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Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Agrobiotecnología Curso 2011
FitorremediaciónAlejandro Mentaberry
Agrobiotecnología
Fitorremediación
SumarioAlternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados
Fitorremediación
- Ventajas
- Limitaciones
- Tipos de plantas más utilizadas
Tipos de fitorremediación
- Fitoextracción
- Rizofiltración
- Fitotransformación
- Fitodegradación de compuestos orgánicos
- Fitoestimulación
- Fitoestabilización
Plantas transgénicas para detectar compuestos inorgánicos tóxicos en el medio ambiente
Referencias
Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Agrobiotecnología a Riley et al.b Clean up Standards for contaminated sites. New Jersey, Department of Environmental Protection(1996)c Microgramos por gramod Picocuries por gramoe Picocuries por kilogramof Stern et al.
-------0,00011-3.500.000 ePlutonio
-------0,02-46.900 eCesio
-------0,03-540.000 eEstronio
-------
250 f0,2-16.000 c
0,06-18.700 dUranio
pCi . g -1UnidadesRadionucleótidos
1.500150-5.000.000Zinc
60030-550.000Cobre
2700,1-1.800.000Mercurio
1005,1-3.950.000Cromo
20100-102.000Arsénico
100100-345.000Cadmio
6001.000-6.900.000Plomo
(mg/Kg) b(µµµµg/Kg) aMetales
Límite regulatorioRango de concentraciónElemento
Rangos de concentración comúnmente hallados y límites permitidos paralos contaminantes metálicos y los radionucleótidos más importantes
Fitorremediación
Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1998.
• Suelos- Rellenado de terrenos- Fijación química e impermeabilización
superficial
- Lixiviación y reposición del suelo
• Aguas- Precipitación o floculación- Intercambio iónico
- Osmosis inversa
- Microfiltración
Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Mercado potencial para la descontaminación ambiental en Estados Unidos mediante las tecnologías actuales
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• En los últimos 10 años se ha desarrollado un mercad o . importante para la biorremediación, principalmente en . Estados Unidos.
Productos tóxicos: ~ U$S 400.000 M Metales pesados: ~ U$S 7.100 M Metales pesados y tóxicos: ~ U$S 35.400 M
• El costo estimado para remediar los sitios utilizad os . por el Departamento de Energía Atómica por mé todos . convencionales se calculó en U$S 142.000 M
• En 2005, el mercado norteamericano de remediación . ambiental era de U$S 6.000 a 8.000 M por año.
• El mercado norteamericano de fitorremediación era d e . U$S 100-150 M anuales (0.5% del total de remediació n).
• El mercado comercial de fitorremediación comprende . 80% de contaminantes orgánicos y 20% de inorgánicos .
• El mercado de fitorremediación creció de 3 y 5 veces . entre 1999 y 2005.
La fitorremediación es económicamente competitiva respecto de otras alternativas de remediación
Adaptado de Chappell, US Environmental Protection Agency,1998.
Fitorremediación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
“Conjunto de métodos para degradar, asimilar, metabolizar o detoxificar metales pesados y compuestos orgánicos por medio de la utilización de plantas.”
“Es el empleo de vegetación parael tratamiento in situ de suelos, sedimentos y aguas contaminadas.”
Fitorremediación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Se basa en los procesos que ocurren naturalmente por los cuales las plantas
y los microorganismos rizosféricos degradan y secuestran contaminantes
orgánicos e inorgánicos
• Sustratos sólidos (suelos y sedimentos):
- sitios militares (TNT, metales, orgánicos)- campos agrícolas (herbicidas, pesticidas, metales, selenio)- sitios industriales (orgánicos, metales, arsénico)- minas (metales)- sitios de tratamiento de maderas (hidrocarburos ar omáticos policíclicos; PAHs)
• Sustratos líquidos
- aguas residuales (nutrientes, metales)- drenajes de agricultura (nutrientes, fertilizantes , metales,
arsénico, selenio, boro, pesticidas orgánicos y her bicidas)- efluentes industriales (metales, selenio)- efluentes de minería (metales)- plumas subterráneas (metales, compuestos orgánicos )
• Sustratos gaseosos
- aire libre e interior (óxidos de nitrógeno, SO 2, ozono, CO 2, gases neurotóxicos, partículas de hollín, e hidrocarburos halogenados volátiles)
La fitorremediación permite detoxificar distintos sustratos
Contaminantes orgánicos
• Son consecuencia de las actividades humanas:
- industria petroquímica (derrames de combustibles y solventes)- actividades militares (explosivos y armas químicas )- agricultura (pesticidas, herbicidas)- industria química (efluentes)- industria forestal y maderera (efluentes)
• Dependiendo de sus propiedades, pueden ser:
- degradados en la zona radicular
- incorporados a la planta degradaciónsecuestrovolatilización
• Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediación:
Solventes orgánicos, herbicidas, explosivos, hidroc arburos derivados del petróleo, bifenilos policlorinados (PCB s), tricloroetileno (TCE), hidrocarburos aromáticos poli cíclicos (PAHs).
• Pueden ser consecuencia de elementos naturales presentes en la corteza . terrestre y/o en la atmósfera, o resultado de actividades humanas:
- minería- industria- transporte- agricultura- actividades militares
• No pueden ser degradados, pero pueden fitorremediarse mediante . estabilización o secuestro en la parte cosechable de la planta.
• Ejemplos de descontaminaciones exitosas por fitorremediación:
Macronutrientes vegetales (nitrato y fosfato), elem entos traza (Cr, Cu, Fe, . Mn, Mo, Zn), elementos no esenciales (Cd, Co, F, Hg , Se, Pb, V y W), e . isótopos radioactivos ( 238U, 137Cs y 90Sr), entre otros.
Contaminantes inorgánicos
Ventajas
• Las plantas pueden ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguascontaminadas (costo 7-10 veces menor respecto de los
. métodos tradicionales).
- Las plantas emplean energía solar.- El tratamiento es in situ.
• Algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida con plantas que con microorganismos.
• Es un método apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de áreas restringidas en plazos largos.
• Es una metodología con buena aceptación pública.
• Se generan menos residuos secundarios.
Fitorremediación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Limitaciones
• El proceso se limita a la profundidad de penetraciónde las raíces o a aguas poco profundas.
• La fitotoxicidad es un limitante en áreas fuertemente contaminadas.
• Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.
• La biodisponibilidad de los compuestos o metaleses un factor limitante de la captación.
• Deben considerarse contaminaciones potencialesde la cadena alimentaria y napas de agua.
• Se requiere comprender mejor la naturalezade los productos de degradación (fitodegradación).
• Falta elaborar el marco regulatorio detallado.
Fitorremediación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Captación por las raíces:- Movilización de los metales
• Quelación mediante fitosideróforos• Unión a proteínas quelantes (fitoquelatinas)• Acidificación por exudado de H+
- Captación por la raíz
• Via apoplástica• Vía simplástica
• Transporte:- Almacenamiento en raíz o exportación al tallo por xilema- Transporte por xilema o redistribución por floema- Almacenamiento en vacuolas
• Mecanismos de evasión o tolerancia:- Captación celular limitada (evasión)
- Metabolismo tolerante a metales pesados- Detoxificación por quelación, compartimentalizacióno precipitación
• Mecanismos más probables:- Compartimentalización en vacuolas y quelación con fitoquelatinas (Cd2+, Zn2+, Cu2+ )
- Precipitación como fitatos (Zn2+)
Biología de la acumulaciónde metalesen plantas
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Mecanismos involucrados en la quelación y compartimentali-zación
Mecanismos de tolerancia para contaminantes orgánic os e inorgánicos en plantas.La detoxificación generalmente involucra la conjugación seguida del secuestro activo en la
vacuola y el apoplasto, donde el contaminante hace el menor daño. Los quelantes son: glutatión (GSH), glucosa (Glu), metalotioneínas (MT), nicotinamina (NA), ácidos orgánicos (OA,
fitoquelatinas (PC). Los transportadores se representan por cajas con flechas.
Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Bi ollogy, 2005.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Contaminante
inorgánico
Contaminante
orgánico
adsorción
pared celular
secuestro
citoplasma
secuestro
vacuola
modificación
enzimática
degradación
enzimática
conjugación
Estrategias de fitorremediación utilizadas para remediar agua, suelo o aire contaminados.
Adaptado de: Pilon-Smits, Annual Review in Plant Bi ology, 2005.
hidroponia(rizofiltración)
humedal artificial
barrera hidráulica fitoextracción y fitoestabilizacion
filtración de aire
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Plantas usadas como barrera hidráulica
para prevenir la contaminación de
napas y la dispersión horizontal de plumas.
Plantas usadas como filtros
• Selección de la especie vegetal
• Datos de toxicidad y de degradación de contaminante s
• Tasa de captación del contaminante y tiempo
de limpieza requerido
• Esquema y densidad de las plantaciones
• Costos de Irrigación, insumos agronó micos, . mantenimiento y gastos de cosecha.
• Zona de captura de agua y tasa de transpiración
• Análisis de riesgos contingentes (plagas, sequías, etc.)
Diseño de sistemas de fitorremediación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Freatófitas- Plantas de raíces profundas
(álamo, sauce, algodonero).
• Pasturas- Por su tipo de raíz retienen el suelo.
• Legumimosas- Permiten enriquecer el suelo en N2.
• Acuáticas- Permiten la degradación de contaminantes
en humedales artificiales.
Tipos de plantas más utilizadas
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Algunas especies propuestas para fitorremediación
Thlapsi caerulescens
Brassica juncea
Silene vulgaris Alyssum lesbiacum Festuca arundinacea
Hibiscus cannabinusLotus corniculatus
Agrobiotecnología
Ejemplosde pruebasde campo para fitorremediación de metales
Fitorremediación
Tomado de: Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.a: Métodos de fitorremediación. FE: fitoextracción; FV: fitovolatilización; RF: rizofiltración; FEAQ: fitoextracción asistida por quelantes; FEC: fitoextracción continua
Comentarios
La incorporación de Pb2+aplicando EDTA resultó en la reducción del 28% en la contaminación en el área en una temporada de cosecha.
Fitoextracción de suelos enmendados con barros sedimentarios. La acumulación de Zn2+
en T. caerulescensfue 10 veces mayor que en otras plantas.
Suelos enmendados con sedimentos.
El contenido de B extraiblepor agua se redujo entre 24% y 52%, y el de Se seredujo entre 13% y 48% por todas las especies.
Remoción de U de aguas subterráneas
Métodoa
FE-FEAQ
FE-FEC
FE-FEC
FE-FEC
FV
RF
Ubicación
Trenton, N.J.
Beltsville, Md.
Rothamstead, U.K.
Los Baños, California
Asthabula, Ohio
Planta
Brassica juncea
Thlapsi caerulescens
Silene vulgaris
Brassica oleracea
Raphanus sativus
Thlapsi caerulescens
Alyssum lesbiacum
Alyssum murale
Arabidopsis thaliana
Brassica juncea
Festuca arundinacea
Lotus corniculatus
Helianthus annus
Metal
Pb
Cd
Zn
Zn
Cd
Ni
Cu
Pb
Cr
Se
B
U
Comentarios
La incorporación de Pbresultó en la reducción del 28% en la contaminación en el área en una temporada de cosecha.
Fitoextracción de suelos enmendados con barros sedimentarios.
en T. caerulescensfue 10 veces mayor que en otras plantas.
Suelos enmendados con sedimentos.
El contenido de B extraiblepor agua se redujo entre 24% y 52%, y el de Se seredujo entre 13% y 48% por todas las especies.
Remoción de U de aguas subterráneas
Métodoa
FE-FEAQ
FE-FEC
FE-FEC
FE-FEC
FV
RF
Ubicación
Trenton, N.J.
Beltsville, Md.
Rothamstead, U.K.
Los Baños, California
Asthabula, Ohio
Planta
Brassica juncea
Thlapsi caerulescens
Silene vulgaris
Brassica oleracea
Raphanus sativus
Thlapsi caerulescens
Alyssum lesbiacum
Alyssum murale
Arabidopsis thaliana
Brassica juncea
Festuca arundinacea
Hibiscus cannabinus
Lotus corniculatus
Helianthus annus
Metal
Pb
Cd
Zn
Zn
Cd
Ni
Cu
Pb
Cr
Se
B
U
• Contaminantes orgánicos:No existen generalmente transportadores específicos en la planta. Se mueven por difusión en los tejidos vegetales, según sus propiedades químicas. La hidrofobicidad les permite atravesar f ácilmente la bicapa lipídica pero se mueven con dificultad por los flui dos celulares.
• Contaminantes inorgánicos :Incorporados por procesos biológicos mediante trans portadores de membrana, preexistentes porque son nutrientes o sim ilares a ellos (arsenato y selenato son incorporados por transportad ores de fosfato). Por ello, su captación es saturable .
• Los contaminantes inorgánicos causan en general tox icidad . por daños en la estructura celular (estrés oxidativ o por su . actividad redox) y reemplazan a otros nutrientes es enciales.
• Los contaminantes orgánicos suelen ser menos tó xicos: no . tienden a acumularse a altos niveles y son menos re activos.
• En los suelos con mezcla de ambos contaminantes, el . crecimiento vegetal y la posibilidad de fitorremedi ación son . más limitados
Características del contaminante que afectan la captación por la planta
Agrobiotecnología
Fitorremediación
La biodisponibilidad depende de:
• Las propiedades químicas del contaminante (hidrofob icidad. y volatilidad):
Las moléculas con extrema hidrofobicidad (PCBs, PAHs, hidrocarburos) se unen fuertemente a la materia orgánica y no se disuelven en el agua (contaminantes “recalcitrantes”).
Los contaminantes no volátiles son fitodegradados o secuestrados, mientras que los volátiles pueden liberarse a la atmósfera sin transformaciones.
• Las propiedades del suelo:
Los arcillosos (partículas pequeñas) retienen más agua que los arenosos y tienen más sitios de unión para iones (cationes), al igual que los de mayor concentración de materia orgánica (humus). Éstos pueden unir mayor cantidad de contaminantes hidrofóbicos. La biodisponibilidad de los contaminantes iónicos está afectada por el pH del suelo (pH ácido, aumenta la biodisponibilidad de cationes)
• Las condiciones medioambientales:
La temperatura y la humedad afectan la biodisponibilidad (por ejemplo, aumentando la migración de contaminantes disueltos en agua)
Factores físicos y químicos que afectan la biodisponibilidad del contaminante
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Interacciones planta-microorganismo:
- La liberación de fotosintatos por la planta aumenta la població n . microbiana capaz de remediar.
- La liberación de metabolitos secundarios de la pla nta puede activar . la expresión de genes relacionados a la degradació n de . contaminantes en los microorganismos o actuar como co-metabolitos . para la degradación por los microorganismos.
La biodisponibilidad es modificada por liberación d e:
• Biosurfactantes (ramnolípidos) liberados por bacterias que aumentan . disponibilidad de compuestos hidrofóbicos• Exhudados vegetales con compuestos que pueden promover la síntesis . de biosurfactantes por las bacterias• Enzimas (vegetales y bacterianas) que modifican las cadenas laterales de . algunos compuestos orgánicos aumentando su biodisponibilidad.• Quelantes por plantas y bacterias (sideróforos, ácidos orgánicos y . fenólicos) que aumentan disponibilidad de metales.• Secreción de H + por las plantas que acidifican el suelo.• Enzimas que convierten los metales a formas menos tóxicas o más . biodisponibles (por ejemplo, Cr VI a Cr III)
Factores biológicos que afectan la biodisponibilidad del contaminante
Agrobiotecnología
Fitorremediación .
Procesos que requieren aumentar los conocimientos para aumentar la eficiencia de la fitorremediación:
• Interacciones planta- microorganismo y otros procesos . rizosféricos
• Captación por la planta
• Mecanismos de traslocación
• Mecanismos de tolerancia (compartimentalización, . degradación)
• Quelantes vegetales involucrados en transporte y . almacenamiento
• Movimiento de los contaminantes en los ecosistemas . vía el sistema suelo-agua-planta hacia niveles tróf icos . superiores
Aspectos que requieren de mayor investigación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Agrobiotecnología
Tipos de fitorremediación
Fitorremediación
Las bases conceptuales de la fitorremediación se apoyan en los mecanismospresentes en plantas que hiperacumulanmetales
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Adaptado de: Buchanan et al., Biochemisty and Molecular Biology of Plants, 2000.
Fitoestimulación
Acumulación o degradación en el tejido cosechable
Fitovolatilización
FitodegradaciónMicroorganismo
que degrada toxinas
Toxina
Fitoestabilización
Fitoextracción
Fitorremediación
• FitoextracciónLas plantas se usan para concentrar metales en las partes cosechables (principalmente, la parte aérea).
• RizofiltraciónLas raíces de las plantas se usan para adsorber, precipitar y concentrar metales pesados a partir de efluentes líquidos contaminados.
• FitoestimulaciónSe usan los exudados radiculares para promover el desarrollo de microorganismos degradativos (bacterias y hongos).
• FitoestabilizaciónLas plantas tolerantes a metales se usan para reducir la movilidad de los mismos y evitar el pasaje a napas subterráneas o al aire.
• Fitotransformación- Fitodegradación: Las plantas acuáticas y terrestres captan, almacenan y degradan compuestos orgánicos para dar subproductos no tóxicos o menos tóxicos.
- Fitovolatilización: Las plantas captan y modifican metales pesados o compuestos orgánicos y los liberan a la atmósferamediante la transpiración.
Tipos de fitorremediación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Fitoextracción:
Usada principalmente para remediar metales y otros tóxicos inorgánicos .. (Se, As, radionucleótidos).
• Rizofiltración:
Técnica relativamente cara de implementar, siendo ú til para cantidades . pequeñas de aguas residuales conteniendo compuestos inorgánicos. peligrosos (radionucleótidos). Los humedales artif iciales se utilizan para . una amplia gama de contaminantes inorgánicos (metales, percloratos, cianuro, . nitratos y fosfatos) y contaminantes orgánicos (explosivos y herbicidas).
• Fitoestimulación:
Es usado para remediar contaminantes orgánicos hidrofóbicos que no pueden . ser incorporados por la planta pero que pueden ser degradados por los . microorganismos (PCBs, PAHs e hidrocarburos derivado s del petróleo).
Las diferentes estrategias de fitorremediación son adecuadas para distintos contaminantes
• Fitoestabilización:
Este técnica es usada cuando se plantan coberturas vegetales en sitios . conteniendo contaminantes orgánicos o inorgánicos ; o cuando se usan . árboles como barreras hidráulicas para permitir el filtrado de contaminantes . orgánicos e inorgánicos .
• Fitodegradación:
Es útil para compuestos orgánicos que se movilizan dentro de la planta, . (herbicidas, TNT, MTBE y TCE).
• Fitovolatilización:
Puede utilizarse para compuestos orgánicos con formas volátiles (TCE y . MTBE) y para algunos compuestos inorgánicos que pueden existir en forma . volátil (Se y Hg).
Las diferentes estrategias de fitorremediación son adecuadas para distintos contaminantes
Fitoextracción • Se utiliza para el tratamiento de contaminaciones c on metales (Cd 2+, Co2+, Cr2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Se2+, Zn2+).
• Características deseables en la planta:- Debe tolerar y acumular altas concentraciones de metalesen las partes cosechables
- Debe tener una alta tasa de crecimiento - Debe producir un gran volumen de biomasa
4258 ± 16820.574 ± 429559 ± 12175 ± 16Cd2+ (5)1
ThlapsiBrassicaThlapsiBrassicaMetal
RaícesTallos
8.425 ± 422011.475 ± 1252.739 ± 383587 ± 115Ni2+ (1)
8.545 ± 42205.486 ± 39389 ± 1580 ± 8Cr2+ (0,4)
60.716 ± 2151055.809 ± 9221623 ± 265159 ± 32Cu2+ (1)
2.990 ± 14241.816 ± 1739770 ± 32049 ± 31Zn2+ (3)
7.011 ± 36161.432 ± 140929 ± 233 ± 1Pb2+ (5)
Coeficiente de bioacumulación ± DE
1 Concentración inicial del metal en solución (mg/L)
Coeficiente de bioacumulación: relación entre la acumulación en el tejido (µg/g de peso seco) y concentración en solución (mg/L) o en suelo.
Agrobiotecnología
FitorremediaciónTomado de: Salt et al., Biotechnology 1995.
• Plantas típicas empleadas en fitoextracción:
• Hiperacumuladores:
- Girasol (Helianthus annuus)
- Mostaza de la India (Brassica juncea)- Nabos (Brassica napus; B. rapa)
- Cebada (Hordeum vulgare)
- Lúpulo (Humulus lupulus)- Ortigas (Urtica dioica; U. urens),
- Diente de León (Taraxacum officinale)
- Thlapsi caerulescens- Brassica juncea- Pelargonium spp..- Allysum lesbiacum
Fitoextracción
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Los metales en el suelo pueden estaren distintas formas:
• Como iones o complejos insolubles
• Adsorbidos a constituyentes inorgánicos del suelo o unidos a sitios de intercambio
• Unidos a moléculas orgánicas
• Como compuestos o precipitados insolubles(óxidos, carbonatos, hidróxidos)
• Integrados a la estructura de los silicatos
Formas de incrementar la biodisponibilidad:
• Agregado de quelantes de metales
• Establecimiento de un pH moderadamente ácido
• Disolución de surfactantes para contaminantes hidrofóbicos
• Agregado de microorganismos
Fitoextracción
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Esquema de fitoextracción continua y asistida por quelantes
Concentración de Pb2+ en tallos de Brassica juncea en un suelo contaminado con plomo (600 mg/kg de suelo) tratado con EDTA.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Adaptado de: D. E. Salt et al., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998.
Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.
Fase de crecimiento Cosecha
Fase de captaciónde metal
Fase de captaciónde metal
Fase de crecimiento Cosecha
Aplicacióndel quelante
La línea sólida naranja ( ) representa la concentración de metal en la biomasa, la línea discontinua ( ) representa la biomasa de tallo.
Con
cent
raci
ón d
e P
b2+en
tallo
s (µ
g/g)
EDTA aplicado (mmol/kg suelo)
Fitoextracción continua
Fitoextracción asistida por quelantes
Acumulación de metalesy toleranciaa manganesoen plantasde tabacoque expresanel gen cax2de Arabidopsis
• El transporte de metales desde el citosol a la vacuola es un componente importante para la tolerancia a metales en las plantas.
• El intercambiador de Ca2+ CAX2 (Calcium Exchanger 2) de Arabidopsises un regulador clave de este proceso.
• La expresión del gen cax2 en células de Saccharomyces cereviciaesuprime defectos en el crecimiento debidos a excesos de Ca2+ y Mn2+.
• Se transformaron plantas de tabaco con el gen cax2 dirigido por el promotor de 35S de CaMV. La secuencia se introdujo también en antisentido para usar esta construcción como un control interno.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Ensayo de tolerancia a Mn2+
en cepas de Saccharomycescereviciae que expresan el intercambiador CAX2.
Control: cepa salvaje de S. cereviciaecnb: cepa de S. cereviciae mutada en el gen de calcineurina (suceptibilidad a Mn2+) Vector: cepas transformadas con el vector vacío CAX2: cepas transformadas con el gen cax2
Vector ControlCAX2 Control Vector cnbCAX2 cnb
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol. 2000.
Las plantas de tabaco que expresan CAX2 acumularon más Ca 2+, Cd2+ y Mn2+ y fueron más tolerantes a niveles elevados de Mn 2+.
Concentración de iones en las raíces (izquierda) y en los tallos (derecha) de plantas transgénicas. Vector: controles transformados con el vector vacío. C-14: línea transformada con el gen cax2. Los ensayos se realizaron complementando el medio con 10 mM Cl2Ca, 0,1 µM Cl2Cd ó 0,1 mM Cl2Mn.
Captación de iones en vacuola de células de raíces de plantas que expresan el gen cax2. A: transporte de Cd2+; 10 µM total Cd2+. B: transporte de Mn2+; 100 µM total Mn2+. C: transporte de Ca2+; 10 µM total Ca2+.
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000. Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
Acumulación de metalesy toleranciaa manganesoen plantasde tabacoque expresanel gen cax2de Arabidopsis
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Vector CAX2
µg/g
pes
o se
co
µg/
g pe
so s
eco
µg/
g pe
so s
eco
µg/
g pe
so s
eco
Control
C-21
C-14
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
AT
rans
port
e de
ione
s (n
mol
es/m
g de
pro
teín
a)
Tiempo (min)Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
B
Tra
nspo
rte
de io
nes
(nm
oles
/mg
de p
rote
ína)
Tiempo (min)
Tomado de: Hirschi et al., Plant Physiol., 2000.
C
Tra
nspo
rte
de io
nes
(nm
oles
/mg
de p
rote
ína)
Tiempo (min)
Las plantas acuáticas emplean dos mecanismos para separar metales y otros contaminantes (incluyendo radioisótopos) de aguas polucionadas:
- Reacción superficial rápida independiente del metab olismo:proceso de difusión que finaliza cuando los iones metálicos solubles se unen o adsorben a la pared celular. Puede removercantidades significativas en minutos.
- Reacción de incorporación intracelular lenta dependi ente del metabolismo: proceso de transferencia desde la pared celular al interior de la célula. Demanda horas o días.
Lemna minor Microspora
Remociónde metales utilizando algas y plantas acuáticas
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Tomado de: Axtell et al., Bioresource Technology, 2003.
Remociónde metales utilizando Lemna minor
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Tiempo (h)
Con
cent
raci
ón d
e N
i 2+
(mg/
L)C
once
ntra
ción
Pb2
+(m
g/L)
Tiempo (h)
0,0 mg/L Pb 2+
5,0 mg/L Pb 2+
10,0 mg/L Pb 2+
Modelo
0,0 mg/L Pb 2+
5,0 mg/L Pb 2+
10,0 mg/L Pb 2+
Modelo
0,0 mg/L Ni2+
2,5 mg/L Ni2+
5,0 mg/L Ni2+
Modelo
0,0 mg/L Ni2+
2,5 mg/L Ni2+
5,0 mg/L Ni2+
Modelo
Concentración inicialde Ni 2+ : 5 mg/L
Concentración inicialde Pb2+ : 10 mg/L
Rizofiltración• Se emplea en el tratamiento de contaminaciones por:
- Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, Ni2+, Cu2+)- Radioisótopos (137Cd, 90Sr, U)- Compuestos orgánicos hidrofílicos
• Características deseables en la planta:
- Debe tener raíces de crecimiento rápido y ramificación abundante.- Debe poder remover metales tóxicos por períodos prolongados.- No debe ser un translocador eficiente al tallo.
• La remoción tiene distintos componentes:
- Componente rápido: combinación de procesos físicos y químicos (quelación, intercambio iónico, adsorción); puede ocurrir en raíces muertas.
- Componentes intermedios: Incluyen captura intracelular, deposición en la vacuola y translocación a los tallos.
- Componente lento: precipitación mediada por la raíz; involucra exudados de la raíz.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Las plantas acuáticas son buenos candidatos para encarar procesos de rizofiltración
Rizofiltración
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Flujo vertical
Capas de
arena y
grava Eflujo
Scirpusvalidus
Esquema de rizofiltración basado en Scirpus validus
-
- Scirpus validus- Typha latifolia- Ceratophyllum demersum- Potamogeton pectinatus- Maranta arundinaceae- Lemna spp
• Plantas acuáticas emergentes:• Plantas acuáticas sumergentes:- Algas- Chara vulgaris- Myriophyllum aquaticum- Myriophyllum spicatum- Hydrilla verticillata
Rizofiltraciónde uranio usando cultivos de raíces de Brassica junceay Chenopodiumamaranticolor
Agrobacterium rhizogenes es capaz de transformar raíces y provocar el sobrecrecimiento de las mismas.
Tejido radicular de Brassica juncea y de Chenopodiumamaranticolor.
Se utilizaron raíces transformadas de ambas especie s para remover U de soluciones con baja concentración .
Tasa de acumulación de U en raíces de Brassica juncea y de Chenopodiumamaranticolor. Los valores se expresan como µg U/g tejido seco.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.
Concentración de U (µM)
C. amaranticolor
µg
U/g
tejid
o se
co
µg
U/g
tejid
o se
coB. juncea
Concentración de U (µM)
C. amaranticolorB. juncea
• Se utilizaron raíces transformadas de ambas especie s para remover U de soluciones con alta concentración .
• Para todas las concentraciones utilizadas, el 90% del U fue absorbido por las raíces dentro de las 10 hde tratamiento.
Tasa de acumulación de U en raíces de Brassica juncea y de Chenopodium amaranticolor .Los valores se expresancomo µµµµg U/g tejido seco.
Las raíces transformadas de ambas especies podrían usarse como bioabsorbentes de uranio, para lo cual podrían producirse a gran escala en biorreactores.
Tomado de: Eapen et al., Environmental Research, 2003.
Rizofiltraciónde uranio usando cultivos de raíces de Brassica junceay Chenopodiumamaranticolor
Agrobiotecnología
Fitorremediación
B. juncea
C. amaranticolor
Concentración de U (µM)
µg
U/g
D.w
.t. (
X10
3 )
Empleada en tratamientos de contaminación por:
• Herbicidas (atrazina, alaclor)• Aromáticos (BTEX: benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos)• Alifáticos clorinados (TCE: tricloroetileno; tetracloroetileno)• Deshechos de nutrientes (NO3
-, NH4+, PO4
3-)• Deshechos explosivos (TNT; RDX: hexahidrotrinitrotriazina)
Depende de:
• Concentración del compuesto disuelto en el suelo
• Eficiencia de captura, que depende de:- las propiedades físico-químicas del compuesto- especie química- propiedades de la especie vegetal
• Tasa de transpiración, que depende de:- el tipo de planta- área foliar- nutrientes- humedad del suelo- temperatura- viento- humedad relativa
Fitotransformación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
La fitotransformació n comprende los procesos de fitodegradación y fitovolatilización
- Almacenamiento del producto (o de sus productos de .degradación) vía conjugación o lignificación
- Metabolización a distintos productos de degradación
- Volatilización por la transpiración
- Mineralización (CO2 + H2O)
• Plantas típicas empleadas en fitotransformación:
- Arboles freatófitos (álamo, sauce, álamo americano)
- Pasturas (centeno, sorgo, festuca)
- Leguminosas (trébol, alfalfa, caupí)
Fitotransformación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Una vez translocado, el compuesto puede tener los siguientes destinos:
Fitodegradación de compuestos orgánicos
Las plantas pueden desarrollar una serie de reaccio nes para metabolizar o mineralizar compuestos orgánicos
Completan la degradación del TNT. Aparentemente involucradas en la incorporación de fragmentos de anillos aromáticos en la biomasa vegetal
Intervienen en la lignificación y delignificación por adición de oxígeno
Lacasas
Procesan grupos cianidados de los anillos aromáticos en herbicidas y otros compuestos cianidados
Detoxifican compuestos aromáticos cianamidados naturales
Nitrilasas
Deshalogenan solventes clorinadosEstán vinculadas a la degradación de subproductos de etileno durante la senescencia
Deshalogenasas
Empleadas en el tratamiento de aguas residuales para degradar fenoles
Degradan en forma no específica compuestos fenólicos, lignina, y otros
Peroxidasas
Procesan grupos fosfato de pesticidas organofosfatados y de compuestos que afectan el sistema nervioso
Su rol es el procesamiento de fosfato durante el desarrollo
Fosfatasas
Reducen grupos nitrato en explosivos y otros compuestos nitroaromáticos y remueven el nitrógeno del anillo aromático
Su función es la reducción de nitrato para obtener nitrógeno destinado al crecimiento celular
Nitroreductasas
Aplicaciones en fitorremediaciónRol naturalEnzimas
Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin, 1998.
• Las té cnicas tradicionales se basan en la . incineración o en utilizació n de microorganismos . e implican remoción del suelo
• La alternativa frente a las técnicas tradicionales fue . usar sistemas de fitorremediación:
- Cultivos celulares de remolacha que degradan nitroglicerina (GNT)
- Plantas acuáticas y cultivos de raíces que biotransforman. trinitroglicerina (TNT)
• El éxito fue limitado, ya que la GNT sólo pudo ser . denitrificado a di- y mononitroglicerol; la remoción . completa de grupos nitratos no se logró nunca.
• Además, la degradación de TNT produjo la . acumulación de otra toxina: aminodinitrotolueno.
• Otra desventaja es que las plantas captan y . metabolizan los compuestos nitrogenados 10 veces . más lentamente que los microorganismos.
Contaminación con explosivos
Agrobiotecnología
Fitorremediación
ADNT: aminodinitrotolueno;DANT: diaminonitrotolueno; TAT: triaminotolueno;TNT: trinitrotolueno
Rutas de degradacióndel TNT mediante nitroreductasasy lacasasvegetales
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Tomado de: McCutcheon, PBI Bulletin 1998.
Crecimiento brotes de tabaco no transformado y tran sgénico(NR 3-2) en medio líquido.
Detoxificaciónde TNT por plantas de tabaco transformadas con el gen de nitroreductasade Enterobactercloacae Crecimiento de plantas de tabaco no transformado y t ransgénicas (NR 3-2)
luego de la germinación en medio conteniendo explosi vos.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
Sin TNT TNT 0,25 mM
NT NR 3-2 NT NR 3-2
Sin TNT TNT 0,05 mM TNT 0,1 mM
NTNT NR 3-2NR 3-2 NTNT NR 3-2NR 3-2 NTNT NR 3-2NR 3-2
Crecimiento de raíces para brotes de plantas no tra nsformadas (NT) y transgénicas (NR 3-2) luego de 21 días de exposic ión a TNT
Detoxificación de TNT por plantas de tabaco que expresan el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae
e.s.= Error estándar Indice de tolerancia = longitud de las raíces de brotes tratados con TNT/longitud de las raíces de brotes control x 100
NT NR 3-2
TNT (mM)
Longitud de las raíces (cm ± e.s.)
0
0,05
0,1
8,1 ± 0,1
5,5 ± 0,6
0,2 3
68
100
Indice de tolerancia de las raíces (%)
8,1 ± 0,1
6,2 ± 0,9
5,5 ± 0,9 68
77
100
Longitud de las raíces (cm ± e.s.)
Indice de tolerancia de las raíces (%)
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
Estudios de toxicidad de TNT en plantas no transformadas (NT) y transgénicas (NR 3-2)
Detoxificación de TNT por plantas de tabaco que expresan el gen de nitroreductasa de Enterobacter cloacae
Tomado de: Hannik et al., Nature Biotechnology, 2001.
NT NR 3-2
TNT (mM)
Peso antes del TNT (g)
Peso después del TNT (g)
Ganancia / pérdida de peso (g)
0
0,1
0,25
11,37 ± 0,17
11,2 ± 0,14
11,59 ± 0,01 7,59 ± 0,19
11,3 ± 0,02
-4,00 ± 0,21
+0,13 ± 0,15
+5,52 ± 0,4516,9 ± 0,28
Peso antes del TNT (g)
Peso después del TNT (g)
Ganancia / pérdida de peso (g)
11,08 ± 0,05
11,4 ± 0,95
11,93 ± 0,18 13,95 ± 1,20
14,65 ± 0,07
-2,02 ± 1,01
+3,24 ± 0,88
+5,79 ± 0,2316,88 ± 0,18
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
• El explosivo hexahidro 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX) es tóxico para todo tipo . de organismos y un posible carcinógeno. Su degradac ión ambiental es muy lenta . y su presencia en suelos y napas de agua constituye un problema grave.
• El RDX es tóxico para las plantas. El hongo Phanerochaete chrysosporium y las . bacterias del género Rhodococcus son capaces de degradar RDX, pero no . desarrollan suficiente biomasa para ser utilizados en procesos de biodegradación.
• La molécula responsable de la degradación es un cit ocromo P450. Como prueba . de concepto, se aisló el gen de citocromo P450 XplA de Rhodococcus. rhodocochrous y se lo expresó en plantas de Arabidopsis thaliana . Las plantas .. fueron utilizadas en ensayos de detoxificación de su elos contaminados con RDX.
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
Ruta de degradación de RDX por el citocromo P450 cod ificado por el gen XplA de R. rhodocochrous y ensayos de actividad realizados con proteína expresada en E. coli. Los controles fueron realizados con proteína someti da a 100oC.
4-nitro-2,4-diazabutanal
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
Caracterización de plantas transgénicas que expresa n el gen XplA
a) Análisis de Northern y Western blot de líneas de A. thaliana que expresan el gen XplA en forma constitutiva.
b) Captación de RDX de medio acuoso por plántulas d e A. thaliana . Los resultados son el promedio de repeticiones de cinco experimentos.
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
Tomado de: Rylott et al., Nature Biotechnology, 2006.
Estudios en suelos contaminados con RDX empleando p lantas wild type y transformadas con 35S::XPLA. Se cultivaron plantas de A. thaliana de 8 semanas de edad en suelo conteniendo
50, 250, 500 y 2000 mg de RDX/Kg de suelo. Se muestr an las mediciones de biomasa (tallos y raíces) obtenidos en las diferentes condiciones exp erimentales (promedio de cinco ensayos).
Detoxificación de RDX por plantas de Arabidopsis que expresan el gen XlpA de Rhodococcus rhodocochrous
Principales interconversiones del mercurio en el medio ambienteEl ciclo biogeoquímico del mercurio y de la biomagnificaciónde metilmercurio
Agrobiotecnología
FitorremediaciónHg(0): mercurio elementalHg(II): mercurio iónico libreRSHg: mercurio unido a azufreMeHg: metilmercurio
• No se conocen plantas capaces de detoxificar Hg.
• En cambio, existen microorganismos presentes en los sitios contaminados que poseen dos enzimas (organomercúricoliasa, gen merB, y mercúrico reductasa, gen merA) que permiten convertir metilmercurio en Hg elemental, detoxificado este metal.
• Se transformaron plantas de Arabidopsis thaliana con los dos genes mencionados aislados de Desulfovibrio desulfuricans.
Expresiónde los genes merA y mer Bde Desulfovibriodesulfuricansen plantas transgénicasde Arabidopsis thaliana
Agrobiotecnología
Fitorremediación
R-CH2-Hg+ + H+ R-CH3 + Hg(II)MerB
Hg(II) + NADPH Hg(0) + NAD+ + H+
MerA
R-CH2-Hg+ + H+ R-CH3 + Hg(II)MerB
Hg(II) + NADPH Hg(0) + NAD+ + H+
MerA
MerB: organomercúrico liasaMerA: mercúrico reductasa
Plantas NT y transgénicas creciendo en medios con m ercurio orgánico.
Tasas de volatilización de Hg(0)en plantas control y en 6 líneas transgénicas de A. thaliana
0 µµµµM 1 µµµµM 5 µµµµM 10 µµµµM
merB merA/B-1 merA NT merB merA/B-1 merA NT merB merA/B-1 merA NT merB merA/B-1 merA NT
Tomado de: Bizily et al., Nature Biotechnology, 2000.
Fenotipos de resistencia a mercurio orgánico de plantas control y de 3 líneas transgénicas para merA/merB
pgH
g(0)
.min
-1/m
gde
te
jido
Líneas de plantas
Expresiónde los genes merA y mer Bde Desulfovibriodesulfuricansen plantas transgénicasde Arabidopsis thaliana
Agrobiotecnología
Fitorremediación
0 µµµµM PMA 5 µµµµM PMA
NT A/B-1 A/B-2 A/B-3A/B-1 A/B-2 A/B-3
A/B-4 A/B-5 A/B-6 A/B-4 A/B-5 A/B-6
NT
Fitorremediación de organomercurialesvía transformación de cloroplastos (genes merAy mer B de Desulfovibriodesulfuricans) Efecto de la concentración de acetato de fenilmercu rio en el crecimiento
de plantas de tabaco controles (NT) y transgénicas (5A y 9)
Agrobiotecnología
Fitorremediación
Tomado de: Ruiz et al., Plant Physiol., 2003.
Concentración de P
MA
NT 5A 9
Se transformaron cloroplastos de tabaco con dos versiones de esta construcción con y sin región 3´ no traductible (3´ UTR) portando el operón MerAB
16S→→→→ trnI →→→→ aadAaadA merBmerB trnA →→→→
P 3´UTR
merA
Aumento de la acumulacióny tolerancia a selenio en plantas transgénicasde Arabidopsisque expresanla enzima selenocisteína liasa I de ratón
• La toxicidad del selenio (Se) se debe a la . incorporación inespecífica de selenocisteí na . (Se-Cys) a las proteínas.
• Estrategia:
Expresar el gen de la selonocisteína liasa de ratónen citoplasma y cloroplastos de Arabidopsis thaliana
Se-Cys Se elemental + alaninaSe-Cys liasaAgrobiotecnología
Fitorremediación
Aumento de la acumulacióny tolerancia a selenio en plantas transgénicas de Arabidopsisthaliana
Incorporación de Se a proteínasen brotes de Arabidopsis thaliana no transgénicas (NT) y transgénicas (citosólicas y plastídicas)
Toleranciaa Se-Cys
selenato y selenito de
brotes de Arabidopsis
no transgénicosy transgénicos.
Agrobiotecnología
Fitorremediación
cyt SL cp SL
Control
50 µM Se-Cys
25 µM SeO2-3
50 µM SeO2-4
Larg
o de
raí
ces
(mm
)
Control
50 µM Se-Cys
25 µM SeO2-3
50 µM SeO2-4
Tomado de: Pilon et al. , Plant Physiol., 2003. NT
µg S
e g
prot
ein
-1
cit SL cp SL
µg S
e g
prot
ein
-1
cit SL cp SL
NT
• Las plantas proveen el hábitat para el incrementoen el tamaño y actividad de poblaciones microbianas.
• Los exudados vegetales estimulan lastransformaciones efectuadas por las bacterias (inducción enzimática).
• La síntesis de carbón orgánico aumenta la tasade mineralización microbiana (enriquecimiento de sustrato).
• El oxígeno que difunde con las raí ces asegura un medio adecuado para las transformaciones
. aeróbicas.
• Los hongos micorríticos asociados a las raíces vegetales metabolizan contaminantes orgánicos.
Fitoestimulación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Empleado en el tratamiento de contaminación orgánic a causada por pesticidas (atrazina ), compuestos
. aromáticos, e hidrocarburos aromáticos policíclicos
. (PAHs)
• Se basa en la liberación por la planta de exudados entre los que se incluyen:
- ácidos orgánicos de cadena corta- compuestos fenólicos- bajas concentraciones de enzimas y péptidos
• Plantas típicas empleadas en fitoestimulación:
- Liberadoras de compuestos fenólicos (mora,
manzano, Maclura pomífera)- Pastos con raíces fibrosas (centeno, festuca)
para contaminantes hasta 1 metro de profundidad
- Arboles freatófitos para contaminantes hasta 3 metros de profundidad
- Plantas acuáticas para sedimentos
Fitoestimulación
Agrobiotecnología
Fitorremediación
• Empleada en el tratamiento de contaminación por:
- Metales (Pb2+, Cd2+, Zn2+, As2+, Cu2+, Se2+, U)- Compuestos orgánicos hidrofóbicos: hidrocarbonos
aromáticos policiclícos (PAHs), bifenilospoliclorados (PCBs), dioxinas, furanos, pentaclorofenol, DDT, dieldrina
• Características deseables en la planta:
- Debe tolerar altos niveles de metales tóxicos- Debe inmovilizar los metales vía captura
y posterior precipitación y reducción- Debe acumular bajas concentraciones en las
raíces
• Plantas típicas empleadas en fitoestabilización:
- Arboles freatrófitos que transpiren grandes volúmenes de H2O
- Pastos con raíces fibrosas que estabilicenla erosión del suelo
- Plantas con sistemas radiculares robustoscapaces de absorber/unir contaminantes
Fitoestabilización
Agrobiotecnología
Fitorremediación
1. Pilon-Smits. Phytorremediation. Annual Review of Plant Biology, 56:15-39. 2005.
2. Eapen and D’Souza. Prospects of genetic engineering of plants for phytoremediation of toxic metals. Advances in Biotechnology, 23:97-114, 2005.
3. Mejáre, M. and Bulow, L. Metal binding proteins and peptides in bioremediation and phytoremediation of heavy metals. Trends in Biotechnology, 19:67-73, 2001.
4. Kovalchuk, O., Titov, V. Hohn, B. and Kovalchuk, I. A sensitive trangenic plant system to detect toxic inorganic compounds in the environment. Nature Biotechnology, 19:568-572, 2001.
5. Salt, D. E., Smith, R.D., and Raskin I. Phytoremediation. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 49:643-668, 1998.
6. http://www.hawaii.edu/abrp/Technologies
7. http://www.envirotools.org/factsheets/phytoremediation.shtml
Referencias
Agrobiotecnología
Fitorremediación