Los objetivos de las prácticas del curso de bioquímica son: 1. Que el estudiante sea capaz de comprender e integrar los conceptos teóricos con la actividad práctica incluyendo una adecuada manipulación de las técnicas de laboratorio, desde la actividad procedimental hasta la entrega de resultados o informe final. 2. Que el estudiante adquiera una preparación en Bioquímica que le permita comprender la transversalidad que tiene la actividad práctica, tanto en otros cursos del programa de estudio como en las actividades profesionales que él desempeñará, así mismo que le permitan desarrollar una actitud de pensamiento crítico y de liderazgo en el trabajo que se de en el grupo. 3. Que el estudiante realice las a actividades las practicas, teniendo en cuenta las normas de seguridad y las indicaciones que del docente responsable de la práctica considere. 4. Que el estudiante adquiera los elementos formativos que incluye: lectura previa de esta guía, planeación de la actividad, asistencia a las prácticas, resolución de problemas con la metodología empleada, interpretación de resultados y presentación de resultados en el informe de laboratorio. La bioquímica es una rama de la ciencia encargada de descifrar los mecanismos esenciales de los seres vivos, con una fase teórica y una fase práctica, la primera se da a través de los distintos referentes bibliográficos y el segundo se apoya en el desarrollo de la guía de prácticas de laboratorio del curso de bioquímica. El desarrollo del trabajo práctico se apoya en una serie de pasos que van describiendo el progreso de una técnica a través de mediciones, cálculos, observaciones cualitativas y cuantitativas de los procedimientos planteados en la guía. La práctica de laboratorio integra, en el estudiante la habilidad de trabajar en el laboratorio, utilizando las técnicas más habituales de un laboratorio bioquímico y aprendiendo a interpretar los resultados experimentales.

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3 PRE INFORME DE LABORATORIO

En la redacción de los preinformes se deben conjugar los verbos en tiempo presente atemporal y en tiempo futuro cuando se indiquen las acciones que se van a realizar. Esta elaboración es individual. Ejemplo La centrifuga gira a 1600 revoluciones por minuto. La estructura de los preinformes es la siguiente:

3.1 Portada

La página de acuerdo a lo establecido por las normas para trabajos escritos, en el entorno de gestión encuentra un manual de normas APA. La portada contiene el nombre la universidad, la escuela a que pertenece el nombre de los integrantes del grupo con los datos necesarios para su identificación.

3.2 El Índice General

Presenta toda la información del contenido, incluyendo el índice general, el índice de tablas, el índice de figuras y el índice de anexos -Índice General -Índice de Tablas -Índice de Figuras -Índice de Anexos

3.3 Introducción

Describirá las prácticas a desarrollar explicado las principales características de las técnicas, así como, descripción de objetivos generales y específicos que da lugar al trabajo experimental. Esta es una sección realizada, redactando las ideas de los autores o sea ustedes.

3.4 Revisión bibliográfica

Consiste en presentar y describir un tema de acuerdo con las temáticas propuestas por la guía del componente práctico. Se toman los principales aspectos teóricos de acuerdo a la metodología que se platea para desarrollar en la guía. Tenga presenta que hay que dar los créditos respectivos a los autores consultados y las ideas resultantes son redactadas por el estudiante.

3.5 Materiales y Métodos

Describir los principales equipos, instrumentos y reactivos indicando las precauciones a tener, así como describir la información relávate que permita el buen desarrollo de la práctica.

3.6 Plan de Trabajo

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Primero que todo identifique quien es el docente encargado de la práctica, describa los principales datos personales, así como la identificación de la fecha lugar de la práctica. Tenga presente las normas de bioseguridad y como debe asistir al desarrollo del componente práctico (Uso de pantalón jean, zapato cerrado, bata blanca, guantes etc.). Define aquí que elementos debe tener en cuenta para el desarrollo de la práctica de acuerdo a las indicaciones que haga el docente de la práctica y la descripción que se de en la guía.

3.7 Nomenclatura

La Nomenclatura deberá ser presentada en tablas, que presenten ordenadamente sustancias químicas o unidades, identificadas con símbolos, abreviaturas.

3.8 Referencias

Es un conjunto de datos precisos y detallados con los que un autor facilita la remisión a fuentes documentales, o a sus partes, y a sus características editoriales. Por lo general y de acuerdo con la normas para trabajos escritos, la información básica a ofrecer es Autor(es). /Año de publicación./Título:/subtítulo./Mención del traductor y/o editor./Edición./Ciudad y/o país de publicación en caso necesario, /Casa editora. /Páginas o volúmenes. / (Mención de serie) Esta información se detalla el final del documento y su descripción es de acuerdo a las normas para trabajos escritos.

3.9 Anexo

En éstos se deben colocar toda aquella información referente a fichas de seguridad, reactivos, equipos y otra información que se considere relévate.

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4 INFORME DE LABORATORIO

En la redacción de los informes se deben conjugar los verbos en tiempo pasado. Esta actividad es grupal. La estructura de los informes es la siguiente:

4.1 Portada

La página de acuerdo a lo establecido por las normas para trabajos escritos, en el entorno de gestión se encuentra un manual de normas APA. La portada contiene el nombre la universidad, la escuela a que pertenece el nombre de los integrantes del grupo con los datos necesarios para su identificación

4.2 Resumen

Indicar una breve reseña de lo hecho durante la práctica y los objetivos, principales resultados y las conclusiones del trabajo realizado.

4.3 El Índice General

El contenido, incluyendo el índice general, el índice de tablas, el índice de figuras y el índice de anexos -Índice General -Índice de Tablas -Índice de Figuras -Índice de Anexos

4.4 Introducción

Describirá las prácticas a desarrollar explicado las principales características de las técnicas, así como, descripción de objetivos generales y específicos que da lugar al trabajo experimental. Esta es una sección realizada, redactando las ideas de los autores o sea ustedes.

4.5 Revisión bibliográfica

Consiste en presentar y describir un tema de acuerdo con las temáticas propuestas por la guía del componente práctico. Se toma los principales aspectos teóricos de acuerdo a la metodología que de platea para desarrollar en la guía. Tenga presenta que hay que dar los créditos respectivos a los autores consultados y las ideas resultantes son redactadas por el estudiante.

4.6 Materiales y Métodos

Describir los principales equipos, instrumentos y reactivos indicando las precauciones a tener, así como describiendo la información relávate que permita el buen desarrollo de la práctica.

4.7 Resultados

Presentar la información sobre el desarrollo de las prácticas de forma estructurada, completa y ordenada de la actividad experimental. Presentando gráficos, tablas, cálculos y demás notas que describa la ejecución de la práctica.

4.8 Discusión

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La discusión contendrá un análisis crítico de los resultados obtenidos de la actividad práctica y los conceptos teóricos.

4.9 Conclusiones

Derivan de los resultados y la discusión del trabajo.

4.10 Recomendaciones

El trabajo realizado debería mostrar nuevos caminos para otras experiencias de laboratorio similares. En esta sección se enumerarán claramente las actividades que podrían realizarse para proyectar la información obtenida en la investigación. Es un conjunto de datos precisos y detallados con los que un autor facilita la remisión a fuentes documentales, o a sus partes, y a sus características editoriales. Por lo general y de acuerdo con la normas para trabajos escritos la información básica a ofrecer es Autor(es)./Año de publicación./Título:/subtítulo./Mención del traductor y/o editor./Edición./Ciudad y/o país de publicación en caso necesario,/Casa editora. /Páginas o volúmenes./ (Mención de serie ) Esta información se detalla el final del documento.

4.11 Revisión bibliográfica

Consiste en presentar y describir un tema de acuerdo con las temáticas propuestas por la guía del componente práctico. Se toman los principales aspectos teóricos de acuerdo a la metodología que se platea para desarrollar en la guía. Tenga presenta que hay que dar los créditos respectivos a los autores consultados y las ideas resultantes son redactadas por el estudiante.

4.12 Referencias

Es un conjunto de datos precisos y detallados con los que un autor facilita la remisión a fuentes documentales, o a sus partes, y a sus características editoriales. Por lo general y de acuerdo con la normas para trabajos escritos la información básica a ofrecer es Autor(es)./Año de publicación./Título:/subtítulo./Mención del traductor y/o editor./Edición./Ciudad y/o país de publicación en caso necesario,/Casa editora. /Páginas o volúmenes./ (Mención de serie ) Esta información se detalla el final del documento.

4.13 Anexo

En éstos se deben colocar toda aquella información referente a fichas de seguridad, reactiva y equipos esta otra información que se considere relévate.

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5 Practica 1. SEGURIDAD Y NORMAS DE LABORATORIO

Referente teórico seguridad y normas de laboratorio Se entiende la práctica de laboratorio, como la estrategia pedagógica que facilita la consolidación del aprendizaje y el desarrollo de competencias disciplinares. La práctica de laboratorio puede desarrollarse en una sesión o en varias sesiones de acuerdo a las indicaciones que se den en la programación de cada periodo académico. En el laboratorio se realiza, para el caso del curso de bioquímica, prácticas experimentales: en donde se aprenden a manipular equipos, reactivos químicos, conformándose pequeños grupos de trabajo para el desarrollo de la actividad. Para llevar a cabo las prácticas de laboratorio se requiere que el estudiante tenga un conocimiento teórico básico sobre el tema y lea detenidamente la guía de laboratorio.

5.1 NORMAS PERSONALES

La vestimenta deberá ser apropiada y cómoda, que facilite la movilidad para la actividad que se desarrolla en los laboratorios. Debe cubrir áreas considerables de la piel con pantalones (jeans), blusas con mangas, la bata y guantes. Use calzado cerrado que cubra completamente el pie. El alumno debe portar en todo momento Bata blanca de Laboratorio. Nunca ingerir alimentos, beber o masticar chicle dentro del laboratorio, igualmente evitar tocar partes del rostro y llevar las manos a la boca o introducir lapiceros u otros en boca nariz y oídos. Asistir puntualmente en la fecha y hora programada, igualmente al entrar a las instalaciones del laboratorio se recomienda que se haga cuando esté presente el docente encargado de la práctica, así como no ausentarse antes de terminar la práctica. El área del laboratorio es exclusivamente para realizar el trabajo de la práctica; cualquier tipo de acción social como cortejar, charlas ajenas a la práctica e igual que las bromas pueden causar pérdida de tiempo y posibles incidentes de alta gravedad.

5.2 NORMAS PARA LA UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS

Cuando se tiene que hacer una reacción química se debe escoger el recipiente adecuado a la cantidad que se va a usar. Los ensayos se hacen en tubos de ensayo o en placas de gotas, nunca en vasos, matraces, etc. No usar recipientes alimenticios para contener productos químicos e igualmente cualquier recipiente que se utilice para la recepción productos es necesario rotular, brindando la mayor información sobre la sustancia contenida.

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De los materiales de laboratorio No utilice vidrio agrietado, el material de vidrio en mal estado aumenta el riesgo de accidente. No deben utilizarse para pipetear jeringuillas provistas de aguja hipodérmica o aspirar con la boca pipetas de vidrio. Compruebe la temperatura de los materiales antes de cogerlos directamente con las manos. Si cuenta con sistemas de extracción y renovación mecánica de aire activados, manténgalos siempre en funcionamiento. Utilizar las campanas extractoras siempre que sean posible. Para detectar el olor de una sustancia, no se debe colocar la cara directamente sobre el recipiente: utilizando la mano abierta como pantalla, es posible hacer llega una pequeña cantidad de vapor hasta la nariz. Los frascos deben cerrarse inmediatamente después de su uso. Al momento de trabajar con ácido, para diluirlos vierta el ácido sobre el agua, nunca al contrario. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados. Nunca debe sacar sustancias químicas del laboratorio sin autorización.

5.3 NORMAS PARA LA UTILIZACIÓN DE INSTRUMENTACIÓN

Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza se utilizará un recipiente adecuado. Se debe mantener perfectamente limpio y seco el lugar dónde se encuentre situado cualquier instrumento con contactos eléctricos. Leer las instrucciones de uso de los instrumentos. Debe revisarse el material de vidrio para comprobar posibles fisuras, especialmente antes de su uso a vacío o presión.

5.4 NORMAS DE EMERGENCIA

En caso de tener que evacuar el laboratorio, cerrar la llave del gas y salir de forma ordenada siguiendo en todo momento las instrucciones que haya impartido el Profesor. Localizar al iniciar la sesión de prácticas los diferentes equipos de emergencia en el correspondiente laboratorio: Duchas y lavaojos, Botiquín, Absorbente para derrames, Alarma de emergencia, Salida de emergencia y Recipiente para el vidrio roto. Al finalizar la práctica, limpia el área de trabajo y entrega los materiales utilizados limpios y en buenas condiciones. Por último esperar las indicaciones para retirarse de las instalaciones del laboratorio.

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5.5 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS.

Se hará la discusión sobre las normas de seguridad antes descriptas y las que encuentran en el Reglamentación y Normas de Bioseguridad en los Laboratorios de la UNAD y Otras Disposiciones. Identifique la señalización que encuentra en el laboratorio, fotografié o dibuje los pictogramas y describa en el informe de laboratorio que significan con que elementos de seguridad se cuenta. (Duchas, extintores, cámaras extractoras, etc.) Preguntas a) Escriba el nombre del reactivo y la formula química de los productos usados en la práctica. Ejemplo, Nitrato de plata (AgNO3) c) Escriba una propiedad física de la sustancia. Ejemplo, Son cristales blancos Densidad: (20/4): 4,352 d) Mencione posibles riesgos que representa la sustancia para la salud. En contacto con la piel y ojos puede provocar irritación y quemaduras. Por ingestión puede causar irritaciones en las mucosas de la boca, garganta, esófago y tracto intestinal. e) Indique cual es el equipo o la vestimenta de seguridad necesaria para manipular la sustancia. Usar equipo respiratorio adecuado. Utilizar guantes y gafas apropiadas. Utilizar ropa de trabajo adecuada (bata de laboratorio) y lavarse las manos y la cara antes y al finalizar el trabajo. f) Resuma la información obtenida en el área de reactividad del símbolo de diamante En cuanto a la salud (rombo azul), el número 2 indica que es un reactivo peligroso. En cuanto a inflamalidad (rombo rojo), el número 0 indica que no es inflamable. En cuanto a la reactividad (rombo amarillo), el número 0 indica que es estable. En cuanto a algún riesgo específico (rombo blanco), no presenta alguno.

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6 Practica 2: PROPIEDADES BIOQUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS.

Referente teórico de aminoácidos Los aminoácidos se denominan así por tener un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxilo (-COOH). Es posible agrupar los aminoácidos en clases principales basadas en las propiedades de sus grupos R, en especial de su polaridad, o tendencia a interaccionar como el agua a pH biológico (cerca del pH 7.0). La polaridad de los grupos R varía enormemente desde totalmente apolar o hidrofóbico (insoluble en agua) hasta altamente polar o hidrofílico (soluble en agua). Tabla 1 Clasificación de los aminoácidos.

Grupos R Propiedades de los aminoácidos

Apolares alifáticos

Los grupos R de esta clase de aminoácidos son apolares e hidrofóbicos. Las cadenas laterales de la alanina, valina, leucina e isoleucina tienden a agruparse entre sí en las proteínas, estabilizando las estructuras proteicas a través de interacciones hidrofóbicas. Otros aminoácidos que conforman este grupo son: glicina, metionina y prolina.

Aromáticos

Fenilalanina, Tirosina y Triptófano, con sus cadenas laterales aromáticas, son relativamente apolares (hidrofóbicos). Todos ellos pueden participar de interacciones hidrofóbicas.

Polares sin carga

Los grupos R de estos aminoácidos son más solubles en agua, que los aminoácidos apolares, debido a que contienen grupos funcionales que forman puentes de hidrógeno con el agua. Incluye este grupo la serina, treonina, cisteína, asparagina y glutamina.

Cargados

Estos aminoácidos pueden tener el grupo R cargado positivamente (básicos) o negativamente (ácidos), siendo más hidrofílicos que los demás aminoácidos. Los aminoácidos en los que los grupos R tienen una carga neta positiva significativa a pH 7.0 Lisina, arginina e histidina Con una carga neta negativa a pH 7.0 son: aspartamo y el glutamato.

La cadena R es de estructura variable y es la responsable de las características particulares de los AA y de su clasificación, en función de ésta podemos agrupar a los 20 aminoácidos, en diversas categorías así mismo, la nomenclatura puede hacerse utilizando un código de tres letras o de una, tal como se observa en la siguiente tabla: Tabla 2 Aminoácidos proteicos con nomenclatura clásica sistema de tres letras y sistema de una sola letra, impuesto en genética molecular.

Nomenclatura Una letra Tres letras Nombre Clasificación

A Ala Alanina

Apolares alifáticos G Gly Glicina I Ile Isoleucina Ae L Leu Leucina Ae V Val Valina F Phe Fenilalanina Ae

Apolares aromáticos W Trp Triptófano Ae C Cys Cisteina

Apolares con azufre M Met Metionina Ae N Asn Asparagina

Polares alifáticos y sin carga Q Gln Glutamina S Ser Serina

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T Thr Treonina Ae Y Tyr Tirosina Polar aromático y sin carga R Arg Arginina

Polar con carga positiva H His Histidina Ae K Lys Lisina D Asp Ac. Aspártico o Aspartato

Polar con carga negativa E Glu Ac. Glutamico o Glutamato P Pro Prolina Iminoacido

Ae = Aminoácido esencial Tomado de: Manual de Prácticas de Laboratorio de bioquímica, Universidad Nacional Autónoma de México Tabla 3 Pruebas bioquímicas para identificar aminoácidos. Prueba bioquímica Descripción de la reacción química entre los aminoácidos y los reactivos.

Reacción con la ninhidrina (Hidrato de

tricetohidrindeno)

El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas

Reacción de Millón El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de Mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la contienen.

Reacción Xantoprotéica Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado por lo cual esta reacción permite reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptófano.

Reacción de Sakaguchi El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina reacciona con soluciones de alfa naftol en presencia de Bromo en medio alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos.

Reacción de Ehrlich La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas.

Reacción de Adamkiewick o Hopkins

Cole

El anillo indólico presente en la cadena lateral de los alfa-aminoácidos libres o haciendo parte de péptidos y proteínas se puede reconocer mediante reacción con el ácido glioxílico a pH ácido, puesto que forma complejos de coloración violeta o

Reacción con acetato de Plomo alcalino

Los Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteína y Cistina se reconocen por la formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino.

6.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

Tabla 4 Materiales y reactivos.

Reactivos Materiales Cantidad Reactivo ninhidrina Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15 NaOH Gradilla 2 Sulfato cúprico (CuSO) Pinza para tubos 2 Ácido acético(CH3COOH) Pipetas Pauster con bulbo 4 Cloruro de sodio (NaCl) Beaker o vasos de precipitados de 500 mL 5 albúmina Estufa 1 Ácido nítrico (HNO3) Cámara de flujo laminas 1 Hidróxido de sodio (NaOH)

Pipetas de vidrio: 0.5 ml, 1 ml, 5 ml y 10 ml. 4

Acetato de Plomo Pera de goma para pipetas 4 α Naftol Hipoclorito de sodio Reactivo de Hopkins- Cole Ácido sulfúrico (H2SO) Reactivo de Millón Aminoácidos: Glicina,

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tirosina, triptófano, fenilalanina y arginina Fenol Albumina de huevo

Procedimiento

6.2 REACCIÓN CON LA NINHIDRINA

El grupo alfa-amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos alfa-amino libres presentes en péptidos y proteínas. Precauciones la ninhidrina es toxica. Tabla 5 Procedimiento a realizar para la reacción de ninhidrina.

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 1.5 mL de

Glicina1% ninhidrina

Preparar los tubos de ensayo. ↓↓↓↓

Agregue a cada tubo de ensayo 1.5mL de la solución correspondiente.

↓↓↓↓ 2 ml de solución (0.3%) de ninhidrina a

cada tubo. ↓↓↓↓

Tubos de ensayo en un baño de agua hirviente por unos 10 minutos.

↓↓↓↓ Observar y tomar apuntes de los

cambios.

Agregar 2 ml de solución de ninhidrina (0.3%)

1.5 ml de solución respectiva

+ Baño de agua hirviente por 10

minutos.

2 con 1.5 mL de Albúmina1%

ninhidrina

3 con 1.5 mL de

Tirosina 1% ninhidrina

4 con 1.5 mL de

Glicina 1% ninhidrina

5 con 1.5 mL de Triptófano 1%

ninhidrina

6 con 1.5 mL de Leucina al 1%

ninhidrina

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6.3 REACCIÓN DE BIURET

Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo de Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa. El Cu, en un medio fuertemente alcalino, se une con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas. Tabla 6 Procedimiento a realizar para la reacción de Reacción de Biuret.

6.4 REACCION XANTOPROTEICA.

Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado por lo cual esta reacción permite reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptófano. Tabla 7 Procedimiento a realizar para la reacción Xantoprotéica.

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 5 ml de solución de

Leucina al 1%

NaOH 2,5N +

sulfato cúprico

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ Agregue a cada tubo de ensayo

agregue 1 ml de NaOH 2,5N de la solución

correspondiente. ↓↓↓↓

Agregue 3 gotas de solución de sulfato cúprico al 1% a cada

tubo de ensayo. ↓↓↓↓

Agite cada tubo de ensayo ↓↓↓↓

Observar y tomar apuntes de los cambios.

1 ml de

NaOH 2,5N +

3 gotas de solución de sulfato cúprico al 1%

5ml de solución respectiva

2 con 1.5 mL

de Albúmina1%

NaOH 2,5N +

sulfato cúprico

3 con 1.5 mL de Tirosina

1%

NaOH 2,5N +

sulfato cúprico

4 con 1.5 mL

de Glicina 1%

NaOH 2,5N +

sulfato cúprico

5 con 1.5 mL

de Triptófano 1%

NaOH 2,5N +

sulfato cúprico

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 1.5 ml de solución de

Triptófano 1%

HNO3

+

NaOH

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ Agregue, 0,5 ml de HNO3

concentrado en cada tubo, en la campana de extracción.

↓↓↓↓ Retire los tubos del baño y déjelos

enfriar. ↓↓↓↓

Agregue lentamente 1 ml de

Agregue, 0,5 ml de HNO3 +

1.5 ml de solución respectiva

2 con 1.5 mL de Albúmina1%

HNO3

+

NaOH

3 con 1.5 mL de Metionina 1%

HNO3

+

NaOH

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6.5 REACCION DE MILLON

El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de Mercurio a pH ácido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la contienen. Tabla 8 Procedimiento a realizar para la reacción de millón.

4 con 1.5 mL de Fenilalanina 1%

HNO3

+

NaOH

Amoniaco (NH4OH) concentrado en la campana de extracción o 1.5 mL.

de NaOH al 40%, ↓↓↓↓

Observar y tomar apuntes de los cambios.

+ Baño de agua hirviente por 10

minutos. +

Agregue 1 ml de Amoniaco (NH4OH) ó 1.5 mL de NaOH al

40%. +

observe el cambio de color

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1

con 1.5 ml de solución de Tirosina

1%

Reactivo de Millón

+ sulfato cúprico

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ agregue 15 gotas del Reactivo de

Millón a cada tubo de ensayo ↓↓↓↓

Agregue 3 gotas de solución de sulfato cúprico al 1% a cada tubo de

ensayo. ↓↓↓↓

Retire con cuidado los tubos de ensayo del baño de María y

colóquelos en la gradilla. ↓↓↓↓

Observar y tomar apuntes de los cambios.

Agregue 15 gotas del Reactivo de Millón

+

1.5 ml de solución respectiva

+ Baño de agua hirviente por 10

minutos +

Dejar enfriar.

2 con 1.5 mL

de Albúmina1%

Reactivo de Millón

+ sulfato cúprico

3 con 1.5 mL de Leucina

1%

Reactivo de Millón

+ sulfato cúprico

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6.6 REACCION DE SAKAGUCHI

El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina reacciona con soluciones de alfanaftol en presencia de Bromo en medio alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos. Tabla 9 Procedimiento a realizar para la reacción de Sakaguchi.

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 5 mL de solución de Arginina 1%

Hidróxido de Sodio (NaOH

+ alfa-naftol

+ hipoclorito de

Sodio

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ Enfríe en baño de hielo por 10 minutos.

↓↓↓↓ 1 ml de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 5%

a cada tubo de ensayo. ↓↓↓↓

Dejar enfriar 10 minutos. ↓↓↓↓

Agregue con un gotero, 2 gotas de alfa-naftol al 1% a cada tubo de ensayo.

↓↓↓↓ Agregue 2 gotas de hipoclorito de Sodio al

10% a cada tubo. ↓↓↓↓

Observar y tomar apuntes de los cambios.

Enfríe en baño de hielo por 10 minutos.

+ 1 ml de Hidróxido de Sodio

(NaOH) al 5% +

Dejar enfriar 10 minutos. +

2 gotas de alfa-naftol al 1%. +

2 gotas de hipoclorito de Sodio al 10%.

5 ml de solución respectiva

2 con 1.5 mL

de Albúmina1%

Hidróxido de Sodio (NaOH

+ alfa-naftol

+ hipoclorito de

Sodio

3 con 1.5 mL de proteína de trigo 1%.

Hidróxido de Sodio (NaOH

+ alfa-naftol

+ hipoclorito de

Sodio

4 con 1.5 mL de Leucina

Hidróxido de Sodio (NaOH

+ alfa-naftol

+ hipoclorito de

Sodio

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Tabla 10 Resumen de las reacciones de aminoácidos en las diferentes técnicas.

NINHIDRINA

(-) incolora No es proteína ni

aminoácido

(+) Violeta o amarillo claro proteína, polipéptido o aminoácido

(+) Rojo o amarillo fuerte Hidroxiprolina o

prolina

BIURET

(-) Azul o amarillo aminoácidos

(+) Violeta Proteínas y polipéptidos

XANTOPROTÉICA

COAGULACIÓN

(-) Incoloro Otros aminoácidos

(+) Amarillo, naranja o verde Tirosina, fenilalanina o

triptófano

(-) No coagula Histonas, protaminas o polipéptidos

(+) Coagula Albúminas o globulinas

ADAMKIEWICK o HOPKINS COLE

SULFATO DE AMONIO

(+) Azul o violeta Triptófano

(-) Incoloro Tirosina o

Fenilalanina

(+) Precipita Globulinas

(-) No Precipita Albúminas

MILLÓN

Grupo SH

(+) Rojo Tirosina

(-) Incoloro Fenilalanina

SAKAGUCHI

(-) Incolora Otros aminoácidos

(+) Rojo Arginina

(+) Negro o gris Cisteína, cistina,

metionina

Tomada:

6.7 PREGUNTAS:

Escriba la reacción para cada una de las pruebas realizadas. Proponga de acuerdo a la pruebas una clasificación de los aminoácidos utilizados y relacione la importancia de la aplicación de algunas de estas pruebas aplicadas a otras áreas del conocimiento como: microbiología, química de alimentos entre otras. Para el siguiente pentapéptido, diga cuales pruebas y porque serán positivas. (ALA- VAL-GLY-GLU-LYS) Defina los siguientes términos: aminoácidos, proteínas, análisis cualitativo, cuantitativo.

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7 Practica 3. BIOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

Referente teórico de proteínas y aminoácidos. Las proteínas son uno de los principales componentes de todas nuestras células. Los aminoácidos (compuestos orgánicos) son los ladrillos de construcción de la proteínas. Los aminoácidos se agrupan de acuerdo con su comportamiento químico. La síntesis de las proteínas ocurre mediante la unión entre sí de las cadenas de aminoácidos. Los distintos aminoácidos imparten diferentes comportamientos químicos en la estructura de las proteínas. Debido a la presencia de diferentes aminoácidos en las uniones peptídicas las proteínas reaccionan con una variedad de compuestos formando productos coloreados. Los aminoácidos tiene tres tipos de reacciones químicas importantes: (1) reacciones debido a la presencia del grupo carboxilo (COO- ), (2) reacciones debidas al grupo amino (NH), y (3) reacciones debido al grupo R. Las reacciones debidas al grupo carboxilo y al grupo amino son generales y se dan para todos los aminoácidos. Las reacciones del radical R son reacciones específicas; por ejemplo, cisteína da una reacción para azufre, triptófano da ciertas reacciones de color debido a que su molécula contiene el grupo indol, tirosina da otras reacciones de color debido a su grupo fenólico, etc. Existen reacciones de coloración que son específicas para aminoácidos de esas proteínas y son importantes tanto para la detección como para el dopaje de aminoácidos y proteínas. Existen también reacciones generales porque sirven para caracterizar grupos comunes a todas las proteínas como grupos amino o uniones Tabla 11 Descripción de reactivos y métodos.

Método Descripción Desventajas Biuret

Gornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949 Se basa en la reacción de sales de Cu+2 con moléculas que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el cobre es reducido a Cu+ formando

complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm.

El método se usa para soluciones que tienen de 0.5 a 10 mg proteína/ml. Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína.

Lowry Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951 Resulta de la reacción de Biuret sobre los enlaces peptídicos, además de la reducción del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por las proteínas pretratadas con cobre en medio alcalino, dando una coloración azul, determinado a 650 nm. El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cisteína reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno.

Este es un método muy sensible, por lo que permite trabajar con soluciones muy diluidas de proteínas (0.02 - 0.5 mg proteína/ ml)

Bradford Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248 Basado en el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas. La reacción entre el colorante y la proteína es muy

Muestra interferencias con detergentes

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rápida (aproximadamente 2 min), y el completo proteína-colorante permanece disperso en solución por un tiempo relativamente largo. Rango de detección: 0.5-10 mg proteína/ml.

7.1 PROCEDIMIENTO Y MATERIALES

Tabla 12 Materiales y Materiales y reactivos.

Reactivos Materiales Cantidad Reactivo ninhidrina Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15 NaOH Gradilla 2 Sulfato cúprico (CuSO) Pinza para tubos 2 Ácido acético(CH3COOH) Pipetas Pauster con bulbo 4 Cloruro de sodio (NaCl) Beaker o vasos de precipitados de 500 mL 5 albúmina Estufa 1 Ácido nítrico (HNO3) Cámara de flujo laminas 1 Hidróxido de sodio (NaOH) Pipetas de vidrio: 0.5 ml, 1 ml, 5 ml y 10 ml. 4

Acetato de Plomo Pera de goma para pipetas 4

α Naftol Vidrios reloj grandes Hipoclorito de sodio Probeta 100 ml Reactivo de Hopkins- Cole Balón aforado de 25 ml Ácido sulfúrico (H2SO) Agitador de vidrio Reactivo de Millón Balanza analítica Aminoácidos: Glicina, tirosina, triptófano, fenilalanina y arginina

Espectrofotómetro

Fenol Micropipeta 10 μL Albumina de huevo Micropipeta 20- 200 μL Agua destilada Micropipeta 20- 200 μL Ácido fosfórico Micropipeta 200-1000 μL

L

Etanol 1 caja con puntas de 200 μL (amarillas) para micropipeta

1 caja con puntas de 200 μL (amarillas) para micropipeta

1 caja con puntas de 1000 μL (azules) para micropipeta. Agitador vórtex múltiple para tubos

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7.2 REACCIÓN DE BIURET

Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo de Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa. El Cu, en un medio fuertemente alcalino, se une con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas. Tabla 13 Procedimiento a realizar para la reacción de Biuret.

7.3 REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.

Tabla 14 Reacción De Aminoácidos Azufrados, Grupos SH.

Tubo Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1

con 3 mL de solución de

Albúmina de huevo 1%

CuSO4 al 1% +

hidróxido sódico

Preparar los tubos de ensayo. ↓↓↓↓

Añadir de 4 a 5 gotas de solución de CuSO4al 1%

↓↓↓↓ Añadir 2 ml de solución de hidróxido sódico al 20%.

↓↓↓↓ Agitar para que se mezcle.

↓↓↓↓ Observar y tomar apuntes de los

cambios.

4 a 5 gotas de solución de

CuSO4 al 1% +

2 ml hidróxido sódico

con 3 mL de solución respectiva

+ Agitar y observar color violeta, azul o amarillo.

2

con 3 mL de solución de

aminoácidos Tirosina, Triptófano

o Fenilalanina.

CuSO4 al 1% +

hidróxido sódico

3 con 3 mL de Leche

1%

CuSO4 al 1% +

hidróxido sódico

4 con 3 mL de Aceite

de cocina

CuSO4 al 1% +

hidróxido sódico

5 con 3 mL de

Glucosa

CuSO4 al 1% +

hidróxido sódico

Tubo Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1

con 3 mL de solución de

Albúmina de huevo 1%

hidróxido sódico +

acetato de plomo

Preparar los tubos de ensayo. ↓↓↓↓

Añadir 2 ml de solución de hidróxido sódico al 20%.

2 ml hidróxido sódico +

solución de acetato de plomo al 5%

+

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7.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE BRADFORD.

Práctica sugerida de acuerdo a la disposición de los recursos. INTRODUCCION Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales como la determinación de la absorbancia a 280 nm, o mediante la formación de derivados coloreados de las proteínas, base de los métodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico; en el método de Lowry, además del complejo anterior también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total. El método de Bradford se basa en el empleo de emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación de la unión de un colorante, el Azul de Coomassie G-250, a la proteína, comparando esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar (Albúmina de Suero Bovino (BSA)). La cuantificación se hace midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro, a 595 nm, y graficando la absorbancia vs la concentración de proteínas, obteniendo una curva de calibración de la proteína estándar. Con esta curva de calibración, se puede interpolar la concentración de proteínas en una muestra al medir su absorbancia a 595 nm. 1- Reactivo de Bradford

2

con 3 mL de solución de

aminoácidos Tirosina,

Triptófano o Fenilalanina.

hidróxido sódico +

acetato de plomo

↓↓↓↓ Añadir 10 gotas de solución de

acetato de plomo al 5% ↓↓↓↓

Calentar el tubo hasta ebullición. ↓↓↓↓

Observar y tomar apuntes de los cambios.

↓↓↓↓

El precipitado de color negruzco indica que se ha formado sulfuro de Plomo, utilizándose el azufre de los

aminoácidos

con 3 mL de solución respectiva

+ Calentar el tubo hasta

ebullición.

3 con 3 mL de Leche

1%

hidróxido sódico +

acetato de plomo

4 con 3 mL de

Aceite de cocina

hidróxido sódico +

acetato de plomo

5 con 3 mL de

Glucosa

hidróxido sódico +

acetato de plomo

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Azul de coomasie G-250 5 mg Etanol 2.5 ml Ácido fosfórico 5 ml Agua Hasta 50 ml Mezclar en el orden indicado, disolver con agitación y a continuación filtrar 2-Patrón de albúmina. Disolver 10 mg de albúmina bovina en 10 ml de agua destilada, con lo que tenemos una disolución madre con una concentración de 1 mg/ml. 1-Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal manera que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl. Mezclar para ello el volumen adecuado de la disolución madre de albúmina bovina de un 1 mg/ml y el correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla. METODO 1-Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal manera que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl. Mezclar para ello el volumen adecuado de la disolución madre de albúmina bovina de un 1 mg/ml y el correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla. Tabla 15 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta.

µg (prot) 0 10 20 30 40 50 60 µl (alb) 0 10 20 30 40 50 60

µl (agua) 300 290 280 270 260 250 240 µl total 300 300 300 300 300 300 300

2-Preparación de tres diluciones de la muestra problema: Hacer una dilución 1:20 de la leche comercial; a continuación realizar las diferentes diluciones de acuerdo con la siguiente tabla. Tabla 16 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta

Leche diluida A B C V. leche (µl) 20 25 30 V. agua (µl) 280 275 270

V. total 300 300 300

Finalmente añadir 3 ml del reactivo de Bradford a todos los tubos; tanto a las diluciones que contienen la albúmina como a las que contienen la leche diluida. Agitar los tubos y a continuación proceder a la lectura de la absorbancia a 595 nm en el colorimetro.

RESULTADOS

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1- Elaboración de la recta patrón. Para ello representar en el papel milimetrado adjunto la absorbancia de cada uno de los tubos que contenían albúmina bovina frente a la cantidad de proteínas correspondiente. Si se dispone de una calculadora con capacidad para hacer rectas de regresión, compruebe el coeficiente de correlación de la recta obtenida. En cualquier caso determine la pendiente de la recta. 2- Para las tres diluciones del problema, interpolar la absorbancia obtenidas sobre la recta representada para saber la cantidad de proteínas presentes en cada una de ellas. Alternativamente, haga el cálculo mediante la pendiente de la recta. 3- Teniendo en cuenta los volúmenes de muestra usados en cada caso y teniendo en cuenta la dilución realizada, calcúlese la concentración de proteínas en la muestra analizada. Dar el resultado en gramos de proteínapor 100 ml de leche.

7.5 PREGUNTAS:

¿Cuáles son los principales métodos colorimétricos usados en la determinación de proteínas? ¿Cuál es la reacción de un alfa-aminoácido y ninhidrina? ¿Cuál es la reacción con el reactivo de Biuret? ¿Qué proteínas dan positivas con la prueba de Hopkins-cole? ¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de la clara de huevo? 2. ¿Cuál de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización? 3. ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína? 4. ¿Qué coloración da la reacción del Biuret? 5. ¿Una proteína coagulada podría dar la reacción del Biuret? 6. Si se realiza la reacción del Biuret sobre un aminoácido como la Glicina ¿es positiva o negativa? ¿Por qué?

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8 Práctica 4: IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Referente teórico. Los hidratos de carbono constituyen el grupo de biomoléculas más abundante sobre la superficie terrestre, representando aproximadamente el 75 % de la materia orgánica existente. En ocasiones, se denominan también carbohidratos, azúcares, sacáridos o glúcidos. Todos son términos que hacen referencia a su sabor dulce, o a que poseen la composición Cn(H2O)n. Estas moléculas usualmente contienen carbono, hidrógeno y oxígeno en una proporción de 1:2:1. Los carbohidratos se clasifican como monosacáridos, disacáridos o polisacáridos, dependiendo del tamaño y la complejidad de la molécula. Los monosacáridos se componen de una sola molécula de azúcar. Cuando dos monosacáridos se unen se produce un disacárido, y cuando dos o más se unen se produce un polisacárido. En los animales los carbohidratos son esenciales desde el punto de vista energético, ya que muchos órganos y células del cuerpo humano, como el cerebro y los glóbulos rojos, obtienen su energía principalmente de la glucosa. Pero sus funciones no se restringen a ser únicamente fuente de energía, sino que también pueden desarrollar funciones estructurales, de reconocimiento celular y adhesión. Estructuralmente, un hidrato de carbono típico es una cadena hidrocarbonada con varios grupos alcohol y un carbono más oxidado, en forma de grupo carbonilo. Este grupo oxidado puede situarse en el extremo de la cadena (aldehído), o adyacente, en posición 2 (cetonas)

Ilustración 1 Clasificación de carbohidratos. Todos los monosacáridos y los disacáridos con enlace mono-carbonilo, cuando se encuentran en solución a pH alcalino, tienen la capacidad de reducir otros compuestos. Esta capacidad reside en las características del grupo carbonilo (C anomérico en formas cicladas) libre. Esta propiedad, y por tanto, la presencia de un azúcar reductor, se ponen de manifiesto mediante las reacciones de:

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Tabla 17 Diferentes ensayos para reconocimiento en carbohidratos.

Ensayo Descripción del ensayo Molisch: Este ensayo es un ensayo para reconocimiento general de carbohidratos en el que los

polisacáridos y disacáridos se hidrolizan con ácido sulfúrico concentrado hasta monosacáridos y se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural los cuales reaccionan con α-naftol formando un color púrpura violeta.

Fehling -Fehling A: CuSO4 disuelto en H2O -Fehling B: NaOH y tartrato Na-K disueltos en agua

(Detecta la presencia de azúcares reductores) Los azúcares reductores, en medio alcalino, son capaces de reducir el ión Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo. Para ello el grupo carbonilo del azúcar se oxida a grupo carboxilo. En medio fuertemente básico, como es en este caso el NaOH, el ión Cu2+ formaría Cu (OH)2 insoluble, por eso se añade tartrato sódico potásico en el Fehling B (el reactivo de Fehling consta de dos componentes: Fehling A y Fehling B) que actúa como estabilizador al formar un complejo con el Cu2+.

NaOH +Calor +R

CuSO2 � Cu(OH)2 (azul) � Cu2O (rojo ladrillo) Reacción

Benedict (Detecta la presencia de azúcares reductores) Se basa en la reducción de Cu2+ a Cu+ en medio básico débil. Aunque es similar a la reacción de Fehling, el medio básico débil y el estabilizante (citrato sódico) utilizados hacen que este test sea más sensible y estable. -Sulfato cúprico. -Citrato de sodio. -Carbonato anhidro de sodio

Barfoed

Ácido acético Acetato cúprico (Detecta la presencia de monosacáridos) El reactivo de Barfoed es débilmente ácido y es reducido solamente por monosacáridos, formándose como producto de reacción óxido cuproso. En medio ácido, tan sólo los monosacáridos son capaces de reducir el Cu2+ a Cu+. El Cu+ así producido reduce al ácido fosfomolíbdico a un complejo de intenso color azul oscuro.

Ioduro Los polisacáridos sin ramificar forman complejos característicos cuando reaccionan con yodo. Los ramificados también lo hacen, pero los complejos formados tienen menos intensidad de color.

Seliwanoff Este ensayo es específico para cetosas y se basa en la conversión de la cetosa en 5-hidro-metil-furfural y su posterior condensación con resorcinol formando así complejos coloreados.

Bial El reactivo de Bial contiene orcinol en ácido clorhídrico, el cual forma complejos de coloración sólo con las pentosas.

Lugol El reactivo de Lugol que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer polisacáridos, particularmente el almidón por la formación de una coloración azul violeta intensa y el glicógeno y las dextrinas por formación de coloración roja.

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Rotación óptica Es una propiedad importante que permite identificar los carbohidratos, y determinar el grado de pureza de los mismos, particularmente monosacáridos, ocasionada por la presencia de centros asimétricos o quirales en la estructura molecular, los cuales desvían el plano de luz polarizada. Esta propiedad no es exclusiva de los carbohidratos pues la presentan todas aquellas sustancias denominadas óptimamente activas, por tener en su estructura centros quirales. Para la medición de la rotación óptica los factores importantes a tener en cuenta son: La longitud de onda de luz polarizada, la cantidad de material óptimamente activo, y la naturaleza del solvente cuando se usa. Los cambios en la temperatura ocasionan solo pequeñas variaciones en las medidas de la rotación. Los datos de rotación óptica se representan como |α] = rotación específica o | M] = Rotación molecular, donde: |α| = α/LC α: Rotación observada en grados angulares L: Longitud en decímetros del paso de luz polarizada a través de la muestra C: Concentración en gramos por mililitro. M: Peso molecular | M | = M x | α |/100 cuando el plano de luz polarizada se desvía en el sentido de las manecillas del reloj se antepone un signo positivo al número de grados que fue rotado el plano de luz. El plano de luz polarizada hacia la derecha se llaman dextrógiros o dextro rotatorios, y esa característica se indica anteponiendo el signo (+) al nombre del compuesto. Los compuestos que desvían el plano de luz polarizada hacia la izquierda se llaman levógiros o levo rotatorios, y esa característica se indica anteponiendo el signo (-) al nombre del compuesto.

Los prefijos D y L no tienen nada que ver con el carácter dextro/levo rotatorio de la molécula, sino que indican la posición del OH del penúltimo carbono en la representación de Fischer. Para indicar su poder rotatorio hay que utilizar los signos (+) y (-). Da la casualidad de que el D-gliceraldehído es dextrógiro (D-(+)-gliceraldehído) y de que el L-gliceraldehído es levógiro (L-(-)-gliceraldehído), pero pueden existir compuestos que pertenecen a la serie D y que son levógiros, como la D-(-)-fructosa.

Ilustración 2 Molécula de glucosa.

O H O H

C C

H – C – OH HO – C – H

HO – C – H H – C – OH

H – C – OH HO – C – H

H – C – OH HO – C – H

CH2OH CH2OH

D-glucose L-glucose

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8.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO.

Tabla 18 Materiales y reactivos.

Reactivos Materiales Cantidad Reactivo de Benedict Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15 Reactivo Fehling A y reactivo Fehling B Gradilla 2 Lugol Pinza para tubos 2 Glucosa Pipetas Pauster con bulbo 4 sacarosa Beaker o vasos de precipitados de 500 mL 5 almidón Estufa 1 Fructosa Cámara de flujo laminas 1 Reactivo Fehling A y B Pipetas de vidrio: 0.5 ml, 1 ml, 5 ml y 10 ml. 4 α-naftol Pera de goma para pipetas 4 Vidrios reloj grandes Probeta 100 ml Balón aforado de 25 ml Agitador de vidrio Balanza analítica

8.2 PRUEBA DE BENEDICT

Es similar a la reacción de Fehling, el medio básico débil y el estabilizante (citrato sódico) utilizados hacen que este test sea más sensible y estable. Tabla 19 Prueba de Benedict (detecta la presencia de azúcares reductores)

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 3 ml de

Glucosa al 1% reactivo de Benedict

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ Agregue a cada tubo de ensayo

2 ml de reactivo de Benedict.

↓↓↓↓ Tubos de ensayo en un baño de

agua hirviente por unos 10 minutos.

↓↓↓↓ Agite cada tubo de ensayo

↓↓↓↓ Observar y tomar apuntes de los

cambios. Positiva aparece un precipitado rojizo, verde o

amarillo.

Agregue a cada tubo de

ensayo 2 ml de reactivo de Benedict

+ Baño de agua hirviente por

10 minutos.

3 ml de solución respectiva

2 con 3 mL de

sacarosa al 1% reactivo de Benedict

3 con 3 mL de

almidón al 1% reactivo de Benedict

4 con 3 mL de

jugo de cebolla al 1%

reactivo de Benedict

5 con 3 mL de

Fructosa al 1% reactivo de Benedict

6 con 3 mL de

agua reactivo de Benedict

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8.3 REACCIÓN DE FEHLING

Los azúcares reductores, en medio alcalino, son capaces de reducir el ión Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo. Para ello el grupo carbonilo del azúcar se oxida a grupo carboxilo. Tabla 20 Reacción de Fehling (detecta la presencia de azúcares reductores)

Reactivo Fehling A: disolver 7 g CuSO4 · 5 H2O en 100 ml de agua destilada. Reactivo Fehling B: 35 g de tartrato de sodio y potasio + 12 g NaOH en 100 ml de agua destilada

8.4 REACCIÓN DE MOLISCH

La presencia de carbohidratos en una muestra se pone de manifiesto por la reacción de Molisch, que a cierto punto es la reacción universal para cualquier carbohidrato. Se basa en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico sobre los hidratos de carbono. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reacción de Molisch) dando un producto coloreado. Tabla 21 Reacción de Molisch.

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 3 mL de

Glucosa al 1%

Reactivo Fehling A Reactivo Fehling B

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ Añadir 1 ml del reactivo

Fehling A y 1 ml del ↓↓↓↓

Tubos de ensayo en un baño de agua hirviente por unos 10

minutos. ↓↓↓↓

Baño de agua hirviente por 10 minutos.

↓↓↓↓ Observar y tomar apuntes de

los cambios.

Añadir reactivo Fehling A y

reactivo Fehling B +

Baño de agua hirviente por 10 minutos.

3 ml de solución respectiva

2 con 3 Ml de sacarosa al

1%

Reactivo Fehling A Reactivo Fehling B

3 con 3 mL de

almidón al 1%

Reactivo Fehling A Reactivo Fehling B

4 con 3 mL de

jugo de cebolla al 1%

Reactivo Fehling A Reactivo Fehling B

5 con 3 mL de Fructosa al

1%

Reactivo Fehling A Reactivo Fehling B

6 con 3 mL de Lactosa al 1%

Reactivo Fehling A Reactivo Fehling B

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 3 mLde de Glucosa al 1%

reactivo de Molisch

+ H2SO4

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓

reactivo de Molisch

+ Incline el tubo y deposite 1

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8.5 PRUEBA DE TOLLENS

Esta prueba es análoga a la de Selivanoff, pero para el reconocimiento de galactosa y sus derivados. La galactosa, algunas pentosas y el ácido glucurónico dan un color rojo con el HCl y floroglucina. La glucosa da también un color rojo con la floroglucina, pero muy opaco, en contraste con el color rojo transparente de la galactosa Tabla 22 Prueba De Tollens.

2 con 3 mL de

Sacarosa al 1%

reactivo de Molisch

+ H2SO4

Agregue dos gotas de reactivo de Molisch

↓↓↓↓ Mezcle bien

↓↓↓↓ Incline el tubo y deposite 1 mL de H2SO4 concentrado deslizándolo lentamente por la pared del tubo.

↓↓↓↓ No mezcle. Sólo coloque el tubo en posición vertical y observe la formación del anillo rojo violeta

que aparece en la zona de contacto de los dos líquido

mL de H2SO4

No mezcle

3 ml de solución respectiva +

coloque el tubo en posición vertical y observe la formación del anillo rojo

violeta

3 con 3 mL de

Galactosa al 1%

reactivo de Molisch

+ H2SO4

4 con 3 mL de Ribosa 1%

reactivo de Molisch

+ H2SO4

5 con 3 mL de

Fructosa al 1%

reactivo de Molisch

+ H2SO4

6 con 3 mL de maltosa al 1%

reactivo de Molisch

+ H2SO4

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 3 mL de

solución Glucosa al 1%

α-naftol +

H2SO4

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ Agregue dos gotas de solución de

α-naftol ↓↓↓↓

Mezcle bien ↓↓↓↓

Incline el tubo y deposite 1 mL de H2SO4 concentrado deslizándolo lentamente por la pared del tubo.

↓↓↓↓ No mezcle. Sólo coloque el tubo en posición vertical y observe la formación del anillo rojo violeta

que aparece en la zona de contacto de los dos líquido

dos gotas de solución de

α-naftol +

1 mL de H2SO4

3 ml de solución respectiva

2 con 3 mL de solución de

Sacarosa al 1%

α-naftol +

H2SO4

3 con 3 mL de solución de

Galactosa al 1%

α-naftol +

H2SO4

4 con 3 mL de solución de Lactosa 1%

α-naftol +

H2SO4

5 con 3 mL de solución de

Fructosa al 1%

α-naftol +

H2SO4

6 con 3 mL de solución de

maltosa al 1%

α-naftol +

H2SO4

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8.6 REACCIÓN DE LUGOL (YODO)

La prueba de yodo se da como consecuencia de la formación de cadenas de poliyoduro a partir de la reacción entre el almidón y el yodo presente en el reactivo de lugol.

La amilosa y la amilopectina son componentes del almidón pero la amilosa es de estructura lineal, con enlaces α (1-4), que forma hélices en donde se juntan las moléculas de yodo formando un color azul oscuro; mientras que la amilopectina es de estructura ramificada, con enlaces α (1-4) (1-6), que forma hélices mucho más cortas y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse presentando un color intermedio entre anaranjado o amarillo. Tabla 23 Reacción de almidones con lugol (yoduro potásico).

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 3 ml de solución

Glucosa al 1% lugol

Preparar los tubos de

ensayo. ↓↓↓↓

Agregar 5 gotas de lugol ↓↓↓↓

Observar y tomar apuntes de los cambios.

Agregar 5 gotas de lugol

3 ml de solución respectiva

Observar y tomar apuntes de los cambios.

2 con 3 mL de

solución sacarosa al 1%

lugol

3 con 3 mL de

solución almidón al 1%

lugol

4 con 3 mL de solución

jugo de cebolla al 1%

lugol

5 con 3 mL de

solución de almidón de papa al 1%

lugol

6 con 3 mL de agua lugol

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8.7 PREGUNTAS

Explique por qué el monosacárido gliceraldehido da negativa la prueba Molish. ¿Cuáles son las aplicaciones prácticas de las pruebas estudiadas? Defina los siguientes términos: carbono anomérico, centro quiral, levorrotatorio. Dibuje los monosacáridos glucosa, galactosa, ribosa y fructosa, clasifíquelos según el número de átomos de carbono y la función principal Efectué un enlace hemiacetálico y uno hemicetálico, escriba las diferencias entre ambos enlaces. Escriba las funciones: aldehídica, cetónica, alcohólica, ácida, colóquelas en orden de reactividad y explique el porqué de ese orden. Explique en qué consiste la hidrólisis ácida de disacáridos. Defina los siguientes términos: azúcar reductor y azúcar no reductor, cite ejemplos. Efectué un enlace glucosídico.

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9 Practica 5. CARACTERÍSTICAS DE LOS ÁCIDOS GRASOS

Los lípidos (del griego lypos, grasa) son biomoléculas orgánicas formadas básicamente por C, H y O, aunque este último elemento se encuentra en proporciones mucho más bajas que los dos primeros. Además, pueden contener P, N y S. Constituyen un grupo de sustancias muy heterogéneas con características químicas diversas, pero con algunas propiedades físicas comunes, que podrían resumirse en estas dos: _ Son mayoritariamente insolubles en agua. _ Son solubles en disolventes orgánicos, tales como éter, cloroformo, alcanos (ej: hexano), benceno, acetona y alcoholes. De acuerdo a la estructura química los lípidos se clasifican en dos grupos, de acuerdo al contenido en su composición ácidos grasos (Lípidos saponificables) o no lo posean (Lípidos insaponificables). La saponificación consiste en una hidrólisis alcalina de la preparación lipídica (con KOH o NaOH). Los lípidos derivados de ácidos grasos (ácidos monocarboxílicos de cadena larga) dan lugar a sales alcalinas (jabones) y alcohol, que son fácilmente extraíbles en medio acuoso. Tabla 24 Clasificación de lípidos. Lípidos saponificables

Simples

Acilglicéridos Céridos

Complejos

Fosfolípidos Glucolípidos

Lípidos insaponificables Terpenos Esteroides Prostaglandinas

9.1 MATERIALES Y PROCEDIMIENTO.

Tabla 25 Materiales y Materiales y reactivos.

Reactivos Materiales Cantidad Aceite de girasol Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15 Agua destilada Gradilla 2 Hexano Pinza para tubos 2 Acetato de etilo Pipetas Pauster con bulbo 4 Etanol Beaker o vasos de precipitados de 500 mL 5 NaOH Estufa 1 KOH Cámara de flujo laminas 1 Reactivo Sudán III Pipetas de vidrio: 0.5 ml, 1 ml, 5 ml y 10 ml. 4 Pera de goma para pipetas 4 Vidrios reloj grandes Probeta 100 ml Balón aforado de 25 ml Agitador de vidrio Balanza analítica

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9.2 SOLUBILIDAD EN LÍPIDOS

Las grasas son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotitas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, puede sepárese en reposo, por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sitúa sobre la de agua. Por el contrario, las grasas con solubles en los llamados disolventes orgánicos como el éter, benceno, xilol, cloroformo, etc. Tabla 26 Determinación de solubilidad en lípidos.

SAPONIFICACIÓN Muchos lípidos, como por ejemplo: los ácidos grasos, reaccionan con bases fuertes, NaOH o KOH, dando sales sódicas o potásicas que reciben el nombre de jabones. Esta reacción se denomina de saponificación. Son saponificables los ácidos grasos o los lípidos que poseen ácidos grasos en su estructura. Tabla 27 Ensayo de Saponificación.

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 3 ml de

Aceite vegetal 4 mL de agua

destilada Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ 4 mL de hexano

↓↓↓↓ Agite los tubos.

↓↓↓↓ deje reposar unos minutos

Observar y tomar apuntes de los

cambios.

4 mL de hexano

3 ml de Aceite vegetal +

Agite los tubos +

Dejar en reposo. +

Observar y tomar apuntes de los cambios.

2 con 3 ml de

Aceite vegetal 4 mL de hexano

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 3 mL de

aceite vegetal

3 mL de NaOH (1 N)

Preparar los tubos de ensayo.

↓↓↓↓ Agregar 3 mL solución de NaOH

(1 N). ↓↓↓↓

Agitar. ↓↓↓↓

Baño de agua hirviente por 10 minutos.

↓↓↓↓ Dejar enfriar.

↓↓↓↓ Observar y tomar apuntes de los

cambios.

Si posible repetir el mismo procedimiento con KOH

Agregar manteca en un tubo de ensayo.

3 ml de la solución de NaOH (1 N).

+ Baño de agua hirviente por

10 minutos. Observar y tomar apuntes de

los cambios.

2 3 mL de

aceite vegetal

3 mL de KOH

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9.3 REACCIÓN CON EL SUDÁN III

El Sudán III es un colorante que se utiliza para detectar específicamente las grasas, porque es insoluble en agua y en cambio es soluble en las grasas. Al ser de color rojo, cuando se disuelve tiñe las grasas de color rojo anaranjado.

Tabla 28 Tinción: Reacción con el Sudán III.

9.4 PREGUNTAS:

¿Qué son los jabones? ¿Cómo se pueden obtener los jabones? ¿Por qué en la saponificación la glicerina aparece en la fase acuosa? ¿Qué enzima logra en el aparato digestivo la hidrólisis de las grasas? Indica lo que ocurre con las mezcla aceite – sudan III y aceite-tinta y explica a qué se debe la diferencia entre ambos resultados. ¿Qué ocurre con la emulsión de agua en aceite transcurridos unos minutos de reposo? ¿Y con la de los otros compuestos empleados? ¿A qué se deben las diferencias observadas entre ambas emulsiones? ¿Qué ocurre con la emulsión cuando se le añade detergente?

Tubos Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo

1 con 3 ml de

Aceite vegetal

Sudan III

Preparar los tubos de ensayo. ↓↓↓↓

Agregar 3mL de aceite vegetal. ↓↓↓↓

Agregar 8 gotas de Sudan III ↓↓↓↓

Observar y tomar apuntes de los cambios.

3 ml de Aceite vegetal

8 gotas de Sudan III

Observar y tomar apuntes de los cambios.

2 con 3 mL de

Aceite vegetal

Tinta roja

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10 BIBLIOGRAFÍA Bejarano, L. D. C., & de Química, P.GUÍA DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA. González, M. P. (2003). Prácticas de laboratorio y de aula Narcea Ediciones. HERNÁNDEZ-BERMÚDEZ, C.GLORIA GUTIÉRREZ-VENEGAS. Quiñones, Z. (2004). “Identificación de carbohidratos y proteínas” . Retrieved from http://lls.ulat.ac.pa/archivos/vrodrig_8-352-694/Archivos_de_Cursos/Materia_-_EFI002-Biologia_I_Grupo_-_1_Anio_-_2011-1/BQMA-SIB2.PDF Rivera, E. I. V. (2005). Prácticas de bioquímica descriptiva USON. TORRES, G. (2013). 6. DESCRIPCIÓN DE PRÁCTICAS PRÁCTICA no. 1: METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS. UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA YA DISTANCIA. Universidad de Bogotá, & Jorge Tadeo Lozano. (2014). GUÍA no 9: ENSAYOS PARA RECONOCIMIENTO DE AMINOACIDOS. Retrieved from http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/organica/guia_7_carbohidratos.pdf Universidad de la frontera, Temuco Chile. (2014). Aminoácidos. Retrieved from http://cmcc.ufro.cl/wiki/doku.php?id=molecular:aas https://sites.google.com/site/laboratoriosbioquimica/bioquimica-i/carbohidratos/reaccion-de-benedict. http://www.academia.edu/6410068/BIOQUIMICA_INF_4 Universidad Complutense de Madrid. (Marzo de 2007). UCM- Manual de Gestión de Residuos Peligroso. Recuperado el 15 de Enero de 2012, de http://www.ucm.es/info/ucmp/cont/descargas/documento28113.pdf Lineamientos para el desecho de productos químicos (s.f.). Disponible 17 de enero de 2013, en http://xml.cie.unam.mx/xml/dir/seguridad/Lineamientos_para_el_Desechos.pdf Stoscheck, C.M. (1990): Quantitation of protein. Methods in Enzymology, 182: 50-69 http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/practicasgenerales.htm http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/ http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MANUALBIOQUIMICACLINICA_10817.pdf http://veterinaria.uaemex.mx/_docs/603_958_MP%20Bioqu%C3%ADmica.pdf