Upload
marysol
View
50
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
VETAGRO SUP CAMPUS VETERINAIRE DE LYON
Année 2012 - Thèse n°
COMPARAISON DE DIFFERENTES COLORATIONS POUR LA
MISE EN EVIDENCE DES PROTOZOAIRES DANS LA
COPROSCOPIE DES RUMINANTS
THESE
Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I
(Médecine - Pharmacie)
et soutenue publiquement le 21 décembre 2012
pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire
par
CHANUDET Jeanne Née le 10 mars 1987
à Mâcon (71)
2
3
LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT
4
5
REMERCIEMENTS
Au président de ma thèse, Monsieur le Professeur Jean-Alain CHAYVIALLE,
Professeur à l’Université Claude Bernard de Lyon,
Pour m’avoir fait l’honneur de présider mon jury de thèse, pour sa disponibilité,
Hommages respectueux.
A Monsieur le Professeur Lionel ZENNER,
Professeur à VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,
Pour avoir dirigé ce travail, pour ses conseils avisés,
Sincères remerciements.
A Madame le Docteur Marie-Anne ARCANGIOLI,
Maître de conférences à VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,
Pour son aide et pour avoir eu la gentillesse de juger cette thèse et d’être mon deuxième
assesseur,
Sincère reconnaissance.
A Madame Marie-Thérèse POIREL,
Technicienne au service de parasitologie de VetAgro Sup, Campus vétérinaire de Lyon,
Pour sa patience, sa disponibilité et ses précieux conseils,
Sincère gratitude.
Au personnel des LVD et LDA contactés,
Pour leurs réponses et l’intérêt qu’ils ont portés à cette étude.
Aux éleveurs et vétérinaires,
Pour leur aide indispensable à la réalisation de ce travail.
6
A mes parents,
Pour tout l’amour et le soutien que vous m’apportez chaque jour,
Pour la confiance que vous m’avez toujours accordée et la liberté dans laquelle j’ai grandi,
Je suis fière d’être votre fille.
A mon frère Pierre,
La vie nous a malheureusement séparés trop tôt, mais je sais que tu resteras toujours à mes
côtés et dans mes pensées,
Ma réussite est aussi la tienne.
A mes grands-parents,
Ce que je suis aujourd’hui, je vous le dois, merci.
A toute la famille Chanudet,
Pour ces rendez-vous café au Tari le dimanche matin, et tous vos sourires.
A ma tante Odile,
Pour ton soutien pendant toutes ces années.
A ma cousine Marie,
Grâce à toi, j’ai pu découvrir l’Espagne où tu es comme un poisson dans l’eau.
A toute la famille Chamonard,
Pour tous ces souvenirs de vacances ensemble.
7
TABLE DES MATIERES
Table des illustrations ...................................................................................................................................................... 13
Table des figures .......................................................................................................................................................... 13
Table des tableaux ....................................................................................................................................................... 14
Introduction générale ....................................................................................................................................................... 17
Partie I : Partie bibliographique .................................................................................................................................... 19
Introduction .................................................................................................................................................................... 20
I. Les protozoaires et les différents tests diagnostiques en coproscopie ............................................... 21
A. Les principaux protozoaires détectables en coproscopie .................................................................. 21
1. Cryptosporidium parvum ....................................................................................................................... 21
a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 21
b) Cycle ........................................................................................................................................................ 21
c) Morphologie .......................................................................................................................................... 22
d) Pathogénie et signes cliniques.......................................................................................................... 23
2. Eimeria spp. ................................................................................................................................................ 23
a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 24
b) Cycle ........................................................................................................................................................ 24
c) Morphologie .......................................................................................................................................... 25
d) Pathogénie et signes cliniques.......................................................................................................... 26
3. Giardia intestinalis ................................................................................................................................... 27
a) Taxonomie.............................................................................................................................................. 27
b) Cycle ........................................................................................................................................................ 27
c) Morphologie .......................................................................................................................................... 28
d) Pathogénie et signes cliniques.......................................................................................................... 29
4. Autres protozoaires .................................................................................................................................. 30
B. Les différents tests diagnostiques réalisables sur un échantillon de selles .................................. 32
1. Techniques microscopiques ................................................................................................................... 32
a) Examen direct des selles .................................................................................................................... 32
b) Examen des selles après coloration ................................................................................................ 32
2. Techniques immunologiques................................................................................................................. 33
8
a) Immunofluorescence directe ............................................................................................................ 33
b) ELISA ...................................................................................................................................................... 34
c) Immunochromatographie .................................................................................................................. 34
3. Technique de biologie moléculaire : PCR ........................................................................................ 36
II. Préparation de l’échantillon à l’examen microscopique ........................................................................ 37
A. Les modalités de prélèvement et conservation de l’échantillon...................................................... 37
1. Techniques de prélèvements ................................................................................................................. 37
2. Conservation des échantillons .............................................................................................................. 38
B. Matériel nécessaire à la réalisation d’un examen microscopique des selles ............................... 39
C. Méthodes de concentration des parasites ............................................................................................... 40
1. Méthodes physiques ................................................................................................................................. 40
a) Concentration par flottation .............................................................................................................. 40
b) Concentration par sédimentation ..................................................................................................... 42
2. Méthodes diphasiques ............................................................................................................................. 42
D. Réalisation et fixation du frottis ................................................................................................................ 45
1. Etalement des selles ................................................................................................................................. 45
2. Fixation des frottis .................................................................................................................................... 46
E. Lutage ................................................................................................................................................................ 48
F. Montage ............................................................................................................................................................ 49
III. Les différentes méthodes de coloration pour la détection des protozoaires ................................ 50
A. Forme végétative............................................................................................................................................ 50
1. Colorations entre lames et lamelles ..................................................................................................... 50
a) Méthode de Bailenger et Faraggi .................................................................................................... 51
b) MIF ou méthode de Sapero, Lawless et Strome ......................................................................... 51
2. Fixation –coloration d’un frottis humide ........................................................................................... 52
a) Technique en trois temps ................................................................................................................... 52
Méthodes à l’hématoxyline ................................................................................... 52 i).
Trichrome (Gomori-Wheatley).............................................................................. 54 ii).
b) Techniques en un temps ..................................................................................................................... 54
3. Coloration d’un frottis sec ...................................................................................................................... 55
a) Méthode de Brooke et Goldman ..................................................................................................... 55
b) Giemsa ..................................................................................................................................................... 56
B. Forme kystique ............................................................................................................................................... 57
9
1. Colorations entre lames et lamelles ..................................................................................................... 57
a) Méthode de Bailenger et Faraggi .................................................................................................... 57
b) MIF ........................................................................................................................................................... 57
c) Colorations iodées ............................................................................................................................... 58
d) Coloration au saccharose ................................................................................................................... 59
e) Méthode de Heine ................................................................................................................................ 60
f) Coloration négative à la nigrosine .................................................................................................. 61
2. Fixation –coloration d’un frottis humide ........................................................................................... 61
a) Techniques en trois temps ................................................................................................................. 61
Méthodes à l’hématoxyline ................................................................................... 61 i).
Trichrome (Gomori-Wheatley).............................................................................. 62 ii).
b) Technique en 1 temps ......................................................................................................................... 62
3. Coloration d’un frottis sec ...................................................................................................................... 62
a) Giemsa ..................................................................................................................................................... 63
b) Les méthodes de Ziehl-Neelsen....................................................................................................... 63
Méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen .............................................. 63 i).
Autres modifications de la méthode de Ziehl-Neelsen .......................................... 65 ii).
c) Méthode de Brooke et Goldman ..................................................................................................... 65
d) Méthode à fluorescence ..................................................................................................................... 66
Auramine-fuchsine carbolique .............................................................................. 66 i).
Auramine-phénol ................................................................................................... 67 ii).
Mépacrine .............................................................................................................. 67 iii).
Conclusion ...................................................................................................................................................................... 69
Partie II : Bilan sur les méthodes de diagnostic des protozoaires digestifs en France et étude
expérimentale comparative de techniques de coloration rapides pour la mise en évidence des
protozoaires intestinaux .................................................................................................................................................. 71
I. Introduction .......................................................................................................................................................... 72
II. Matériels et méthodes ....................................................................................................................................... 73
A. Recueil de données et d’échantillons ...................................................................................................... 73
1. Modalités de contact ................................................................................................................................ 73
2. Zone et période d’étude .......................................................................................................................... 73
3. Collectes et modalités de prélèvement des échantillons ............................................................... 74
B. Préparation du questionnaire et des échantillons ................................................................................. 75
1. Réalisation du questionnaire ................................................................................................................. 75
10
2. Préparation des échantillons en vue de la coloration ..................................................................... 75
3. Dilution des échantillons ........................................................................................................................ 76
C. Modalités de coloration et de lecture des prélèvements .................................................................... 78
1. Coloration des prélèvements ................................................................................................................. 78
a) La coloration par une solution de saccharose.............................................................................. 78
b) La méthode de Heine ou coloration à la fuchsine ...................................................................... 79
c) La méthode de Ziehl-Neelsen modifiée ........................................................................................ 79
d) La coloration au lugol ......................................................................................................................... 79
2. Lecture des lames...................................................................................................................................... 80
D. Etude statistique ............................................................................................................................................. 82
III. Résultats ........................................................................................................................................................... 83
A. Enquête sur les méthodes de détection des protozoaires en coproscopie en France ................ 83
1. Les colorations en routine lors d’analyse coproscopique de jeunes bovins dans les
laboratoires départementaux ........................................................................................................................... 84
2. Les colorations lors de demande de recherche de Cryptosporidium ........................................ 84
3. Les colorations lors de demande de recherche de Giardia .......................................................... 86
4. Critères de choix des colorants par les laboratoires ....................................................................... 88
B. Comparaison de quatre techniques de coloration en coproscopie .................................................. 89
1. Comparaison de la sensibilité des colorants vis-à-vis de trois genres courants de
protozoaires .......................................................................................................................................................... 89
a) Comparaison pour le genre Cryptosporidium ............................................................................. 89
b) Comparaison pour le genre Giardia ............................................................................................... 94
c) Comparaison pour le genre Eimeria .............................................................................................. 97
2. Comparaison de la spécificité des colorants ..................................................................................... 99
a) Genre Cryptosporidium ...................................................................................................................... 99
b) Genre Giardia .................................................................................................................................... 101
c) Genre Eimeria .................................................................................................................................... 104
3. Comparaison de la mise en pratique des différentes techniques de coloration de formes
parasitaires de protozoaires .......................................................................................................................... 109
a) Temps de préparation ...................................................................................................................... 109
b) Coût des différentes techniques de coloration ......................................................................... 109
c) Facilité de lecture des différentes techniques ........................................................................... 110
11
4. Comparaison de différentes durées des étapes de la coloration de Ziehl-Neelsen modifiée
111
IV. Discussion ..................................................................................................................................................... 113
A. Enquête sur les méthodes de détections des protozoaires digestifs en France ........................ 113
B. Méthodologie ............................................................................................................................................... 116
C. Comparaison des 3 méthodes de coloration ....................................................................................... 118
1. Pour la recherche de C. parvum ........................................................................................................ 118
2. Pour la recherche de G. intestinalis .................................................................................................. 120
3. Pour la recherche d’Eimeria ............................................................................................................... 121
Conclusion générale ...................................................................................................................................................... 125
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ............................................................................................................... 129
ANNEXES ....................................................................................................................................................................... 145
Annexe 1 : Les sites de prédilections, les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria chez les
bovins ............................................................................................................................................. 146
Annexe 2 : Les sites de prédilections et les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria chez les
ovins ............................................................................................................................................... 147
Annexe 3 : Les sites de prédilections et les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria chez les
caprins ............................................................................................................................................ 148
Annexe 4 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces d’Eimeria
présentes chez les bovins ................................................................................................................ 149
Annexe 5 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces d’Eimeria
présentes chez les ovins .................................................................................................................. 151
Annexe 6 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces d’Eimeria
présentes chez les caprins ............................................................................................................... 153
Annexe 7 : Protocole de coloration par la méthode de Bailenger et Faraggi ................................. 155
Annexe 8 : Protocole de coloration par la méthode M.I.F. ............................................................ 156
Annexe 9 : Protocole de coloration de la technique d’Heindenhain .............................................. 157
Annexe 10 : Protocole de la méthode de coloration de Trichrome de gomori-Weathley .............. 158
Annexe 11 : Protocole de la méthode de coloration au noir chlorazol de Kohn ............................ 159
Annexe 11 : Protocole de coloration par la méthode de Brooke et Goldman ................................ 160
Annexe 12 : Protocole de la méthode de coloration de Giemsa ..................................................... 161
Annexe 13 : Protocole de coloration au lugol ................................................................................ 162
Annexe 14 : Protocole de coloration au saccharose ....................................................................... 163
Annexe 15 : Protocole de coloration pour la méthode de Heine .................................................... 163
Annexe 16 : Protocole de la coloration négative à la nigrosine ..................................................... 164
12
Annexe 17 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen et
Pohlenz ........................................................................................................................................... 165
Annexe 18 : Protocole de la technique de Ziehl-Neelsen modifiée par Angus .............................. 166
Annexe 19 : Protocole de coloration de diméthylsulphoxyde-Ziehl-Neelsen ................................ 167
Annexe 20 : Protocole de coloration à l’auramine-fuchsine carbolique ........................................ 168
Annexe 21 : Protocole de coloration à l’auramine-phénol ............................................................. 169
Annexe 22 : Protocole de coloration à la mépacrine ...................................................................... 170
Annexe 23 : Questionnaire envoyé aux laboratoires ...................................................................... 171
Annexe 24 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée choisie pour l’étude
expérimentale ................................................................................................................................. 172
13
TABLE DES ILLUSTRATIONS
TABLE DES FIGURES
Figure 1 : Cycle parasitaire de Cryptosporidium parvum [Fayer et al. (1990)] ............................................ 22
Figure 2 : Cycle parasitaire du genre Eimeria.......................................................................................................... 25
Figure 3 : Paramètres clés de diagnostic morphologique d’un oocyste de coccidie [Dorchies et al.
(2012)] .................................................................................................................................................................................. 26
Figure 4 : Cycle de Giardia intestinalis [à l'aide du site centers for Disease control and Prevention] ... 28
Figure 5 : Schémas d’un trophozoïte et d’un kyste de Giardia [Magne et al. (1996)] ................................ 29
Figure 6 : Schéma d’une tigette [Depierreux et al. (2001)] ................................................................................. 35
Figure 7 : Schéma des étapes de la méthode de flottation [Beugnet (2000)] ................................................. 41
Figure 8 : Tubes après centrifugation lors d’une méthode diphasique [OMS, 1997] .................................. 43
Figure 9 : Les trois étapes de réalisation d’un frottis ............................................................................................. 45
Figure 10 : Répartition des laboratoires départementaux ayant répondu ........................................................ 83
Figure 11 : Part des laboratoires utilisant chaque colorant en routine ............................................................. 84
Figure 12 : Pourcentage d’utilisation des colorants lors de recherche de C. parvum .................................. 85
Figure 13 : Tarifs de recherche de C. parvum pour des méthodes de colorations et pour des méthodes
immunologiques ................................................................................................................................................................ 86
Figure 14 : Pourcentage d’utilisation des colorants lors de recherche spécifique de Giardia ................... 87
Figure 15 : Tarifs de recherche de kystes de giardia pour des méthodes de colorations et pour des
méthodes immunologiques ............................................................................................................................................ 87
Figure 16 : Critères de choix des laboratoires de leur méthode de coloration ............................................... 88
Figure 17 : Nombre d’échantillons, dans chaque catégorie de semi-quantification de C. parvum, pour
les 4 méthodes de coloration ......................................................................................................................................... 91
Figure 18 : Nombre d’échantillons, dans chaque catégorie de semi-quantification de kystes de giardia,
pour les 4 méthodes diagnostiques étudiées ............................................................................................................. 96
Figure 19 : Nombre d’échantillons dans chaque catégorie de quantité d’Eimeria pour les 4 méthodes
diagnostiques étudiées ..................................................................................................................................................... 98
Figure 20 : Oocystes de C. parvum par la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée (objectif x40) ............... 99
Figure 21: Oocystes de C. parvum par dans une solution de saccharose (objectif x40) ......................... 100
Figure 22: Oocystes de C. parvum sur une lame colorée par du lugol (objectif x40) .............................. 100
Figure 23 : Oocystes de C. parvum dans une solution de fuchsine (objectif x40) .................................... 101
Figure 24 : Kystes de giardia sur une lame non colorée (à gauche) et dans une solution de saccharose
(objectif x40) ................................................................................................................................................................... 102
Figure 25 : Kystes de giardia colorés par du lugol (objectif x40) .................................................................. 103
Figure 26 : Kystes de giardia et artefact colorés par la méthode de Heine (objectif x40) ...................... 103
Figure 27 : Oocystes d’Eimeria photographiés sur des lames non colorées (objectif x40) ................... 105
Figure 28 : Oocystes d’Eimeria dans une solution de saccharose (objectif x40) ..................................... 106
Figure 29 : Oocystes d’Eimeria colorés par le lugol (objectif x40) .............................................................. 107
Figure 30 : Oocystes d’Eimeria colorés par la fuchsine (objectif x40) ....................................................... 108
14
TABLE DES TABLEAUX
Tableau I : Résultats du nombre d’oocystes de Cryptosporidium parvum à l’aide des 4 colorations .... 90
Tableau II : Résultats du nombre d’oocystes de Cryptosporidium parvum à l’aide des 4 colorations sur
des dilutions ........................................................................................................................................................................ 93
Tableau III: Résultats du nombre de kystes de Giardia à l’aide des 4 colorations ....................................... 95
Tableau IV: Résultats du nombre d’oocystes d’Eimeria à l’aide des 4 colorations ..................................... 97
15
TABLE DES ABREVIATIONS
ADN Acide désoxyribonucléique
ARN Acide ribonucléique
CR Corps résiduel
C. parvum Cryptosporidium parvum
E. Eimeria
G. intestinalis Giardia intestinalis
LDA Laboratoire départemental d’analyse
LVD Laboratoire vétérinaire départemental
MIF Merthiolate Iode Formol
PCR Réaction de polymérase en chaîne
Z-N Ziehl-Neelsen
16
17
INTRODUCTION GENERALE
En médecine vétérinaire, comme en médecine humaine, les protozoaires digestifs sont
fréquemment rencontrés. Ils ont une grande importance d’un point de vue économique et
sanitaire, par les signes cliniques provoqués mais aussi par leur aspect zoonotique important
pour certains.
Le diagnostic de protozoose digestive se fait souvent par coproscopie. C’est un acte
non invasif et le prélèvement est facile à réaliser. De nombreux laboratoires sont qualifiés
pour l’analyse des selles, des vétérinaires équipés peuvent également réaliser cette analyse
directement au cabinet.
La coproscopie peut aussi être utilisée pour la réalisation de diagnostic d’élevage dans
le but d’avoir un bilan de l’infestation des protozoaires ainsi que des trématodes et des
nématodes.
Pour que cet examen puisse être réalisé en clientèle, il faut que la technique utilisée
soit rapide, demande peu de matériel, que les solutions nécessaires soient facile d’accès et non
toxiques mais aussi que la réalisation et la lecture soit aisée.
Pour la détection des protozoaires digestifs, la principale difficulté est la petite taille
des éléments parasitaires. Ils sont donc parfois difficiles à visualiser et peuvent être facilement
confondus avec des débris, des spores végétales ou des levures. Il peut donc être utile et
parfois indispensable d’utiliser un colorant pour mettre en évidence ces éléments parasitaires
dans les selles.
Dans un premier temps, les différentes étapes de la coproscopie, de la réalisation du
prélèvement jusqu’à l’observation microscopique, vont être développées. Les éléments
parasitaires de protozoaires et les différentes techniques permettant leur mise en évidence
vont être cités et les méthodes de coloration permettant la mise en évidence de ces éléments
parasitaires vont être décrites.
Dans un second temps, une enquête sur les méthodes de diagnostic des protozoaires en
laboratoires vétérinaires départementaux français ayant été réalisée pour ce travail sera
18
étudiée permettant ainsi d’avoir un point de vue sur les différentes méthodes utilisées
actuellement. Puis, trois méthodes de colorations rapides testées sur trois genres de
protozoaires majeurs chez les ruminants vont être comparées sur différents points de la
sensibilité à leur mise en pratique.
19
PARTIE I : PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
20
INTRODUCTION
Le diagnostic de suspicion des infections par les protozoaires digestifs se fait de façon
clinique mais il est nécessaire de faire une analyse en laboratoire pour avoir le diagnostic de
certitude. L’analyse de la présence des protozoaires dans les selles est la recherche la plus
courante. Pour que le diagnostic soit correct, il faut que toutes les étapes de ces analyses se
déroulent convenablement, du prélèvement au choix de la technique utilisée et sa réalisation.
Aujourd’hui de nombreuses méthodes de diagnostic des protozoaires dans les selles sont
développées. Dans cette partie bibliographique, il va tout d’abord être question des
protozoaires les plus couramment rencontrés en coproscopie chez les jeunes ruminants ainsi
que des différents types de techniques développées pour la recherche de ces protozoaires. Par
la suite, les modes de prélèvement et les étapes de préparation de l’échantillon de selles en
vue d’une coproscopie vont être détaillés. En dernier lieu, les nombreuses techniques de
coloration de matière fécale pour la recherche des formes végétatives et kystiques des
protozoaires vont être exposées.
21
I. LES PROTOZOAIRES ET LES DIFFERENTS TESTS DIAGNOSTIQUES
EN COPROSCOPIE
A. LES PRINCIPAUX PROTOZOAIRES DETECTABLES EN COPROSCOPIE
Parmi les nombreux parasites détectés lors d’une coproscopie chez les ruminants, nous
allons nous intéresser plus spécialement aux protozoaires. Différents protozoaires sont
retrouvés dans les fèces, sous une forme kystique ou végétative.
1. Cryptosporidium parvum
Cryptosporidium parvum est un parasite rencontré fréquemment chez l’homme et
l’animal. Il est reconnu depuis plus de 20 ans comme un agent majeur de diarrhée néonatale
chez les ruminants et donc associé à des pertes économiques importantes [Naciri et al.
(2000)]. Il a été identifié pour la première fois par Tyzzer en 1907 [O’Hara et Chen (2011)].
a) Taxonomie
Ce parasite appartient au groupe des Sporozoaires, au phylum des Apicomplexa, il fait
partie de la classe des Coccidea et de l’ordre Eimeriida.
Le genre Cryptosporidium compte une vingtaine d’espèces, 3 sont présentes chez les
ruminants : C. andersoni, C. bovis et C. parvum, cette dernière est l’espèce majeure [Bowman
(2003), Fayer et al. (2005), Lindsat et al. (2000)]. C. parvum n’est pas spécifique d’une espèce
(elle touche un grand nombre d’espèces animales ainsi que l’Homme) et sa répartition est
mondiale.
b) Cycle
C. parvum est un parasite monoxène et son cycle est très rapide, la période prépatente est
de 4 jours.
Après l’ingestion d’oocystes par un hôte, les 4 sporozoïtes contenus dans l’oocyste sont
libérés au niveau de la bordure en brosse et vont s’attacher aux cellules épithéliales
22
intestinales. Le sporozoïte passe alors en position intracellulaire et devient un trophozoïte. Un
trophozoïte va donner plusieurs mérontes. Il existe 2 types de mérontes, les mérontes de type I
qui vont infecter d’autres cellules épithéliales (auto-infection), et les mérontes de type II qui
vont donner des macrogamontes et des microgamontes. La fusion d’un microgamonte avec un
macrogamonte donne un zygote qui devient un oocyste. Les oocystes sont alors émis dans la
lumière intestinale. Deux types d’oocystes sont émis dans la lumière, des oocystes à paroi fine
dont l’excystation se fait dans le tube digestif de l’animal (ce qui participe à un phénomène
d’auto-infection) et des oocystes à paroi épaisse qui sont une structure de résistance dans le
milieu extérieur [O’Handley et Olson (2006)].
Figure 1 : Cycle parasitaire de Cryptosporidium parvum [Fayer et al. (1990)]
c) Morphologie
Les oocystes de C. parvum sont difficiles à voir dans les fèces du fait de leur petite
taille et de leur absence de couleur.
Ils sont de forme ovoïde à sphéroïde. Ils mesurent environ 5 µm de longueur pour 4,5
µm de largeur. La paroi des oocystes est épaisse ce qui lui procure une grande résistance dans
le milieu extérieur. Les 4 sporozoïtes, en demi-lune, situés dans les oocystes sont
difficilement discernables en microscopie optique, ils donnent au contenu des oocystes un
aspect granuleux [Beugnet et al. (2004)].
23
d) Pathogénie et signes cliniques
Chez les ruminants, la présence de ces parasites au niveau de la bordure en brosse
provoque des modifications morphologiques qui induisent une malabsorption et une mauvaise
digestion des aliments. Le mécanisme n’est pas très bien connu, mais la pénétration du lactose
non digéré dans le gros intestin favoriserait la croissance bactérienne et la formation d’acides
gras libres volatiles. Cette accumulation de nutriments hypertrophiques non absorbés dans la
lumière du gros intestin provoquerait la diarrhée.
La diarrhée est également due à un phénomène d’hypersécrétion dans la lumière
intestinale.
Les ruminants atteints de cryptosporidiose clinique, sont âgés de 5 jours à 3 semaines.
Les premiers signes sont souvent une anorexie et une apathie, la diarrhée survient
généralement le lendemain. Les animaux présentent alors une diarrhée aigüe aqueuse plutôt
jaunâtre qui entraine un état de déshydratation plus ou moins sévère. En moyenne la durée de
la diarrhée est de 6 à 10 jours. Certains auteurs signalent que les cryptosporidies seules
n’engendrent pas de diarrhée, celle-ci ne survient seulement que lorsque d’autres agents
pathogènes sont associés à C. parvum [Naciri et al. (1999)].
Chez certains animaux, l’infection par C. parvum provoquerait uniquement un
amaigrissement [O’Handley et Olson (2006)].
Chez les chevreaux, la cryptosporidiose engendre une très forte morbidité et la
mortalité est plus élevée que chez les veaux et les agneaux.
2. Eimeria spp.
Les parasites du genre Eimeria sont responsables de la coccidiose. C’est une maladie
parasitaire très fréquente chez de nombreuses espèces animales et sa répartition est mondiale.
Son influence économique est très importante du fait de sa prévalence et de sa
morbidité. Une enquête réalisée en 2006, montre que sur 10 élevages étudiés dans l’Allier,
tous présentent au moins 4 veaux excréteurs [Richard et al. (2006)]. En Vendée, une autre
étude a été réalisée sur des élevages laitiers, 14 élevages sur 15 présentent des veaux
excréteurs [Denis et al. (2008)]. L’importance économique de cette maladie est due aux pertes
24
occasionnées lors de coccidiose clinique chez les jeunes ruminants, mais également lors de
coccidiose sub-clinique engendrant des retards de croissance [Chartier (2002)].
a) Taxonomie
Le genre Eimeria fait partie du phylum des Apicomplexa, et de l’ordre des Eimeriida
tout comme le genre Cryptosporidium.
Chez les bovins, il existe au moins 13 espèces d’Eimeria, 11 sont retrouvées chez les
ovins et 9 chez les caprins [Taylor et al. (2007)]. Chaque espèce d’Eimeria présente une
spécificité d’hôte très stricte.
Toutes ces espèces ne sont pas pathogènes. Les espèces E. zuernii, E. bovis sont les
plus pathogènes chez les bovins [Navetat et al. (1996)], E. alabamensis l’est également. De
nombreuses espèces de coccidies ne le sont pas comme E. auburnensis, E. brasiliensis, E.
bukidnonensis, E. canadensis, E. cylindrica, E. ellipsoidalis, E. pellita, E. subspherica et E.
wyomingensis.
Chez les ovins, les espèces E. crandallis et E. ovinoidalis sont hautement pathogènes
alors que les autres ne provoquent aucun signe clinique chez les agneaux.
Chez les caprins parmi les 9 espèces de coccidies, 4 sont pathogènes : E. caprina, E.
ninakohlyakimovae, E. christenseni et E. hirci.
b) Cycle
Le cycle est identique pour toutes les coccidies, seul le site de prédilection des
parasites change selon les espèces d’Eimeria.
Suite à l’ingestion d’oocystes sporulés, les sporozoïtes sont libérés au niveau du
jéjunum sous l’action de la bile et de la trypsine. Ils vont alors pénétrer dans les cellules
épithéliales dans des sites de prédilection au niveau de l’intestin ; ces sites sont différents
selon l’espèce d’Eimeria (voir annexes 1, 2 et 3). C’est à ce niveau que se déroule la
mérogonie (ou schizogonie), les mérozoïtes (ou schizozoïtes) alors formés font éclater les
cellules dans lesquelles ils se trouvent et infectent d’autres cellules voisines. Ces mérozoïtes
vont alors subir la gamogonie ce qui aboutit à la formation des gamètes, puis la fusion de
25
ceux-ci donne un zygote et par la suite un oocyste non sporulé. L’oocyste est éliminé dans la
lumière du tube digestif donc dans les selles suite à l’éclatement de la cellule dans laquelle il
est situé
La durée des cycles est différente selon l’espèce d’Eimeria, les périodes prépatentes
varient de 10 à 30 jours, (voir annexes 1, 2 et 3).
Dans certaines conditions d’humidité et de température, les oocystes sporulent, c’est la
sporogonie, les oocystes contiennent alors 4 sporocystes contenant chacun 2 sporozoïtes.
Figure 2 : Cycle parasitaire du genre Eimeria
c) Morphologie
La morphologie des oocystes varie selon les espèces ce qui permet leur différenciation.
Les oocystes coccidiens sont subsphériques. Leur taille est en général supérieure à 10 µm de
longueur pour 10 µm de largeur [Beugnet et al. (2004)], elle n’excède pas 50 µm de longueur
et 40 µm de largeur [Taylor et al. (2007)]. Ils sont entourés par une paroi relativement épaisse.
26
Figure 3 : Paramètres clés de diagnostic morphologique d’un oocyste de coccidie [Dorchies
et al. (2012)]
Les oocystes sporulés sont composés de 8 sporozoïtes. Etant donné l’absence de
pouvoir pathogène de nombreuses espèces de coccidies, il est utile de déterminer l’espèce
présente, pour cela il existe des clés de diagnostic morphologique (voir annexe 4, 5 et 6).
L’identification est possible grâce à la taille, la couleur, la forme, la présence ou non de
micropyle ou de calotte micropylaire, ainsi que la forme des sporocystes dans les oocystes
sporulés [Daugcshies et Ditmtmar (2007)].
d) Pathogénie et signes cliniques
La destruction des cellules épithéliales par les coccidies engendre souvent de la
diarrhée chez les animaux atteints.
En cas de faible infestation, seule une forme subclinique est présente, les animaux
présentent alors un retard de croissance. Les formes chroniques peuvent provoquer de
l’anorexie et prédisposent aux infections secondaires. L’infection par les coccidies produit
une réponse immunitaire cellulaire et humorale protectrice.
Lors de plus forte infestation, les animaux ont une diarrhée profuse hémorragique avec
des épreintes. Ils présentent également une perte d’appétit, ils deviennent plus faibles et se
déshydratent. Il existe une forme nerveuse relativement fréquente chez les veaux à
l’engraissement et plus rare chez les petits ruminants. Les animaux présentent des
27
trémulations musculaires, de l’incoordination, des convulsions et des pertes d’équilibres
[Adjou et al. (2006)].
Les signes cliniques engendrés par les différentes espèces de coccidies sont légèrement
différents. Lors d’une infection par E. zuernii, les veaux présentent une diarrhée hémorragique
noirâtre avec du mucus, des épreintes, de l’anémie, ainsi que des troubles nerveux. Pour E.
bovis, la diarrhée est plus claire et n’est pas hémorragique [Institut de l’élevage (2000)].
Les animaux atteints de coccidiose sont les jeunes ruminants, âgés de 3 à 8 semaines
environ.
3. Giardia intestinalis
Ce parasite a été observé pour la première fois en 1681 par Antony Van Leeuwenhoek
dans ses propres selles diarrhéiques [Burke (1977)]. Il a été reconnu comme cause de diarrhée
chez l’homme depuis 1892. Tout comme C. parvum, il est de plus en plus étudié depuis les
années 80 en raison de son potentiel zoonotique. En effet, il provoque de la diarrhée chez des
personnes immunodéficientes atteintes par le virus de l’immunodéficience humaine.
a) Taxonomie
Le genre Giardia fait partie des Flagellés, il appartient au phylum des
Sarcomastigophora, au subphylum Mastigophora, à la classe des Zoomastigophora et à l’ordre
des Diplomonadida [Magne et al. (1996)]. L’espèce principale de ce genre est Giardia
intestinalis, elle est également appelée G. lamblia et G. duodenalis.
Ce parasite est retrouvé chez de nombreuses espèces de mammifères dans le monde
[Taylor et Webster (1998)].
b) Cycle
Suite à l’ingestion d’un kyste, des trophozoïtes sont libérés dans le tube digestif de
l’animal hôte. Ces trophozoïtes subissent alors une multiplication asexuée par division binaire
et colonisent alors l’intestin grêle. Les trophozoïtes adhèrent à l’épithélium grâce à un disque
28
ventral. Chez les ruminants, on retrouve les trophozoïtes sur toute la longueur de l’intestin
mais ils sont plus nombreux au niveau du jéjunum.
Puis les trophozoïtes s’enkystent et sont éliminés avec les fèces [O’Handley et Olson
(2006)].
La période prépatente est en moyenne de 14 jours [Jokipii et Jokipii (1977)].
Figure 4 : Cycle de Giardia intestinalis [à l'aide du site centers for Disease control and
Prevention]
c) Morphologie
Le trophozoïte est piriforme. De face, il mesure 10 à 20 µm de long sur 6 à 10 µm de
large, on peut distinguer 2 noyaux à l’intérieur. De profil, il présente une dépression au niveau
de la face ventrale : c’est un disque d’adhésion, il se prolonge par une extrémité effilée et
quatre paires de flagelles (2 paires en position antérolatérale, une en position ventrale et une
paire postérieure). La face dorsale est convexe.
Les kystes sont ovoïdes ou elliptiques, ils mesurent 10 à 13 µm de long sur 8 à 9 µm
de large. Ils possèdent 2 à 4 noyaux et contiennent des flagelles groupés en un faisceau
réfringent dans l’axe longitudinal [Magne et al. (1996)].
29
Figure 5 : Schémas d’un trophozoïte et d’un kyste de Giardia [Magne et al. (1996)]
d) Pathogénie et signes cliniques
La pathogénie de G. intestinalis est discutée, certains chercheurs comme Björkman et
Huentink ont montré que ce n’était pas une cause de diarrhée chez les ruminants [Björkman et
al. (2003), Huentink et al. (2001)]. En effet, dans une étude effectuée en Vendée, sur les 20
élevages caprins étudiés, des kystes de giardia ont été retrouvés dans toutes les fermes, il a
aussi été montré qu’il n’y avait pas de relation entre la quantité de kystes excrétés et une
diarrhée survenue chez les chevreaux en post-sevrage [Castro-Hermida et al. (2005)].
Des articles ont décrit qu’il existait un lien entre l’infection par des giardias et un
affaiblissement voir l’apparition d’une légère diarrhée [Olson et al. (1997)]. Pour finir
certaines études ont mis en évidence un lien direct entre l’excrétion de Giardia dans les selles
et la présence de diarrhée chez des veaux de moins de 3 mois [Xiao et al. (1993), O’Handley
et al. (1999), St Jean et al. (1987)].
La plupart du temps l’affection est asymptomatique. Cependant, lorsqu’elle est
symptomatique, elle est plutôt chronique et provoque de la diarrhée, une perte de poids ainsi
qu’un affaiblissement [Taylor et Webster (1998)].
Lors de giardiose la diarrhée est muqueuse et fluide, l’appétit et la prise de boisson
sont conservés [Pitel et al. (2005)].
La giardiose est considérée par certains comme n’étant pas une cause majeure de
diarrhée chez les ruminants et ayant un impact économique faible [O’Handley et Olson
(2006)].
30
4. Autres protozoaires
Il existe d’autres protozoaires chez les ruminants, ceux-ci sont retrouvés de façon
moins fréquente que les trois premiers genres étudiés.
Le parasite Blastocystis hominis est responsable de diarrhée chez l’homme [Zierdt
(1991), Taylor et Webster (1998)], il est également retrouvé chez les ruminants. Sa taxonomie
est controversée, il a parfois été placé parmi les protozoaires, notamment par les travaux de
Zierdt en 1967. Grâce aux avancées en biologie moléculaire, de plus récentes études ont
rapproché le genre Blastocystis des Straménopiles [cités par Tan (2004)].
Buxtonella sulcata est un protozoaire appartenant au phylum ciliophora [Taylor et al.
(2007)]. Ce parasite est un pathogène incertain, il pourrait être la cause de colites ulcératives
et de diarrhées chez les bovins.
Il possède une forme végétative, celle-ci est ciliée, et se multiplie dans le colon. Elle
présente 2 noyaux : un macronucleus réniforme et un micronucleus. Des vacuoles digestives
sont également visibles. Sa taille est d’environ 60 à 138 µm de longueur pour 46 à 100 µm de
large. Cette forme végétative possède un grand nombre de cils courts sur tout son pourtour.
Comme pour le genre Giardia, la reproduction se fait par fission binaire.
Dans les matières fécales, la forme retrouvée est la forme kystique. Les kystes sont de
forme ovale à ronde et mesurent de 55 à 130 µm, mais la taille des kystes diminue dans les
jours suivant l’excrétion. Ils sont de couleur jaunâtre et présentent une double membrane. On
retrouve les deux noyaux présents dans la forme végétative mais le micronucleus est difficile
à observer vu sa localisation dans la concavité du macronucleus [Dorchies et al. (2012)].
31
A retenir :
Les genres de protozoaires les plus fréquents chez les jeunes ruminants sont
Cryptosporidium, Giardia et Eimeria.
Les genres Giardia et Cryptosporidium ont une grande importance par leur potentiel
zoonotique, ainsi que par leurs graves conséquences sur les jeunes animaux ce qui provoque
de grandes pertes économiques. La pathogénie du genre Giardia reste cependant discutée.
Ces protozoaires digestifs sont présents chez de très jeunes ruminants, à partir de 7 jours pour
C. parvum, tandis qu’on ne retrouve le genre Eimeria qu’à partir de 3 semaines.
Pour le genre Eimeria, seul quelques espèces sont pathogènes, il est donc important de faire
un diagnostic d’espèce lors de la présence de coccidies dans les matières fécales.
Ces différents protozoaires pathogènes chez les jeunes ruminants doivent être
diagnostiqués afin d’administrer un traitement adapté aux animaux et de mettre en place des
mesures sanitaires pour éliminer ou limiter ce problème dans l’élevage.
32
B. LES DIFFERENTS TESTS DIAGNOSTIQUES REALISABLES SUR UN ECHANTILLON
DE SELLES
Avant tout examen sur les selles, un examen macroscopique doit être réalisé. La
couleur, la consistance, la présence ou non de mucus ou de vers de grande taille sont notées.
1. Techniques microscopiques
Lors d’un examen coproscopique, il est important de faire systématiquement un
examen direct des fèces puis un examen après concentration et/ou coloration.
a) Examen direct des selles
L’examen direct des selles est la méthode la plus simple et rapide. Elle permet
d’étudier les caractères de mobilité des formes végétatives de protozoaires lorsque les fèces
sont fraiches (moins de 3 heures environ).
Une petite quantité de selles est mélangée à du sérum physiologique sur une lame et
recouverte d’une lamelle. Toute la lamelle est parcourue à faible grossissement. Si un élément
est observé, un plus fort grossissement est alors utilisé pour l’identifier. Par la suite, les zones
les plus minces du frottis sont également observées au plus fort grossissement (objectif x 40).
Cette méthode a de nombreux avantages, elle est très rapide et demande un minimum
d’équipement. Une petite quantité de selles est suffisante, mais l’examen est par conséquent
moins représentatif. La lecture peut parfois être difficile étant donné la présence de débris
fécaux sur la lame [Hendrix (1998)].
b) Examen des selles après coloration
L’examen microscopique des selles nécessite parfois une coloration surtout lors de
recherche de protozoaires dont la petite taille ne facilite pas leur observation. Les colorations
peuvent être réalisées après concentration ou non. Différentes colorations permettent la mise
en évidence des protozoaires digestifs dans leurs formes végétatives ou kystiques. Les
colorations seront détaillées par la suite.
33
2. Techniques immunologiques
Les techniques immunologiques se sont vite développées car celles-ci sont rapides et
faciles à réaliser en laboratoire et en clientèle (immunochromatographie). Contrairement aux
colorations, les résultats ne sont pas dépendants de l’opérateur [Diaz-Lee et al. (2011)].
a) Immunofluorescence directe
L’immunofluorescence directe est une technique de coloration utilisant des anticorps
monoclonaux, dirigés contre le parasite, auxquels est lié un colorant fluorescent.
Il existe des kits commercialisés pour la détection de Cryptosporidium et/ou de
Giardia [Tangtrongsup et Scorza (2010), Scorza et Tangtrongsup (2010)]. Une étape de
sédimentation ou de flottation est recommandée avant l’utilisation de ces kits pour concentrer
les parasites [Kehl et al. (1995)].
Cette technique est très spécifique et permet l’obtention de résultats clairs et non
ambigus contrairement à certaines colorations classiques [Baron et al. (1989), Alles et al.
(1995)]. En 1996, une étude réalisée sur la détection de Cryptosporidium dans des fèces de
bovins et de porcs, a montré que l’immunofluorescence est plus sensible qu’une méthode de
coloration Ziehl-Neelsen modifiée [Quílez et al. (1996)].
L’immunofluorescence est très facile à lire mais nécessite un microscope à
fluorescence. Elle n’est donc pas réalisable dans tous les laboratoires ni dans une clinique
vétérinaire, mais elle est rapide et peu onéreuse. Dans une étude, il a été montré qu’elle
prenait moins de temps aux techniciens qu’une coloration de Ziehl-Neelsen modifiée par
Kinyoun ou qu’un test ELISA. De plus, le coût du test est inférieur à celui des deux tests
ELISA étudiés mais supérieur à une coloration [Kehl et al. (1995)]. Une autre étude montre,
au contraire, que cette technique est longue lorsque la concentration de parasite est faible, et
qu’il semble judicieux de la coupler avec de la cytométrie de flux permettant d’analyser un
grand nombre d’échantillons en peu de temps [Dixon et al. (1997)].
34
b) ELISA
Différents kits ELISA pour le diagnostic de C. parvum et G. intestinalis sont
commercialisés.
Certains tests ELISA pour la détection de Giardia détectent directement les antigènes
de la paroi des éléments parasitaires de Giardia et d’autres, comme Prospect® Giardia
Microplate Assay, permettent la détection d’une protéine, la protéine GSA 65. Cette protéine
est produite par le parasite lors de sa multiplication et elle est émise dans les selles
indépendamment de l’émission de kystes ou de trophozoïtes [Papini et Cardini (2006)].
Ce test a été évalué comme étant moins cher que la recherche directe des parasites
dans les selles et que l’immunofluorescence [Aldeen et al. (1995)]. Ces tests ELISA sont
rapides, sensibles et spécifiques et peuvent donc être très utiles pour confirmer le diagnostic
de giardiose, [Adiss et al. (1991)].
Pour les tests permettant la détection de Cryptosporidium parvum, ce sont directement
les antigènes de surface des oocystes qui sont recherchés. Des anticorps monoclonaux dirigés
contre ces antigènes sont présents au fond des puits, une dilution de selles est placée dans ces
puits. Après incubation et rinçage, des anticorps de détection sont ajoutés, puis un conjugué et
pour finir un substrat (avec un temps de lavage entre chaque étape) [Depierreux et al. (2001)].
Le résultat peut alors être lu.
Les tests ELISA permettent la confirmation d’une suspicion de giardiose ou de
cryptosporidiose même lorsque les parasites sont peu nombreux. Ils peuvent être réalisés par
un technicien non spécialisé en parasitologie [Gaafar (2011)].
c) Immunochromatographie
Divers tests rapides existent, Certains ne recherchent qu’un seul élément parasitaire C.
parvum ou G. intestinalis. D’autres tests recherchent de façon combinée Cryptosporidium et
Giardia ou C. parvum avec les virus rotavirus et coronavirus ainsi que la bactérie Escherichia
coli K99. Il n’existe pas de test immunochromatographique permettant la détection des
coccidies.
35
Ces tests utilisent des anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines spécifiques
de la membrane ou de la paroi des oocystes, des kystes et des trophozoïtes. Pour générer un
signal visuel, dans certains tests, des microbilles de latex colorées sont liées aux anticorps
monoclonaux [Papini et Cardini (2006)].
La plupart du temps ces tests sont sous forme de tigettes ou de plaquettes. Les tigettes
sont à tremper dans l’échantillon de selles puis à mettre dans une solution tampon pour faire
migrer les antigènes. Lors de tests sous forme de plaquettes [thermo scientific], il faut alors
effectuer une dilution des selles dans une solution, puis mettre quelques gouttes du mélange
dans les différents puits présents et ajouter une solution tampon [Depierreux et al. (2001)]. La
lecture se fait facilement par l’apparition ou non d’un trait coloré dans une zone précise.
Figure 6 : Schéma d’une tigette [Depierreux et al. (2001)]
Les différents tests rapides d’immunochromatographie présentent des sensibilités et
des spécificités supérieures à 94% [Garcia et Shimizu (1997)]. Par exemple pour le FASTest
Crypto-Giardia Strip du laboratoire allemand Megacor, la Sensibilité est de 96,7% pour C.
parvum et 97,2% pour G. duodenalis et la spécificité de 99,9% pour les deux parasites,
[Megacor]. Pour le kit détectant les antigènes de Cryptosporidium du laboratoire Kitvia, les
études montrent une sensibilité de 98% et une spécificité de 99% [KITVIA].
Cette technique est très rapide et ne nécessite pas un technicien spécialisé pour sa
réalisation. Aucun matériel supplémentaire n’est nécessaire pour ces tests et la quantité de
selles nécessaire est très faible [Gaafar (2011)].
36
3. Technique de biologie moléculaire : PCR
La méthode de PCR (réaction de polymérisation en chaine) amplifie l’ADN ou l’ARN
de certains protozoaires ce qui permet leur détection. Il existe des kits de PCR commercialisés
pour la détection de Cryptosporidium parvum ou Giardia intestinalis. Dans certains kits de
détection de C. parvum, l’ARN amplifié n’est pas présent chez tous les génotypes de C.
parvum (infectant les humains, les bovins…), ce qui peut limiter la détection de ce
protozoaire [Higgins et al. (2001)].
Cette technique de biologie moléculaire à une sensibilité équivalente aux méthodes
immunologiques pour la détection de C. parvum, ces procédés ne sont donc pas un apport
supplémentaire pour des examens coprologiques de routine [Bialek et al. (2002)]. La
détection d’acides nucléiques libres ou d’oocystes non viables dans les fèces, la contamination
des selles au moment du prélèvement ou dans le laboratoire peuvent aboutir à des faux
positifs [Fayer et al. (2000)].
En raison du coût de l’analyse, du temps de manipulation ainsi que de la technicité
nécessaire, les PCR sont essentiellement réalisées pour la recherche [Paul et al. (2009)]. Elles
sont utilisées pour l’analyse de selles humaines et animales mais également pour la recherche
des protozoaires dans l’eau (Giardia, Cryptosporidium ou Eimeria). Elles permettent aussi la
réalisation d’analyses génétiques des diverses espèces et génotypes de ces protozoaires [De
Waal (2012), Kawahara et al. (2010), Bertrand et al. (2004)].
A retenir :
De nombreuses techniques sont disponibles pour la détection des protozoaires digetifs, les
techniques de PCR, d’ELISA et d’immunofluorescence nécessitent d’être effectuées en
laboratoire. Les techniques d’examen microscopique et d’immunochromatographie peuvent
être facilement réalisées en laboratoire et dans les cabinets et cliniques vétérinaires.
Les différentes techniques permettant le diagnostic des protozoaires à partir des selles
nécessitent une bonne collecte et une préparation de l’échantillon. Pour l’examen
microscopique des matières fécales, il y a plusieurs étapes de préparation de l’échantillon en
vue d’analyse.
37
II. PREPARATION DE L’ECHANTILLON A L’EXAMEN MICROSCOPIQUE
A. LES MODALITES DE PRELEVEMENT ET CONSERVATION DE L’ECHANTILLON
1. Techniques de prélèvements
Le prélèvement de selles est facile à réaliser, mais il est nécessaire de suivre certaines
règles pour avoir un échantillon de bonne qualité.
Il est important de prendre des fèces fraîches pour avoir des éléments parasitaires qui
n’ont pas évolué et pour pouvoir observer des formes végétatives de Giardia. Pour cela, il est
possible de stimuler la défécation chez le veau (à l’aide d’un thermomètre par exemple) ou
d’utiliser une curette pour les chevreaux [Polack et al. (1983)]. Il faut éviter de prendre des
fèces sur le sol car celles-ci peuvent être contaminées par des nématodes libres ou des larves
de diptères [Hendrix (1998)].
Si l’on désire faire un bilan parasitaire sur l’élevage, il est possible de faire un mélange
de 7 à 10 prélèvements individuels pour diminuer le coût de l’analyse pour l’éleveur [Chartier
(2002)].
Il est recommandé de prendre 10 à 20 g de selles par échantillon. Pour certaines
recherches de parasites, dont l’excrétion est intermittente comme pour la recherche de
cryptosporidies, il est conseillé de faire plusieurs prélèvements sur quelques jours.
Les selles doivent être conditionnées dans un pot à prélèvement transparent avec un
couvercle, fermé hermétiquement, qui doit être correctement identifié. La date du
prélèvement, l’identification de l’animal, le nom de l’élevage et d’autres informations comme
l’âge de l’animal et les symptômes de celui-ci doivent être mentionnées sur le pot ou sur un
document d’accompagnement.
38
2. Conservation des échantillons
Il est important de faire parvenir les échantillons au laboratoire le plus rapidement
possible. L’analyse de fèces fraiches (moins de trois heures) permet l’observation des formes
végétatives de protozoaires qui sont détruites dans le milieu extérieur. Elles sont alors très
mobiles et facilement observables.
Mais ils peuvent également être conservés de différentes façons lorsqu’il est
impossible de faire parvenir l’échantillon très rapidement. Les échantillons, une fois prélevés
et conditionnés dans des flacons hermétiques, peuvent se conserver plusieurs mois au
réfrigérateur à une température de 4°C.
Les prélèvements peuvent également être conservés à température ambiante dans du
bichromate de potassium à 2,5% (il faut alors mettre 2 volumes de solution pour 1 volume de
fèces). Les échantillons se conservent alors à température ambiante pendant 120 jours
[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].
L’eau formolée permet la conservation des œufs d’helminthes et des kystes de
protozoaires dans les selles mais les kystes de protozoaires perdent leur réfringence et les
noyaux se colorent plus difficilement. On utilise de l’eau formolée à 5% pour des selles
fermes et à 10% pour des selles plus pâteuses [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. Si l’on
utilise une plus grande quantité de formol cela entraine la destruction des kystes de giardia.
Une fois l’échantillon correctement prélevé et conservé au laboratoire, les
manipulations pour le préparer à l’examen microscopique peuvent être réalisées.
39
B. MATERIEL NECESSAIRE A LA REALISATION D’UN EXAMEN MICROSCOPIQUE
DES SELLES
L’examen microscopique des selles nécessite peu de matériel.
Pour cet examen, il est nécessaire de disposer, au minimum, d’un microscope optique
avec des objectifs allant de x4 à x100 à immersion (le plus souvent avec des objectifs x4, x10,
x40 et x100 à immersion) [Beugnet et al. (2004)]. Un éclairage classique est suffisant, mais
parfois le contraste de phase permet d’avoir une vision différente.
En ce qui concerne la verrerie, des lames porte-objet et des lamelles sont nécessaires.
Pour des méthodes de concentration il est nécessaire d’avoir un tamis ou une passoire à thé,
des verres à pied, des pipettes pasteur, des agitateurs et des tubes [Rousset (1993)].
Pour accélérer certaines méthodes de concentration dans des liquides de flottation, une
centrifugeuse peut être utilisée. Il faut donc avoir des tubes de centrifugation correspondants.
Pour les techniques de coloration du matériel supplémentaire sera nécessaire pour la
réalisation des colorations (colorants, bécher ou flacons fermés parfois opaques). Certaines
colorations nécessitent un microscope à fluorescence avec un filtre défini.
40
C. METHODES DE CONCENTRATION DES PARASITES
Pour augmenter la sensibilité des tests, il est utile de concentrer les parasites d’un
grand échantillon dans un petit volume. Différentes méthodes permettent la concentration des
protozoaires. La concentration permet également de limiter les débris fécaux sur le frottis.
1. Méthodes physiques
Deux types de méthodes physiques augmentent la quantité de parasites dans le frottis,
la méthode par flottation (ou flotaison) et la méthode par sédimentation. Les méthodes
physiques sont basées sur les différences de poids existant entre les parasites (œufs, kystes,
larves) et les débris.
a) Concentration par flottation
La méthode de concentration par flottation repose sur la différence de densité entre les
œufs et le liquide. La densité des œufs est de 1,1 à 1,2. Pour condenser les œufs à la surface
du liquide celui-ci doit avoir une densité supérieure à celle des œufs [Hendrix (1998)].
Différents liquides de flottation sont utilisables, leurs densités sont différentes et varient de
1,18 à 1,44.
La procédure des techniques de flottation consiste à mélanger une petite quantité de
fèces dans le liquide de flottation choisi, d’homogénéiser la solution, puis de filtrer le mélange
dans un tamis (par exemple une petite passoire à thé). Un tube est rempli du mélange jusqu’à
ras bord et une lamelle est placée sur le tube. Au bout d’une dizaine de minutes environ, les
œufs sont remontés sur la lamelle. Une centrifugation est possible pour accélérer cette étape
[Beugnet (2000), Beugnet et al. (2004)].
41
Figure 7 : Schéma des étapes de la méthode de flottation [Beugnet (2000)]
Le liquide le plus employé et recommandé pour la concentration des oocystes de
Cryptosporidium est une solution de saccharose ou solution de Sheather. Cette technique est
également appelée technique d’Anderson [Boufassa-Ouzrout et al. (1986), Mc Nabb et al.
(1985)]. Cette solution permet de réunir la majorité des oocystes à la surface du liquide et
permet une bonne purification du surnageant en éliminant les levures et les oocystes
dégénérés et non viables [Kar et al. (2011)]. Cette technique permet la concentration et la
coloration des oocystes, mais le prélèvement ne peut être conservé longtemps car celle-ci
déforme les oocystes rapidement (une heure environ) [Broussard (2003)]. Une centrifugation
peut être utile pour cette technique pour diminuer le temps de flottation car cette solution est
relativement épaisse.
Les liquides de flottation couramment utilisés en coproscopie sont : le sulfate de
magnésium dont la densité est de 1,28 et le sulfate de zinc (d=1,18 à 1,39). Ces liquides sont
très souvent employés car ils nécessitent peu de matériel.
Le sulfate de zinc est d’une efficacité presque équivalente au saccharose pour
l’ensemble des œufs et kystes, mais il est considéré comme idéal pour la concentration des
42
kystes de giardia selon certains auteurs [Broussard (2003), Hendrix (1998)], car il est le plus
efficace pour leur concentration et ne provoque pas de déformation de ceux-ci.
Une solution à base de NaCl (d=1,21) peut permettre de concentrer les parasites à la
surface. Une étude a montré que cette solution est une des plus efficaces pour concentrer les
oocystes de Cryptosporidium parvum lorsqu’ils sont présents en faible quantité [Kuczynska et
Shelton (1999)]. Cependant, ce liquide est très corrosif pour le matériel du laboratoire et
déforme les œufs d’helminthes, il forme également des cristaux sur la lame (Hendrix, 1998).
Le iodo-mercurate de potassium (d=1,44) est un liquide de flottation qui était utilisé de
façon courante en coproscopie, mais ce liquide est très polluant et corrosif. Il nécessite donc
des mesures de protection et de récupération [Beugnet (2000), Golvan et Ambroise-Thomas
(1984)].
b) Concentration par sédimentation
Contrairement aux méthodes de flottation, la sédimentation utilise des liquides dont la
densité est inférieure à celle des éléments parasitaires mais supérieure à celle des débris.
Les méthodes de sédimentation sont moins réalisées en routine que les méthodes de
flottation, car celles-ci demandent plus de temps et de nombreuses manipulations [Kuczynska
et Shelton (1999)].
Les techniques de sédimentation ne donnent pas un résultat aussi clair que la
flottation, il y a souvent plus de débris. Ces techniques ne sont pas efficaces pour la mise en
évidence des protozoaires digestifs sous leurs formes végétatives comme kystiques [Golvan et
Ambroise-Thomas (1984)].
2. Méthodes diphasiques
Le principe de la méthode diphasique est de mettre l’échantillon de selles en présence
de deux phases non miscibles, une phase aqueuse et une phase organique (éther). Toutes les
méthodes diphasiques dérivent de celle décrite par Telemann en 1908. La concentration des
éléments parasitaires dans le culot est due à l’action dissolvante de l’éther et la mise en jeu
43
des deux phases non miscibles qui réalisent pour les éléments fécaux un coefficient de partage
dont la valeur n’est pas fixe et dépend de sa balance hydrophile/lipophile [Anonyme].
Pour réaliser cette technique, les selles sont mélangées avec une solution déterminée
puis le mélange est agité avec de l’éther, le tout est centrifugé pour recueillir les œufs et les
kystes. On obtient quatre couches, au sommet l’éther puis les débris ensuite le formol et pour
finir le culot contenant les éléments parasitaires.
Figure 8 : Tubes après centrifugation lors d’une méthode diphasique [OMS, 1997]
Il existe plusieurs méthodes diphasiques, la méthode de Telemann-Rivas est souvent
utilisée comme méthode de routine en laboratoire, elle est simple et peu onéreuse mais n’est
pas toujours suffisante pour concentrer les œufs [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. Elle
est, par exemple, moins performante que la flottation au saccharose pour la concentration des
cryptosporidies [Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].
La méthode de Ritchie, ou Ritchie simplifiée permet de mettre en évidence les œufs
d’helminthes et les kystes de protozoaires, mais le culot est souvent très abondant. Cette
technique suivie d’une coloration de Kinyoun modifiée à froid est aussi efficace pour la
détection de Cryptosporidies que la flottation et la coloration à l’aide de la solution de
Sheather [Mc Nabb et al. (1985)].
La méthode de Blagg, Schloegel, Mansoer et Khalaf permet la concentration des
éléments parasitaires contenus dans des prélèvements fixés par le mercurothiolate-iode-formol
44
(MIF), les kystes de protozoaires sont alors colorés par le MIF [Rousset (1993), Golvan et
Ambroise-Thomas (1984)].
A retenir :
Les techniques de concentration les plus utilisées sont les techniques de flottation. Elles
permettent un résultat clair avec peu de manipulation. Les liquides de flottation les plus
courants sont le sulfate de zinc, le sulfate de magnésium, le saccharose ou le chlorure de
sodium. Une centrifugation peut être utilisée pour accélérer la technique.
45
D. REALISATION ET FIXATION DU FROTTIS
1. Etalement des selles
Certaines colorations se font dans les tubes de sédimentation ou de flottation, d’autres
se font de façon directe ou sur la lame. Pour toutes les colorations, il est nécessaire de réaliser
un étalement à une étape du processus.
Le frottis consiste à réaliser un étalement de fèces le plus fin possible afin de pouvoir
identifier les éléments parasitaires au microscope. Il est donc nécessaire d’avoir une texture de
selles assez liquide pour le réaliser.
Si les selles sont liquides, une goutte de matière fécale est placée sur une lame porte-
objet et l’étalement est réalisé directement.
Si les selles sont plus solides, il est nécessaire de les liquéfier avec une solution. Pour
réaliser un frottis simple on y ajoute alors une goutte de NaCl isotonique tiédie dans lequel on
mélange des fèces [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)].
Si l’on souhaite faire une coloration directe (comme pour la méthode de Heine) on
ajoute alors une très petite quantité de selles dans une goutte de fuchsine sur une lame [Adam
et al. (1971)]. Ensuite, l’étalement du mélange se fait en le recouvrant d’une lamelle ou à
l’aide d’une lame pour étirer le prélèvement [Rousset (1993)].
Figure 9 : Les trois étapes de réalisation d’un frottis
A : Dépôt d’une goutte de matière fécale ; B : Apposition d’une lame à 45° ; C : Mouvement
de translation lent et uniforme
46
Pour réaliser un frottis, il faut apposer la lame au contact de la goutte de matière
fécale, préalablement posée sur une lame, avec un angle de 45°, puis attendre que cette goutte
diffuse le long de la lame. Une fois que la goutte est répartie sur le bord de la lame, on réalise
un mouvement de translation lent et uniforme, de la même façon que pour la réalisation d’un
frottis sanguin (voir figure 9).
Le frottis doit être fin et l’on doit pouvoir lire les caractères d’un journal au travers de
celui-ci.
Si les oocystes ont été concentrés par une méthode de flottation, il n’est pas nécessaire
d’effectuer un frottis puisque les oocystes seront venus se coller à la lamelle au sommet du
tube de centrifugation.
2. Fixation des frottis
Selon la coloration envisagée par la suite, le frottis doit être fixé ou non. Il existe
différentes techniques de fixation, certaines colorations permettent également la fixation.
Pour les techniques de coloration acido-résistantes, le frottis est séché à l’air, puis la
lame est plongée dans du méthanol pur pendant 5 minutes environ pour la fixation [Bessieres
et al. (1995)].
Pour les colorations permanentes qui se déroulent en plusieurs étapes ou les
colorations sur frottis fixé et sec, le frottis est directement plongé dans le fixateur sans être
séché.
Plusieurs fixateurs peuvent être utilisés comme le fixateur de Bouin, la solution de
Schaudinn acétique ou la fixation PVA (PolyVinyl Alcool). Le choix du fixateur est
indépendant de la méthode, la solution de Schaudinn acétique est généralement préférée
[Bailenger (1982)].
Pour la fixation PVA, cela se passe en même temps que le frottis, une petite quantité
de fèces est mélangée à une goutte de la solution de fixation PVA, puis le mélange est étalé, il
est alors séché et laissé une nuit à 37°C [Adam et al. (1971)].
47
Une fois le frottis réalisé et fixé, il peut être coloré, la conservation de la préparation
après coloration peut être de courte durée, cela est principalement dû à la déshydratation de la
préparation. Le lutage et le montage peuvent prolonger la durée de conservation pour
permettre une lecture différée.
48
E. LUTAGE
Pour augmenter la conservation d’une préparation microscopique (avec ou sans
coloration) pendant quelques jours, il peut être utile d’effectuer un lutage.
Le lutage permet d’empêcher l’évaporation de l’eau contenue dans la préparation en
limitant les échanges entre la préparation et le milieu extérieur.
Plusieurs techniques existent, certaines ont une efficacité limitée comme le lutage à la
vaseline qui ne conserve la préparation que quelques heures.
Le lutage au lut de Rondeau de Noyer est une technique ayant une bonne efficacité, les
lames peuvent se conserver plusieurs mois. Mais elle nécessite l’utilisation d’un fer à luter et
la technique est relativement longue.
Le lutage au vernis à ongles est la technique la plus utilisée du fait de sa simplicité.
Une fois la lamelle posée sur la lame, le pourtour de la lamelle est séché à l’aide d’un papier
absorbant, puis du vernis est déposé sur les bords de la lamelle. Cette technique a une bonne
efficacité mais les formes végétatives et kystiques se conservent mal [GOLVAN et Ambroise-
Thomas (1984)].
49
F. MONTAGE
Pour certaines techniques microscopiques de coloration, il est parfois nécessaire de
réaliser un montage après la fixation et la coloration des frottis.
Les méthodes de montage utilisées en coprologie sont les mêmes que celles utilisées
pour les pièces histologiques. Il faut veiller à ce que le frottis ne sèche pas avant le montage.
Il existe deux grandes techniques de montage, la plus ancienne est le montage au
baume du Canada.
Pour cette technique, le frottis humide est déshydraté par de l’alcool éthylique à titre
croissant : 60°, 70°, 80°, 95° puis avec de l’alcool absolu. Pour finir il est déshydraté par le
xylène ou le toluène. Le frottis est laissé une à deux minutes dans chaque solution. Sur le
frottis encore imprégné de toluène, une lamelle avec une petite goutte de baume du Canada
sirupeux est déposée [Achir et Hamrioui (2001), Bailenger (1982)].
Une résine de synthèse peut également être utilisée pour effectuer un montage comme
l’Eukitt®. Cette résine permet de fixer une lamelle sur le frottis et de pouvoir le conserver
pendant plusieurs années.
Les étapes de la réalisation d’un examen microscopique de fèces ont donc été
expliquées. Une fois les fèces conservées ou le frottis réalisé, une coloration peut être
effectuée. Ensuite la lame peut éventuellement être lutée ou montée. Selon l’élément
parasitaire cherché, différents colorants peuvent être choisis.
50
III. LES DIFFERENTES METHODES DE COLORATION POUR LA
DETECTION DES PROTOZOAIRES
Les protozoaires sont de petites tailles, des colorations permettent donc de faciliter leur
recherche dans les selles. Les formes végétatives ou kystiques ne sont pas colorées par les
mêmes méthodes.
A. FORME VEGETATIVE
La forme végétative des protozoaires intestinaux est la forme flagellée, encore appelée
trophozoïte. En ce qui concerne les protozoaires étudiés, seule la forme végétative de Giardia
intestinalis est retrouvée dans les excréments des ruminants. Les trophozoïtes sont présents
dans les glaires muqueuses et les selles liquides.
Cette forme est fragile dans le milieu extérieur, elle n’est donc visualisable que sur des
fèces fraiches. Différentes méthodes permettent de mettre en évidence les formes végétatives
grâce à des colorants. Il y a des méthodes dont le colorant s’applique directement entre lames
et lamelles, d’autres se font sur un frottis humide après fixation de celui-ci et pour finir,
certaines s’effectuent sur un frottis préalablement séché.
1. Colorations entre lames et lamelles
Les colorations réalisables directement entre lames et lamelles comportent des
techniques simples et rapides, il est donc très utile de les mettre systématiquement en œuvre
lorsque l’examen direct n’a pas permis l’identification des trophozoïtes.
Ces méthodes sont à effectuer sur des selles contenant des trophozoïtes vivants.
Pour toutes ces méthodes, la technique est identique. Sur une lame, une goutte de
préparation fécale est mélangée à une petite goutte de réactif. Le tout est recouvert d’une
lamelle puis observé au microscope.
51
a) Méthode de Bailenger et Faraggi
Cette technique, décrite en 1972, permet de colorer toutes les formes parasitaires de
protozoaires.
Le réactif utilisé est une solution composée d’un mélange de violet cristal, de fuchsine
basique et de phénol (voir protocole en annexe 7). Cette solution se conserve correctement
mais elle doit être placée dans un flacon opaque fermé hermétiquement [Bailenger (1982)].
Une petite goutte du réactif est suffisante, cela permet à la coloration d’être
progressive et de ne pas altérer les parasites, de plus une petite quantité de liquide permet de
ne pas diluer la préparation fécale.
Si le frottis est lutté (avec du vernis à ongles ou de la colle cellulosique),
l’identification des trophozoïtes reste possible plusieurs jours après la coloration.
Après coloration, le cytoplasme et les cristalloïdes apparaissent de couleur rouge rosé,
les structures nucléaires et les rudiments flagellaires sont colorés en noir.
Cette méthode colore correctement les formes végétatives et les détails cytologiques
sont très bons. De plus cette coloration est rapide et nécessite peu de manipulations.
Cette coloration peut également se réaliser en tube, la solution est mise dans un tube à
hémolyse, puis une petite quantité de matière fécale y est ajoutée. Après une trentaine de
minutes, la couche supérieure du sédiment peut être prélevée pour effectuer un frottis et
observée au microscope [Rousset (1993)].
b) MIF ou méthode de Sapero, Lawless et Strome
La méthode de Sapero, Lawless et Strome a été décrite en 1951. Le sigle MIF
correspond à Merthiolate Iode Formol, ce sont les principaux constituants des réactifs [Levine
(1973), Adam et al. (1971)].
Le colorant est composé par un mélange de lugol, de teinture de merthiolate et de
formol (voir protocole en annexe 8). Les proportions peuvent être modifiées car le lugol
s’altère avec le temps, il peut alors être nécessaire d’augmenter la proportion de lugol pour
compenser sa détérioration. Le mélange ainsi formé ne se conserve pas plus de 8 heures.
La coloration se fait en deux phases. Tout d’abord l’iode colore immédiatement les
trophozoïtes qui apparaissent alors vert-jaune à jaune-brun. Au bout de quelques heures, les
membranes nucléaires sont colorées en rouge foncé et le cytoplasme en rouge. La chromatine
52
n’est pas colorée mais est visible grâce à sa réfringence [Bailenger (1982), Golvan et
Ambroise-Thomas (1984)].
Le frottis, une fois coloré, peut se conserver pendant quelques heures, mais au-delà les
parasites sont détruits.
Cette coloration peut s’effectuer entre lames et lamelles ou sur tube. La coloration
dans un tube à hémolyse permet de conserver les fèces si le tube est fermé hermétiquement
[Adam et al. (1971)].
Cette méthode est simple et peu cher, elle est également rapide et permet la
conservation des fèces (pour la coloration en tube).
2. Fixation –coloration d’un frottis humide
La fixation doit être effectuée le plus tôt possible après la défécation pour éviter la
dégénérescence des trophozoïtes. Le frottis doit rester humide tout au long des manipulations,
il faut donc que celles-ci s’enchainent rapidement.
a) Technique en trois temps
Il y a un temps de fixation, un temps de coloration et pour finir un temps de
différenciation. Un frottis fécal est réalisé, puis fixé selon une des techniques décrites
précédemment dans le paragraphe « Réalisation et fixation d’un frottis ». Après la phase de
coloration, les frottis sont montés en suivant la technique expliquée dans le paragraphe
« montage au baume ». Les techniques en trois temps sont réparties en deux catégories selon
la nature du colorant.
Méthodes à l’hématoxyline i).
De nombreuses méthodes utilisant l’hématoxyline comme colorant ont été mises au
point. L’hématoxyline seule n’a pas un grand pouvoir colorant, il est donc nécessaire
d’utiliser un mordant [Levine (1973)]. Les méthodes utilisant l’hématoxyline comprennent
53
souvent trois étapes, la première étape est le mordançage, puis il y a une étape de coloration et
pour finir une étape de différenciation.
La méthode de coloration la plus utilisée et souvent jugée comme une des meilleurs est
la méthode de Heindenhain ou méthode à l’hématoxyline ferrique [Shetty et Prabhu (1988)].
Cette technique utilise l’affinité des constituants nucléaires pour le fer, puis
l’hématoxyline apportée se combine avec le fer déjà fixé. Cela permet de faire ressortir les
structures nucléaires en noir sur un fond gris clair. Toutes les étapes de cette coloration sont
effectuées dans une étuve à 37°C.
Le mordant utilisé est une solution d’alun de fer à 3%, cette solution se conserve mal à
température ambiante, mais elle se conserve très bien au réfrigérateur (voir protocole en
annexe 9).
La solution de coloration se fait par une dilution au dixième d’une solution mère. La
solution mère est constituée d’une dissolution d’hématoxyline cristallisée dans de l’alcool à
90°. Une fois préparée, cette solution se conserve bien.
Pour finir, le différenciateur utilisé est la solution de mordançage diluée. C’est le
temps le plus difficile de la coloration, il est donc nécessaire de suivre cette étape au
microscope, lorsque les structures nucléaires apparaissent nettes, le frottis peut être lavé pour
enlever l’alun de fer [Bailenger (1982), Adam et al. (1971)].
Les éléments parasitaires sont mis en évidence par leur couleur gris foncé voire noire
sur un fond gris clair.
Après montage, le frottis peut être conservé. Cette méthode est la technique qui a
permis la description des protozoaires, mais elle est très difficile à exécuter. Elle est longue et
assez délicate, elle ne peut donc pas être utilisée en routine [Golvan et Ambroise-Thomas
(1984), Rousset (993)].
Les autres techniques utilisant l’hématoxyline sont légèrement différentes, elles
utilisent d’autres solutions de mordançage ou de différenciation. La méthode de Thompkins et
Miller utilise une solution d’acide phosphotungstique à 2% comme différenciateur.
La méthode de Mallory utilise le lugol comme solution de mordançage. Puis le frottis
est coloré par une solution d’hématoxyline phosphotungstique, il n’y alors pas d’étape de
différenciation. Les noyaux apparaissent violet foncé et le cytoplasme des cellules est violet
clair [Bailenger (1982)].
54
Trichrome (Gomori-Wheatley) ii).
La coloration trichrome de Gomori a été appliquée par Weathley aux frottis fécaux en
1951.
Cette technique s’effectue en deux temps.
Dans un premier temps le frottis est plongé dans une solution colorante pendant une
dizaine de minutes. La solution colorante : le trichrome de Gomori, est un mélange de
chromotrope 2R, de vert lumière SF, d’acide phosphotungstique et d’acide acétique
cristallisable (voir protocole en annexe 10).
Après ce premier temps de coloration, il y a un temps de rinçage ou de différenciation.
Le rinçage est effectué avec une solution d’alcool acétique et d’acide acétique pendant
quelques secondes [Bailenger (1982), Golvan et Ambroise-Thomas (1984)]. D’autres
protocoles utilisent de l’eau distillée pour le rinçage [Adam et al. (1971)].
Après coloration, la chromatine apparait de couleur rouge et le cytoplasme apparait
vert teinté de pourpre, ces éléments sont donc mis en évidence par rapport au fond coloré en
vert.
.
Il y a une grande irrégularité des résultats due à la difficulté d’obtenir des produits
chimiques de qualité. Cependant, lorsque la coloration est réussie, les résultats des colorations
sont de très bonne qualité. Cette technique est rapide et peut donner de très bons résultats. Elle
est relativement simple à mettre en place et les réactifs utilisés se conservent facilement.
Cette coloration est souvent préférée à d’autre coloration comme l’hématoxyline
ferrique pour la coloration des flagellés. Elle est recommandée pour la recherche des formes
végétatives comme kystiques [Garcia et al. (1979)].
b) Techniques en un temps
Pour les techniques en un temps, la fixation et la coloration se font simultanément. Les
manipulations sont donc simplifiées et plus rapides. Cependant, les résultats sont de moins
bonne qualité que ceux fournis par les techniques en trois temps.
Il existe plusieurs méthodes dont la fixation et la coloration se font simultanément
comme la méthode de Lawless ou celle de Noble. La plus utilisée est la méthode de Kohn.
55
Gleason et Healy ont décrit en 1965 la coloration de Kohn modifiée pour la détection
des protozoaires, c’est la méthode de coloration au noir chlorazol de Kohn.
Le réactif utilisé est un mélange de noir chlorazol, d’alcool éthylique, d’alcool
méthylique, d’acide acétique, de phénol et d’une solution aqueuse d’acide phosphotungstique
(voir protocole en annexe 11). La maturation du réactif doit s’effectuer à la lumière pendant
plusieurs semaines avant la première utilisation [Bailenger (1982)].
Les trophozoïtes apparaissent globalement gris. Les structures cellulaires sont colorées
en vert foncé à noir, le cytoplasme apparait incolore. Cela permet donc de mettre en évidence
les trophozoïtes sur un fond grisâtre [Levine (1973)].
Cette technique est facile à réaliser et relativement simple. La solution colorante est
stable et se conserve bien. Les colorations donnent des résultats de bonne qualité [Bullock
(1980)]. Cette technique est cependant relativement longue (les frottis restent au contact du
colorant de 4 à 8 heures), même si le temps de manipulation est court [Rousset (1993)].
3. Coloration d’un frottis sec
Pour ces techniques le frottis est réalisé, fixé selon la technique de fixation choisie
puis séché à l’air ou dans une étuve à 37°C. Lorsque les frottis sont fixés et séchés, ils
conservent leur colorabilité pendant longtemps. Les frottis peuvent donc être réalisés puis
expédiés à un laboratoire.
a) Méthode de Brooke et Goldman
Cette technique permet de colorer à l’aide d’une méthode de coloration d’un frottis
humide, un frottis déjà fixé et séché. Ce frottis est placé dans un bain d’alcool à 70°
additionné de quelques gouttes de lugol, puis il est placé dans de l’alcool à 50° (voir protocole
en annexe 11). Après cette succession de bains, le frottis peut alors être coloré avec une des
techniques précédemment décrite (Hématoxyline, Trichrome ou méthode Kohn [Bailenger
(1982)].
Cette méthode donne de bons résultats lors de la détection de trophozoïtes. Elle permet
de pouvoir fixer les frottis s’il n’est pas possible de les observer immédiatement et de les
56
colorer par la suite. Cependant, cette technique est bien plus longue et rajoute un certain
nombre de manipulations [Golvan et Ambroise-Thomas (1984)].
b) Giemsa
Cette coloration est une méthode qui repose sur les différences de pénétration du
décolorant dans les organismes.
Pour la réalisation d’une coloration de Giemsa, le frottis sec est fixé puis coloré à
l’aide de Giemsa rapide. La lame est alors observée au microscope optique à l’aide des plus
forts grossissements et avec l’objectif à immersion [Polack et al. (1983)].
Cette technique ne donne pas de très bons résultats pour l’observation des formes
végétatives, elle n’est donc pas utilisée.
A retenir :
Les formes végétatives sont rapidement détruites dans les fèces.
Quelques colorations permettent de les mettre en évidence, les plus utilisées et les
plus efficaces sont la technique de MIF (qui permet aussi de concentrer et de conserver la
matière fécale si elle effectuée sur tube), la méthode à l’hématoxyline ferrique et la technique
au trichrome de Gomori-Weatley.
Les formes végétatives et les formes kystiques ne sont pas colorées par les mêmes
techniques en raison de leur structure différente. Les colorants permettant la mise en évidence
des formes kystiques des protozoaires peuvent être identiques à ceux utilisés pour les
trophozoïtes mais d’autres techniques ont également été développées.
57
B. FORME KYSTIQUE
La forme kystique est la forme de résistance des protozoaires. On retrouve la forme
kystique des différents genres de protozoaires intestinaux dans les matières fécales des
ruminants. C’est la forme parasitaire retrouvée dans les fèces lors de coproscopies. Du fait de
la petite taille des kystes, il n’est pas toujours évident de les visualiser en coprologie. L’action
de différentes solutions permettant la coloration mettent en évidence ces éléments parasitaires.
Comme pour les méthodes utilisées pour la forme végétative, les méthodes de
coloration de la forme kystique sont classées en trois catégories, les colorations effectuées
directement entre lames et lamelles, les colorations après fixation d’un frottis humide et les
colorations sur un frottis sec.
1. Colorations entre lames et lamelles
Le principe de ces colorations est le même que celui pour les colorations des formes
végétatives. Mais les méthodes permettant la coloration des formes kystiques entre lames et
lamelles sont plus nombreuses. Toutes ces méthodes sont assez rapides.
a) Méthode de Bailenger et Faraggi
Cette méthode est la même que celle décrite pour les formes végétatives. Elle permet
donc de colorer directement, sans fixation préalable, les formes kystiques et végétatives des
protozoaires.
Les cytoplasmes et les cristalloïdes se colorent en rouge-rosé et les structures
nucléaires ressortent en noir. Les résultats obtenus avec cette technique sont aussi bons pour
les trophozoïtes que pour les kystes.
b) MIF
Cette méthode est la même pour la coloration des kystes que pour celle des
trophozoïtes.
58
Les kystes apparaissent clairs avec des reflets verts sur un fond rose dans un premier
temps, puis la seconde coloration pénètre à l’intérieur des kystes. Elle colore les membranes
nucléaires en rouge foncé et le cytoplasme en rouge [Rousset (1993)].
Cette méthode de coloration est simple, peu cher et rapide, elle donne de très bons
résultats pour la coloration des kystes de giardia [Thornton et al. (1983)). Cependant les
réactifs sont plus compliqués à préparer que pour une coloration au lugol et les résultats
semblent identiques [Bailenger (1982)].
La méthode de Sapero, Lawless et Strome, lorsqu’elle est réalisée en tube, permet la
conservation mais également la concentration des éléments parasitaires comme les oocystes
du genre Cryptosporidium. Cette concentration n’est pas de bonne qualité, la pureté du
sédiment est de moins bonne que celle réalisée par les autres méthodes de concentration
[Kvác et al. (2003), Badparva et al. (2009)].
c) Colorations iodées
Il existe de nombreux protocoles de coloration avec des réactifs iodés (Solution iodo-
acétique, Solution iodée de Faust). Tous les réactifs iodés dérivent du lugol. La réalisation des
solutions rend les protocoles légèrement plus compliqués alors que les résultats sont
semblables. Ils ne semblent donc pas plus avantageux que la coloration au lugol [Bailenger
(1982)].
Tous les réactifs iodés se conservent mal, il est donc nécessaire de les renouveler
fréquemment et de les conserver en respectant certaines mesures (flacon opaque et fermé
hermétiquement).
La technique de réalisation de la coloration au lugol est simple et courte (voir
protocole de coloration en annexe 13). La technique peut être identique à celle des autres
colorations entre lames et lamelles. Elle peut également se faire sur un étalement de fèces
recouvert d’une lamelle, une goutte de lugol est alors déposée au bord de la lamelle.
L’observation au microscope se fait immédiatement.
Avec cette coloration, les trophozoïtes sont immobilisés et seule leur chromatine est
colorée, cette technique ne permet donc pas la coloration de ceux-ci [Rousset (1993)].
59
Les kystes de giardia apparaissent jaune-orangé sur un fond marron. La paroi des
kystes de flagellés prend une teinte orange foncé et les structures internes sont soulignées. Les
kystes dégénérés sont colorés en bleu [Bioforma (1998)]. Les oocystes du genre
Cryptosporidium apparaissent non colorés sur un fond marron ce qui les différencie des
levures qui sont colorées par le lugol [Garcia et al. (1983), O’Donoghue (1995)]. Les lames
sont à lire rapidement car les oocystes de cryptosporidies se colorent au bout de 15 minutes
environ.
Cette méthode met en évidence tous les kystes de protozoaires dans les matières
fécales, elle permet une bonne coloration des kystes de giardia, mais elle ne colore pas les
oocystes coccidiens [Hendrix (1998), Beugnet et al. (2004)].
Cette technique est rapide et simple, elle peut être réalisée après une observation de
matière fécale en routine. Elle permet surtout la mise en évidence des kystes de giardia. Elle
est donc souvent réservée à l’observation de fèces lors d’une suspicion de giardiose.
d) Coloration au saccharose
La solution de saccharose ou solution de Sheather est utilisée pour la concentration des
parasites par la technique de flottation mais elle peut également être utilisée pour colorer une
lame. Un étalement de fèces peut être réalisé à partir du surnageant issu d’une flottation au
saccharose ou à partir d’un mélange d’une goutte de saccharose et d’une goutte de matière
fécale directement sur la lame [Beugnet et al. (2004)].
La solution de saccharose est réalisée à saturation (voir protocole de coloration en
annexe 14). Certains auteurs décrivent également la possibilité d’utiliser du sirop de sucre
[MacPherson et McQueen (1993)].
La lame doit être observée dans les 20 à 30 minutes suivant la coloration, les oocystes
se collabent après un certain temps dans cette solution et finissent par disparaitre.
Les oocystes de cryptosporidies apparaissent roses et sont réfringents, leur
morphologie est très bien conservée si l’observation est faite rapidement [Garcia et al.
(1983)].
60
Des études ont montré que la sensibilité de ce test est identique à celle d’un test
ELISA sur un prélèvement moyennement riche et très riche en cryptosporidies [Robert et al.
(1990)].
Cette technique ne nécessite pas de matériel onéreux et le réactif est facile à trouver,
de plus ce réactif n’est pas toxique et ne détériore pas le matériel, mais elle ne permet pas la
conservation des lames et la lecture doit être réalisée immédiatement. La solution est très
épaisse, par conséquent elle n’est pas très facile à utiliser.
Cette coloration, ou montage au saccharose, est facile à réaliser et rapide. Elle est donc
recommandée pour un examen rapide ou en routine sur des prélèvements de fèces de veaux
[Trotz-Williams et al. (2005)].
e) Méthode de Heine
Cette technique utilise la fuchsine (voir protocole de coloration en annexe 15), une
petite quantité de réactif est mélangée à une quantité égale de matière fécale sur une lame
[Beugnet et al. (2004)].
La lame doit être observée, à microscopie à contraste de phase, dans les 15 minutes
suivant la coloration, car les oocystes perdent leur réfringence.
En microscopie optique, les oocystes de C. parvum apparaissent non colorés mais
réfringents sur un fond rouge. Ils présentent un point sombre central représentant le corps
résiduel. Pour mieux les distinguer, il faut passer en microscopie à contraste de phase, les
oocystes sont alors très brillants sur fond noir. La réfringence des oocystes n’excède pas une
quinzaine de minutes [Khelef et al. (2002), Polack et al. (1983)].
Cette technique est simple, très rapide et facile à mettre en œuvre. Elle fait partie des
méthodes les plus sensibles dans la détection des oocystes de C. parvum. Pour bénéficier des
qualités de cette coloration il est nécessaire d’avoir un microscope à contraste de phase. Les
bulles d’air apparaissent également réfringentes ce qui complique la lecture de la lame
[Boufassa-Ouzrout et al. (1986), Khelef et al. (2002), Polack et al. (1983)].
La coloration de Heine est très rapide et sensible, elle est donc à conseiller pour
orienter le diagnostic de cryptosporidiose.
61
f) Coloration négative à la nigrosine
Pour cette coloration, le réactif utilisé est une solution de nigrosine à 1% (voir
protocole en annexe 16).
Les oocystes de cryptosporidies ne sont pas colorés par cette solution mais ils
deviennent brillants, la structure interne des oocystes est peu visible. Le fond est coloré en
noir, c’est donc une coloration négative. Les levures apparaissent presque semblables aux
oocystes, mais elles sont moins brillantes, plus petites et moins rondes [Boufassa-Ouzrout et
al. (1986), O’Donoghue (1995)].
Cette technique présente des résultats comparables à ceux obtenus avec une coloration
par une méthode de Ziehl-Neelsen modifiée.
Elle est rapide, sensible, peu couteuse et assez facile à interpréter. Ce colorant
convient donc bien à la détection d’organismes ayant un faible pouvoir de coloration comme
les oocystes de cryptosporidies. Il peut ainsi être utilisé en routine [Pohjola (1984)].
2. Fixation –coloration d’un frottis humide
Les techniques permettant la fixation et la coloration d’un frottis humide sont les
mêmes pour les formes végétatives que pour les formes kystiques des protozoaires.
a) Techniques en trois temps
Ces techniques en trois temps sont représentées essentiellement par les méthodes à
l’hématoxyline et la méthode du trichrome de Gomori-Wheatley.
Méthodes à l’hématoxyline i).
Comme pour la coloration des formes végétatives, la méthode la plus utilisée parmi les
méthodes à l’hématoxyline est la méthode à l’hématoxyline ferrique.
Les avantages et inconvénients de cette technique sont identiques pour la mise en
évidence des formes végétatives comme kystiques.
62
Trichrome (Gomori-Wheatley) ii).
Certains auteurs recommandent la coloration par le trichrome pour la recherche des
formes kystiques et végétatives de giardia [Garcia et al. (1979)]. En effet cette technique
colore bien les deux formes de giardia. Elle est d’une sensibilité équivalente voir supérieure à
celle de la méthode de MIF pour la détection des kystes de giardia par exemple [Thornton et
al. (1983), Badparva et al. (2009)].
Par contre cette coloration est décrite comme peu fiable pour la détection des oocystes
de cryptosporidies qui sont mal colorés et par conséquent difficile à retrouver sur les frottis de
fèces [Boufassa-Ouzrout et al. (1986)].
b) Technique en 1 temps
La principale méthode est la méthode de coloration au noir chlorazol de Kohn.
Le protocole est identique à celui effectué pour la coloration des formes végétatives.
Avec cette coloration, les kystes prennent une couleur bleu-gris à vert-gris. Les
noyaux sont facilement observables et les contours de ceux-ci sont nets, les structures
cellulaires se détachent en vert foncé à noir sur le cytoplasme incolore. Les levures se colorent
en gris foncé à noir [O’Donoghue (1995)].
Cette technique est facile à réaliser mais elle est longue (même si elle demande peu de
manipulations) [Rousset (1993)].
3. Coloration d’un frottis sec
Pour ces différentes méthodes, tout comme pour celles utilisées pour la détection des
trophozoïtes, un frottis mince de fèces est réalisé puis séché à l’air. Par la suite il sera souvent
fixé à l’aide d’alcool avant d’être coloré. Il y a différents types de méthodes, celles utilisant
les différents types de résistance aux acides des différents éléments présents dans les fèces
(Giemsa, Ziehl-Neelsen), la méthode de Brooke et Goldman et les méthodes par fluorescence.
63
a) Giemsa
Cette technique fut la première coloration pour la détection des oocystes de
Cryptosporidium parvum. Elle a été remplacée par les techniques de Ziehl-Neelsen.
Grâce à cette coloration, les oocystes sont entourés d’un halo clair. Ils présentent un
cytoplasme bleuté granuleux avec un centre plus clair et jusqu’à 6 corpuscules rouge foncé.
Les levures sont également colorées en bleu, leur contenu est moins granuleux. La taille et la
forme sont donc les deux seuls éléments permettant de différencier les levures des kystes
parasitaires [Polack et al. (1983), O’Donoghue (1995)].
Cette technique est simple à réaliser et permet de conserver la morphologie des
éléments parasitaires. De plus elle permet la conservation des lames colorées.
Cette méthode ne donne pas de résultat satisfaisant pour la détection des
cryptosporidies. Le risque de confusion des kystes parasitaires avec les levures est important
et les lames sont difficiles à lire étant donné le manque de contraste. Cette technique demande
donc plus de temps de lecture que d’autres et un personnel plus expérimenté [Khelef et al.
(2002), Garcia et al. (1983), MacPherson et McQueen (1993)].
La coloration de Giemsa a été abandonnée par les laboratoires car cette technique est
plus difficile à lire qu’une coloration de Ziehl-Neelsen modifiée.
b) Les méthodes de Ziehl-Neelsen
Il existe un grand nombre de méthodes de Ziehl-Neelsen, elles ont été modifiées par
rapport à la méthode de base pour être plus rapide, plus pratique et pour en augmenter
l’efficacité.
Méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen i).
Cette méthode est la plus utilisée par les laboratoires, elle est issue de la coloration de
Gram.
Les étapes de cette technique sont identiques pour toutes les méthodes de coloration de
Ziehl-Neelsen. Il y a une étape de fixation, puis une étape de coloration, une étape de
décoloration et une dernière étape de recoloration.
64
Le protocole donné par Henriksen et Pohlenz (voir en annexe 17) décrit la fixation du
frottis dans du méthanol ou de l’éthanol, puis il est séché et flambé à la lame. La lame est
alors colorée dans de la fuchsine puis décolorée avec une solution de différenciation (acide
sulfurique). Pour finir il est recoloré avec une solution de vert de malachite [Henriksen et
Pohlenz (1981)]. Le frottis est ensuite observé au microscope optique.
Quelques modifications de ce protocole originel ont été réalisées, l’acide sulfurique
peut être remplacé par un mélange d’acide chlorhydrique et d’alcool et les durées d’action des
différents produits peuvent être modifiées.
Cette méthode permet de mettre en évidence les oocystes qui prennent une couleur
rouge facilement distinguable sur le fond vert. Le cytoplasme de ceux-ci est d’aspect
granuleux avec le centre plus clair, 0 à 6 corpuscules apparaissant de couleur foncé sont
visibles à l’intérieur des kystes. Les autres coccidies apparaissent également colorées en rouge
tandis que les cellules, les bactéries et les débris le sont en vert [Polack et al. (1983),
Henriksen et Pohlenz (1981), Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]. Cependant, les oocystes ne
sont pas toujours colorés de façon uniforme [Kar et al. (2011), Casemore (1991)]. Cette
technique est donc plus facile à lire que la coloration par le Giemsa étant donné le plus grand
contraste de couleur et la distinction aisée entre les levures et les éléments parasitaires
[MacPherson et McQueen (1993)].
La morphologie des oocystes est bien conservée et il n’y a pas de risque de confusion
avec les levures ou les débris fécaux ce qui rend l’observation des lames facile. Cette
technique est simple et d’une très bonne sensibilité. Certaines études montrent qu’il y a
seulement 5,5% de sensibilité de moins pour la détection de Cryptosporidium parvum avec le
Ziehl-Neelsen modifiée qu’avec l’immunofluorescence [Kvác et al. (2003)].
Après coloration, les lames peuvent être conservées et leur lecture peut se faire
quelques temps après, mais cette technique est relativement longue et demande plusieurs
manipulations. Elle est donc difficile à utiliser en routine [Trotz-Williams et al. (2005),
Henriksen et Pohlenz (1981)].
Cette méthode de coloration de Ziehl-Neelsen modifié par Henriksen est la méthode
de référence pour la détection des oocystes de Cryptosporidium du fait de sa sensibilité, de sa
facilité de lecture et de sa fiabilité [Garcia et al. (1983), Khelef et al. (2002)]. Elle permet
également de visualiser les giardias, mais cette technique est relativement lente et par
conséquent difficile à utiliser dans les laboratoires pour des analyses de routine.
65
Autres modifications de la méthode de Ziehl-Neelsen ii).
Depuis la parution du protocole de coloration de Ziehl-Neelsen modifié par Henriksen,
d’autres auteurs ont décrit des modifications différentes.
Le temps de décoloration peut être diminué, ou le vert de malachite peut être remplacé
par du bleu de méthylène [Beugnet et al. (2004), Ortolani (2000)].
Certaines de ces modifications sont très utilisées, comme la modification apportée par
Angus (voir protocole en annexe 18) ou par Kinyoun. Ce dernier décrit un temps plus court de
coloration à la fuchsine et une décoloration à l’aide d’un mélange d’acide et d’alcool. La
contre-coloration s’effectue à l’aide de bleu de méthylène.
Cette technique permet donc de diminuer le temps total de coloration et de limiter les
vapeurs inflammables car toutes les étapes se réalisent à froid. La morphologie reste bien
conservée et les oocystes apparaissent toujours de couleur rouge mais sur un fond de couleur
bleu [Garcia et al. (1983), MacPherson et McQueen (1993)].
Une autre méthode de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée utilise un mélange de
fuchsine diamant et de dimethylsulphoxide comme solution colorante (voir protocole en
annexe 19). La contre-coloration se fait avec du vert de malachite après une décoloration avec
de l’acide acétique.
Les oocystes sont de couleur rose brillant à rose fuchsia ce qui ressort sur le fond vert
pâle. Les levures sont, elles, colorées en bleu-gris. La structure interne est bien conservée. Les
formes végétatives sont partiellement colorées par cette méthode, elles sont marron à noires.
Cette technique permet une bonne coloration, elle est rapide, elle diminue le temps de
coloration par rapport à la méthode décrite par Henriksen et elle est facile à lire. Par contre,
elle est instable et nécessite plusieurs manipulations [Pohjola et al. (1985), Bronsdon (1984)].
c) Méthode de Brooke et Goldman
La technique de Brooke et Goldman a déjà été décrite dans la partie sur les colorants
des formes végétatives puisqu’elle permet de colorer les kystes et les trophozoïtes des
protozoaires.
66
Toutefois, lors de la réalisation de cette technique pour la mise en évidence de kystes,
ceux-ci sont moins visibles car ils perdent leur réfringence et subissent une distorsion.
Cette méthode n’est donc pas à privilégier pour la détection des formes kystiques en
coproscopie.
d) Méthode à fluorescence
Les méthodes à fluorescence sont utilisées pour avoir une vision rapide de
l’échantillon et permettent d’orienter le diagnostic. Tout comme les colorations de Ziehl-
Neelsen, le principe repose sur la résistance à la décoloration des éléments parasitaires
recherchés, mais le colorant utilisé est un colorant fluorescent.
Les différents protocoles s’effectuent donc en trois étapes, une étape de coloration
avec le colorant fluorescent, une étape de décoloration et une dernière étape de contre-
coloration.
Ces techniques permettent une visualisation rapide des oocystes coccidiens puisque
ceux-ci sont alors colorés en orange ou rose fluorescent sur un fond très foncé [O’Donoghue
(1995)]. L’inconvénient majeur est la nécessité de disposer d’un microscope à fluorescence
[MacPherson et McQueen (1993)].
Différents colorants fluorescents sont utilisés comme l’Auramine-O, l’auramine-
phénol, la mépacrine ou l’acridine orange.
Auramine-fuchsine carbolique i).
Cette technique associe le principe de la coloration négative avec celui de la coloration
par fluorescence.
Le colorant fluorescent utilisé est de l’auramine-phénol et la recoloration s’effectue
avec de la fuchsine carbolique. Dans ce protocole (voir en annexe 20), il n’y a pas d’étape de
décoloration [Casemore et al. (1984)].
Les oocystes ressortent alors du fond rouge-noir par leur aspect fluorescent. Cette
technique ne permet pas la coloration des formes végétatives et kystiques de Giardia
[Harrington (2008)]. La morphologie des coccidies n’est pas très nette et en cas de doute, il
67
peut parfois être nécessaire de recolorer la lame avec la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée
par Henriksen.
La coloration à l’auramine-fuchsine carbolique est rapide, simple et pratique pour
réaliser un dépistage. Néanmoins, elle nécessite un microscope à fluorescence et un contrôle à
l’aide d’une autre coloration peut être nécessaire [Beugnet et al. (2004), Casemore et al.
(1984), Casemore et al. (1985)].
Auramine-phénol ii).
Pour cette coloration, le colorant fluorescent est toujours l’auramine-phénol, mais le
second colorant est une solution de permanganate de potassium (voir protocole en annexe 21).
La décoloration entre les deux étapes est réalisée à l’aide d’un mélange acide-alcool.
Les oocystes coccidiens sont clairement visibles, ils sont colorés en jaune sur le fond
noir.
L’auramine-phénol a une plus grande affinité pour les oocystes que la fuchsine
carbolique, c’est pour quoi cette coloration donne de meilleurs résultats [Boufassa-Ouzrout et
al. (1986), Nichols et Thom (1984)].
Cette technique est utilisée en routine dans de nombreux laboratoires, les lames
positives peuvent être recolorées par une autre technique comme celle de Giemsa ou de Ziehl-
Neelsen, mais cela n’est pas forcément nécessaire [Casemore et al. (1984)].
Mépacrine iii).
Le protocole est identique à celui de la coloration à l’auramine-phénol, mais le
colorant fluorescent utilisé est la mépacrine (voir protocole en annexe 22). L’Auramine-O
peut également être utilisée comme colorant fluorescent, mais celle-ci est plus chère que la
mépacrine.
Les oocystes de cryptosporidies apparaissent sous forme de disques fluorescents très
caractéristiques qui sont mis en évidence par leur couleur sur fond noir. La morphologie des
68
éléments parasitaires n’est pas bien conservée. Les levures ne prennent pas la mépacrine donc
elles sont facilement discernables des oocyste de C. parvum.
Cette méthode est rapide et facile à réaliser, de plus elle est peu chère. Mais comme
pour toutes les autres colorations fluorescentes, elle nécessite un matériel particulier pas
toujours présent dans tous les laboratoires [Ungureanu et Dontu (1992)].
Ces colorations ne sont pas spécifiques mais elles permettent de réaliser un diagnostic
rapide sur un grand nombre de lames. La méthode est rapide, simple et peu chère, de plus la
lecture est aisée, mais ces techniques demandent un matériel spécialisé, des contrôles qualités
réguliers et parfois une confirmation par une autre coloration de la présence des oocystes
coccidiens [Hanscheid et al. (2008), Garcia et al. (1983)].
Il est donc recommandé d’utiliser une technique à fluorescence pour étudier un grand
nombre de lames et de recolorer à l’aide de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée les lames
positives [MacPherson et McQueen (1993)].
A retenir :
Pour le diagnostic de cryptosporidiose, la technique de référence est la coloration de Ziehl-
Neelsen modifiée. Elle donne de très bons résultats, cependant elle est assez longue. D’autres
techniques plus rapides sont alors régulièrement utilisées en laboratoire ou en clinique
comme la coloration par le saccharose. Certains laboratoires utilisent une coloration
fluorescente ou la coloration de Heine pour orienter le diagnostic.
Pour la recherche de kystes de giardia, la coloration de choix est la coloration au lugol, la
coloration de Ziehl-Neelsen modifiée permet également ce diagnostic.
69
CONCLUSION
Chez les ruminants, trois genres de protozoaires digestifs sont principalement
rencontrés : Cryptosporidium, Giardia et Eimeria. Tous ont une forme kystique retrouvée
dans les matières fécales, mais le genre Giardia présente également une forme flagellée. Pour
le genre Eimeria, il existe un grand nombre d’espèces non pathogènes. Il est donc utile
d’identifier l’espèce ou les espèces présentes dans l’échantillon.
Pour permettre un bon diagnostic, il est nécessaire de respecter certaines règles de
prélèvement et de conservation de l’échantillon. Pour l’observation de formes végétatives de
giardia, il faut une conservation rapide du prélèvement ou un acheminement très rapide (de
l’ordre de quelques heures) tandis que pour les autres éléments parasitaires, l’échantillon peut
être expédié sous 2 à 3 jours sans conservation spéciale. L’examen des fèces peut nécessiter
une concentration des éléments parasitaires pour limiter les débris et augmenter les chances de
retrouver les parasites. La méthode de flottation est la principale technique employée pour
cette étape. Pour la préparation de certaines colorations, un frottis fécal peut être nécessaire, il
est alors à réaliser de façon rigoureuse pour permettre une bonne lecture.
Différents moyens de diagnostic existent pour la détection des protozoaires digestifs
dans les matières fécales chez les ruminants. Les techniques immunologiques et de biologie
moléculaire se développent de plus en plus de nos jours, mais l’examen microscopique reste
un examen de choix et réalisable sans nécessiter de matériel spécialisé. En ce qui concerne la
coproscopie, les méthodes de coloration permettant la mise en évidence des éléments
parasitaires sont nombreuses et parfois assez spécifiques d’un genre de parasite. Certains
colorants ne colorent pas toutes les formes parasitaires mais parfois seulement les formes
kystiques. Parmi les colorants présentés, les plus couramment utilisés sont les colorations
iodées pour la détection de giardia, ainsi que les colorations de Ziehl-Neelsen modifiées ou
les colorations rapides par la méthode de Heine ou le saccharose.
Dans la suite de ce travail, nous allons donc étudier le résultat d’une enquête réalisée
sur les techniques de diagnostic utilisées par les laboratoires en France ainsi qu’une
comparaison de la sensibilité, de la spécificité et de l’aspect pratique de différentes
colorations rapides des protozoaires intestinaux.
70
71
PARTIE II : BILAN SUR LES METHODES DE
DIAGNOSTIC DES PROTOZOAIRES DIGESTIFS EN
FRANCE ET ETUDE EXPERIMENTALE
COMPARATIVE DE TECHNIQUES DE COLORATION
RAPIDES POUR LA MISE EN EVIDENCE DES
PROTOZOAIRES INTESTINAUX
72
I. INTRODUCTION
Les protozoaires sont des parasites pathogènes chez les jeunes bovins.
Cryptosporidium parvum affecte les veaux dès l’âge de 6 jours puis ils peuvent être
contaminés par Giardia intestinalis ou Eimeria sp.. Ils sont donc souvent recherchés pour
déterminer la cause de diarrhées ou de ralentissements de croissance en élevage.
De nombreuses techniques coproscopiques peuvent être utilisées dans les laboratoires
ou en clinique vétérinaire pour la détection des protozoaires dans les fèces de bovins, qu’elles
soient immunologiques ou microscopiques.
Cette partie expérimentale a pour but de connaitre et de faire un bilan des diverses
techniques employées en France pour la recherche des protozoaires en coproscopie et de
comparer des méthodes de coloration rapide pour la détection des 3 genres principaux de
protozoaires : Cryptosporidium, Giardia et Eimeria.
Afin de connaitre les techniques employées en France, les laboratoires vétérinaires
départementaux et les laboratoires départementaux d’analyses ont été questionnés. L’étude de
leurs réponses permet de réaliser un état des lieux des techniques actuellement utilisées.
De nombreux examens coproscopiques ont été réalisés à l’aide de 3 méthodes de
coloration (Heine, Lugol et Saccharose). Ils ont été comparés à une coproscopie réalisée à
l’aide d’une méthode de référence choisie : La méthode de Ziehl-Neelsen modifiée pour C.
parvum et une coproscopie sans coloration pour les genres Giardia et Eimeria.
73
II. MATERIELS ET METHODES
A. RECUEIL DE DONNEES ET D’ECHANTILLONS
1. Modalités de contact
La liste des laboratoires et les coordonnées de ceux-ci ont été récupérées grâce au site
internet des pages jaunes, à l’annuaire Roy ainsi qu’aux sites internet officiels des conseils
généraux.
Les laboratoires ont été contactés par e-mail dans un premier temps. En cas d’absence
de réponse ou d’erreur dans les adresses e-mail, les laboratoires ont été contactés par fax.
Un questionnaire permettant une entrée rapide des données a été envoyé par e-mail en
pièces jointes. Ce questionnaire a été réalisé grâce à l’outil de formulaire disponible sur le
logiciel Word. Cet outil a permis au personnel des laboratoires de pouvoir répondre
rapidement aux questions grâce à des cases à cocher et des zones d’entrée lors de
renseignements supplémentaires. Les réponses nous ont été transmises par e-mail ou par fax.
Un lien vers un site disposant du même questionnaire leur a également été envoyé dans le
corps de l’e-mail. Ce site donne aux laboratoires la possibilité de répondre directement en
ligne (http://www.mon-enquete-enligne.fr/index.php?sid=99725&lang=fr).
Lorsqu’aucune réponse n’a été obtenue après deux contacts par e-mail, le
questionnaire leur a été transmis par fax, avec un retour possible par e-mail, fax et téléphone.
Pour la récupération des échantillons de fèces, des éleveurs laitiers et allaitants ont été
contactés. Des vétérinaires exerçant en clientèle rurale ainsi que le service de pathologie du
bétail de VetAgro Sup nous ont permis de réaliser des prélèvements et nous ont fait parvenir
quelques échantillons de fèces.
2. Zone et période d’étude
Les questionnaires ont été envoyés aux LVD et LDA de France métropolitaine. Les
envois se sont déroulés sur 3 mois, les premiers contacts ont été pris à partir de la fin du mois
74
de juin 2012. Les envois se sont poursuivis sur les mois de juillet et d’août. La réception des
questionnaires s’est principalement déroulée au cours des mois d’été, mais les dernières
réponses sont arrivées au début du mois de septembre.
Après la prise de contact avec des éleveurs, des vétérinaires et le service de pathologie
du bétail de VetAgro Sup, les fèces ont été prélevées sur des jeunes bovins laitiers et
allaitants. Les prélèvements proviennent d’élevages répartis sur 3 départements : l’Allier, la
Loire et le Rhône. La collecte des échantillons s’est faite, de façon étalée, sur une période
d’un mois et demi. Ces prélèvements ont été réalisés sur les mois de septembre et d’octobre
2012.
3. Collectes et modalités de prélèvement des échantillons
Les animaux prélevés sont de jeunes bovins, de 5 jours à 3 mois venant d’élevages laitiers
et d’élevages allaitants. Certains veaux présentaient des signes de diarrhées aigües, quelques
un présentaient une diarrhée chronique. Les autres bovins ne montraient aucune anomalie
clinique.
Pour récupérer des matières fécales, pour l’échantillon, les bovins ont été stimulés pour
déféquer afin d’obtenir des fèces les plus fraiches possibles. Les selles sont alors prélevées
puis mises dans des pots adaptés. Ils sont ensuite placés directement au réfrigérateur avant et
après leur acheminement au laboratoire. En moyenne les analyses ont été réalisées 2 jours
après l’émission des selles.
Au total, 84 échantillons ont été obtenus, 30 échantillons ont été colorés et analysés pour
la recherche de C. parvum, 27 ont été observés à la recherche de kystes de G. intestinalis et 27
autres ont été utilisés pour comparer les méthodes de coloration pour le genre Eimeria.
75
B. PREPARATION DU QUESTIONNAIRE ET DES ECHANTILLONS
1. Réalisation du questionnaire
Cette enquête sur la coproscopie chez les ruminants a été menée pour deux thèses, les
questionnaires comportent donc 2 parties, une sur les méthodes de flottation en coproscopie
(thèse de doctorat vétérinaire de Fabienne RICHARD) et une partie sur la recherche des
protozoaires digestifs dans les fèces.
La partie concernant la recherche des protozoaires intestinaux comporte 7 questions.
Les deux premières questions concernent le coût de la recherche de Giardia et celui de la
recherche de Cryptosporidium.
Deux autres questions concernent les colorations utilisées en routine et lors d’une
demande de recherche spécifique. La liste des colorants proposée est Ziehl-Neelsen modifié,
Heine, Saccharose, Lugol, MIF. Ce sont les 5 techniques de colorations utilisées les plus
fréquemment, une zone d’entrée était disponible en cas d’utilisation d’un colorant absent de la
liste.
La durée moyenne d’une coloration leur est demandée.
Dans cette enquête, nous demandons la ou les raisons du choix du ou des colorants
utilisés. Il y a 4 possibilités de réponse : le coût, la facilité de préparation, le type de parasite
recherché et la facilité de lecture.
En raison d’un grand nombre de techniques de Ziehl-Neelsen modifiées, la dernière
question de cette enquête porte sur les réactifs et les durées d’action de ceux-ci lors
d’utilisation d’une technique de Ziehl-Neelsen (voir le questionnaire envoyé aux laboratoires
en annexe).
2. Préparation des échantillons en vue de la coloration
Les prélèvements issus de bovins âgés de moins de 3 semaines n’ont pas été utilisés
pour la recherche des protozoaires du genre Eimeria, de même les échantillons provenant de
bovins âgés de plus de 5 semaines n’ont pas été utilisés pour la recherche de C. parvum.
Lors de la recherche de cryptosporidies, les méthodes de colorations comparées
nécessitent une texture de selles assez liquide pour pouvoir être correctement effectuées.
Lorsque les fèces sont trop solides, une petite quantité de celles-ci (environ 2g) est placée
76
dans un verre à pied. Du sérum physiologique est alors ajouté (environ 3 ml) afin d’obtenir
un mélange de selles pâteux. La quantité de sérum physiologique est à adapter en fonction de
la texture initiale des selles.
Pour une des techniques de coloration réalisée pour la détection des cryptosporidies,
un frottis fécal est nécessaire. Pour cela une goutte de fèces ou une goutte du mélange de
fèces avec du sérum physiologique est prélevée et déposée sur une lame. A l’aide d’une autre
lame, la goutte est alors étalée pour obtenir une mince couche de matière fécale homogène sur
la lame. Le frottis ainsi réalisé est alors laissé à l’air ambiant pendant une heure environ
jusqu’à ce qu’il soit secs.
Lors de la comparaison des colorations pour la détection des formes parasitaires des
genres Giardia et Eimeria, une méthode de flottation est effectuée afin de concentrer les
éléments parasitaires présents.
Pour cela, 5 g de fèces sont mélangés avec 20 ml d’une solution de sulfate de zinc
(d=1,36). Le mélange est alors filtré à l’aide d’un tamis et d’une gaze. Le filtrat est enfin placé
dans un tube à centrifuger, le tube est complètement rempli jusqu’à ce que la solution forme
un ménisque surmontant le tube. Une lamelle est alors déposée sur le tube, l’ensemble est
placé ensuite dans la centrifugeuse. La centrifugation s’effectue pendant 5 minutes à 1500
tours par minute. A la fin de l’étape de centrifugation, la lamelle est récupérée et posée sur
une lame porte-objet présentant ou non une goutte d’un colorant étudié.
3. Dilution des échantillons
Pour la réalisation de différentes dilutions d’un échantillon riche en oocystes de C.
parvum, le nombre d’oocystes dans cet échantillon a été quantifié.
Une cellule de Malassez est nécessaire afin de réaliser la quantification. L’épaisseur
des fèces de veau nécessite une dilution pour pouvoir distinguer le quadrillage de la cellule.
200µl de l’échantillon initial est mélangé à 1800µl de la solution de saccharose. Ce mélange
est alors agité afin d’être homogénéisé. Avant que la solution ne se stabilise, une petite
quantité de la solution est prélevée et déposée sur la cellule de Malassez.
77
Les oocystes sont comptés sur tous les rectangles de la cellule de Malassez, puis la
moyenne par rectangle est effectuée. Le volume d’un rectangle étant de 1.10-5
ml, le nombre
d’oocystes par ml est donc connu.
Lors des dilutions de l’échantillon initial pour la comparaison des colorations de Heine
et de lugol, celui-ci est dilué dans du sérum physiologique.
Pour chaque dilution, 100 µl de fèces sont diluées dans différents volumes de sérum
physiologique selon la concentration voulue.
Pour la réalisation des colorations au saccharose, la dilution s’effectue dans la solution
de saccharose.
78
C. MODALITES DE COLORATION ET DE LECTURE DES PRELEVEMENTS
1. Coloration des prélèvements
Chaque échantillon est analysé selon plusieurs procédures.
En vue de la comparaison des techniques de coloration pour la détection de
Cryptosporidium parvum, les fèces sont utilisées directement et colorées par 4 techniques
différentes. La méthode de Ziehl-Neelsen a été choisie comme méthode de référence en raison
de son importance historique. Les autres colorations testées sont les colorations par une
solution de saccharose, par la méthode de Heine (solution de fuchsine) et par une solution de
lugol.
En ce qui concerne la comparaison des colorants pour la recherche d’éléments
parasitaires des genres Giardia et Eimeria, un autre type de procédure est réalisé. Une
concentration des fèces est effectuée par la méthode de flottation au sulfate de zinc. La
lamelle issue de cette concentration est alors placée sur une goutte de colorant déposée sur
une lame.
a) La coloration par une solution de saccharose
Pour cette coloration, une solution de saccharose à saturation est préparée. On mélange
environ 20g de saccharose dans 10 ml d’eau (voir protocole en annexe 14). Cette solution est
agitée pendant plus d’une heure jusqu’à la dissolution complète des derniers cristaux de
saccharose. La solution peut être chauffée pour accélérer la dissolution.
Une goutte de saccharose est déposée sur une lame.
Pour l’observation directe de fèces, une goutte de fèces est mélangée à la goutte de
saccharose à l’aide d’une pipette pasteur fermée. Ensuite une lamelle est déposée sur le
mélange. L’observation se fait immédiatement après la préparation, on regarde l’étalement au
microscope optique à l’aide des objectifs x10 et x 40.
Pour la coloration suite à une méthode de concentration, la lamelle est alors posée
directement sur la goutte de saccharose. L’observation se fait rapidement après la coloration.
79
b) La méthode de Heine ou coloration à la fuchsine
Comme pour la technique de coloration avec la solution de saccharose, lors
d’observation directe, une petite quantité de fèces est mélangée à une égale quantité de
fuchsine sur une lame. Elle est ensuite recouverte d’une lamelle avant que le mélange ne
sèche. De même lors de l’utilisation d’une méthode de concentration, la lamelle est posée
directement sur une goutte de fuchsine disposée sur une lame.
L’observation de la lame se fait rapidement après la coloration pour limiter les effets
dus à la déshydratation du mélange. Cette technique a été souvent décrite avec une
observation au microscope optique à contraste de phase. Dans le cadre de cette étude,
l’observation s’est effectuée avec un microscope optique à l’objectif x40.
c) La méthode de Ziehl-Neelsen modifiée
Différentes solutions et colorants sont nécessaires pour la réalisation de cette
technique, le protocole choisi est celui décrit par Beugnet [Beugnet et al. (2004)].
Un mélange d’acide chlorhydrique à 3% dans de l’éthanol à 95° est réalisé avant le
début des manipulations, ce mélange se conserve bien dans un flacon hermétique.
Le frottis sec est fixé pendant 5 minutes avec de l’éthanol à 95° puis l’alcool restant
sur la lame est flambé. La lame est alors placée dans un bain de fuchsine pendant 3 minutes
30. Puis elle est rincée à l’eau et décolorée à l’aide du mélange acide-alcool par deux passages
rapides, un rinçage à l’eau est effectué après et entre les décolorations. La recoloration se fait
dans un bain de vert de malachite à 0,5% pendant 1 minute. La lame est ensuite rincée et
séchée (voir le protocole en annexe 24).
L’observation se fait après séchage de la lame à l’air ambiant. Les objectifs x10 et x40
sont utilisés.
d) La coloration au lugol
Une solution de lugol est préparée à l’aide d’un mélange d’iode et d’iodure de
potassium (voir annexe 13).
Un étalement de fèces est réalisé en déposant une goutte de fèces liquide ou d’un
mélange fèces-sérum physiologique que l’on recouvre d’une lamelle. Avant que l’étalement
80
ne se dessèche, une goutte de lugol est déposée au bord de la lamelle. Le colorant migre alors
sous la lamelle et colore les éléments.
Lors d’une coloration d’une lamelle après centrifugation, la technique est identique,
une petite quantité de lugol est placée au bord de la lamelle.
L’observation se fait dans la zone de progression du colorant, à l’aide d’un microscope
optique et d’objectifs x 10 et x 40.
2. Lecture des lames
La lecture des lames se fait à plusieurs grossissements.
Pour la recherche des éléments parasitaires du genre Eimeria, la lame est observée à
l’aide de l’objectif x10. Toute la lame est parcourue et tous les parasites aperçus sont observés
à plus fort grossissement pour leur identification. Leur taille est mesurée à l’aide d’un oculaire
micrométrique étalonné sur le microscope. Tous les parasites du genre Eimeria sont alors
identifiés et classés par espèce, ils sont également comptabilisés sur toute la lamelle.
Pour le genre Eimeria, l’échantillon est qualifié de négatif lorsqu’aucun parasite n’est
observé sur la lamelle, présence lorsque le nombre de parasites vu est compris entre 1 et 10,
positif entre 11 et 50, très positif de 51 à 100 et fortement positif lorsque le nombre
d’oocystes est supérieur à 100.
Pour la recherche des éléments parasitaires du genre Giardia, la lame est observée à
l’objectif x10, en cas d’observation d’éléments semblables à des kystes, l’objectif x40 est
utilisé.
Lors de la lecture d’une lame à la recherche d’oocystes de C. parvum, celle-ci est
observée à l’objectif x40.
Les oocystes de C. parvum et les kystes de G. intestinalis, sont comptés sur 25 champs
au plus fort grossissement, pris sur la diagonale de la lamelle.
En fonction de la quantité d’oocystes observés sur 25 champs à l’objectif x 40, les
échantillons sont qualifiés d’une catégorie.
Pour C. parvum, un résultat de présence est rendu lorsqu’il y a de 1 à 5 oocystes,
positif (+) de 6 à 50, très positif (++) de 51 à 100, fortement positif (+++) de 101 à 200 et très
fortement positif (++++) au-delà.
81
Pour G. intestinalis, la limite des catégories est différente. De 1 à 5 kystes vus dans les
25 champs c’est une présence (P), de 6 à 10 le prélèvement est positif (+), de 11 à 20 il est
très positif (++) et au-delà de 20 il est fortement positif (+++).
Après la lecture de toute la lamelle, les lames sont éliminées. Les colorants employés
n’ont pas une toxicité chimique importante et les lames utilisées (en verre) sont
potentiellement coupantes. Ces 2 critères justifient que les lames soient considérées comme
des déchets d’activité de soins à risques. Elles doivent donc être conservées dans des
collecteurs adaptés et éliminées en vue de leur incinération.
82
D. ETUDE STATISTIQUE
Les données étudiées sont analysées à l’aide d’outils statistiques. En raison de données
provenant de l’analyse des mêmes prélèvements par des méthodes de coloration différentes et
de leur caractère non paramétrique, le test de rang de Wilcoxon est utilisé pour leur analyse.
Les tests ont été réalisés avec des tables de contingences représentant le nombre
d’oocyste de C. parvum sur 25 champs selon le colorant utilisé. La quantité d’éléments
parasitaires est représenté par 5 catégories (négatif, présence, +, ++, +++, et ++++), à chaque
catégorie est associé un chiffre (1 pour négatif, 2 pour présence etc.).
Pour les tables de contingences pour les genres Giardia et Eimeria, celles-ci sont
réalisées avec le nombre de kystes de giardia observés sur 25 champs ou le nombre
d’oocystes d’Eimeria vus sur la lame.
Le logiciel de statistique R a été utilisé pour réaliser les différents tests des rangs de
Wilcoxon pour tous les colorants et tous les genres de protozoaires.
83
III. RESULTATS
A. ENQUETE SUR LES METHODES DE DETECTION DES PROTOZOAIRES EN
COPROSCOPIE EN FRANCE
Sur les 73 questionnaires envoyés aux LVD et LDA de France métropolitaine, 49
laboratoires ont répondu. Parmi ces réponses, 3 laboratoires nous ont informés qu’ils ne
réalisent plus d’analyse concernant la parasitologie.
Les laboratoires ont utilisé différents moyens pour nous répondre, 16 laboratoires ont
choisi de nous répondre grâce au questionnaire en ligne, 14 ont répondu par l’intermédiaire du
fax et 16 par e-mail.
Figure 10 : Répartition des laboratoires départementaux ayant répondu
Pour la détection des protozoaires dans les selles chez les jeunes bovins, 91,3% des
laboratoires interrogés utilisent une méthode de coloration pour Giardia intestinalis et
Cryptosporidium parvum. Certains laboratoires utilisent les tests immunologiques pour la
recherche des formes parasitaires de Giardia et de Cryptosporidium. 21,7% des laboratoires
ayant répondu, utilisent ce type de test pour la détection des kystes de giardia ou des oocystes
de C. parvum.
84
1. Les colorations en routine lors d’analyse coproscopique de jeunes bovins
dans les laboratoires départementaux
Après étude des réponses des LDA et LVD, la coloration la plus fréquemment utilisée
par les laboratoires départementaux est la coloration de Ziehl-Neelsen modifiée, puisque
60,6% des laboratoires utilisant une coloration, emploient cette technique pour leurs analyses
coproscopiques. En seconde place on retrouve la coloration de Heine, qui est effectuée par
36,4% des laboratoires, suivie de la méthode de coloration au lugol (27,3%). Les techniques
de MIF et de coloration par une solution de saccharose sont des colorations moins utilisées.
Figure 11 : Part des laboratoires utilisant chaque colorant en routine
Les laboratoires utilisant des colorations signalent mettre en moyenne 18 minutes pour
réaliser la technique de coloration permettant la recherche des éléments parasitaires de
protozoaires dans les selles.
2. Les colorations lors de demande de recherche de Cryptosporidium
D’après les réponses des laboratoires recherchant les cryptosporidies, 95,6% d’entre
eux utilisent une technique de coloration pour la recherche des oocystes de C. parvum. Un
autre type de méthode diagnostique est également employé, les méthodes immunologiques
sont utilisées par près de 9% des laboratoires pour la recherche de ce genre de protozoaire.
Z-N modifié
60,60%
Heine
36,40%
Lugol
27,30%
M.I.F.
18,20%
Saccharose
12,10%
85
La moitié des laboratoires employant une technique de coloration pour leur diagnostic
utilise la méthode historique de Ziehl-Neelsen modifiée. Au vu des réponses sur les
protocoles réalisés de Ziehl-Neelsen modifiée, la plupart des laboratoires utilisent un
protocole différent. Parmi les 17 laboratoires nous ayant indiqué leur protocole, seuls 2
protocoles sont communs à 2 laboratoires chacun. 13 protocoles différents ont donc été décrits
par les laboratoires, avec des nuances dans la durée de chaque étape, le type de décolorant et
de recolorant. 11 laboratoires utilisent de l’acide sulfurique pour l’étape de coloration et 5
emploient un mélange d’acide chlorhydrique et d’éthanol à 3%. De même pour l’étape de
recoloration, 13 recolorent les lames à l’aide de vert de malachite (à des concentrations
différentes), 3 laboratoires utilisent le bleu de méthylène. Les temps de coloration à la
fuchsine phéniquée varient de 5 à 60 minutes.
La technique de Heine est la seconde coloration la plus utilisée pour la recherche de C.
parvum chez les ruminants, en effet 36% des laboratoires notifient son application dans le
questionnaire. La dernière coloration utilisée est la technique de coloration par une solution de
saccharose. Aucune autre coloration n’est utilisée pour ce diagnostic dans les laboratoires
ayant répondu à nos questions.
Figure 12 : Pourcentage d’utilisation des colorants lors de recherche de C. parvum
Le tarif d’un examen coproscopique pour la recherche des éléments parasitaires du
genre Cryptosporidium est en moyenne de 9,59 €. Le tarif varie de 3 à 20 € avec une moyenne
de 9,11 € lors d’un diagnostic à l’aide d’une coloration. Ce tarif varie de 7,65 à 20,74 € et la
moyenne s’élève à 15,10 € lors d’utilisation d’une technique immunologique.
Z-N
modifié
50% Heine
36,10%
Saccharose
13,90%
86
Figure 13 : Tarifs de recherche de C. parvum pour des méthodes de colorations et pour des
méthodes immunologiques
Les laboratoires utilisant la technique de Ziehl-Neelsen modifiée pour le diagnostic de
cryptosporidiose notifient une durée moyenne de la technique de coloration de 24 minutes.
Elle est de 15 minutes pour le saccharose et de 9,5 minutes pour la technique décrite par
Heine.
3. Les colorations lors de demande de recherche de Giardia
Les réponses au questionnaire montrent que près de 85% des LVD et LDA réalisent le
diagnostic de la giardiose lors de demande spécifique. Plus de la moitié de ces laboratoires
utilisent un colorant pour la recherche des kystes de giardia. Un quart des laboratoires
départementaux recherchant ce genre de protozoaire utilise une technique immunologique
pour le diagnostic.
Seul 2 colorants ont été notifiés dans le questionnaire, les colorations citées font toutes
les deux partie des colorations iodées. La technique la plus utilisée est la coloration au lugol,
en effet cette technique est employée dans plus de 56% des laboratoires. L’autre méthode
employée est celle de MIF,
9
22
8
0 1 0 1 0 2 1
[3€-7€[ [7€-11€[ [11€-15€[ [15€-19€[ [19€-23€[
Coloration
Immunologie
87
Figure 14 : Pourcentage d’utilisation des colorants lors de recherche spécifique de Giardia
Le tarif pour une recherche de G. intestinalis dans les selles est en moyenne de 13,21
€. Lors de diagnostic par une technique de coloration, les tarifs s’échelonnent de 5 à 25 €
avec un tarif moyen de 11,18 €. Les tarifs varient de 6,50 à 30,50 € et la moyenne passe à
18,96 € lorsque la méthode utilisée est immunologique.
Figure 15 : Tarifs de recherche de kystes de giardia pour des méthodes de colorations et pour
des méthodes immunologiques
Les laboratoires ayant répondu utiliser la coloration de MIF pour la recherche des
kystes de giardia, mettent environ 25 minutes pour réaliser cette technique. Le temps de
réalisation de la coloration au lugol est d’approximativement 4 minutes 40 en moyenne.
Lugol
56,25%
MIF
43,75%
1
7
15
5
1 1 0 0 0
1 0
4
1 1 2
1
Coloration
Immunologie
88
4. Critères de choix des colorants par les laboratoires
Au sein de l’enquête, il a été demandé aux LVD et LDA de nous préciser quels sont
leurs critères de choix de leur technique de coloration.
Les deux critères qui s’avèrent être les plus importants sont le type de parasite
recherché (selon les hypothèses diagnostiques et l’âge de l’animal) et la facilité de lecture de
la lame (69% et 66,7% respectivement). La facilité de réalisation du protocole est un critère
qui a été cité dans un peu moins de 40% des réponses reçues. Pour finir la sélection du
colorant par son coût est le dernier critère choisi, seul 28,6% des laboratoires utilisant une
technique de coloration pour le diagnostic l’ont mentionné.
Figure 16 : Critères de choix des laboratoires de leur méthode de coloration
69% 66,70%
38,10%
28,60%
Parasites
recherchés
Facilité de
lecture
Facilité de
préparation
Coût
89
B. COMPARAISON DE QUATRE TECHNIQUES DE COLORATION EN COPROSCOPIE
1. Comparaison de la sensibilité des colorants vis-à-vis de trois genres
courants de protozoaires
Afin de comparer la sensibilité de 3 techniques de coloration rapide, des échantillons
de fèces ont été observés avec 4 méthodes. Les 3 techniques qui sont la coloration au
saccharose, la coloration à la fuchsine ou coloration de Heine et la coloration au lugol, ont été
comparées à une méthode de référence.
a) Comparaison pour le genre Cryptosporidium
Pour tester la sensibilité des colorants pour la mise en évidence des oocystes de C.
parvum, les 3 techniques ont été comparées à une technique de référence : la méthode de
Ziehl-Neelsen modifiée.
Les résultats sont notés dans le tableau I.
90
Tableau I : Résultats du nombre d’oocystes de Cryptosporidium parvum à l’aide des 4
colorations
Echantillons Z-N modifiée Heine Lugol Saccharose
1 - - - -
2 - - - -
3 - - - -
4 - - - P
5 - P - +
6 - + - +
7 P - - P
8 P P - P
9 P P P +
10 + P P +
11 + P P ++
12 + + - +
13 + + P +
14 + ++ P +++
15 + ++ + +++
16 + + + ++
17 ++ P P ++
18 ++ + P ++
19 ++ + + ++
20 ++ ++ + ++
21 ++ ++ ++ +++
22 ++ ++ ++ +++
23 +++ ++ ++ +
24 +++ ++ ++ ++
25 +++ ++ ++ ++
26 +++ ++ ++ +++
27 +++ ++ + +++
28 +++ ++ ++ +++
29 ++++ +++ + ++++
30 ++++ ++ ++ ++++
- = aucun parasite sur la lame, P = présence (de 1 à 5 parasites sur 25 champs) ; + (de 6 à 50
parasites sur 25 champs) ; ++ (de 51 à 100 parasites sur 25 champs) ; +++ (>100 parasites sur
25 champs)
Les techniques de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée et de montage au saccharose
donnent des résultats supérieurs aux colorations à la fuchsine et au lugol. En effet c’est dans
ces méthodes de coloration que l’on retrouve le plus grand nombre d’échantillons fortement et
très fortement positifs. Les techniques de Heine et au lugol possèdent les plus grands nombres
de résultats négatifs ou de présence, parmi ces deux techniques, la méthode de Heine parait
91
être plus efficace au vu de son plus grand nombre de résultats très positifs et fortement
positifs.
Figure 17 : Nombre d’échantillons, dans chaque catégorie de semi-quantification de C.
parvum, pour les 4 méthodes de coloration
En analysant les données grâce au test des rangs de Wilcoxon, une différence
significative est observée entre la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée et la coloration au lugol
(p<0 ,01) ainsi qu’avec la coloration de Heine (p<0,05).
Il n’y a pas de différence significative entre la technique de Ziehl-Neelsen modifiée et
celle au saccharose (p=0,07).
0
2
4
6
8
10
12
14
Z-N modifiée
0
2
4
6
8
10
12
14
Saccharose
0
2
4
6
8
10
12
14
Lugol
0
2
4
6
8
10
12
14
Heine
92
Il existe une différence entre les techniques de coloration au saccharose et celle au
lugol et à la fuchsine. Avec l’aide des statistiques, on peut voir que les différences sont
significatives (p<0 ,01 pour le lugol et la méthode de Heine).
Le test des rangs de Wilcoxon appliqué pour les techniques de Heine et au lugol
montre une différence significative entre celles-ci (p<0 ,01).
Pour la recherche des oocystes de C. parvum, les méthodes de coloration de Ziehl-
Neelsen modifiée et au saccharose sont significativement plus sensibles que les colorations de
Heine et au lugol. Parmi ces dernières, la coloration de Heine est significativement plus
sensible que le lugol.
Pour apprécier la limite de détection des colorations au saccharose, au lugol et à la
fuchsine, des dilutions d’un échantillon positif ont été réalisées. L’échantillon initial a été
quantifié à l’aide d’une cellule de Malassez à 4,175.106
oocystes de C. parvum par ml.
Chaque dilution a été testée 5 fois pour chaque méthode de coloration et les résultats
ont été reportés dans le tableau II.
93
Tableau II : Résultats du nombre d’oocystes de Cryptosporidium parvum à l’aide des 4
colorations sur des dilutions
dilution Concentration Saccharose Heine Lugol
1/1 4,17.106/ml
+++ ++ ++
+++ ++ ++
+++ ++ +
++++ ++ ++
+++ ++ ++
1/10 4,17.105/ml
++ + +
+ ++ +
++ + +
++ ++ +
++ + +
1/15 2,78.106/ml
+ + +
+ + +
+ + +
++ + +
+ + +
1/30 1,39.105/ml
+ + P
+ + P
+ + P
+ + P
+ + +
1/60 6,95.104/ml
+ P P
+ P P
+ + P
+ + -
+ + P
1/120 3,48.104/ml
+ P -
P P -
+ P P
+ P -
+ P -
1/240 1,74.104/ml
P P -
P P -
P P -
P P -
P P -
1/480 8,70. 103/ml
- - -
P P -
- - -
- P -
- - -
1/960 4,35. 103/ml
- - -
- - -
- - -
- - -
- - -
94
Une différence entre les résultats obtenus avec la coloration au saccharose et les
colorations de Heine et au lugol est visible pour les premières dilutions, mais celle-ci
s’amenuise lorsque la dilution augmente. La coloration à la fuchsine et au lugol donnent des
résultats presque équivalents pour les premières dilutions puis la coloration au lugol semble
moins mettre en évidence les oocystes de C. parvum.
En dessous de 3,48.104/ml les oocystes de Cryptosporidium ne sont plus détectés par
la coloration au lugol alors qu’ils sont encore détectés par la coloration au saccharose et à la
fuchsine jusqu’à 8,70. 103/ml ce qui parait être le seuil de détection de C. parvum. A partir de
4,35. 103
oocystes /ml aucune des 3 colorations ne détecte la présence du protozoaire.
La coloration de Heine apparait donc plus sensible que la coloration au lugol, car elle
permet la mise en évidence des oocystes à des concentrations plus faibles que le lugol. A de
faibles concentrations, le saccharose et la fuchsine semblent être des colorants équivalents.
b) Comparaison pour le genre Giardia
Pour tester la sensibilité des colorants pour la mise en évidence des kystes de giardia, 3
techniques de coloration rapide ont été comparées à une lame non colorée. Ces techniques
sont : la méthode de coloration au saccharose, au lugol et à la fuchsine.
Tous les échantillons ont été analysés avec toutes les techniques.
En raison de la faible quantité de prélèvements positifs en G. intestinalis chez les
bovins et de la présence de la même espèce de Giardia chez les bovins et chez les carnivores
domestiques, de petites quantités de fèces de chiens présentant des kystes de giardia (moins de
10%) ont été introduites dans des fèces des bovins. Les nouveaux échantillons ont été
analysés de façon identique aux prélèvements de bovins purs.
Les résultats sont renseignés dans le tableau III.
95
Tableau III: Résultats du nombre de kystes de giardia à l’aide des 4 colorations
Echantillons Sans coloration Saccharose Heine Lugol
1 - - - -
2 - - - -
3 - - - P
4 - - P P
5 - P + +
6 - P P -
7 - P P -
8 - P P P
9 - P P P
10 P - P +
11 P P - -
12 P P - P
13 P P - P
14 P P - P
15 P P P P
16 P P P P
17 P P P P
18 P P P +
19 P P P +
20 P + P +
22 P P P +
23 + + ++ ++
24 ++ + ++ +
25 ++ ++ ++ ++
26 ++ ++ ++ +++
27 +++ ++ ++ +++
- = aucun parasite sur 25 champs ; P = présence (de 1 à 5 parasites sur 25 champs) ; + (de 5 à
10 sur 25 champs) ; ++ (de 10 à 20 sur 25 champs) ; +++ (>20 sur 25 champs)
Le plus grand nombre de résultats positifs à fortement positifs est retrouvé pour la
coloration au lugol, celle-ci parait donc plus sensible que les autres colorations.
Les autres méthodes paraissent sensiblement équivalentes en raison d’un nombre
identique de résultats négatifs et faibles.
96
Figure 18 : Nombre d’échantillons, dans chaque catégorie de semi-quantification de kystes de
giardia, pour les 4 méthodes diagnostiques étudiées
L’analyse des données avec le logiciel R, permet de détecter une différence
significative entre la méthode de coloration au lugol et toutes les autres techniques (p<0 ,01).
La méthode de coloration au lugol est donc la coloration la plus sensible parmi les 3
testées. Elle améliore la détection par rapport à une analyse sans méthode de coloration.
02468
10121416
Lugol
02468
10121416
Heine
02468
10121416
Sans coloration
02468
10121416
Saccharose
97
c) Comparaison pour le genre Eimeria
Dans le but de comparer des techniques de coloration rapide, la quantité d’oocystes
d’Eimeria observée sur chaque lame est renseignée dans le tableau IV.
Tableau IV: Résultats du nombre d’oocystes d’Eimeria à l’aide des 4 colorations
Echantillons Sans colorant Saccharose Heine Lugol
1 - - - -
2 - - - -
3 P P - -
4 P P P -
5 P P P -
6 P P - P
7 P P - P
8 P P - P
9 P P P P
10 P P P P
11 P P P P
12 P P P P
13 P P P P
14 P P P P
15 P P P P
16 P P P P
17 + P P P
18 + P P P
19 + + P P
20 + + + P
21 + + + P
22 + + P +
23 + + + +
24 + + + +
25 ++ ++ ++ ++
26 ++ + P P
27 +++ +++ +++ ++
- = aucun parasite ; P = présence (de 1 à 10 parasites sur la lame) ; + (de 11 à 50) ; ++ (de 51 à
100) ; +++ (>100)
98
Figure 19 : Nombre d’échantillons dans chaque catégorie de quantité d’Eimeria pour les 4
méthodes diagnostiques étudiées
Après analyse statistique, il existe une différence significative entre la méthode sans
coloration et les méthodes de coloration au lugol (p<0,01) et de Heine (p<0,01). La technique
sans coloration est donc plus sensible que les colorations au lugol et à la fuchsine.
Il n’existe pas de différence significative entre la méthode de coloration au saccharose
et la technique sans coloration (p=0,625). La technique au saccharose est significativement
différente de la méthode au lugol (p<0,01) et à la fuchsine (p<0,01).
Les techniques sans colorant et au saccharose sont donc plus sensibles que les
techniques au lugol et à la fuchsine pour ces éléments parasitaires.
02468
10121416
Sans coloration
02468
10121416
Saccharose
02468
10121416
Lugol
02468
10121416
Heine
99
2. Comparaison de la spécificité des colorants
Selon la technique de détection employée, les éléments parasitaires des 3 genres de
protozoaires se dessinent de façon variée.
a) Genre Cryptosporidium
Les oocystes de C. parvum apparaissent de façon différente selon la méthode de
coloration utilisée.
Lors d’une coloration par la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée, les oocystes sont
colorés en rose sur un fond vert, ce qui représente un contraste important. Ce contraste permet
une bonne visualisation des éléments parasitaires recherchés. De plus aucun autre élément
présent sur la lame ne reste coloré en rose après l’étape de décoloration. La recoloration par le
vert de malachite permet donc une coloration en vert de tous les débris permettant la mise en
évidence des oocystes de C. parvum (voir figure 20). Les parasites sont détectables à l’aide
d’un faible grossissement (objectif x10), mais il est souvent nécessaire de passer à un plus fort
grossissement.
Figure 20 : Oocystes de C. parvum par la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée (objectif x40)
Le montage au saccharose rend les oocystes de C. parvum réfringents, ceux-ci
apparaissent rosés sur un fond gris à orangé (voir figure 21) ce qui permet une bonne
visualisation de ceux-ci. Seuls les oocystes de C. parvum semblent être teintés par le
saccharose. Lors d’une présence d’un grand nombre d’oocystes, ils sont visibles à partir du
grossissement observé avec l’objectif x10. Le contenu de l’oocyste est bien visible à l’objectif
100
x4. Les oocystes sont ronds et la morphologie est bien conservée dans les 15 premières
minutes. A partir d’une vingtaine de minutes, les oocystes se déforment et deviennent
réniformes. Seules les bulles peuvent apparaitre légèrement rosées et réfringentes. Cette
solution fais remonter les oocystes sous la lamelle, ils sont donc tous sur le même plan.
Figure 21: Oocystes de C. parvum par dans une solution de saccharose (objectif x40)
Lors d’une coloration du prélèvement par du lugol, les éléments parasitaires de C.
parvum apparaissent non colorés légèrement réfringents sur un fond jaune-orangé (voir figure
22). Les débris sont colorés en orange-brun, lorsque les oocystes se superposent à des débris,
ils deviennent difficilement visibles en raison de leur transparence, il est donc parfois
nécessaire de diluer les fèces dans du sérum physiologique pour éliminer des débris. Le
contraste ne permet pas toujours une bonne visualisation de ces parasites. Quelques autres
éléments apparaissent non colorés, mais ceux-ci ne sont pas ronds et n’ont pas la même taille
que les oocystes, ils ne peuvent donc pas être confondus.
Figure 22: Oocystes de C. parvum sur une lame colorée par du lugol (objectif x40)
101
Comme pour la coloration au lugol, la méthode de Heine fait paraitre les oocystes
réfringents et non colorés. Tous les débris sont colorés en rose (voir figure 23). Tout comme
pour la coloration au lugol, il peut être difficile de distinguer les éléments parasitaires de C.
parvum lorsque ceux-ci se superposent à des débris, et il est parfois utile de diluer le
prélèvement pour diminuer la quantité de débris sur la lame. Avec cette coloration, la
différenciation entre les levures et les oocystes se fait facilement, en raison de la coloration
rose prise par les levures grâce à la fuchsine.
Figure 23 : Oocystes de C. parvum dans une solution de fuchsine (objectif x40)
Les colorations de Ziehl-Neelsen modifiées et au saccharose sont les méthodes
permettant le meilleur contraste entre les oocystes et le fond.
b) Genre Giardia
Aucune forme végétative de Giardia n’a été observée sur les lames examinées, les
formes kystiques le sont différemment selon la méthode employée.
En l’absence de méthode de coloration, les kystes de giardia apparaissent non colorés
et assez réfringents. Ils sont ovales, de 8 à 12 µm de longueur et présentent généralement un
signe en forme de vague (voir figure 24). Certains kystes apparaissent légèrement plus petits
(entre 8 et 10 µm de longueur) et renfermant un contenu granuleux visible. De nombreux
éléments sont également non colorés, ovalaires et de 10 à 15 µm de longueur. Il peut donc
être difficile de faire la distinction entre des kystes de giardia et des débris. De plus, dans
102
certaines zones où l’étalement est épais, les kystes de giardia sont difficilement visibles au
milieu des débris.
La coloration au saccharose ne modifie pas l’apparence des kystes de giardia. Ils sont
non colorés, réfringents et leur morphologie n’est pas modifiée (voir figure 24). Comme pour
la méthode sans coloration, des débris peuvent facilement être confondus avec des kystes. Les
kystes sont très difficilement repérables dans les zones où l’étalement est plus épais.
La coloration au saccharose est donc très peu spécifique pour le genre Giardia.
Figure 24 : Kystes de giardia sur une lame non colorée (à gauche) et dans une solution de
saccharose (objectif x40)
Lors de coloration au lugol, les kystes apparaissent ovales de 8 à 10 µm de longueur.
La paroi est colorée en brun-vert et souligne la couleur orangée du cytoplasme (voir figure
25). La teinte prise par les kystes de giardia avec le lugol permet de pouvoir les distinguer à
l’objectif x10, ils sont également facilement détectables parmi les débris. Les débris,
d’apparence proche des éléments parasitaires de Giardia sans coloration, ne prennent pas la
même teinte que les kystes ce qui permet de les distinguer. Toute la lame est colorée en
orangé-brun, il n’y a donc pas un très bon contraste avec les kystes de giardia qui apparaissent
légèrement plus bruns que les débris.
La coloration au lugol colore uniquement les kystes de giardia en marron avec la paroi
soulignée de vert, cette méthode permet donc de différencier les kystes de giardia du reste des
éléments présents sur la lame. A ce titre, elle parait très spécifique pour la détection des
éléments parasitaires du genre Giardia.
103
Figure 25 : Kystes de giardia colorés par du lugol (objectif x40)
Après la réalisation de la technique de Heine, les kystes de giardia sont révélés par une
couleur rose entourée par une paroi plus sombre, ils sont ovales et de 8 à 12 µm de longueur
(voir figure 26). Tous les éléments présents sur la lame sont colorés en rose. Des débris de la
taille des kystes apparaissent moins colorés que ceux-ci ce qui permet de faire la distinction
(voir figure 26). Mais lorsque ces débris ressemblants aux kystes se superposent à d’autres
débris, il devient difficile de les distinguer des éléments parasitaires de G. intestinalis.
Les kystes de giardia sont mis en évidence par la coloration de Heine, par la teinte rose
et la paroi noire acquise après coloration. En ce sens, la coloration par la fuchsine semble
relativement spécifique des giardia, car ils prennent un aspect permettant leur différenciation.
Cependant, les autres éléments de la lame apparaissent dans des teintes très proches de celles
des kystes de G. intestinalis.
Figure 26 : Kystes de giardia et artefact colorés par la méthode de Heine (objectif x40)
104
Le colorant le plus spécifique pour la détection des kystes de G. intestinalis est le
lugol, il permet une bonne visualisation des éléments parasitaires et une bonne distinction de
ceux-ci avec les débris.
c) Genre Eimeria
Dans le genre Eimeria, il existe différentes espèces, 11 d’entre elles sont retrouvées
chez les bovins. Les différentes espèces sont distinguables par leur forme, leur taille, leur
contenu, la présence de micropyle ou de capsule polaire et leur couleur.
Les différentes espèces d’Eimeria apparaissent légèrement réfringentes lors de
coproscopie sans colorant. La paroi de l’oocyste est foncée, la cellule unique qui remplit plus
ou moins l’oocyste apparait granuleuse, grise et réfringente (voir figure 27). Les oocystes
d’Eimeria sont bien visibles sur les lames, ils peuvent être plus difficiles à distinguer lors
d’amas de débris.
La distinction des espèces se fait en mesurant les éléments parasitaires dans leur
longueur et leur largeur. La couleur, la forme, la présence d’un micropyle ou d’une capsule
polaire et la taille de la cellule unique par rapport à l’oocyste sont des éléments importants
pour la distinction des espèces. E. subspherica, E. zuernii, E. alabamensis, E. bovis, E.
cylindrica et E. ellipsoidalis sont de couleur claire (cf. photographies A à F figure 27), leur
contenu apparait de couleur rose et très réfringent. Les espèces E. auburnensis et E.
brasiliensis ont une teinte jaune-marron et E. bukidnonensis et E. pellita apparaissent marron
(cf. photographies G à I figure 27).
105
Figure 27 : Oocystes d’Eimeria photographiés sur des lames non colorées (objectif x40)
A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. subspherica ; E : E. cylindrica;
F : E. canadensis ; G : E. auburnensis ; H : E. brasiliensis ; I : E. pellita
Les éléments parasitaires du genre Eimeria ne sont pas colorés par le saccharose, le
cytoplasme apparait rosé tout comme ce que l’on peut observer sans coloration (voir figure
28).
Il n’apparait aucune différence pour toutes les espèces d’Eimeria entre leur apparence
sans colorant et dans le saccharose.
La coloration par une solution de saccharose n’est donc pas spécifique du genre
Eimeria puisque celle-ci ne les colore pas et ne modifie nullement leur aspect.
A B C
D
A
E F
G H I
106
Figure 28 : Oocystes d’Eimeria dans une solution de saccharose (objectif x40)
A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. subspherica ; E : E. cylindrica;
F : E. canadensis ; G : E. auburnensis ; H : E. pellita
Sur les lames colorées au lugol, les éléments parasitaires du genre Eimeria
apparaissent teintés en jaune plus ou moins foncé sur un fond jaunâtre, la morphologie n’est
pas modifiée (cf. figure 29). La distinction par la couleur devient plus difficile car les
différentes teintes naturelles des oocystes sont modifiées par la couleur jaune. Les oocystes
des espèces incolores à roses sans colorant apparaissent alors jaune, alors que les oocystes
jaunâtres apparaissent légèrement plus foncés. Cela diminue donc le contraste de couleur
entre les diverses espèces (voir figure 29 G).
A B C
D E F
G H
107
Figure 29 : Oocystes d’Eimeria colorés par le lugol (objectif x40)
A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. canadensis ; E : E. auburnensis
F : E. bukidnonensis ; G : E. bovis et E. alabamensis
Comme lors de la recherche de G. intestinalis, la coloration à la fuchsine colore tous
les éléments de la lame. Les oocystes d’Eimeria sont donc également colorés en rose.
Certaines espèces apparaissent moins colorées comme E. zuernii ou E. alabamensis (cf. figure
30 A et B) Au contraire E. bovis semble mieux prendre le colorant et apparait souvent plus
foncé dans les mêmes zones (voir figure 30 C et F).
Comme la coloration au lugol, la coloration à la fuchsine ne modifie pas la
morphologie des oocystes mais seulement leur couleur. Les oocystes colorés perdent leur
réfringence et semblent être moins facilement différenciables des débris.
A B C
D
A
E F
G
108
Figure 30 : Oocystes d’Eimeria colorés par la fuchsine (objectif x40)
A : E. zuernii ; B : E. alabamensis ; C : E. bovis ; D : E. cylindrica; E : E. auburnensis
F : E. bovis et E. zuernii
Sans coloration les oocystes du genre Eimeria sont plus facilement repérables sur la
lame en raison d’un meilleur contraste. De plus, les douze espèces d’Eimeria sont plus
facilement distinguables lorsqu’elles ne sont pas colorées car le critère de la couleur est alors
utilisable.
A B C
D E
F
109
3. Comparaison de la mise en pratique des différentes techniques de
coloration de formes parasitaires de protozoaires
a) Temps de préparation
Les 3 techniques de coloration comparées dans cette étude sont des méthodes rapides.
Le temps de réalisation des techniques est court et approximativement identique pour les
colorations au saccharose, au lugol et à la fuchsine.
Pour ces 3 techniques, le temps de préparation est évalué à 1 minute 30 environ.
Le temps de manipulation de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée est cependant bien
plus long. Il correspond au temps de réalisation d’un frottis, de séchage de celui-ci et le temps
de réalisation des différentes étapes de coloration, décoloration et recoloration.
Le temps de manipulation est donc d’environ 8 minutes, mais il faut rajouter la durée
de séchage après la réalisation du frottis et après les étapes de coloration, il faut donc au
minimum une heure et demie entre la réalisation du frottis et la lecture de la lame.
Les techniques de coloration au lugol, au saccharose et à la fuchsine sont les méthodes
de coloration ayant une durée de réalisation très courte.
Ces techniques ne rajoutent que très peu de temps de manipulation à la réalisation
d’une coproscopie sans coloration.
b) Coût des différentes techniques de coloration
Les colorations employées dans cette étude nécessitent des solutions différentes pour
chaque technique, il est donc intéressant de connaitre le coût total de chaque technique.
Seul le coût cumulé des colorants, des solutions de fixation et des décolorants a été
calculé. Les tarifs ont été relevés sur le catalogue en ligne de la société Merck millipore.
La technique de Ziehl-Neelsen modifiée est la technique nécessitant le plus de
solutions. Le coût estimé pour la coloration d’une centaine de lames est de 7,38 €.
La technique de coloration au lugol s’avère être la moins couteuse. En effet, la
coloration de 100 lames est estimée à 0,04 €.
110
La réalisation d’une solution de saccharose permettant de colorer 100 lames coûte
0,53€.
Pour la méthode de Heine, le coût correspondant au volume de fuchsine phéniquée
nécessaire pour traiter 100 lames est de 1, 03 €.
Toutes ces techniques sont très peu onéreuses, la plus chère étant la méthode de Ziehl-
Neelsen modifiée dont le coût est d’un peu plus de 7 centimes par lame.
c) Facilité de lecture des différentes techniques
Selon le parasite recherché, certaines techniques donnent des lames plus faciles à lire
que d’autres.
Pour la recherche de cryptosporidies, les lames obtenues à l’aide d’une coloration de
Ziehl-Neelsen modifiée sont faciles à lire en raison d’un fort contraste entre les éléments
parasitaires recherchés colorés en rose et le fond vert.
La solution de Sheather colore les C. parvum en rose et ils deviennent réfringents. Le
contraste n’est pas très important mais le fait que les oocystes apparaissent plus colorés sur un
fond grisâtre facilite la lecture. De plus, lorsque les fèces analysées sont très liquides, le
mélange des selles à cette solution fait remonter les oocystes et les repousse sur les bords de la
lamelle. Ils se retrouvent alors juste en dessous de la lamelle et sur le pourtour de celle-ci, ce
qui facilite la recherche surtout lors d’une faible quantité d’oocystes.
Pour les lames colorées par de la fuchsine ou du lugol, la lecture est plus délicate en
raison de la non-coloration des oocystes. En effet, il semble plus difficile de voir des éléments
incolores sur un fond coloré que l’inverse. A cela s’ajoute la difficulté lorsque des éléments
parasitaires se superposent à des débris colorés.
Pour la recherche des cryptosporidies, les colorations donnant des lames ayant la plus
grande facilité de lecture sont donc le saccharose et la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée.
111
Pour la recherche des éléments parasitaires de Giardia, les techniques ne colorant pas
les kystes, comme la solution de Sheather, ne permettent pas une lecture facile des lames. En
effet, les kystes étant de petite taille et incolores, ils ressortent difficilement sur le fond
incolore.
Au contraire la coloration de Heine colore tous les éléments présents sur la lame en
rose. Il est alors difficile de détecter les kystes de G. intestinalis, la lecture est rapidement
fatigante en raison de l’apparence de tous les débris.
La coloration au lugol donne des lames avec un meilleur contraste entre les kystes de
giardia de couleur brun et le fond avec des débris jaune-orangé. De plus la lame peut être
parcourue plus rapidement en l’observant à l’objectif x10.
La coloration au lugol semble être la technique permettant la lecture la plus facile pour
la détection des kystes de giardia.
Lors de la recherche d’oocystes du genre Eimeria, les méthodes ne colorant pas les
formes parasitaires comme la méthode sans coloration ou le saccharose, donnent des lames
relativement faciles à lire, les oocystes d’Eimeria apparaissant légèrement colorés sur fond
incolore.
Les méthodes colorant les oocystes d’Eimeria c’est-à-dire les méthodes de Heine et au
lugol, colorent également le fond de la préparation, cela diminue donc le contraste entre les
éléments parasitaires recherchés et les débris.
Les méthodes sans coloration et au saccharose donnent les lames les plus faciles à lire
pour la recherche d’éléments parasitaires du genre Eimeria.
4. Comparaison de différentes durées des étapes de la coloration de Ziehl-
Neelsen modifiée
Divers protocoles de Ziehl-Neelsen modifiés ont été publiés.
Ils présentent des temps de coloration à la fuchsine différents, ils varient de 4 minutes
à 1 heure. Deux types de solutions ont été décrits pour l’étape de décoloration, un mélange
acide-alcool ou une solution d’acide sulfurique. La recoloration peut également se faire de
112
plusieurs façons, du vert de malachite est utilisé pour recolorer le frottis. La durée de
recoloration varie de 30 secondes à 15 minutes. Du bleu de méthylène peut également être
utilisé.
Des frottis ont été colorés en utilisant différents temps de coloration à la fuchsine (4, 5,
15, 30 minutes et 1 heure). L’étape de décoloration s’est effectuée à l’aide d’un mélange
acide-alcool pendant quelques secondes suivie d’une recoloration par une solution de vert de
malachite à 0,5% pendant 1 minute. Les frottis issus de ces essais sont colorés de façon
presque identique.
Quelques soit le temps de coloration par la fuchsine, les oocystes se colorent de façon
identique.
Des frottis ont été colorés et décolorés en suivant le protocole de l’annexe 24. L’étape
de recoloration s’est effectuée à l’aide de vert de malachite à 0,5%. Plusieurs temps de
recoloration ont été testés : 30 secondes, 1 minute, 5 minutes, 10 minutes et 15 minutes.
Les débris présents sur les lames se recolorent tous de la même façon quel que soit la
durée de recoloration.
Il n’y a pas d’influence de la durée de coloration ou de recoloration sur la qualité de
coloration du frottis.
113
IV. DISCUSSION
L’observation des formes kystiques de protozoaires digestifs dans les selles peut être
facilitée ou non par l’utilisation de méthodes de coloration. Le travail présenté dans cette
thèse a été réalisé afin de faire un bilan des techniques de coproscopie employées en France
pour la recherche des protozoaires digestifs, mais également afin d’effectuer une comparaison
de 3 méthodes de coloration rapides pour la détection de ces parasites dans les fèces de jeunes
ruminants.
A. ENQUETE SUR LES METHODES DE DETECTIONS DES PROTOZOAIRES
DIGESTIFS EN FRANCE
Près de 90% des laboratoires français ayant répondu à notre enquête déclarent utiliser
des méthodes de coloration pour la détection des protozoaires digestifs.
Pour la recherche de C. parvum, les méthodes les plus utilisées sont la méthode de
Ziehl-Neelsen modifiée (dans 50% des laboratoires), puis celle de Heine (36%) et la méthode
de coloration au saccharose (14%).
Pour la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée, les laboratoires utilisent des protocoles
légèrement différents. Les temps de coloration à la fuchsine varient, la décoloration est
réalisée par un mélange d’acide et d’alcool ou par une solution d’acide sulfurique, la
recoloration s’effectue avec du vert de malachite, avec une concentration et un temps d’action
variant ou avec du bleu de méthylène.
Parmi les laboratoires recherchant les cryptosporidies, 10% d’entre eux ont choisi
l’emploi d’une méthode immunologique pour cette recherche. Le tarif moyen d’une recherche
de C. parvum par coloration est de 9,60 € alors qu’il est d’environ 15 € lors de l’emploi d’une
technique immunologique.
Lors de la recherche de kystes de giardia, les méthodes employées par les LVD et
LDA sont la coloration au lugol, majoritairement, ainsi que la méthode de MIF. Le tarif
moyen est d’environ 11 € pour une coloration.
114
Pour cette recherche, près d’un quart des laboratoires utilise une technique
immunologique, le tarif moyen est alors de près de 19 €.
Aucun laboratoire n’a spécifié utiliser une méthode de coloration ou immunologique
pour rechercher les oocystes du genre Eimeria.
Les laboratoires interrogés sur leurs critères de choix des techniques de coloration ont
répondu majoritairement sélectionner la méthode de coloration en fonction du parasite
recherché et de la facilité de lecture de la lame obtenue.
Ainsi les méthodes citées par les laboratoires lors de notre enquête pour la recherche
de C. parvum et de G. intestinalis, sont les plus rencontrées dans la bibliographie. Les
méthodes employées par les laboratoires sont les techniques jugées comme ayant de bonnes
sensibilités et spécificités [Khelef et al. (2002)].
Les différents protocoles de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée utilisés par les
laboratoires proviennent de modifications par différents auteurs. Certains protocoles se
rapprochent de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Henriksen et Pohlenz, la
décoloration s’effectuant avec de l’acide sulfurique [Henriksen et Pohlenz (1981)], d’autres se
rapprochent de la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée par Angus qui est beaucoup plus
rapide, la solution décolorante est alors un mélange d’acide chlorhydrique et d’éthanol
[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]. Les derniers sont issus de la modification de la méthode de
Ziehl-Neelsen par Kinyoun qui utilise une décoloration à l’aide d’un mélange acide-alcool
mais également la recoloration dans du bleu de méthylène [Ortolani (2000)].
Selon certains chercheurs comme Addis [Addis et al. (1991)], les techniques
immunologiques sont très spécifiques et très sensibles, elles permettent donc de réaliser une
bonne analyse des fèces. Les tarifs des techniques immunologiques semblent supérieurs à
ceux des techniques de coloration. Certains auteurs ont montré un coût équivalent entre une
technique immunochromatographique et un montage au sucrose pour la détection de
cryptosporidies chez des veaux [Trotz-Williams et al. (2005)], mais ces tests sont rapides et
peuvent être réalisés par du personnel non expérimenté. Les tests ELISA nécessitent une
préparation par du personnel qualifié même s’il n’est pas nécessaire que celui-ci soit
spécialisé en parasitologie. Le laboratoire doit être équipé du matériel nécessaire à la
115
réalisation de cette analyse, cela implique donc un coût supplémentaire. L’analyse d’un
prélèvement par une technique ELISA parait donc plus coûteuse que par de
l’immunochromatographie ou de la coloration.
Dans les articles écrit par O’Donoghue et Martinez et Belda Neto [O’Donogue (1995)
et Martinez et Belda Neto (2001)], les auteurs ont montré que les différentes colorations
utilisées pour la recherche de C. parvum n’ont pas la même sensibilité, ni la même spécificité,
il en est de même pour G. intestinalis. Il parait donc raisonnable de choisir la méthode de
coloration en fonction du parasite recherché comme le fait la majorité des laboratoires. De
plus la spécificité des colorants permet en général d’améliorer la lecture de la lame en limitant
les situations douteuses, ce qui est également un autre critère choisi par les laboratoires.
116
B. METHODOLOGIE
Parmi les nombreuses méthodes permettant la coloration d’un échantillon de fèces
pour la recherche de protozoaires intestinaux, nous avons choisi de comparer 3 techniques : le
montage au saccharose, la méthode de Heine et la coloration au lugol.
Ces colorations ont été sélectionnées en raison de plusieurs critères. Comme notre
enquête l’a montrée, ces méthodes font partie des colorations les plus utilisées par les
laboratoires français, ce sont aussi les plus décrites en médecine humaine comme vétérinaire
[Polack et al. (1983), O’Donoghue (1995), Hendrix (1998)]. Ces techniques font également
parties des colorations réalisables entre lames et lamelles, elles sont rapides et les solutions
nécessaires sont faiblement toxiques pour les manipulateurs et pour l’environnement. De plus
la même quantité de fèces est utilisée dans ces différentes techniques ce qui permet de pouvoir
les comparer. La technique de MIF n’a pas été sélectionnée car selon Bailenger, celle-ci
donne des résultats semblables au lugol pour la coloration des kystes de giardia avec des
réactifs plus compliqués à préparer [Bailenger (1982)].
Finalement, les colorations de Heine, au saccharose et au lugol ont été choisies en
raison de leurs importances bibliographiques, de leur fréquence d’utilisation et de leur rapidité
de réalisation.
Afin de pouvoir les comparer, des méthodes de référence ont été choisies pour la
recherche des 3 genres de protozoaires intestinaux étudiés.
Pour la comparaison des méthodes de coloration pour les genres Giardia et Eimeria, la
méthode de référence que nous avons sélectionnée est une méthode sans coloration. En effet,
dans l’enquête aucun laboratoire n’a mentionné utiliser de colorant pour l’observation des
coccidies, de plus de nombreuses études utilisent une technique sans coloration comme
méthode coproscopique pour la recherche de G. intestinalis dans le cadre de comparaison
avec d’autres techniques de diagnostic [Dixon et al. (1997), Aldeen et al. (1995)].
Pour la comparaison des méthodes de coloration lors de la recherche des oocystes de
C. parvum, la méthode de référence choisie est la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée. Cette
technique a été choisie en raison de son importance historique et bibliographique, en effet de
nombreux articles ont été rédigés sur cette méthode et l’ont comparé à d’autres colorations ou
méthodes immunologiques ou de biologie moléculaire [Garcia et al. (1983), Casemore et al.
117
(1985) et MacPherson et McQueen (1993)]. Elle a également été choisie en raison de sa forte
fréquence d’utilisation dans les LDA et LVD.
Pour choisir le protocole de Ziehl-Neelsen modifié, nous avons coloré des frottis selon
les différents protocoles mentionnés par les laboratoires dans le questionnaire. Aucune
différence n’a été observée. Le temps de coloration par la fuchsine a donc été réduit à 4
minutes, le temps de recoloration dans du vert de malachite à 0,5% à 1 minute. Cela permet
de faciliter la succession des manipulations et de diminuer le temps nécessaire à la coloration
du frottis. La solution décolorante utilisée est le mélange acide-alcool, comme décrit par
Beugnet [Beugnet et al. (2004)]. Selon Lenette cité par Martinez [Martinez et Belda Neto
(2001)], ce protocole permet également d’éviter un excès de fuchsine sur la lame, ce qui
diminue le temps de lecture du frottis.
Pour la réalisation des techniques lors de la recherche de C. parvum, seule une goutte
de fèces est nécessaire. Cette faible quantité de selles utilisée peut donc introduire un biais de
prélèvement, en effet, même si l’échantillon est homogénéisé, la quantité d’éléments
parasitaires présente dans la goutte peut être très différente. L’analyse peut donc ne pas être
représentative du nombre d’oocystes présent dans l’échantillon de fèces. Il en est de même
pour la recherche de G. intestinalis et d’Eimeria, malgré une quantité de matière fécale
nécessaire plus importante (5 grammes), il peut également avoir une fluctuation du nombre
d’éléments parasitaires dans chaque portion du prélèvement [Cartwright (1999)]. Ce biais est
donc présent pour tous les échantillons et donc toutes les techniques, par conséquent, la
comparaison des techniques les unes par rapport aux autres ne doit pas être modifiée par ce
biais.
Lors de la réalisation de la technique de Ziehl-Neelsen modifiée, la qualité du frottis
est très importante. En effet, lorsque la matière fécale est mal répartie, les oocystes se
superposent et forment des amas avec les débris, les lames sont alors plus difficiles à lire. Le
nombre d’oocystes peut donc être sous-estimé lors de mauvaise réalisation du frottis.
118
C. COMPARAISON DES 3 METHODES DE COLORATION
1. Pour la recherche de C. parvum
Lors de la comparaison des méthodes de coloration pour la mise en évidence de C.
parvum, Le montage au saccharose s’est avéré aussi sensible que la méthode de Ziehl-Neelsen
modifiée, il est également très spécifique. Les colorations au lugol et de Heine sont
significativement moins sensibles que la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée et le montage au
saccharose, celles-ci sont également plus difficiles à lire en raison d’un faible contraste et de
la présence d’un grand nombre de débris colorés. La coloration par la fuchsine reste
cependant plus spécifique que la coloration par le lugol.
Le coût des colorants de toutes les techniques comparées est sensiblement identique
(inférieur à 1€ pour 100 lames) sauf pour la méthode de Ziehl-Neelsen où celui-ci est plus
important (7€ pour 100 colorations), cela reste négligeable sur le coût total de l’analyse
coproscopique.
Dans un article écrit par Garcia et al. en 1983, il a été montré que le montage au
saccharose et une coloration de Ziehl-Neelsen modifiée sont deux méthodes de diagnostic très
efficaces lorsque le nombre d’oocystes présents dans les selles est assez important, ce que
confirme notre étude.
Les lames colorées par le saccharose sont faciles à lire en raison de la teinte rosée prise
par les oocystes mais également grâce à leur réfringence ce qui a été observé lors de nos
expérimentations ainsi que par MacPherson et McQueen en 1993. Peter O’Donoghue décrit
dans un article qu’un microscope optique à contraste de phase peut être utilisé pour augmenter
le contraste, les oocystes de C. parvum apparaissent alors clairs et biréfringents sur un fond
noir alors que les levures ne deviennent pas réfringentes [O’Donoghue (1995)].
La lecture de la lame se fait très rapidement, moins de 3 minutes selon MacPherson et
McQueen (1993), environ 10 minutes d’après Trotz-Williams, pour réaliser les manipulations
et la lecture [Trotz-Williams et al. (2005)].
Par contre, comme l’a décrit MacPherson et McQueen, la solution est très poisseuse et
visqueuse, elle peut donc être pénible à manipuler et le matériel doit être régulièrement rincé à
l’eau.
La solution de saccharose est très facile à réaliser, elle peut être faite à partir de
saccharose ou de sucre blanc. Pendant la durée de nos expériences, elle a été conservée au
frais, dans un flacon hermétiquement fermé au cours de ce travail et n’est pas apparue
119
contaminée. Elle peut cependant être contaminée par des moisissures, il peut donc être
nécessaire de la renouveler.
En résumé, la coloration au saccharose est sensible et spécifique pour la recherche
d’oocystes de C. Parvum. De plus, le coût est faible, la préparation et la lecture sont très
rapides en raison de la simplicité du protocole et la facilité de lecture des lames.
La coloration par le lugol n’est pas souvent décrite dans les articles pour la mise en
évidence de C. parvum, en effet notre étude a montré qu’elle est significativement moins
sensible que la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée ou le montage au saccharose. Elle apparait
également moins spécifique, la morphologie des oocystes n’est pas bien conservée ils sont
parfois difficiles à distinguer de certains débris incolores de taille identique.
La lecture des lames parait difficile en raison du faible contraste, en effet, comme la
décrit Garcia, cette méthode est une coloration négative (les oocystes sont incolores sur un
fond coloré), ce qui est plus difficile à lire que les autres colorations [Garcia et al. (1983)].
La méthode de Heine est une technique de coloration des cryptosporidies
fréquemment décrite. Dans ce travail, la sensibilité de cette méthode s’est avérée
significativement inférieure à celle des colorations de Ziehl-Neelsen et au saccharose,
pourtant elle a été décrite comme étant une des méthodes les plus sensibles par Khelef [Khelef
et al. (2002)]. Cette différence de sensibilité peux provenir de la méthode d’observation, en
effet au cours de ce travail, les lames ont été observées à l’aide d’un microscope sans
contraste de phase, alors qu’elles ont été observées avec un microscope à contraste de phase
dans l’étude dirigée par D. Khelef. Il est donc possible que ce soit la modification de la mise
en évidence faite par le microscope à contraste de phase qui augmente la sensibilité [Vohra et
al. (2012)].
La spécificité de la coloration par la fuchsine semble bonne, mais les lames colorées
sont difficiles à lire en raison de la coloration négative, tout comme pour la coloration par le
lugol.
Avec cette coloration, nous avons pu lire correctement les lames jusqu’à 24 heures
après la coloration. Cela n’est pas le cas avec l’observation à l’aide d’un microscope à
contraste de phase où la lecture doit être effectuée dans les 15 minutes [Boufassa-Ouzrout et
al. (1986)]. La conservation des lames est donc correcte même si elle reste inférieure à celle
des lames issues de la technique de Ziehl-Neelsen modifiée, mais la méthode de Heine est
plus rapide et moins coûteuse [Amato Neto et al. (1996), Vohra et al. (2012)].
120
La méthode de Heine est une méthode rapide, peu coûteuse mais elle est peu sensible
lorsqu’elle est observée au microscope sans contraste de phase. La sensibilité peut être
augmentée par l’utilisation d’un microscope à contraste de phase, par conséquent, les lames
sont plus faciles à lire mais elles doivent être observées rapidement et le matériel nécessaire
est assez couteux.
Au final, les colorations les plus efficaces pour la détection de C. parvum sont la
méthode de Ziehl-Neelsen modifiée et la coloration au saccharose. Cette dernière est à
conseiller en raison de sa rapidité, sa facilité de lecture et son très faible coût. Elle peut aussi
être facilement réalisée en laboratoire ainsi qu’en clinique vétérinaire.
2. Pour la recherche de G. intestinalis
Dans la bibliographie, le saccharose a été décrit comme une solution ne colorant pas
les kystes de giardia, c’est également ce que l’on a pu constater au cours des
expérimentations. Le montage au saccharose s’avère donc identique à un protocole sans
coloration, par conséquent la sensibilité de ce test est semblable à celle de la méthode sans
coloration. Les kystes sont visibles sans coloration [Dixon et al. (1997)], mais ceux-ci peuvent
être confondus avec des débris végétaux, ce qui complique la lecture.
La solution de saccharose peut toutefois avoir une utilité comme liquide de flottation
pour faciliter la détection des kystes du genre Giardia, [McNabb et al. (1985), Weber et al.
(1992)].
Lors de nos expérimentations, la coloration par le lugol s’est montrée la technique la
plus sensible pour la mise en évidence de G. intestinalis, ce résultat est en accord avec la
bibliographie, en effet, cette méthode est la technique conseillée par la plupart des auteurs
pour le diagnostic de giardiose en coproscopie [Beugnet et al. (2000), Dorchies et al. (2012)].
La spécificité de cette technique s’avère importante et très intéressante car celle-ci permet de
distinguer facilement les débris végétaux des kystes de giardia qui changent légèrement de
morphologie au contact du lugol. La coloration par une solution de lugol peut donc être
utilisée pour détecter les kystes de giardia mais aussi pour confirmer leur présence lors d’un
doute sur une coproscopie simple [Dorchies et al. (2012)].
121
La teinte prise par les kystes grâce au lugol permet de les repérer plus aisément sur la
lame, celle-ci permet également de les discerner facilement lors d’une observation à l’objectif
x10 au lieu de x40 sans coloration, cela diminue donc le temps de lecture. Mais le lugol colore
également un grand nombre de débris rendant la lame plus difficile à lire.
La solution de lugol se conserve bien lorsqu’elle est maintenue dans un flacon
hermétique [Bailenger (1982)], de plus elle est peu coûteuse, rapide et demande peu de
matériel, cette méthode peut donc être effectuée en laboratoire et dans les cliniques
vétérinaires.
Les lames doivent être observées rapidement après la coloration, en effet, au bout de
quelques dizaines de minutes, le lugol cristallise sur le pourtour de la lamelle. De plus, selon
Tangtrongsups, les kystes semblent se collaber après une vingtaine de minutes, l’identification
devient alors plus difficile [Tangtrongsups et Scorza (2010)].
La coloration par le lugol est une méthode sensible et spécifique. Cette technique peut
être parfois difficile à lire, mais elle permet d’augmenter la sensibilité et la rapidité de lecture
par rapport à une coproscopie simple sans en augmenter la durée ni le coût.
La méthode de Heine n’a pas été décrite pour la mise en évidence des kystes de
giardia. Cependant, nous avons observé que la fuchsine colore les kystes en rose mais cette
méthode est significativement moins sensible que le lugol.
La lame est cependant difficile à lire car la fuchsine colore les débris et les kystes dans
la même teinte, il peut donc s’avérer nécessaire d’utiliser une autre technique pour donner un
diagnostic précis [Badparva et al. (2009)].
La méthode de coloration la plus efficace pour mettre en évidence les kystes de giardia
est donc la coloration au lugol, elle est rapide et peu coûteuse, elle peut également être utilisée
pour confirmer un diagnostic douteux sur une coproscopie simple.
3. Pour la recherche d’Eimeria
Tout comme pour les kystes de giardia, le saccharose n’a pas été décrit comme
permettant une modification de couleur ou de morphologie des oocystes d’Eimeria, ce qui
correspond aux observations faites pendant ce travail. Le montage de la lamelle issue d’une
122
concentration par flottation dans du saccharose ne montre donc aucun intérêt. Cependant la
solution de Sheather peut être utilisée directement pour la flottation [McNabb et al. (1985),
Weber et al. (1992)]. En effet cette solution est utile car nous avons pu constater qu'elle ne
cristallise pas rapidement et ne déforme par les oocystes.
Nous avons observé que le lugol donne une teinte jaunâtre à tous les éléments présents
sur les lames (hormis les oocystes de C. parvum et les kystes de giardia), il teinte donc
également les oocystes d’Eimeria ce qui diminue le contraste. La sensibilité est également
diminuée par rapport à une méthode sans coloration, de plus le jaunissement des oocystes ôte
le critère de couleur des caractéristiques utilisables pour l’identification des espèces
d’Eimeria. Il a été constaté au cours de cette étude, que les oocystes d’E. bovis, se colorent
mieux que les autres, ceux-ci sont donc plus faciles à reconnaitre grâce au lugol, mais cette
solution améliore seulement l’identification de cette espèce. Ces observations n’ont pas été
mentionnées dans d’autres études, il convient donc de rester prudent quant à ces constatations.
Tout comme la coloration au lugol, l’action de la fuchsine sur les oocystes d’Eimeria
n’a pas été décrite dans la bibliographie. Les colorations réalisées au cours de cette étude,
nous ont permis de voir que la fuchsine colore les oocystes de coccidies et les débris
végétaux, la lecture de la lame est rendue plus difficile en raison d’une diminution du
contraste par rapport à une lame non colorée. L’identification des espèces est également
compliquée par la fuchsine sauf pour les oocystes d’E. bovis qui apparaissent plus foncés que
les autres après l’action du colorant, mais cette observation n’a pas été confirmée par d’autres
études.
Au final, les colorations au lugol et à la fuchsine apparaissent néfastes sur la mise en
évidence et l’identification des espèces d’Eimeria. Le montage au saccharose semble inutile.
La méthode la plus efficace pour la recherche de coccidies est donc la coproscopie simple.
123
Pour conclure, certaines méthodes de colorations rapides permettent d’améliorer la
sensibilité et de faciliter la lecture lors de la recherche de formes kystiques de C. parvum ou
de G. intestinalis. De plus elles peuvent être aisément réalisées en laboratoire ou en clinique
vétérinaire. Mais il est important de choisir le colorant en fonction de l’hypothèse
diagnostique.
Lors de la recherche des oocystes d’Eimeria ainsi que leur identification, l’utilisation
de colorant n’apporte pas d’intérêt et diminue même la sensibilité de la coproscopie. Un
protocole de coloration apparait donc inutile voire néfaste pour la détection des oocystes de
coccidies. Les colorants n’ont pas permis de faciliter l’identification des oocystes non
sporulés d’Eimeria, mais il pourrait être intéressant de réaliser à nouveau ce test sur des
oocystes sporulés.
Lors d’une demande de recherche de cryptosporidies, nous conseillons l’utilisation
d’une solution de saccharose pour mettre en évidence les oocystes de C. parvum, le montage
au saccharose étant facile à réaliser et à lire, aussi sensible qu’une méthode de Ziehl-Neelsen
modifiée tout en étant plus rapide et moins couteuse. L’utilisation du montage au saccharose
de façon systématique sur tous les prélèvements pourrait permettre la détection de
nombreuses cryptosporidioses sub-cliniques jusqu’à présent non détectées lors de
coproscopies simples.
En ce qui concerne la recherche de kystes de giardia, le lugol est le colorant rapide de
choix, il permet d’améliorer significativement la sensibilité et d’augmenter la rapidité de
lecture par rapport à une coproscopie simple. Malgré l’utilisation de ce colorant, le diagnostic
de giardiose peut parfois s’avérer délicat, l’utilisation de tests immunochromatographiques est
alors un bon moyen de réaliser ce diagnostic.
124
125
CONCLUSION GENERALE
Parmi les protozoaires présents chez les bovins, trois genres ont une importance
majeure. Les éléments parasitaires de ces genres sont détectables en coproscopie, mais la
petite taille de certains peut rendre le diagnostic difficile. D’autres méthodes d’examen des
selles peuvent alors être utilisées afin de les détecter, comme les méthodes immunologiques
ou de biologies moléculaires. Pour faciliter le diagnostic coproscopique, des techniques
utilisant des solutions colorantes ont été décrites, elles ont des sensibilités et des spécificités
différentes et ne concernent pas tous les protozoaires intestinaux.
Dans l’enquête réalisée pour ce travail auprès des LVD et LDA, la majorité d’entre
eux a choisi d’utiliser des techniques de coloration pour mettre en évidence les éléments
parasitaires de Giardia et de Cryptosporidium.
En effet, après comparaison de 3 méthodes de coloration rapides et couramment
utilisées dans les laboratoires, il existe des techniques assez sensibles et spécifiques.
Le lugol est le colorant le plus sensible et spécifique pour la détection des kystes de
giardia, c’est également le colorant le plus utilisé par les laboratoires pour cette recherche.
La méthode de Heine observée au microscope optique ne s’est pas avérée facile ni
efficace pour la détection des 3 genres de protozoaires étudiés.
La coloration au saccharose est aussi sensible et spécifique que la coloration de Ziehl-
Neelsen modifiée pour la mise en évidence de C. parvum. Le montage au saccharose est
cependant plus rapide et moins coûteux, c’est toutefois la méthode la moins utilisée dans les
laboratoires ayant répondus à l’enquête.
Aucun laboratoire n’a mentionné utiliser une méthode spéciale pour la détection des
coccidies, et lors de l’étude des colorants sur les éléments du genre Eimeria, aucune solution
colorant les éléments parasitaires n’a permis d’améliorer la sensibilité d’une coproscopie
simple.
Il est donc nécessaire d’avoir de bonnes hypothèses diagnostiques afin de pouvoir
mettre en place la technique correspondant au parasite recherché.
126
Les techniques de coloration spécifiques d’un parasite permettent le diagnostic de
façon aisée et elles sont réalisables par une personne non expérimentée. Des colorations
pourraient être testées pour la détection et la distinction d’autres éléments parasitaires, comme
par exemple pour les nématodes ou les trématodes.
127
127
128
129
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ACHIR I., HAMRIOUI B. (2001)
Grand Cours Institut Pasteur d’Algérie. La coprologie parasitaire.
Editions Pirates, Alger, 39p.
ADAM K.M.G., PAUL J., ZAMAN V. (1971)
Laboratory aids in the diagnosis of protozoan infections
In: Medical and Veterinary protozoology, an illustrated guide.
Longman group limited, Ontario, 162-166.
ADDISS D.G. et al. (1991)
Evaluation of a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay for Giardia
lamblia antigen in stool.
J. Clin. Microbiol. 29, (6), 1137–1142.
ADJOU K., MICHE N., BRUGERE-PICOUX J. (2006)
Principales affections du système nerveux des ovins.
Point vét. 263, 24–30.
ALDEEN W. E., HALE D.V., ROBISON A.J., CARROLL K. (1995)
Evaluation of a commercially available ELISA assay for detection of Giardia lamblia in fecal
specimens.
Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 21, (2), 77–79.
ALLES A.J., WALDRON M.A., SIERRA L.S., MATTIA A. R. (1995)
Prospective comparison of direct immunofluorescence and conventional staining methods for
detection of Giardia and Cryptosporidium spp. in human fecal specimens.
J. Clin. Microbiol. 33, (6), 1632–1634.
130
AMATO NETO V., BRAZ L.M., DI PIETRO A.O., MODOLO J.R. (1996)
Oocyts of Cryptosporidium sp. In feces: comparison of the modified Kinyoun and Heine
method.
Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 29, (6), 575-578.
ANONYME, Coprologie parasitaire. [en ligne]. In : Université Lille 2 Droit et Santé, Site de
la faculté des Sciences Pharmaceutiques et BiologiquesUniversité de p de Lille 2, Site de
cours en ligne. Site disponible sur : http://pharmacie.univ-
lille2.fr/typo3conf/ext/naw_securedl/secure.php?u=0&file=fileadmin/user_upload/ressources_
communes/aides_pedagogiques/parasitologie/uvb1/copro-parasitaire-
080307.pdf&t=1261977509&hash=6acd8ea0e523af6f658a05bffb00e63c. (Page consultée le
29/08/2012)
BADPARVA E., FALLAHI S., SEPAHVAND A. (2009)
The comparison of the efficacy of various fixatives on diverse staining methods of Giardia
lamblia cyst.
Pak. J. Biol. Sci. 12, (17), 1212–1216.
BAILENGER J. (1982)
Coprologie parasitaire et fonctionnelle. 4ème
édition
E. Drouillard, Bordeaux, 324p.
BARON E.J., SCHENONE C., TANENBAUM B. (1989)
Comparison of three methods for detection of Cryptosporidium oocysts in a low-prevalence
population.
J. Clin. Microbiol. 27, (1), 223–224.
BERTRAND I., GANTZER C., CHESNOT T., SCHWARTZBROD J. (2004)
Improved specificity for Giardia lamblia cyst quantification in wastewater by development of
a real-time PCR method.
J. Microbiol. Methods 57, (1), 41–53.
131
BESSIÈRES M.-H., LINAS M.-D., BOYER M. (1995)
Recherche de cryptosporidies dans les selles.
Rev. fr. Lab. 1995, (279), 125–126.
BEUGNET F. (2000)
Diagnostic coproscopique en pratique.
Action vét. 1510, (Cahier clinique n°41), 7p.
BEUGNET F., BOURDOISEAU G., VILLENEUVE V. (2000)
La giardiose des carnivores domestiques.
Action vét. 1518, (cahier clinique n°49), 7p.
BEUGNET F., POLACK B., DANG H. (2004)
Atlas de coproscopie.
Kalianxis, Clichy, 277p.
BIALEK R., BINDER N., DIETZ K., JOACHIM A., KNOBLOCH J., ZELCK U. E. (2002)
Comparison of fluorescence, antigen and PCR assays to detect Cryptosporidium parvum in
fecal specimens.
Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 43, (4), 283–288.
Bioforma (1998).
Flagellés formes végétatives et kystes
In Cahier de formation - Amibes et flagellés intestinaux.
EGOPRIM, Paris, 169–182.
BJÖRKMAN C., SVENSSON C., CHRISTENSSON B., DE VERDIER K. (2003)
Cryptosporidium parvum and Giardia intestinalis in calf diarrhoea in Sweden.
Acta vet.scand. 44, (3-4), 145–152.
BOUFASSA- OUZROUT S., CHERMETTE R., MEISSONNIER E. (1986)
La cryptosporidiose : Une maladie animale et humaine cosmopolite. Série technique n°5.
Office international des Epizooties, Paris, 97 p.
132
BOWMAN D.D. (2003)
Protozoans
In Georgis’Parasitology for Veterinarians.
Saunderts, St Louis, 84-114.
BRONSDON M.A. (1984)
Rapid dimethyl sulfoxide-modified acid-fast stain of Cryptosporidium oocysts in stool
specimens.
J. Clin. Microbiol. 19, (6), 952–953.
BROUSSARD J.D. (2003)
Optimal fecal assessment.
Clin. Tech. small Anim. Pract.18, (4), 218–230.
BULLOCK W.L. (1980)
The use of the Kohn chlorazol black fixative-stain in an intestinal parasite survey in rural
Costa Rica.
J. Parasitol. 66, (5), 811–813.
BURKE J. A. (1977)
The clinical and laboratory diagnosis of giardiasis.
CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 7, (4), 373–391.
CARTWRIGHT C.P. (1999)
Utility of Multiple-Stool-Specimen ova and parasite examinations in e high prevalence
setting.
J. Clin. Microbiol. 37, (8), 2408-2411.
CASEMORE D.P. (1991)
Laboratory methods for diagnosing cryptosporidiosis.
J. Clin. Pathol. 44, (6), 445-451.
133
CASEMORE D.P., ARMSTRONG M., JACKSON B. (1984)
Screening for cryptosporidium in stools.
Lancet, 1, (8379), 734–735.
CASEMORE D. P., ARMSTRONG M., SANDS R.L. (1985)
Laboratory diagnosis of cryptosporidiosis.
J. Clin. Pathol. 38, (12), 1337–1341.
CASTRO-HERMIDA J.A., PORS I., POUPIN B., ARES-MAZAS E., CHARTIER C. (2005)
Prevalence of Giardia duodenalis and Cryptosporidium parvum in goat kids in western
France.
Small Ruminant Res. 56, (1-3), 259–264.
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, Parasites - Giardia. [en ligne].
In: CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION. Site disponible sur :
http://www.cdc.gov/parasites/giardia/biology.html. (Page consultée le 9/09/2012)
CHARTIER C. (2002)
Protozooses digestives.
Dépêche vét. 81, 2–12.
DAUGSCHIES, DITMTMAR : Diagnosis of Bovine coccidiosis. [CD-Rom]. Leverleuser :
Bayer HealthCare Animal Health. 2007
DENIS G., RICHARD A., REYNAUD A., VALOGNES A. (2008)
Prévalence des coccidies chez les veaux laitiers en Vendée.
In : Rencontres Recherches Ruminants. 90p.
DEPIERREUX C., PE E., PAQUET A., RAIMOND O., LECLIPTEUX T. (2001)
L’immunochromatographie, technique alternative à la microscopie et à l ’ ELISA, pour la
détection rapide, simple, efficace et performante du Cryptosporidium parvum.
Focus diagnostica, 9, (4), 90–93.
134
DE WAAL T. (2012)
Advances in diagnosis of protozoan diseases.
Vet. Parasitol. 189, (1), 65-74.
DIAZ-LEE A. et al. (2011)
Cryptosporidium parvum in diarrheic calves detected by microscopy and identified by
immunochromatographic and molecular methods.
Vet. Parasitol. 176, (2-3), 139–144.
DIXON B.R., PARENTEAU M., MARTINEAU C., FOURNIER J. (1997)
A comparison of conventional microscopy, immunofluorescence microscopy and flow
cytometry in the detection of Giardia lamblia cysts in beaver fecal samples.
J. immunol. Meth. 202, (1), 27–33.
DORCHIES P., DUNCAN J., LOSSON B., ALZIEU J.-P. (2012)
Protozooses.
In Parasitologie clinique des bovins.
Editions Med’Com, Paris, 342p.
FAYER R. MORGAN U., UPTON S.J. (2000)
Epidemiology of Cryptosporidium : transmission, detection and identification.
Int. J. Parasitol., 30, 1305–1322.
FAYER R., SANTIN M., XIAO L. (2005)
Cryptosporidium bovis n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) in cattle (Bos taurus).
J. Parasitol. 91, (3), 624-629.
FAYER R., SPEER C.A., DUBEY J.P. (1990)
Cryptosporidiosis of Man and Animals.
CRC Press, Boca Raton, 356p.
135
GAAFAR M.R. (2011)
Evaluation of enzyme immunoassay techniques for diagnosis of the most common intestinal
protozoa in fecal samples.
Int. J. infect. Dis. 15, (8), 541–544.
GARCIA L.S., BREWER T.C., BRUCKNER D.A. (1979)
A comparison of the formalin-ether concentration and trichrome-stained smear methods for
the recovery and identification of intestinal protozoa.
Am. J. med. Technol. 45, (11), 932–935.
GARCIA L.S., BRUCKNER D.A., BREWER T.C., SHIMIZU R.Y. (1983)
Techniques for the recovery and identification of Cryptosporidium oocysts from stool
specimens.
J. Clin. Microbiol. 18, (1), 185–190.
GARCIA L., SHIMIZU R. (1997)
Evaluation of nine immunoassay kits (enzyme immunoassay and direct fluorescence) for
detection of Giardia lamblia and Cryptosporidium parvum in human fecal specimens.
J. Clin. Microbiol. 35, (6), 1526–1529.
GOLVAN Y.V., AMBROISE-THOMAS P. (1984)
Les nouvelles techniques en parasitologie.
Flammarion, ed., Chevilly-Larue, 306 p.
HANSCHEID T., CRISTINO J.M., SALGADO M.J. (2008)
Screening of auramine-stained smears of all fecal samples is a rapid and inexpensive way to
increase the detection of coccidial infections.
Int. J. infect. Dis. 12, (1), 47–50.
HARRINGTON B.J. (2008)
Micoscopy of 4 pathogenic enteric protozoan parasites: A review.
Lab. med. 39, (4), 231–238.
136
HENDRIX C.M. (1998)
Diagnostic Veterinary parasitology. 2nd
edition.
Mosby, St Louis, 321p.
HENRIKSEN S.A., POHLENZ J.F. (1981)
Staining of cryptosporidia by a modified Ziehl-Neelsen technique.
Acta vet. scand. 22, (3-4), 594–596.
HIGGINS J.A. et al. (2001)
Real-time PCR for the detection of Cryptosporidium parvum.
J. Microbiol. Methods, 47, 323–337.
HUETINK R.E., VAN DER GIESSEN J.W., NOORDHUIZEN J.P., PLOEGER H.W. (2001)
Epidemiology of Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis on a dairy farm.
Vet. Parasitol. 102, (1-2), 53–67.
Institut de l’élevage (2000)
Les maladies dues à des parasites unicellulaires
In Maladies des bovins.
France Agricole, Paris, 548 p.
JOKIPII A.M., JOKIPII L. (1977)
Prepatency of giardiasis.
Lancet, 1, (8021), 1095–1097.
KAR S., GAWLOWSKA S., DAUGSCHIES A., BANGOURA B. (2011)
Quantitative comparison of different purification and detection methods for Cryptosporidium
parvum oocysts.
Vet. Parasitol. 177, (3-4), 366-370.
KAWAHARA F. et al. (2010)
Genetic analysis and development of species-specific PCR assays based on ITS-1 region of
rRNA in bovine Eimeria parasites.
Vet. Parasitol. 174, (1-2), 49–57.
137
KEHL K.S., CICIRELLO H., HAVENS P.L. (1995)
Comparison of four different methods for detection of Cryptosporidium species.
J. Clin. Microbiol. 33, (2), 416–418.
KHELEF D., AKAM A., KAIDI R., HUSSEIN M.S.A., ŞUTEU E., COZMA V. (2002)
Evaluation comparative des méthodes de détection de l’oocyste de Cryptosporidium parvum
dans les selles des veaux.
Sci. Parasitol. 1, 22–27.
KITVIA, Cryptosporidium Ag, test rapide.
In: KITVIA. Biologie Vétérinaire, Industrielle, Agroalimentaire. [en ligne]. Disponible sur :
http://www.kitvia.com/images/sampledata/kitvia/veterinaire/test_diagnostic/test_rapide/crypt
o_ag_bq.pdf. (Page consultée le 23/08/2012)
KUCZYNSKA E., SHELTON D.R. (1999)
Method for detection and enumeration of Cryptosporidium parvum oocysts in feces, manures,
and soils.
Appl. Environ. Microbiol. 65, (7), 2820–2826.
KVÁC M., KVETONOVÁ D., PŮZOVÁ G., DITRICH O. (2003)
Comparison of selected diagnostic methods for identification of Cryptosporidium parvum and
Cryptosporidium andersoni in routine examination of faeces.
J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health, 50, (8), 405–411.
LEVINE N.D. (1973)
Protozoan parasites of domestic animals and of man, 2nd
edition.
Burgess publishing Company, Mineapolis, 406.
LINDSAY D.S., UPTON S.J., OWENS D.S., MORGAN U.M., MEAD J.R., BLAGBURN
B.L. (2000)
Cryptosporidium andersoni n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporiidiae) from cattle, Bos Taurus.
J. Eukaryot. Microbiol. 47, (1), 91-95.
138
MacPHERSON D.W., McQUEEN R. (1993)
Cryptosporidiosis: multiattribute evaluation of six diagnostic methods.
J. Clin. Microbiol. 31, (2), 198–202.
MAGNE D., CHOCHILLON C., SAVEL J., GOBERT J.G. (1996)
Giardia intestinalis et giardiose.
Journal de Pédiatrie et de Puériculture, 9, (2), 74–83.
MARTINEZ I., BELDA NETO F.M. (2001)
Contribution to the laboratory diagnosis of human cryptosporidiosis.
Rev. Inst. Med. Trop. S. Paulo. 43, (2), 79-82.
McNABB S.J., HENSEL D.M., WELCH D.F., HEIJBEL H., McKEE G.L., ISTRE G.R.
(1985)
Comparison of sedimentation and flotation techniques for identification of Cryptosporidium
sp. oocysts in a large outbreak of human diarrhea.
J. Clin. Microbiol. 22, (4), 587–589.
MEGACOR, Diagnostik megacor. [en ligne]. In: MEGACOR, MegaCor Diagnostik,
Veterinary diagnostic. Site disponible sur : http://www.megacor.at/product.html. (Page
consultée le 01/11/2012)
NACIRI M., LACROIX S., LAURENT F. (2000)
La cryptosporidiose des ruminants.
Action vét. 1536, 17–23.
NACIRI M., LEFAY M.P., MANCASSOLA R., POIRIER P., CHERMETTE R. (1999)
Role of Cryptosporidium parvum as a pathogen in neonatal diarrhoea complex in suckling and
dairy calves in France.
Vet. Parasitol. (85), 245–257.
139
NAVETAT H., RICHARD A., DURAND Y., BRIANT E. (1996)
Coccidioses bovines cliniques et subcliniques
In: Groupe de recherche et de développement pour l'élevage et la pathologie du veau.
Protozooses bovines actualités, Annecy, 3 octobre 1996, Société française de buiatrie, 2–13.
NICHOLS G., THOM B.T. (1984)
Screening for Cryptosporidium in stools.
Lancet, 1, (8379), 735.
OLSON M.E. et al. (1997)
Giardia and Cryptosporidium in dairy calves in British Columbia.
Can. Vet. J. 38, (11), 703–706.
OMS (1997)
Parasitologie médicale : techniques de base pour le laboratoire.
Organisation Mondiale de la Santé, Genève, 63p.
ORTOLANI E.L. (2000)
Standardization of the modified Ziehl-Neelsen technique to stain oocysts of Cryptosporidium
sp..
Rev. Bras. Parasitol. Vet. 9, (1), 29–31.
O’DONOGHUE P.J. (1995)
Cryptosporidium and cryptosporidiosis in man and animals.
Int. J. Parasitol. 25, (2), 139–195.
O'HANDLEY R.M., COCKWILL C., MCALLISTER T.A., JELINSKI M., MORCK D.W.,
OLSON M.E. (1999)
Duration of naturally acquired giardiosis and cryptosporidiosis in dairy calves and their
association with diarrhea.
J Am Vet Med Assoc. 214, (3), 391–396.
140
O’HANDLEY R.M., OLSON M.E. (2006)
Giardiasis and cryptosporidiosis in ruminants.
Vet. Clin. North. Am. Food. Anim. Pract. 22, (3), 623–643.
O’HARA S.P., CHEN X.-M. (2011)
The cell biology of cryptosporidium infection.
Microbes Infect. 13, (8-9), 721–730.
PAPINI R., CARDINI G. (2006)
Evaluation of a rapid Cryptosporidium / Giardia immunochromatographic test for diagnosis
of giardiasis in dogs.
Rev. Méd.Vét. 157, (10), 490–493.
PAUL S. et al. (2009)
Comparative evaluation and economic assessment of coprological diagnostic methods and
PCR for detection of Cryptosporidium spp. in bovines.
Vet. Parasitol. 164, 291–295.
PITEL P.-H., CHAUVIN A., FORTIER G., BALLET J.-J., FAVENNEC L. (2005)
Quelle attitude adopter lors de giardiose
Point vét. 255, 34–35.
POHJOLA S. (1984)
Negative staining method with nigrosin for the detection of cryptosporidial oocysts: a
comparative study.
Res. Vet. Sci. 36, (2), 217–219.
POHJOLA S., JOKIPII L., JOKIPII A.M.M. (1985)
Dimethylsulphoxide-Ziehl-Neelsen staining technique for detection of cryptosporidial
oocysts.
Vet. Rec. 116, (16), 442–443.
141
POLACK B., CHERMETTE R., SAVEY M., BUSSIERAS J. (1983)
Les cryptosporidies en France. Techniques usuelles d’identification et résultats préliminaires
d'enquêtes épidémiologiques.
Point vét. 15, (71), 41–46.
QUILEZ J., SANCHEZ-ACEDO C., CLAVEL A., DEL CACHO E., LOPEZ-BERNAD F.
(1996)
Comparison of an acid-fast stain and a monoclonal antibody-based immunofluorescence
reagent for the detection of Cryptosporidium oocysts in faecal specimens from cattle and pigs.
Vet. Parasitol. 67, (1-2), 75–81.
RICHARD A., RIZET C., REYNAUD A., VALOGNES A. (2006)
Prévalence des coccidies sur veaux Charolais à l’étable dans l’Allier
In Rencontres Recherches Ruminants. 441p.
ROBERT B., GINTER A., ANTOINE H., COLLARD A., COPPE P. (1990)
Diagnosis of bovine cryptosporidiosis by an enzyme-linked immunosorbent assay.
Vet. Parasitol. 37, (1), 1–8.
ROUSSET J. (1993)
Copro-parasitologie pratique Intérêt et méthodologie.
ESTEM, Paris, 89p.
THERMO SCIENTIFIC, Thermo Scientific rapid new tests that enable swifter diagnosis and
infection control. [en ligne]. In: Rapidmicrobiolgy. Site disponible sur :
http://www.rapidmicrobiology.com/news/603h301.php. (Page consultée le 23/08/2012)
SCORZA V., TANGTRONGSUP S. (2010)
Update on the diagnosis and management of Cryptosporidium spp. infections in dogs and
cats.
Top Companion Anim. Med. 25, (3), 163–169.
142
SHETTY N., PRABHU T. (1988)
Evaluation of faecal preservation and staining methods in the diagnosis of acute amoebiasis
and giardiasis.
J. Clin. Pathol. 41, (6), 694–699.
ST JEAN G., COUTURE Y., DUBREUIL P., FRECHETTE J.L. (1987)
Diagnosis of Giardia infection in 14 calves.
J Am Vet Med Assoc. 191, (7), 831–832.
TAN K.S.W. (2004)
Blastocystis in humans and animals: new insights using modern methodologies.
Vet. parasitol. 126, (1-2), 121-144.
TANGTRONGSUP S., SCORZA V. (2010)
Update on the diagnosis and management of Giardia spp infections in dogs and cats.
Top Companion Anim Med. 25, (3), 155–162.
TAYLOR M.A., COOP R.L., WALL R.L. (2007)
Veterinary parasitology, 3ème
édition.
Blackwell publishing, Oxford, 874p.
TAYLOR M.A., WEBSTER K.A. (1998)
Recent advances in the diagnosis in livestock of Cryptosporidium, Toxoplasma, Giardia and
other protozoa of veterinary importance.
Res Vet Sci. 65, 183–193.
THORNTON S.A., WEST A.H., DUPONT H.L., PICKERING L.K. (1983)
Comparison of methods for identification of Giardia lamblia.
American J. Clin. Pathol. 80, (6), 858–860.
TROTZ-WILLIAMS L.A. et al. (2005)
Multiattribute evaluation of two simple tests for the detection of Cryptosporidium parvum in
calf faeces.
Vet. Parasitol. 134, (1-2), 15–23.
143
UNGUREANU E.M., DONTU G.E. (1992)
A new staining technique for the identification of Cryptosporidium oocysts in faecal smears.
Trans. r. Soc. trop. Med. Hyg. 86, (4), 638.
VOHRA P., SHARMA M., CHAUDHARY U. (2012)
A comprehensive review of diagnostic techniques for detection of Cryptosporidium parvum in
stool samples.
IOSR Journal of pharmacy; 2, (5), 15-26.
WEBER R., BRYAN R.T., JURANEK D.D. (1992)
Improved stool concentration procedure for detection of Cryptosporidium oocysts in fecal
specimens.
J. Clin. Microbiol. 30, (11), 2869-2873.
WOLFE M.S. (1992)
Giardia.
Clin. Microbiol. Rev. 5, (1), 93-100.
XIAO L., HERD R.P., RINGS D.M. (1993)
Concurrent infections of Giardia and Cryptosporidium on two Ohio farms with calf diarrhea.
Vet. Parasitol. 51, (1-2), 41–48.
ZIERDT C.H. (1991)
Pathogenicity of Blastocystis hominis.
J. Clin. Microbiol. 29, (3), 662-663.
144
145
ANNEXES
146
Annexe 1 : Les sites de prédilections, les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria chez
les bovins
[D'après TAYLOR et al. (2007)]
Espèces Site de prédilection Période prépatentes (en
jours)
Espèces pathogènes
E. alabamensis Intestin grêle et gros intestin 6-11
E. zuernii Intestin grêle et gros intestin 15-17 (12-14 pr georgi’s)
E. bovis Intestin grêle et gros intestin 16-21
Espèces non pathogènes
E. auburnensis Intestin grêle 16-24
E. brasiliensis ? ?
E. bukidnonensis ? ?
E. canadensis ? ?
E. cylindrica ? 10
E. ellipsoidalis Intestin grêle 8-13
E. pellita ? ?
E. subspherica ? 7-18
E. wyomingensis ? 13-15
147
Annexe 2 : Les sites de prédilections et les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria
chez les ovins
[D'après Taylor et al. (2007)]
Espèces Site de prédilection Période prépatente (en
jours)
Espèces pathogènes
E. crandallis Intestin grêle et gros intestin 15-20
E. ovinoidalis Intestin grêle et gros intestin 12-15
Espèces non pathogènes
E.ahsata Intestin grêle 18-30
E. bakuensis Intestin grêle 18-29
E. faurei Intestin grêle et gros intestin 13-15
E. granulosa ? ?
E. intricata Intestin grêle et gros intestin 23-27
E. marsica ? 14-16
E. pallida ? ?
E. parva Intestin grêle et gros intestin 12-14
E. weybridgensis Intestin grêle 23-33
148
Annexe 3 : Les sites de prédilections et les périodes prépatentes des espèces d’Eimeria
chez les caprins
[D'après Taylor et al. (2007)]
Espèces Site de prédilection Période prépatente
(en jours)
Espèces pathogènes
E. caprina Intestin grêle et gros intestin 17-20
E. ninakohlyakimovae Intestin grêle et gros intestin 10-13
E. christenseni Intestin grêle 14-23
E. hirci ? 13-16
Espèces non pathogènes
E. alijevi Intestin grêle et gros intestin 7-12
E. aspheronica ? 14-17
E. arloingi Intestin grêle 14-17
E. caprovina ? 14-20
E. jolchijevi ? 14-17
149
Annexe 4 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces
d’Eimeria présentes chez les bovins
[D'après Taylor et al. (2007) et Dorchies et al. (2012)]
150
Espèces Description des oocystes Taille (µm)
Espèces pathogènes
E. alabamensis
Ovoïde, transparent, coque lisse, absence de micropyle,
absence de CR d’oocyste et de sporocyste
18 x 13,4
E. zuernii
Sphérique à subsphérique, transparent, absence de micropyle,
absence de corps résiduel d’oocyste et de sporocyste
15,6 x 17,8
E. bovis
Ovoïde à subsphérique, transparent, micropyle difficilement
visible, présence d’un CR
27,7 x 20,3
Espèces non pathogènes
E. auburnensis
Ellipsoïde à ovoïde, couleur jaune-marron, micropyle avec
granule polaire, absence de CR d’oocyste, présence de CR de
sporocyste
38,4 x 23,1
E. brasiliensis
Ellipsoïde à ovoïde, couleur jaune-marron, micropyle
recouvert d’une capsule polaire, granules polaires parfois
présent, absence de CR d’oocyste, présence de CR de
sporocyste
37 x 27
E.
bukidnonensis
Piriforme à ovoïde, aplati à un pôle, couleur jaune-marron,
coque striée, micropyle, granule polaire parfois présent
48,6 x 35,4
E. canadensis
Ovoïde à ellipsoïde, transparent à jaune, micropyle et granules
polaires, absence de CR d’oocyste, présence de CR de
sporocyste
32,5 x 23,4
E. cylindrica
Allongé à cylindrique, transparent, coque lisse, absence de
micropyle et de CR d’oocyste, présence de CR de sporocyste
23,3 x 12,3
E. ellipsoidalis
Ellipsoïde à ovoïde, transparent, coque lisse, absence de
micropyle et de CR d’oocyste, présence de CR de sporocyste
23,4 x 15,9
E. pellita
Ovoïde, coque marron présentant parfois des protubérances,
micropyle et granules polaires, absence de CR d’oocyste,
présence de CR de sporocyste
40 x 28
E. subspherica
Sphérique à subsphérique, transparent, absence de micropyle
et de CR d’oocyste et de sporocyste
11 x 10,4
E.
wyomingensis
Ovoïde, couleur jaune-marron, coque fine, présence d’un
micropyle, absence de CR
40,3 x 28,1
151
Annexe 5 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces
d’Eimeria présentes chez les ovins
[D'après Taylor et al. (2007)]
152
Espèces Description des oocystes Taille
moyenne
(µm)
Espèces pathogènes
E. crandallis
Ellipsoïde à subsphérique, avec ou sans capsule polaire,
absence de CR d’oocystes, présence de CR de sporocystes
21,9 x 19,4
E. ovinoidalis
Ellipsoïde, transparent à jaune pâle, absence de CR
d’oocystes, présence de CR de sporocystes
23 x 18
Espèces non pathogènes
E.ahsata
Ovoïde avec une capsule polaire, couleur jaune-marron,
absence d’oocyste résiduel
33,4 x 22,6
E. bakuensis
Ellipsoïde avec une capsule polaire, couleur jaune-marron
pâle, absence de CR d’oocystes, présence de CR de
sporocystes
31 x 20
E. faurei
Ovoïde, couleur jaune-marron pâle, absence de CR
d’oocystes ou de sporocystes
33 x 23
E. granulosa
En forme d’urne, avec une large capsule polaire, couleur
jaune- marron, absence d’oocystes résiduels
29,4 x 20,9
E. intricata
Ellipsoïde, coque mince et striée couleur marron, absence
d’oocystes résiduels
48 x 34
E. marsica
Ellipsoïde, micropyle inconstant, couleur pâle à jaune-
marron, absence de CR d’oocystes et de sporocystes
19 x 13
E. pallida
Ellipsoïde, coque fine, couleur pâle à jaune, absence de CR
d’oocystes, présence de CR de sporocystes
14 x 10
E. parva
Sphérique à subsphérique, couleur pâle, absence de CR
d’oocystes, présence de CR de sporocystes
16,5 x 14,0
E.
weybridgensis
Ellipsoïde à subsphérique, présence d’un micropyle avec ou
sans calotte, absence de CR d’oocystes ou de sporocystes
24 x 17
153
Annexe 6 : Schéma et description de la morphologie des oocystes sporulés des espèces
d’Eimeria présentes chez les caprins
[D'après Taylor et al. (2007)]
154
Espèces Description des oocystes Taille
moyenne (µm)
Espèces pathogènes
E. caprina
Ellipsoïde, couleur jaune-marron à marron foncé,
présence d’un micropyle et de CR de sporocystes.
absence de CR d’oocystes
32 x 23
E.
ninakohlyakimovae
Ellipsoïde, coque fine, transparent, absence de
micropyle et de CR d’oocyste, présence de CR de
sporocystes
20,7 x 14,8
E. christenseni
Ovoïde, coque fine, couleur claire à jaune pâle,
présence d’un micropyle, d’une capsule polaire et de
CR de sporocystes, absence de CR d’oocystes
38 x 25
E. hirci
Rond à ovale, couleur jaune pâle, présence d’un
micropyle et d’une capsule polaire, absence de CR
d’oocystes
20,7 x 16,2
Espèces non pathogènes
E. alijevi
Ovoïde à ellipsoïde, micropyle inconstant, transparent
à jaune pâle, absence de CR d’oocystes, présence de
CR de sporocystes
17 x 15
E. arloingi
Ellipsoïde, coque fine, présence d’un micropyle, d’une
capsule polaire de CR de sporocystes, absence de CR
d’oocystes
27 x 18
E. aspheronica
Ovoîde, couleur vert à jaune-marron, présence d’un
micropyle et de CRde sporocystes, absence de résidus
d’oocystes
31 x 32
E. caprovina
Ellipsoïde à subsphérique, transparent, présence d’un
micropyle et de CR de sporocystes, absence de résidus
d’oocystes
30 x 24
E. jolchijevi
Ellipsoïde à ovoïde, couleur jaune pâle, présence d’un
micropyle d’une capsule polaire et de CR de
sporocystes, absence de résidus d’oocystes
31 x 22
155
Annexe 7 : Protocole de coloration par la méthode de Bailenger et Faraggi
[Bailenger (1982)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Violet cristal
Fuchsine basique
Alcool à 95°
Phénol cristallisé
Eau distillée
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Réactif :
Violet cristal : 50g
Fuchsine basique : 10mg
Alcool à 95° : 20 ml
Phénol cristallisé fondu : 4 ml
Eau distillée : 100 ml
Dissoudre le violet cristal et la fuchsine dans l’alcool à 95° et le phénol. Ajouter l’eau après
dissolution.
Maintenir le réactif à l’abri de la lumière dans un flacon hermétique. Utiliser
seulement le surnageant.
MODE OPERATOIRE :
1- Mettre une goutte de fèces liquide ou réaliser un mélange de fèces dans une goutte de
sérum physiologique
2- Avec le coin d’une lamelle mélanger une goutte de réactif
3- Recouvrir d’une lamelle
4- Observer au microscope avec un objectif à immersion
156
Annexe 8 : Protocole de coloration par la méthode M.I.F.
[Bailenger (1982)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Solution de lugol
Teinture de merthiolate n°99 à 1‰ Lilly
Solution de formol
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Réactif :
Teinture de merthiolate : 77,5 ml
Lugol : 10 ml
Formol : 12,5 ml
Les proportions peuvent être modifiées car le lugol s’altère avec le temps, il peut alors
être nécessaire d’augmenter la proportion de lugol pour compenser sa détérioration.
La conservation du mélange ne dépasse pas 6 à 8 heures.
MODE OPERATOIRE :
1- Mélanger une goutte de réactif et une goutte d’eau distillée
2- Délayer une petite quantité de fèces
3- Recouvrir d’une lamelle
4- Observer au microscope optique à l’objectif x40
157
Annexe 9 : Protocole de coloration de la technique d’Heindenhain
[Bailenger (1982)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Alun de fer
Hématoxyline cristallisée
Alcool à 90°
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Mordant :
Alun de fer : 3g
Eau distillée : 100 ml
La solution doit être réalisée à froid, elle est jaune et se conserve au réfrigérateur.
Colorant :
Solution mère :
Hématoxyline cristallisée : 10g
Alcool à 90° : 100 ml
Cette solution doit être préparée et laissée à la lumière diffuse pendant 15 jours minimum.
Solution extemporanée : dilution de la solution mère au dixième
Différenciateur : Mordant dilué au demi
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Fixer la lame
3- Plonger la lame dans le mordant à 37°C pendant 30 minutes
4- Rincer à l’eau distillée
5- Plonger la lame dans la solution extemporanée de colorant pendant 30 minutes à 37°C
ou 24 heures à température ambiante
6- Laver la lame à l’eau distillée
7- Placer la lame sur la platine du microscope (ou sur une boite de Pétri pour ne pas salir
la platine du microscope)
8- Mettre quelques gouttes de différenciateur sur la lame
9- Lorsque les structures nucléaires ressortent, rincer la lame à l’eau courante
10- Réaliser le montage de la lame
11- Observer au microscope optique à l’objectif x40
158
Annexe 10 : Protocole de la méthode de coloration de Trichrome de gomori-Weathley
[Bailenger (1982)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Chromotrope 2R
Vert lumière SF
Acide phosphotungstique
Acide acétique cristallisable
Alcool à 90°
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Colorant trichrome de Gomori :
Chromotrope 2R : 0,6g
Vert lumière SF : 0,3g
Acide phosphotungstique : 0,7g
Acide acétique cristallisable : 1 ml
15 à 30 minutes plus tard ajouter 100ml d’eau distillée
Alcool acétique :
Alcool à 90° : 10 ml
Acide acétique cristallisable : 1 goutte
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Fixer au Schaudinn acétique
3- Laver le frottis
4- Plonger le frottis dans le colorant trichrome pendant une dizaine de minutes
5- Rincer rapidement à l’aide de l’alcool acétique (10 à 20 secondes)
6- Monter la lame
7- Observer au microscope optique à l’objectif x40
159
Annexe 11 : Protocole de la méthode de coloration au noir chlorazol de Kohn
[Bailenger (1982)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Noir chlorazol
Alcool éthylique à 90°
Alcool méthylique
Acide acétique cristallisable
Phénol cristallisé fondu
Solution aqueuse d’acide phosphotungstique à 1%
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Réactif :
Noir chlorazol : 0,5g
Broyer au mortier et dissoudre progressivement dans le mélange suivant :
Alcool éthylique à 90° : 17 ml
Alcool méthylique : 16 ml
Acide acétique cristallisable : 2 ml
Phénol cristallisé fondu : 2 ml
Solution aqueuse d’acide phosphotungstique à 1% : 1,2ml
Eau distillée : q.s.p. 100 ml
Transvaser les portions bien dissoutes dans un flacon et laisser à la lumière pendant
plusieurs semaines. Un dépôt se forme, le réactif est un liquide limpide pourpre
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Plonger le frottis encore humide dans le colorant pendant une dizaine d’heures
3- Rincer les frottis à l’eau courante
4- Monter la lame
5- Observer au microscope optique à l’objectif x40
160
Annexe 11 : Protocole de coloration par la méthode de Brooke et Goldman
[Bailenger (1982)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Alcool à 70°
Alcool à 50°
Lugol
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser et fixer un frottis fécal à l’aide d’un fixateur polyvinylique
2- Plonger le frottis fixé dans un bain d’alcool à 70° avec quelques gouttes de lugol
pendant 20 minutes
3- Plonger le frottis dans un bain d’alcool à 50° pendant 10 minutes
4- Plonger le frottis dans l’eau pendant 5 minutes
5- Colorer le frottis par une technique de coloration de frottis humide
6- Monter la lame
7- Observer au microscope optique à l’objectif x40
161
Annexe 12 : Protocole de la méthode de coloration de Giemsa
[Jokipii, Pohjola et Jokipii (1983)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Méthanol
Solution de Giemsa à 10%
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Laisser sécher à l’air pendant 1 heure
3- Fixer à l’aide de méthanol pendant 10 minutes
4- Plonger le frottis dans la solution de Giemsa à 10% pendant 10 minutes
5- Rincer les frottis à l’eau courante
6- Monter la lame
7- Observer au microscope optique à l’objectif x40 et à immersion
162
Annexe 13 : Protocole de coloration au lugol
[Bailenger (1982)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Iode
Iodure de potassium
PREPARATION PRELIMINAIRE :
LUGOL :
Iode (cristallisé) : 1 g
Iodure de potassium : 2 g
Eau distillée : 100 ml qsp
Faire dissoudre l’iodure de potassium dans une très faible quantité d’eau puis ajouter
lentement les cristaux d’iode.
Agiter jusqu’à dissolution puis ajouter le reste de l’eau. Pour finir filtrer la solution.
MODE OPERATOIRE :
1- Mettre une goutte de fèces liquide ou réaliser un mélange de fèces dans une goutte de
sérum physiologique
2- Recouvrir d’une lamelle
3- Déposer une goutte de lugol au bord de la lamelle
4- Observer au microscope sur la zone de progression du colorant à l’objectif x40
163
Annexe 14 : Protocole de coloration au saccharose
[Beugnet et al. (2004)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Saccharose
Lame
Lamelle
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Solution de saccharose :
Saccharose : 20g
Eau distillée : 10 ml
Agiter le mélange jusqu’à dissolution complète (environ une heure)
MODE OPERATOIRE :
1- Déposer une goutte de solution de saccharose sur une lame
2- Mélanger avec une goutte de matière fécale
3- Recouvrir d’une lamelle
4- Observer immédiatement au microscope optique à l’objectif x40
Annexe 15 : Protocole de coloration pour la méthode de Heine
[Beugnet et al. (2004)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Fuchsine
MODE OPERATOIRE :
1- Mettre 10µL de fuchsine sur une lame
2- Mélanger 10µL de fèces
3- Réaliser un frottis (ou recouvrir directement par une lamelle)
4- Sécher
5- Observer au microscope optique à l’objectif x 40 et/ ou à immersion
164
Annexe 16 : Protocole de la coloration négative à la nigrosine
[Pohjola (1984)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Solution de Nigrosine à 1%
MODE OPERATOIRE :
1- Mélanger 20 µl de fèces et 20 µl de solution de nigrosine sur une lame
2- Etaler le mélange
3- Laisser sécher le frottis à l’air
4- Observer au microscope optique à l’objectif x40
165
Annexe 17 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée par
Henriksen et Pohlenz
[Henriksen et Pohlenz (1981), Jokipii et al. (1983)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Méthanol à 96°
Fuchsine basique
Phénol à 5%
Ethanol à 95°
Acide sulfurique
Vert de Malachite à 5%
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Fuchsine carbolique :
Fuchsine basique : 1g
Ethanol : 10 ml
Phénol à 5% : 90ml
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Laisser sécher à l’air ambiant
3- Plonger le frottis dans du méthanol à 96% pendant 2 à 5 minutes
4- Laisser sécher
5- Fixer brièvement à la flamme
6- Plonger le frottis dans de la fuchsine carbolique pendant 20 à 30 minutes à froid
7- Rincer à l’eau
8- Décolorer à l’aide d’acide sulfurique (de 0,25 à 10%) pendant 20 à 60 secondes
9- Rincer à l’eau
10- Colorer avec la solution de vert de malachite pendant 5 minutes
11- Rincer à l’eau
12- Sécher
13- Monter la lame à l’aide d’Eukitt
14- Observation au microscope optique à l’objectif x40 ou à immersion
166
Annexe 18 : Protocole de la technique de Ziehl-Neelsen modifiée par Angus
[Boufassa-Ouzrout et al. (1986)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Fuchsine phéniquée
Ethanol à 95°
Acide chlorhydrique
Vert de Malachite à 0,25%
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Mélange HCl-éthanol :
Acide chlorhydrique : 3ml
Ethanol à 95° : 100ml
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Laisser sécher à l’air ambiant
3- Fixer le frottis à l’éthanol
4- Laisser sécher
5- Plonger le frottis dans de la fuchsine carbolique pendant 5 minutes à froid
6- Rincer à l’eau
7- Décolorer dans le mélange HCl-éthanol jusqu’à ce que le colorant s’élimine
8- Rincer à l’eau
9- Colorer avec la solution de vert de malachite à 0,25% pendant 30 secondes
10- Rincer à l’eau
11- Sécher
12- Monter sous lamelle
13- Observation au microscope optique à l’objectif x40 ou à immersion
167
Annexe 19 : Protocole de coloration de diméthylsulphoxyde-Ziehl-Neelsen
[Pohjola et al. (1985)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Méthanol
Fuchsine diamant
Glycérol
Ethanol à 95°
Diméthylsulphoxyde
Vert de malachite à 2%
Acide acétique à 99,5%
Glycérol
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Solution 1 :
Fuchsine diamant : 4 g
Glycérol : 12 g
Ethanol à 95° : 25 ml
Diméthylsulphoxyde : 25 ml
Eau distillée : q.s.p. 160ml
Solution 2 :
Vert de malachite à 2% : 220 ml
Acide acétique à 99,5% : 30 ml
Glycérol : 50 ml
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Laisser sécher à l’air ambiant
3- Plonger le frottis dans du méthanol pendant 10 minutes
4- Laisser sécher
5- Recouvrir de la solution 1 pendant 2 minutes
6- Rincer à l’eau
7- Recouvrir de la solution 2 pendant 1 minute
8- Rincer à l’eau
9- Sécher à l’air
10- Observation au microscope optique à l’objectif x40 ou à immersion
168
Annexe 20 : Protocole de coloration à l’auramine-fuchsine carbolique
[Casemore et al. (1984)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Auramine
Fuchsine phéniquée
Microscope à fluorescence avec un filtre Leitz KP 540
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Laisser sécher à l’air ambiant
3- Plonger le frottis dans l’auramine pendant 5 minutes
4- Rincer à l’eau
5- Immerger rapidement dans la fuchsine phéniquée (10 secondes environ)
6- Rincer à l’eau
7- Sécher
8- Observation au microscope à fluorescence avec un objectif x10
169
Annexe 21 : Protocole de coloration à l’auramine-phénol
[Nichols et Thom (1986)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Auramine O
Phénol
Acide chlorhydrique
Ethanol à 95°
Méthanol
Formol
Permanganate de potassium
Microscope à fluorescence
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Solution d’auramine-phénol :
Auramine O : 0,03g
Phénol : 3g
Eau distillée : 100 ml
Mélange acide-alcool :
HCl concentré : 3 mL
Ethanol 95° : 100mL
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Laisser sécher à l’air ambiant
3- Fixer dans du méthanol pendant 3 minutes
4- Exposer à des vapeurs de formol à 37°C pendant 30 minutes
5- Colorer le frottis avec la solution d’auramine-phénol pendant 10 minutes
6- Rincer à l’eau
7- Décolorer avec le mélange acide-alcool pendant 5 minutes
8- Rincer à l’eau
9- Recolorer avec une solution de permanganate de potassium à 0,1% pendant 30
secondes
10- Rincer à l’eau
11- Sécher
12- Observation au microscope à fluorescence avec un objectif x10
170
Annexe 22 : Protocole de coloration à la mépacrine
[Ungureanu et Dontu (1992)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Formol à 10%
Solution de mépacrine à 0,05%
Acide chlorhydrique
Ethanol à 97°
Permanganate de potassium
Microscope à fluorescence
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Mélange acide-alcool :
Acide chlorhydrique : 1ml
Ethanol à 97° : 100 ml
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Laisser sécher à l’air ambiant
3- Fixer le frottis dans du formol à 10% pendant 2 à 3 minutes
4- Recouvrir la lame d’une solution de mépacrine à 0,05% pendant 5 minutes
5- Rincer à l’eau
6- Décolorer dans le mélange acide-alcool pendant 1 à 2 minutes
7- Rincer à l’eau
8- Recolorer dans une solution de permanganate de potassium à 1% pendant 30 secondes
9- Rincer la lame
10- Sécher
171
Annexe 23 : Questionnaire envoyé aux laboratoires
METHODES UTILISEES POUR LE DIAGNOSTIC COPROLOGIQUE CHEZ
LES RUMINANTS.
Nous sommes étudiantes vétérinaires et dans le cadre de notre thèse d’exercice vétérinaire nous
cherchons à connaitre les méthodes utilisées en coprologie chez les ruminants dans les laboratoires
départementaux.
Merci de votre participation à cette étude.
Quel est votre département ? : ……………..
Quels sont vos tarifs en parasitologie ?
- Coprologie simple (qualitative) : …………….. €
- Coprologie quantitative (mac master) : …………….. €
- Recherche spéciale : de giardia : ………….. € de cryptosporidies : ……………..€
I. Méthode de flottation
a) Quel liquide de flottation utilisez-vous en routine (merci de préciser sa densité) :
Iodomercurate de potassium ……… Sulfate de zinc ……… Sucrose ………
Chlorure de sodium ……… Chlorure de zinc ……… Autre (précisez) : ……………..
b) Réalisez-vous une coproscopie : Qualitative Semi-quantitative Quantitative
c) Quelle est la durée d’une coproscopie simple ? ……………………….
d) Quelles mesures de sécurité et hygiène sont en place lors de la manipulation des liquides :
Port de gants Port de masque Manipulation sous hotte Recyclage
Autre : ………………………………………………………………..
e) En cas de demande diagnostique précise, utilisez-vous d’autres liquides :
OUI NON si oui lesquelles : …………………………………………
II. Colorations des protozoaires en coproscopie
a) Quelles colorations utilisez-vous en routine :
Ziehl-Neelsen modifié Heine Saccharose Lugol
MIF Autres : (précisez) …………………………………………
b) Quelles colorations utilisez-vous lors d’une demande spécifique (précisez le parasite recherché)
Ziehl-Neelsen modifié ………………. Heine …………… Saccharose ……………….
Lugol ………………. MIF ………………. Autres : (précisez) ………………………
c) Quelle est la durée d’une coloration : …………………………………………
d) Quelles sont les raisons qui vous ont fait choisir les colorants :
Coût Facilité de préparation Type de parasite recherché Facilité de lecture
e) Si vous utilisez la coloration de Zieh-Neelsen modifiée, quelles sont les durées et la concentration
des produits pour chaque étape :
1- Fixation méthanol : …………….. min 2-Coloration fuchsine phéniquée : …………… min
3-Décoloration acide sulfurique : ….%, tps: …. 4-Recoloration vert de Malachite : …………… sec
Fabienne RICHARD : [email protected] Jeanne CHANUDET : [email protected]
172
Annexe 24 : Protocole de la technique de coloration de Ziehl-Neelsen modifiée choisie
pour l’étude expérimentale
[Beugnet et al. (2004)]
MATERIEL NECESSAIRE :
Fuchsine phéniquée
Ethanol à 95°
HCl
Vert de Malachite à 0,5%
PREPARATION PRELIMINAIRE :
Mélange HCl 3%-Ethanol 95°
HCl concentré : 3 ml
Ethanol 95° : 100 ml
MODE OPERATOIRE :
1- Réaliser un frottis fécal
2- Laisser sécher à l’air ambiant
3- Recouvrir le frottis par de l’éthanol à 95° pendant 5 minutes
4- Fixer brièvement à la flamme
5- Plonger le frottis dans de la fuchsine pendant 4 minutes
6- Rincer à l’eau
7- Décolorer à l’aide du mélange acide-alcool par 2 giclées
8- Rincer à l’eau
9- Colorer avec la solution de vert de malachite pendant 1 minute
10- Rincer à l’eau
11- Sécher
12- Observation au microscope optique à l’objectif x40 ou à immersion
NOM PRENOM : CHANUDET Jeanne
TITRE : COMPARAISON DE DIFFERENTES COLORATIONS POUR
LA MISE EN EVIDENCE DES PROTOZOAIRES DANS LA
COPROSCOPIE DES RUMINANTS
Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, le 21 décembre 2012
RESUME :
Dans cette étude, nous avons réalisé un bilan des différentes techniques utilisées par les LVD et LDA français à
l’aidé d’un questionnaire qui leur a été envoyé, mais aussi une comparaison de 3 méthodes de coloration rapides:
la coloration au lugol, le montage au saccharose et la méthode de Heine pour la détection de 3 genres de
protozoaires intestinaux courants dans les fèces.
En France, les laboratoires utilisent en majorité des colorations lors d’une recherche spécifique de protozoaires
digestifs comme C. parvum et G. intestinalis. Certains choisissent pour ces recherches des techniques
immunologiques, les tarifs sont alors plus élevés.
Les différents résultats ont permis de mettre en évidence 2 techniques de coloration. La coloration par une
solution de saccharose est la méthode la plus sensible, spécifique et facile d’utilisation pour mettre en évidence
les oocystes de C. parvum dans les fèces. Ce n’est pourtant que la troisième méthode la plus employée par les
laboratoires pour cette recherche, derrière la technique de Ziehl-Neelsen modifiée et la méthode de Heine.
La coloration par le lugol est la méthode ayant la meilleure sensibilité, la plus forte spécificité et la plus grande
facilité de lecture pour détecter les kystes de giardia. C’est également celle qui est la plus employée par les
laboratoires français. Les laboratoires ayant répondus à notre enquête n’utilisent pas de technique de coloration
lors de la recherche de coccidies. En effet, nous avons pu voir que les colorations engendrant une modification
de teinte des oocystes d’Eimeria (le lugol et la fuchsine), diminuent la sensibilité et compliquent la lecture et
l’identification des oocystes d’Eimeria.
MOTS CLES : - diagnostic
- coloration
- protozoaire
- coproscopie
- ruminants
JURY :
Président : Monsieur le Professeur Jean-Alain CHAYVIALLES
1er Assesseur : Monsieur le Professeur Lionel ZENNER
2ème Assesseur : Madame le Docteur Marie-Anne ARCANGIOLI
DATE DE SOUTENANCE : 21 décembre 2012
ADRESSE DE L’AUTEUR :
Corcelette
69910 VILLIE-MORGON