ΑTEI ΑΘΗΝΑΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΝΟΙΑΣ

ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ

ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

ΚΥΤΤΑΡΟΛΟΓΙΑ ΥΓΡΗΣ ΦΑΣΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗ, ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΤΑ, ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ

ΣΑΜΑΡΑ ΕΝΙΝΤΑ

ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: ΡΕΒΕΛΟΣ ΚΥΡΙΑΚΟΣ

ΑΘΗΝΑ 2012

ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ

ΤΤΕΕΧΧΝΝΙΙΚΚΗΗ,, ΠΠΛΛΕΕΟΟΝΝΕΕΚΚΤΤΗΗΜΜΑΑΤΤΑΑ,, ΠΠΡΡΟΟΟΟΠΠΤΤΙΙΚΚΕΕΣΣ

i

ΠΠΕΕΡΡΙΙΕΕΧΧΟΟΜΜΕΕΝΝΑΑ

11 ΕΕΙΙΣΣΑΑΓΓΩΩΓΓΗΗ ............................................................................................ 1

1.1 Τι είναι η τεχνολογία της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης; ................... 3

1.2 Συστήματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ......................................... 4

1.3 Εφαρμογή της κυτταρολογίας υγρής φάσης και στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία ........................................................................ 5

22 ΤΤΕΕΧΧΝΝΙΙΚΚΗΗ ΤΤΗΗΣΣ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ ................... 8

2.1 Παρασκευή γυναικολογικών δειγμάτων ............................................ 8

2.1.1 Συσκευές δειγματοληψίας ......................................................... 8

2.1.2 Λήψη δειγμάτων ....................................................................... 9

2.1.3 Διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς ................................... 11

2.1.4 Προετοιμασία δειγμάτων ......................................................... 12

2.1.5 Επεξεργασία δειγμάτων και παρασκευή επιχρισμάτων .......... 13

2.1.5.1 ThinPrep 2000 Processor (Hologic) ................................. 14

2.1.5.2 BD PrepStain™ Slide Processor (Becton Dickinson) ...... 16

2.2 Λήψη και παρασκευή μη-γυναικολογικών δειγμάτων ...................... 20

2.2.1 Διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς ................................... 20

2.2.2 Συλλογή και προετοιμασία δειγμάτων ..................................... 21

2.3 Αξιολόγηση επιχρισμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης στο μικροσκόπιο .............................................................................................. 25

2.4 Αυτοματοποιημένα συστήματα ελέγχου .......................................... 30

2.4.1 Ιστορική Αναδρομή ................................................................. 30

2.4.2 FocalPoint™ Slide Profiler ...................................................... 31

2.4.3 Διαδραστικά συστήματα ελέγχου ............................................ 33

33 ΠΠΛΛΕΕΟΟΝΝΕΕΚΚΤΤΗΗΜΜΑΑΤΤΑΑ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ ........ 36

3.1 Απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ................................... 37

3.1.1 Η απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στον έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων ........................................................... 37

3.1.1.1 Δημοσιευμένες έρευνες και στοιχεία που υποστηρίζουν την χρήση της κυτταρολογίας υγρής φάσης στην κλινική πράξη .............. 37

3.1.1.2 Έρευνες του Κολλεγίου των Αμερικανών Παθολόγων ..... 40

ii

3.1.1.3 Βασικές μελέτες (pivotal studies) σύγκρισης των τεχνολογιών κυτταρολογίας υγρής φάσης με την συμβατική κυτταρολογία ..................................................................................... 42

3.1.2 Η απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στον έλεγχο επιχρισμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας .................................. 43

3.1.3 Συμπέρασμα ........................................................................... 44

3.2 Επάρκεια δειγμάτων ....................................................................... 45

3.2.1 Ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων και οι αιτίες που τα προκαλούν ............................................................................................ 46

3.3 Οι επιδόσεις των κυτταροπαθολόγων στην ερμηνεία επιχρισμάτων Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ............................................. 50

3.4 Επικουρικές εξετάσεις σε δείγματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης .. 52

3.5 Αυτοματοποίηση στην ανάλυση επιχρισμάτων γυναικολογικής κυτταρολογίας ............................................................................................ 53

44 ΕΕΦΦΑΑΡΡΜΜΟΟΓΓΗΗ ΜΜΟΟΡΡΙΙΑΑΚΚΩΩΝΝ ΜΜΕΕΘΘΟΟΔΔΩΩΝΝ ΣΣΕΕ ΔΔΕΕΙΙΓΓΜΜΑΑΤΤΑΑ

ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ ΚΚΑΑΙΙ ΗΗ ΧΧΡΡΗΗΣΣΗΗ ΤΤΟΟΥΥΣΣ ΣΣΤΤΗΗΝΝ

ΔΔΙΙΑΑΓΓΝΝΩΩΣΣΗΗ ΤΤΟΟΥΥ ΚΚΑΑΡΡΚΚΙΙΝΝΟΟΥΥ:: ΠΠΡΡΟΟΚΚΛΛΗΗΣΣΕΕΙΙΣΣ ΚΚΑΑΙΙ ΠΠΡΡΟΟΟΟΠΠΤΤΙΙΚΚΕΕΣΣ 57

4.1 Ο ρόλος της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στην ανίχνευση μοριακών δεικτών για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ....................................................................................................... 57

4.1.1 Μοριακή διάγνωση του HPV ................................................... 58

4.1.2 Παραδείγματα εφαρμογής του HPV DNA test στον πρωτοβάθμιο έλεγχο ............................................................................. 60

4.1.3 Μοριακοί δείκτες ..................................................................... 63

4.1.4 Νέοι τρόποι προσέγγισης στην πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας με σημαντική προγνωστική αξία ......................... 66

4.1.4.1 Διπλή χρώση p16INK4a/ Ki-67 ........................................... 66

4.1.4.2 Διάγνωση του ΚΤΜ ανιχνεύοντας το mRNA των E6/E7 ... 67

4.2 Μοριακοί δείκτες για την ανίχνευση του θυρεοειδούς καρκινώματος σε δείγματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης ......................... 68

4.3 Εξελίξεις στην κυτταρολογία του καρκίνου του μαστού ................... 71

55 ΣΣΧΧΕΕΣΣΗΗ ΚΚΟΟΣΣΤΤΟΟΥΥΣΣ--ΑΑΠΠΟΟΤΤΕΕΛΛΕΕΣΣΜΜΑΑΤΤΙΙΚΚΟΟΤΤΗΗΤΤΑΑΣΣ ΤΤΗΗΣΣ

ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗ ....................................................... 74

66 ΣΣΥΥΜΜΠΠΕΕΡΡΑΑΣΣΜΜΑΑ ................................................................................. 78

ΠΠΕΕΡΡΙΙΛΛΗΗΨΨΗΗ ............................................................................................... 83

AABBSSTTRRAACCTT ............................................................................................... 84

ΒΒΙΙΒΒΛΛΙΙΟΟΓΓΡΡΑΑΦΦΙΙΑΑ ........................................................................................ 85

iii

Στην οικογένειά μου

1

11 ΕΕΙΙΣΣΑΑΓΓΩΩΓΓΗΗ

επανάσταση στην διαγνωστική κυτταρολογία ήρθε ως γνωστόν, με την εφαρμογή του τεστ Παπανικολάου. Με την καθιέρωση της Κλινικής Κυτταρολογίας ως νέα επιστήμη

αναγνωρίστηκε επίσημα ο τομέας της Διαγνωστικής Αποφολιδωτικής Κυτταρολογίας στις αρχές της οποίας στηρίχτηκε το τεστ Παπανικολάου. Ο νέος κλάδος έθεσε τα θεμέλιά του μέσα από την συνεργασία του έλληνα γιατρού Γεώργιου Παπανικολάου με κορυφαίους ειδικούς που οδήγησε στην δημοσίευση του «Διάγνωση του καρκίνου της μήτρας μέσω των κολπικών επιχρισμάτων» (The diagnosis of uterine cancer by the vaginal smear) το 1943, η οποία υπεγράφη από τα μέλη των μεγάλων ιατρικών σχολών του Χάρβαρντ, της Βοστόνης και της Νέας Υόρκης. Έκτοτε το τεστ Παπανικολάου μπήκε στην ζωή των γυναικών σε όλο τον κόσμο και συνεχίζει να χρησιμοποιείται έως και σήμερα. Στην ουσία η τεχνική αφορούσε την συλλογή κυττάρων από τον τράχηλο της μήτρας, την επίστρωσή τους σε αντικειμενοφόρο πλάκα, την μονιμοποίηση του με υγρό ή σπρέι για να αποφευχθεί η εκφύλισή τους, ύστερα την εφαρμογή ειδικής χρώσης κατά Παπανικολάου ώστε να μπορούν να διακριθούν τα κύτταρα και οι πυρήνες τους κάτω από το μικροσκόπιο. Στην συνέχεια τα επιχρίσματα αυτά εξετάζονται από εκπαιδευμένο προσωπικό, αναζητώντας τυχόν μη φυσιολογικά κύτταρα ανάμεσα σε χιλιάδες κύτταρα που περιέχει το κάθε επίχρισμα. Τότε η μέθοδος δεν αξιολογήθηκε ποτέ σε ελεγχόμενες διερευνητικές μελέτες, όμως τα αποτελέσματα που ακολούθησαν την εφαρμογή της την συνέδεσαν απόλυτα με την πρόληψη του καρκίνου της μήτρας1.

Έως τώρα υπήρχε ελάχιστη κατανόηση των περιορισμών της μεθόδου, όμως τώρα οι επιστήμονες γνωρίζουν ότι η μέθοδος της συμβατικής κυτταρολογίας στερείται ευαισθησίας, ειδικότητας, αξιοπιστίας και επαναληψιμότητας2. Οι αναλύσεις σχετικών ερευνών έχουν δείξει συστηματικά ότι στις μισές στον αριθμό γυναίκες που φέρουν ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση, η εξέταση του συμβατικού κολποτραχηλικού επιχρίσματός τους θα δείξει τουλάχιστον μια φορά ψευδο-αρνητικό αποτελέσματα3-5. Η επιτυχία του πρωτοβάθμιου ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων οφείλεται στον

Η

2

τακτικό ανά διαστήματα επανέλεγχο των γυναικών, πράγμα που αντισταθμίζει την χαμηλή ευαισθησία που έχει το συμβατικό τεστ Παπανικολάου. Τα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα ήταν πάντα θέμα όσον αφορά τα επιχρίσματα γυναικολογικής κυτταρολογίας. Μια ακριβής μέθοδος «απαιτεί», αν υπάρχουν μη φυσιολογικά κύτταρα, αυτά να συλλεχθούν και να μεταφερθούν από τον τράχηλο της μήτρας στην αντικειμενοφόρο πλάκα ώστε στην συνέχεια να αξιολογηθούν στο μικροσκόπιο. Διάφορες έρευνες έχουν αναλύσει τα ποσοστά ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων της συμβατικής μεθόδου, άλλα δείχνουν χαμηλά ποσοστά και άλλα υψηλά ποσοστά, πιθανώς η αλήθεια να βρίσκεται κάπου ενδιάμεσα. Βάση μεταναλύσεων θεωρείται ότι διεθνώς τα ποσοστά ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων απαντούν στο 50% των περιπτώσεων6. Οι πιθανοί λόγοι ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων φαίνονται στον πίνακα 1.1.

Το παρασκεύασμα στερείται άτυπων κυττάρων (ανακριβής δειγματοληψία), αυτό απαντά στο 60-70% των περιπτώσεων.

Το επίχρισμα φέρει άτυπα κύτταρα αλλά δεν μπορούν να προσδιοριστούν λόγω κακής μονιμοποίησης και/ή επικάλυψης από βλέννη, αίμα ή άλλων κυττάρων.

Το επίχρισμα φέρει άτυπα κύτταρα αλλά δεν μπορούν να διαγνωστούν από τους εξεταστές (σφάλμα ελέγχου).

Το επίχρισμα φέρει άτυπα κύτταρα τα οποία εντοπίζονται από τους εξεταστές αλλά δεν ερμηνεύονται σωστά.

Πίνακας 1.1 Πιθανές αιτίες ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων στα συμβατικά κολποτραχηλικά επιχρίσματα.

Η βελτίωση της ευαισθησίας και της ειδικότητας του συμβατικού προσυμπτωματικού ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων έπρεπε να αρχίσει από την βελτίωση στην τεχνική συλλογής δείγματος ώστε να παρασκευάζονται καλύτερης ποιότητας δείγματα, καλύτερα παρασκευάσματα για πιο εύκολη και γρήγορη μικροσκοπική αξιολόγηση, τα οποία και θα παρέχουν την δυνατότητα εφαρμογής επιπλέον εξετάσεων. Προτάθηκε ότι οι περιορισμοί των συμβατικών επιχρισμάτων θα μπορούσαν να αντιμετωπιστούν με την χρήση της τεχνολογίας υγρής φάσης, ενώ τα σφάλματα κατά την εξέτασή τους θα μπορούσαν να αντιμετωπιστούν με την χρήση υπολογιστικών αυτοματοποιημένων συσκευών ελέγχου.

3

1.1 Τι είναι η τεχνολογία της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης;

Ενώ τις δεκαετίες του ’70 και ’80 η αυτοματοποίηση στην ανάλυση των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων έκανε την εμφάνισή του στις ΗΠΑ κα στην Ευρώπη και ενώ διεξαγόντουσαν πολλά προγράμματα για την χρηματοδότηση και την ανάπτυξή τους, έγινε ξεκάθαρο ότι εάν έπρεπε να χρησιμοποιηθούν αυτές οι μηχανές, παράλληλα τα κυτταρολογικά παρασκευάσματα έπρεπε να πληρούν ορισμένα κριτήρια (πίνακας 1.2). Η διαπίστωση αυτή οδήγησε στην ανάπτυξη τεχνικών μεμονωμένων κυττάρων και στον διαχωρισμό των κυττάρων και καθαρισμού του υποστρώματος, που αποτελούσαν τα βασικά βήματα της υγρής κυτταρολογία*. Ο ιδανικός σκοπός της τεχνικής μεμονωμένων κυττάρων (μονοδιασπορά) είναι η παραγωγή μεμονωμένων κυττάρων σε μια οπτική στοιβάδα (μονοστιβάδα), αποφεύγοντας έτσι τον σχηματισμό κυτταρικών συστάδων.

Προϋποθέσεις Τεχνικές λύσεις

Τα κύτταρα να παρουσιάζονται μεμονωμένα Τα κύτταρα να παρουσιάζονται σε ένα οπτικό

επίπεδο (μονοστιβάδα)

Διαχωρισμός μεμονωμένων

κυττάρων (μονοδιασπορά)

Να υπάρχει υψηλή αντίθεση μεταξύ πυρήνα, κυτταροπλάσματος και υποστρώματος

Το παρασκεύασμα να παρουσιάζει καθαρό υπόστρωμα

Διαχωρισμός κυττάρων και καθαρό υπόστρωμα

Πίνακας 1.2 Προϋποθέσεις κυτταρολογικών παρασκευασμάτων για να χρησιμοποιηθούν

στην αυτοματοποίηση.

Ενώ ο όρος «μονοδιασπορά διαχωρισμένων κυττάρων» επικεντρώνεται στην τοποθέτηση μεμονωμένων κυττάρων στο επίχρισμα, η έκφραση «παρασκευάσματα μονοστιβάδωσης» τονίζει το γεγονός ότι τα κύτταρα βρίσκονται σε ένα επίπεδο. Ωστόσο η τεχνολογία της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης δεν πληροί ακόμα αυτά τα κριτήρια: τα κύτταρα στα παρασκευάσματα κυτταρολογίας υγρής φάσης έχουν, θα έλεγε κανείς, μια πιο τρισδιάστατη δομή συγκρίνοντας με την συμβατική κυτταρολογία, γεγονός που απαιτεί από τον εξεταστή να επανεστιάζει συνεχώς κατά την ανάλυση του επιχρίσματος. Επομένως είναι συνεπές να

* Συνώνυμα της «υγρής κυτταρολογίας» είναι «κυτταρολογία λεπτής επίστρωσης, μονοστρωματική κυτταρολογία, κυτταρολογία υγρής φάσης».

4

αντικατασταθεί ο όρος «κυτταρολογία μονοστιβάδας» με τον όρο «κυτταρολογία λεπτής επίστρωσης ή υγρής φάσης».

Η ΚΥΦ αποτέλεσε το υπόβαθρο για την ανάπτυξη αυτοματοποιημένων συστημάτων ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων καθώς εκπληρούσαι όλα τα κριτήρια ώστε τα συστήματα αυτά να χρησιμοποιηθούν στα κυτταρολογικά εργαστήρια. Όμως η απόδοση της ΚΥΦ ήταν τόσο καλή σε κλινικές δοκιμές έναντι της συμβατικής κυτταρολογίας, που βρήκε μια θέση στην αγορά ανεξάρτητα από τα συστήματα αυτοματοποίησης. Αν και υπάρχουν εξαιρέσεις7, η πλειοψηφία των ερευνών με ομότιμη αναθεώρηση, έδειξαν αυξημένα ποσοστά ανίχνευσης αλλοιώσεων χαμηλού βαθμού (LSIL) ή υψηλού βαθμού (HSIL) με την χρήση της ΚΥΦ8. Ενώ ο διάλογος περί αυξημένης ανίχνευσης νόσου με την μέθοδο ΚΥΦ συνεχίζεται μέχρι και σήμερα, παρόλα αυτά η ΚΥΦ προσφέρει αδιάσειστα πλεονεκτήματα έναντι της συμβατικής μεθόδου: όπως η δυνατότητα να προετοιμαστούν διπλές διαφάνειες ακόμα και παρασκευάσματα κύβων παραφίνης από το υπολειπόμενο δείγμα, η επιλογή να αφαιρεθεί μια μικρή ποσότητα από το διάλυμα για την εκτέλεση συμπληρωματικών εξετάσεων ή μοριακών εξετάσεων όπως ανίχνευση HPV, χλαμύδια, γονόρροια, αλλά και άλλους μοριακούς δείκτες ανίχνευσης νεοπλασμάτων, δυνατότητα χρήσης αυτοματοποιημένων συστημάτων ελέγχου, καθώς το υπόστρωμα των επιχρισμάτων εμφανίζεται καθαρό, και η παραγωγή παρασκευασμάτων με μια λεπτή στρώση κυττάρων, χαρακτηριστικό που βοηθάει πολύ τους κυτταροτεχνολόγους και κυτταροπαθολόγους στον έλεγχο τον επιχρισμάτων, σε αντίθεση με τα συμβατικά παρασκευάσματα.

1.2 Συστήματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης

Αρχές της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης (ΚΥΦ) για την προετοιμασία των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων

Ένα δείγμα κυττάρων συλλέγεται από τον τράχηλο με τον κανονικό τρόπο

χρησιμοποιώντας μια σπάτουλα ή ψήκτρα ως συσκευή δειγματοληψίας Το δείγμα μεταφέρεται σε ένα υγρό με συντηρητικό μέσο μεταφοράς Τα κύτταρα διασκορπίζονται στο υγρό Ένα υποπολλαπλάσιο του διαθέσιμου υλικού επιλέγεται για την επεξεργασία Τα κύτταρα χωρίζονται με φυγοκέντρηση ή φιλτράρισμα και κατατίθενται σε μια

αντικειμενοφόρο πλάκα ως λεπτό στρώμα μιας στιβάδας κυττάρων με ιζηματοποίηση ή εφαρμογή πίεσης

Τα επιχρίσματα βάφονται επικαλύπτονται και ετοιμάζονται για τν μικροσκόπηση

5

Ένα σημαντικό ορόσημα στην ιστορία του τεστ Παπανικολάου αποτέλεσε το 1996 όταν ο αμερικανικός Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων (US Food and Drug Administration, FDA) ενέκρινε το ThinPrep Pap test (Hologic, Marlborough, Mass.) ως μια εναλλακτική μέθοδος για τον έλεγχο των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Τρία χρόνια μετά ακολούθησε η έγκριση από τον FDA της μεθόδου SurePath Pap Test (τότε γνωστή ως AutoCyte Prep; BD TriPath, Burlington, NC). Η τελευταία τεχνολογία ΚΥΦ που εγκρίθηκε από τον FDA ήταν η MonoPrep (MonoGen, Inc. Lincolnshire, IL) το 2006. Τα συστήματα που χρησιμοποιούνται ευρέως και για τα οποία έχουν διεξαχθεί όλες σχεδόν οι έρευνες για την αξιολόγηση της τεχνολογίας ΚΥΦ, είναι το σύστημα ThinPrep και το σύστημα SurePath. Η διαδικασία συλλογής του δείγματος παραμένει ίδια. Η συσκευή που χρησιμοποιείται για την δειγματοληψία είτε ξεπλένεται μέσα σε υγρό μέσο μονιμοποίησης και συντήρησης (ThinPrep), είτε η αποσπώμενη κεφαλή της συσκευής τοποθετείται μέσα στο υγρό (SurePath). Τα υγρά είναι ρυθμιστικά διαλύματα κυττάρων με βάση την αλκοόλη καθώς ο ρόλος τους είναι να αποτελούν μέσο μεταφοράς των κυττάρων (συντηρητικό μέσο) και να μονιμοποιούν τα κύτταρα (μέσο μονιμοποίησης).

Στόχος της κυτταρολογίας υγρής φάσης είναι: η συλλογή ολόκληρου του αποφολιδωτικού υλικού για κυτταρολογική

εξέταση να συμπεριλαμβάνει μέθοδο αξιολόγησης κυτταροβρίθειας ως μέτρο

διασφάλισης ποιότητας να βελτιστοποιήσει την οπτική μορφολογική εξέταση μέσω της

βελτιωμένης παρουσίασης του κυτταρικού υλικού να πληροί τα κριτήρια ώστε να είναι δυνατή η εφαρμογή της

αυτοματοποίησης στον πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων

να αποθηκεύει προσωρινά το κυτταρικό υλικό για περεταίρω μορφολογική και μη-μορφολογική εξέταση

να «προσφέρει» στους τεχνολόγους και παθολόγους μια ασφαλέστερη και λιγότερο κουραστική εργασία, όσον αφορά την εξάλειψη στοιχείων του επιχρίσματος που κάνουν την διάγνωση πιο δύσκολη (π.χ. φλεγμονώδη κύτταρα, βλέννα, αίμα, ινώδες).

1.3 Εφαρμογή της κυτταρολογίας υγρής φάσης και στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία

Η κυτταρολογία υγρής φάσης έχει βρει μια σπουδαία θέση ως διαγνωστική μέθοδος στην γυναικολογική κυτταρολογία αντικαθιστώντας σε πολλές χώρες του πλανήτη το συμβατικό τεστ Παπανικολάου. Ωστόσο η

6

χρήση της στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία, αν και έχει εξαπλωθεί αρκετά, φέρει πολλές διφορούμενες απόψεις.

Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την επεξεργασία μη-γυναικολογικών δειγμάτων με την μέθοδο ΚΥΦ είναι η ThinPrep και η SurePath, με την ThinPrep να έχει επικρατήσει κατά πολύ της άλλης τεχνολογίας. Η ThinPrep έχει εγκριθεί το 1991 από το FDA για την χρήσης της στα μη-γυναικολογικά δείγματα: για δείγματα που προέρχονται είτε από εκπλύσεις οργάνων, είτε από υγρά του σώματος, είτε από αναρρόφηση μέσω λεπτής βελόνης κ. ά. Η τεχνολογία αυτή βρέθηκε να είναι ισοδύναμη με τις άλλες ήδη υπάρχουσες τεχνολογίες (Cytospin, Millipore), οι οποίες χρησιμοποιούνταν ευρέως για την επεξεργασία δειγμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας. Για αυτόν τον λόγο δεν απαιτήθηκαν και δεν διενεργήθηκαν έρευνες που να αξιολογήσουν και να επικυρώσουν την αποτελεσματικότητα της μεθόδου πριν την υιοθέτησή της από τα εργαστήρια. Αντιθέτως από ότι έγινε στην γυναικολογική κυτταρολογία που ο πήχης ήταν υψηλότερα εξαιτίας της δημοσίευσης δύο άρθρων στο Wall Street Journal, που είχαν μεγάλη απήχηση από το κοινό, και τα οποία αποκάλυπταν ανησυχητικά ζητήματα σχετικά με την γυναικολογική κυτταρολογία9, με αποτέλεσμα να διενεργηθούν μια πληθώρα ερευνών πριν την έγκριση της μεθόδου από τον FDA για την εισαγωγή της στην γυναικολογική κυτταρολογία.

Τα τελευταία 10 χρόνια η ΚΥΦ έχει χρησιμοποιηθεί όλο και περισσότερο για την επεξεργασία ποικίλων δειγμάτων στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία. Σε μερικά ιδρύματα η ΚΥΦ έχει συνδυαστεί με άλλες τεχνικές παρασκευάσματος όπως οι κύβοι παραφίνης, και σε άλλα ιδρύματα, αν και δεν είναι πολλά, η ΚΥΦ αποτελεί την μόνη διαγνωστική μέθοδο. Από διάφορες έρευνες και ανακοινώσεις σε επιστημονικά συνέδρια9 έχει γίνει ξεκάθαρο ότι οι γνώμες διίστανται όσον αφορά την χρήση της ΚΥΦ έναντι της συμβατικής μεθόδου στα κυτταρολογικά δείγματα, με θερμούς υποστηρικτές και των δύο πλευρών. Η επιλογή της τεχνικής που θα εφαρμόσει το κυτταρολογικό εργαστήριο επηρεάζει τόσο τον πρακτικό χειρισμό του δείγματος από την πρώτη στιγμή που συλλέγεται, έως την επεξεργασία του στο εργαστήριο και την μικροσκοπική εξέταση του, όσο και την διαγνωστική μεθοδολογία που θα ακολουθείται για την εξέταση του προκύπτοντος επιχρίσματος. Τα πλεονεκτήματα που προσφέρει η ΚΥΦ στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία είναι ίδια με αυτά που περιγράφτηκαν πιο πάνω και αφορούσαν τα κολποτραχηλικά επιχρίσματα, δηλαδή η καλή μονιμοποίηση και διατήρηση των κυττάρων, η απουσία αίματος, η δυνατότητα παρασκευής πολλαπλών δειγμάτων από το ίδιο δείγμα, και επίσης το γεγονός ότι δεν απαιτείται ο κυτταροτεχνολόγος ή κυτταροπαθολόγων να εξασκηθεί στην τεχνική επίστρωσης. Οι υποστηρικτές της ΚΥΦ διαφωνούν με τις απόψεις της άλλης ομάδας ότι δεν υπάρχουν αρκετά δημοσιευμένα στοιχεία που να δηλώνουν την υπεροχής της ΚΥΦ έναντι της συμβατικής κυτταρολογίας. Από την άλλη, οι υποστηρικτές της συμβατικής κυτταρολογίας δηλώνουν ότι μερικά σημαντικά χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνταν ανέκαθεν για την αξιολόγηση καλοηθών και κακοηθών ευρημάτων έχουν μειωθεί αρκετά ή δεν είναι διαθέσιμα για να αξιολογηθούν σε επιχρίσματα ΚΥΦ, διακυβεύοντας έτσι την διαγνωστική ακρίβεια10-12. Αν και η ΚΥΦ φέρει τεράστιες δυνατότητες και πλεονεκτήματα

7

στην επεξεργασία μη-γυναικολογικών δειγμάτων, η θέσπιση διαγνωστικών μορφολογικών κριτηρίων αποτελεί σημαντικό στοιχείο για την πλήρη αποδοχή του.

«Η επιστήμη της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο. Στοιχηματίζω ότι ο Γεώργιος Παπανικολάου θα ήταν ο μεγαλύτερος υποστηρικτής του.» (Leiman 2007)13

8

22 ΤΤΕΕΧΧΝΝΙΙΚΚΗΗ ΤΤΗΗΣΣ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ

ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ

2.1 Παρασκευή γυναικολογικών δειγμάτων

Η λήψη γυναικολογικών δειγμάτων γίνεται με σκοπό την ανίχνευση καρκινικών και προκαρκινικών αλλοιώσεων καθώς και άλλων βλαβών στον τράχηλο της μήτρας. Ο τρόπος δειγματοληψίας και επεξεργασίας δείγματος κυτταρολογίας υγρής φάσης, όπως παρουσιάζεται παρακάτω, περιγράφεται στο εγχειρίδιο «Εγκεκριμένες Κατευθυντήριες Γραμμές της Τεχνικής Παπανικολάου, 2η έκδοση»*. Γενικά οι κατευθυντήριες γραμμές αναφέρουν ότι το δείγμα που λαμβάνεται δεν πρέπει να περιέχει αίμα, βλέννη, φλεγμονώδεις εκκρίσεις ή λιπαντική ουσία.

2.1.1 Συσκευές δειγματοληψίας

Για την κυτταρολογική εξέταση του τραχήλου της μήτρας απαιτείται

δείγμα από τον εξωτράχηλο και τον ενδοτράχηλο, το οποίο λαμβάνεται με τις απαραίτητες συσκευές. Παραδοσιακά, η λήψη δειγμάτων για την παρασκευή επιχρισμάτων Παπανικολάου γινόταν με μια ξύλινη σπάτουλα, γνωστή ως σπάτουλα Ayre. Στην συνέχεια υιοθετήθηκε η μέθοδος συνδυασμού σπάτουλας Ayre, για την λήψη κυτταρολογικού υλικού από τον εξωτράχηλο, και κωνικής βούρτσας, για την λήψη κυτταρολογικού υλικού από τον ενδοτράχηλο (εικόνα 2.1 Α). Μια παραλλαγή της σπάτουλας Ayre είναι η σπάτουλα Aylesby της οποίας το ένα άκρο προεξέχει πιο πολύ και σχηματίζει ελαφρώς μια γωνία με τον κεντρικό άξονα της σπάτουλας. Η

* Ινστιτούτο Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων, Έγγραφο GP15-A2 (CLSI Document

GP15-A2). «Papanicolaou Technique Approved Guidelines - 2nd

edition».

9

καμπύλη που σχηματίζεται μεταξύ των δύο άκρων της είναι πιο μεγάλη σε σχέση με την σπάτουλα Ayre. Την τελευταία δεκαετία κυκλοφόρησε στην αγορά μια συσκευή η οποία συνδυάζει την χρήση της σπάτουλας και της βούρτσας για την λήψη ενδοτραχηλικού και εξωτραχηλικού κυτταρολογικού υλικού. Η Cervex brush (εικόνα 2.1 Β), όπως ονομάζεται, είναι μια συσκευή που μοιάζει με σκούπα της οποίας οι κεντρικές τρίχες είναι πιο μακριές, ώστε να εισέρχονται στην ενδοτραχηλική κοιλότητα, ενώ παράλληλα οι ακριανές τρίχες είναι πιο κοντές κατάλληλα σχεδιασμένες ώστε να εφάπτονται στην εξωτραχηλική επιφάνεια (ζώνη μετάπτωσης)(εικόνα 2.2). Η συσκευή αυτή συστήνεται για την λήψη δειγμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης, κατάλληλος όμως θεωρείται επίσης και ο κλασικός τρόπος συνδυασμού πλαστικής σπάτουλας και βούρτσας14. Για το σύστημα SurePath χρησιμοποιείται μόνο συσκευή Cervex broom με αποσπώμενη κεφαλή. Αυτό που πρέπει να τονιστεί είναι ότι η δειγματοληψία για κυτταρολογία υγρής φάσης πρέπει να γίνεται πάντα με πλαστικές συσκευές καθώς θεωρείται ότι η ξύλινη σπάτουλα μειώνει την ευαισθησία της ΚΥΦ λόγω των απορροφητικών ιδιοτήτων του ξύλου15.

2.1.2 Λήψη δειγμάτων

Ο τρόπος δειγματοληψίας στην κυτταρολογία υγρής φάσης δεν διαφέρει γενικά από αυτόν που χρησιμοποιείται για την προετοιμασία συμβατικών επιχρισμάτων16. Με την βοήθεια του κολποδιαστολέα ανοίγονται τα τοιχώματα του κόλπου τόσο ώστε να υπάρχει μια πλήρης εικόνα του τραχήλου της μήτρας. Ο γυναικολόγος πριν προβεί στην λήψη του δείγματος παρατηρεί με γυμνό μάτι τον τράχηλο για την παρουσία ορατών αλλοιώσεων

Εικόνα 2.1 Α) σπάτουλα Ayre και βουρτσάκι Β) Cervex broom

10

ή βλάβες ελκωτικής μορφής που μπορεί να υποδεικνύουν διηθητικό καρκίνο του τραχήλου. Σε αυτή την περίπτωση πρέπει να ληφθεί δείγμα από την αλλοίωση και να γίνει κυτταρολογική αξιολόγηση χωριστά από το τεστ Παπ. Ο τρόπος λήψης του δείγματος για τεστ Παπ εξαρτάται από την συσκευή που χρησιμοποιείται. Αναλυτικά:

Σε περίπτωση που χρησιμοποιείται η συσκευή Cervex brush ενδοτραχηλικά και εξωτραχηλικά κύτταρα λαμβάνονται συγχρόνως καθώς οι μακριές κεντρικές τρίχες της σκούπας εισέρχονται στην ενδοτραχηλική κοιλότητα τόσο ώστε οι κοντές τρίχες να εφάπτονται πλήρως στην εξωτραχηλική επιφάνεια. Οι κοντές τρίχες στις άκρες τους είναι σχηματισμένες με τέτοιο τρόπο ώστε να συλλέγουν υλικό μόνο κατά την δεξιόστροφη περιστροφή της συσκευής. Η σκούπα περιστρέφεται πέντε φορές κατά 360ο συλλέγοντας συγχρόνως κύτταρα από τον ενδοτράχηλο (μονόστιβο κυλινδρικό επιθήλιο) και από τον εξωτράχηλο (πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο) εκεί που βρίσκεται η ζώνη μετάπτωσης η οποία έχει ιδιαίτερη σημασία διότι από αυτήν κατά κανόνα εξορμώνται οι αλλοιώσεις της κακοήθους εξαλλαγής του τραχηλικού επιθηλίου.

Όταν χρησιμοποιείται ο συνδυασμός σπάτουλας και ενδοτραχηλικής βούρτσας το πρώτο βήμα είναι να τοποθετηθεί η σπάτουλα σταθερά στον εξωτράχηλο με την μακριά προεξοχή να εισέρχεται ελάχιστα στην ενδοτραχηλική κοιλότητα. Στην συνέχεια η σπάτουλα περιστρέφεται κατά 360ο με δεξιόστροφη φορά και αφαιρείται. Κατά την λήψη ο γυναικολόγος πρέπει να είναι πολύ προσεκτικός καθώς ενώ περιστρέφεται η σπάτουλα είναι εύκολο να χαθεί η επαφή της με την επιφάνεια του τραχήλου ανά τμήματα, αυτό μπορεί να αποφευχθεί παρατηρώντας συνέχεια τον τράχηλο κατά την λήψη. Ύστερα

Εικόνα 2.2 Οι μακριές κεντρικές τρίχες της «σκούπας» εισέρχονται στην ενδοτραχηλική κοιλότητα και οι κοντές τρίχες εφάπτονται πλήρως στην εξωτραχηλική επιφάνεια. Κατά την περιστροφή της συλλέγονται ταυτόχρονα κύτταρα κυλινδρικού και πλακώδους επιθηλίου

11

λαμβάνεται δείγμα από την ενδοτραχηλική κοιλότητα χρησιμοποιώντας την ειδική κωνική βούρτσα η οποία εισάγεται στην ενδοτραχηλική κοιλότητα κατά τα 2/3 και περιστρέφεται δεξιόστροφα κατά 90-180ο. Με αυτή την περιστροφή λαμβάνεται επαρκές δείγμα και γενικά δεν προκαλεί αιμορραγία.

Από τις πολυάριθμες έρευνες που συγκρίνουν τα συμβατικά

παρασκευάσματα με τα παρασκευάσματα κυτταρολογίας υγρής φάσης και από την σχετική βιβλιογραφία είναι φανερό ότι οι συσκευές δειγματοληψίας αποτελούν ένα σημαντικό κομμάτι της διαδικασία παρασκευής επιχρισμάτων. Μια μετανάλυση των Martin-Hirsch and colleagues15 κατέληξε στο συμπέρασμα ότι η ευρέως μέχρι τότε χρησιμοποιημένη Ayre σπάτουλα είναι η λιγότερο αποτελεσματική συσκευή δειγματοληψίας τραχηλικού δείγματος και πρέπει να αντικατασταθεί από την Aylesby σπάτουλα (με επεκταμένο άκρο). Από την μετανάλυση προέκυψε ότι η Aylesby σπάτουλα σε σύγκριση με την Ayre σπάτουλα είχε καλύτερη επίδοση όσον αφορά την συλλογή ενδοτραχηλικού δείγματος, σχετίστηκε με υψηλότερα ποσοστά ανίχνευσης δυσκαρύωσης και λιγότερο αριθμό μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων. Στα περισσότερα μέρη του Ηνωμένου Βασιλείου η σπάτουλα Ayre έχει αντικατασταθεί με την Aylesby. Το μεγαλύτερο ποσοστό των πρόσφατων ερευνών που έχουν διεξαχθεί χρησιμοποίησαν για συσκευή δειγματοληψίας την Cervex brush, ελάχιστες ήταν αυτές που χρησιμοποίησαν την σπάτουλα Ayre.

Από ‘δω και πέρα η επεξεργασία του δείγματος διαφέρει ριζικά από αυτήν της συμβατικής μεθόδου. Στην συμβατική κυτταρολογία το δείγμα επιστρώνεται σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα και στην συνέχεια μονιμοποιείται με ειδικό σπρέι, στην κυτταρολογία υγρής φάσης η συσκευή δειγματοληψίας μεταφέρεται σε ένα φιαλίδιο με υγρό μέσο συντήρησης και μεταφοράς το οποίο στην συνέχεια αποστέλλεται στο εργαστήριο για την παρασκευή επιχρισμάτων.

2.1.3 Διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς

Στο σύστημα ThinPrep το διάλυμα συντήρησης που χρησιμοποιείται είναι το PreservCyt® (Hologic™ Inc, πρώην Cytyc). Το PreservCyt (εικόνα 2.3) είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα με βάση την μεθανόλη σχεδιασμένο να συντηρεί τα κύτταρα κατά την μεταφορά και την προετοιμασία των παρασκευασμάτων και έχει αιμολυτικές και βλεννολυτικές ιδιότητες. Τα φιαλίδια περιέχουν 20ml συντηρητικού υγρού του οποίου η σύσταση είναι

κατοχυρωμένη άρα και άγνωστη. Τα φιαλίδια αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 15-30οC μέχρι την ημερομηνία λήξεως που αναγράφεται πάνω στο φιαλίδιο.

Εικόνα 2.3 Φιαλίδιο με διάλυμα

PreservCyt®

12

Όταν το υγρό περιέχει κυτταρολογικό υλικό που προορίζεται για ThinPrep Pap τεστ, τα φιαλίδια αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 15-30οC για έξι εβδομάδες. Αν το κυτταρολογικό υλικό πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των Chlamydia trachomatis και Neisseria gonorrhea με την μέθοδο Roche Diagnostics COBAS AMPLICOR CT/NG, τότε τα φιαλίδια αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 4-25οC για έξι εβδομάδες17.

Στο σύστημα SurePath χρησιμοποιείται το SurePath® Preservative Fluid (TriPath, BD Diagnostics) (εικόνα 2.4). Το διάλυμα αυτό είναι επίσης

ένα ρυθμιστικό διάλυμα με βάση την αιθανόλη που χρησιμεύει ως αντιβακτηριδιακό μέσο μεταφοράς και συντήρησης γυναικολογικών δειγμάτων. Τα φιαλίδια αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 15-30οC μέχρι την ημερομηνία λήξεως που αναγράφεται πάνω στην συσκευασία. Όταν το υγρό περιέχει κυτταρολογικό υλικό τότε τα φιαλίδια διατηρούνται για έξι μήνες σε θερμοκρασίες 2-10οC ή για τέσσερις εβδομάδες σε θερμοκρασίες 15-30οC. Αν το κυτταρολογικό υλικό πρόκειται να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των

Chlamydia trachomatis με την μέθοδο BD ProbeTex™ CT Qx και Neisseria gonorrhea με την μέθοδο GC Qx Amplified DNA Assays, τότε τα δείγματα αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 2-30οC για περίπου 30 ημέρες18.

2.1.4 Προετοιμασία δειγμάτων

Εικόνα 2.4 Φιαλίδιο με συντηρητικό

διάλυμα SurePath®

Εικόνα 2.5 Α) Η σκούπα ξεπλένεται καλά μέσα στο φιαλίδιο ThinPrep ώστε να αποχωριστεί όλο το κυτταρολογικό υλικό. Β) Η αποσπώμενη κεφαλή τοποθετείται στο φιαλίδιο SurePath

13

Η περαιτέρω επεξεργασία του δείγματος είναι ανάλογη με το σύστημα κυτταρολογίας υγρής φάσης που χρησιμοποιεί το κάθε εργαστήριο. Για το σύστημα ThinPrep, αμέσως μετά την λήψη η σκούπα (ή η σπάτουλα/βουρτσάκι) μεταφέρεται γρήγορα στο φιαλίδιο με το διάλυμα PreservCyt όπου πιέζεται δυνατά στον πάτο τόσο ώστε οι τρίχες της να λυγίσουν και να απελευθερωθεί όλη η ποσότητα του υλικού στο υγρό (εικόνα 2.5 Α), αυτό γίνεται 15-20 φορές. Στην συνέχεια η σκούπα στροβιλίζεται απότομα μέσα στο φιαλίδιο για να απελευθερωθεί το υπόλοιπο υλικό. Πριν απορριφθεί η συσκευή δειγματοληψίας ελέγχεται πάντα για τυχόν υπολείμματα υλικού, εάν αυτά τα υπολείμματα υπάρχουν τότε επαναλαμβάνονται τα βήματα από την αρχή.

Για το σύστημα SurePath, η αποσπώμενη κεφαλή της σκούπας ελευθερώνεται μέσα στο φιαλίδιο με το διάλυμα συντήρησης SurePath® Preservative Fluid (εικόνα 2.5 Β). Η κεφαλή της συσκευής δειγματοληψίας δεν αφαιρείται ποτέ από το φιαλίδιο, ούτε κατά την διάρκεια επεξεργασίας του δείγματος.

Στην συνέχεια το φιαλίδιο, που πλέον περιέχει το δείγμα, σφραγίζεται καλά και αφού αναγραφούν τα στοιχεία του ασθενή αποστέλλεται στο εργαστήριο μαζί με το παραπεμπτικό μέσα σε ειδική πλαστική σακούλα16.

2.1.5 Επεξεργασία δειγμάτων και παρασκευή επιχρισμάτων

Μέχρι σήμερα έχουν εγκριθεί από τον Οργανισμό Διαχείρισης Τροφίμων και Φαρμάκων (Food and Drug Administration, FDA) των Ηνωμένων Πολιτειών τρία συστήματα κατάλληλα για την προετοιμασία κολποτραχηλικού υλικού με την μέθοδο της ΚΥΦ: το ημιαυτόματο σύστημα ThinPrep 2000 Processor, το πιο ολοκληρωμένο αυτοματοποιημένο σύστημα ThinPrep 3000 Processor, κατασκευασμένα από την εταιρεία Hologic (MA, ΗΠΑ), και επιπλέον το σύστημα BD PrepStain™ Slide Processor κατασκευασμένο από την TriPath Imaging Inc. (NJ, USA).

14

2.1.5.1 ThinPrep 2000 Processor (Hologic)

Η εικόνα 2.8 παρουσιάζει τα αυτοματοποιημένα βήματα της μεθόδου ThinPrep που πραγματοποιούνται στο ThinPrep 2000 Processor (εικόνα 2.6). Στο εργαστήριο, το φιαλίδιο με το δείγμα τοποθετείται στο ThinPrep (TP) Processor μαζί με μια αντικειμενοφόρο πλάκα και ένα κυλινδρικό φίλτρο (TransCyt filter). Το ΤΡ2000 Processor τίθεται σε λειτουργία, τότε το φίλτρο εισέρχεται μηχανικά στο φιαλίδιο με το δείγμα και αρχίζει να περιστρέφεται [ή περιστρέφεται το φιαλίδιο (TP3000)], με αυτόν τον τρόπο δημιουργούνται ρεύματα μέσα στο υγρό τα οποία είναι μεν αρκετά δυνατά ώστε το κυτταρολογικό υλικό να διασκορπιστεί τυχαία και να διαχωριστούν αίμα, μύκητες και βλέννη αλλά παράλληλα και τόσο ήπια που να μην αλλοιωθεί η μορφολογική εικόνα των κυττάρων. Μετά την τυχαία διασκόρπιση των κυττάρων ακολουθεί το φιλτράρισμα. Το κάτω άκρο του κυλίνδρου καλύπτεται από ένα φίλτρο με πολύ μικρούς πόρους και στο άνω άκρο του υπάρχει σύστημα αναρρόφησης. Καθώς το υγρό αναρροφάται οι πόροι του φίλτρου είναι αρκετά μεγάλοι ώστε να επιτρέψουν στα ουδετερόφιλα και στα ερυθροκύτταρα να διαπεράσουν την μεμβράνη αλλά αρκετά μικροί για να μην την διαπεράσουν τα επιθηλιακά κύτταρα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τα επιθηλιακά κύτταρα να φράσουν τους πόρους του φίλτρου και όταν ο επεξεργαστής εντοπίσει ότι όλοι οι πόροι έχουν φραχτεί τότε σταματάει την διαδικασία του φιλτραρίσματος. Το κυλινδρικό φίλτρο αποσύρεται από το φιαλίδιο, περιστρέφεται μερικώς και απορρίπτει το υλικό που έχει φιλτράρει στο μπουκάλι των αποβλήτων, και στην συνέχεια περιστρέφεται προς τα

Εικόνα 2.6 a) ThinPrep 2000 Processor. b) 1.δοχείο με υγρό μονιμοποίησης, 2.βάση τοποθέτησης πλακιδίου, 3.εξάρτημα που περιστρέφει το φίλτρο, 4.φίλτρο TransCyt, 5.βάση φιαλιδίου.

15

πάνω ώστε το κάτω άκρο του να κοιτάει προς την αντικειμενοφόρο πλάκα. Τότε ασκείται ελαφριά πίεση αέρα στο φίλτρο για να πραγματοποιηθεί η μεταφορά των κυττάρων από το φίλτρο στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Λόγω των φυσικών ιδιοτήτων των κυττάρων και των φυσικών ηλεκτροχημικών ιδιοτήτων των ThinPrep αντικειμενοφόρων πλακών τα κύτταρα παρουσιάζουν μία τάση προσκόλλησης προς την αντικειμενοφόρο πλάκα και έτσι μια μονοεπίπεδη, λεπτή στοιβάδα κυττάρων κυκλικού σχήματος και διαμέτρου 20mm (εικόνα 2.7) μεταφέρεται στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Μόλις ολοκληρωθεί η διαδικασία μεταφοράς των κυττάρων το φίλτρο επιστρέφει στην αρχική του θέση και η αντικειμενοφόρος πλάκα μεταφέρεται αυτόματα στο φιαλίδιο με το υγρό μονιμοποίησης. Ύστερα το πλακίδιο αφαιρείται από τον επεξεργαστή και είναι έτοιμο να εφαρμοστεί χρώση Παπανικολάου.

Η παρασκευαστική διαδικασία με τον ΤΡ2000 διαρκεί περίπου 70sec/επίχρισμα1 και μπορεί να παρασκευάσει ένα επίχρισμα την φορά. Το σύστημα ΤΡ3000 είναι ικανό να προετοιμάσει μια σειρά από 80 δείγματα ταυτόχρονα. Η εταιρεία Hologic επίσης έχει βγάλει το σύστημα ΤΡ5000 το οποίο έχει την δυνατότητα να παρασκευάσει είτε 20 δείγματα γυναικολογικής ή μη γυναικολογικής κυτταρολογίας ταυτόχρονα είτε να παρασκευάσει από το ίδιο δείγμα μέχρι 10 διαφορετικά επιχρίσματα19, ανάλογα με τις διαγνωστικές ανάγκες.

Μόνο μια μικρή ποσότητα χρησιμοποιείται κάθε φορά για την

παρασκευή επιχρίσματος. Το υπόλοιπο υλικό που έχει απομείνει στο φιαλίδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για επιπλέον επιχρίσματα, για παρασκευή κύβων παραφίνης είτε για μοριακές διαγνωστικές εξετάσεις (π.χ. HPV, χλαμύδια, γονόρροια) για το οποίο και έχει εγκριθεί από τον FDA.

Εικόνα 2.7 ThinPrep παρασκεύασμα. Η λεπτή στιβάδα κυττάρων έχει κυκλικό σχήμα διαμέτρου 20 mm.

16

Εικόνα 2.8 Αυτοματοποιημένα βήματα του ThinPrep 2000 Processor κατά την τεχνική ThinPrep.

2.1.5.2 BD PrepStain™ Slide Processor (Becton Dickinson)

Το σύστημα SurePath χρησιμοποιεί μια τεχνολογία διαχωρισμού του υλικού σύμφωνα με την διαβάθμιση της πυκνότητας. Στην αρχή το δείγμα αναμειγνύεται στο Vortex ώστε το κυτταρολογικό υλικό να διασκορπιστεί και να μην υπάρχουν συστάδες κυττάρων. Στην συνέχεια τα φιαλίδια μεταφέρονται στο BD PrepMate™ System (εικόνα 2.9) το οποίο είναι ένα αυτοματοποιημένο εξάρτημα του BD PrepStain™ Slide Processor (εικόνα 2.11), η χρήση του οποίου είναι προαιρετική, όπου το κυτταρολογικό υλικό αναμιγνύεται μέσα στο φιαλίδιο και το σύστημα μεταφέρει αυτόματα μια ποσότητα 2ml σε σωληνάρια φυγοκέντρησης. Το BD PrepMate™ System μπορεί να επεξεργαστεί μέχρι 12 δείγματα σε λιγότερο από 4min. Στην συνέχεια τα δείγματα μεταφέρονται στην φυγόκεντρο όπου τα κύτταρα διαχωρίζονται σύμφωνα με το ειδικό τους βάρος. Τα κοκκιοκύτταρα, ερυθροκύτταρα και βλέννη, που έχουν χαμηλότερο

Εικόνα 2.9 BD PrepMate™ System

17

ειδικό βάρος από τα επιθηλιακά κύτταρα, αποτελούν το υπερκείμενο το οποίο και απορρίπτεται. Το ίζημα που δημιουργήθηκε φυγοκεντρείται, αναδεύεται στο Vortex και στην συνέχεια τα σωληνάρια τοποθετούνται στο BD PrepStain™ Slide Processor για την παρασκευή και χρώση των επιχρισμάτων. Μέσω αυτοματοποιημένου συστήματος παρασκευής και χρώσης επιχρισμάτων το BD PrepStain™ Slide Processor μεταφέρει το ίζημα από το σωληνάριο στον θάλαμο καθίζησης το οποίο είναι τοποθετημένο πάνω σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα (εικόνα 2.12). Στην συνέχεια, τα κύτταρα καθιζάνουν σε λεπτή στοιβάδα, το υπόλοιπο του υγρού απορρίπτεται και ακολουθεί η χρώση χρησιμοποιώντας μια παραλλαγή της μεθόδου Παπανικολάου.

Η τελική εικόνα του

επιχρίσματος είναι ένα κυκλικό σχήμα διαμέτρου 13mm που περιέχει κύτταρα σε μονοεπίπεδη στοιβάδα (εικόνα 2.10). Το BD PrepStain™ Slide Processor

μπορεί να επεξεργαστεί 92 επιχρίσματα σε 60min χωρίς την διαδικασία της χρώσης, ή 48 επιχρίσματα σε 60min εφαρμόζοντας την χρώση20.

Η χρώση αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι της επεξεργασίας του

επιχρίσματος SurePath στο BD PrepStain™ Slide Processor όπου χρησιμοποιείται μια παραλλαγή της μεθόδου χρώσης κατά Παπανικολάου. Κατά την χρώση των επιχρισμάτων με την τεχνική SurePath, τα κερατινοποιημένα κύτταρα, που αποτελούν έναν σημαντικό δείκτη αλλοίωσης

Εικόνα 2.11 BD PrepStain™ Slide Processor. Δεξιά της εικόνας φαίνονται σε μεγέθυνση οι θάλαμοι καθίζησης τα οποία βρίσκονται τοποθετημένα πάνω σε αντικειμενοφόρες πλάκες όπου καθιζάνουν τα κύτταρα.

Εικόνα 2.10 Παρασκεύασμα SurePath. Η διάμετρος της κυκλικής επιφάνειας είναι 13 mm.

18

που προκαλείται από την μόλυνση με HPV, δεν βάφονται καλά και αυτό οδήγησε σε μια χαμηλή βαθμολογία της τεχνικής χρώσης SurePath από ένα πρόγραμμα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας της τεχνικής που διεξάχθηκε στην Μεγάλη Βρετανία (TEQA) (NHS CSP 2004).

Αφού παρασκευαστεί το επίχρισμα, το υπολειπόμενο υλικό στο φιαλίδιο του SurePath Preservative Fluid μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή επιπλέον επιχρισμάτων ή για διάφορες συμπληρωματικές εξετάσεις όπως τυποποίηση HPV, εξετάσεις για χλαμύδια ή γονόρροια.

Εικόνα 2.12 Τα βήματα που ακολουθούνται κατά το ημι-αυτοματοποιημένο σύστημα SurePath. Τα βήματα 2 και 3 μπορεί να γίνουν είτε δια χειρός, είτε στο BD PrepMate system. Τα βήματα 5, 6 πραγματοποιούνται στο BD PrepStain™ Slide Processor.

19

Πίνακας 2.1 Χρώση κατά Παπανικολάου

# Διαδικασία Χρόνος Σχόλια

1 Αφαίρεση μονιμοποίησης με οινόπνευμα 50%

2min Εάν η αφαίρεση του μονιμοποιητικού αποτύχει αυτό θα επηρεάσει την εικόνα των κυττάρων τα οποία θα έχουν επισκιαστεί

2 Εμβάπτιση σε νερό 1min Ενυδάτωση κυττάρων

3 Χρώση αιματοξυλίνης Harris 5 min

4 Εμβάπτιση σε νερό 2 min Απομάκρυνση περίσσειας αιματοξυλίνης

5 Διαφοροποίηση σε 0.5% υδατικού διαλύματος υδροχλωρικού οξέος

10-20 sec

6 Νερό βρύσης 2 min

7 Υποκατάστατο νερό βρύσης Scott

1 min Το καφέ χρώμα της αιματίνης σε όξινο περιβάλλον γίνεται μπλε/μαύρο υπό την επίδραση ασθενούς αλκαλικού διαλύματος

8 Εμβάπτιση σε νερό 2 min Καλή έκπλυση για την αφαίρεση των αλκαλικών αλάτων

9 Αφυδάτωση σε 70% οινόπνευμα 2 min Αφυδάτωση με αύξουσα διαβαθμισμένη αλκοόλη

10 Αφυδάτωση σε 95% οινόπνευμα 2 min

11 Αφυδάτωση σε 95% οινόπνευμα 2 min

12 Χρώση Orange G6 (OG6) 2 min

13 Εμβάπτιση σε 95% οινόπνευμα 2 min

14 Εμβάπτιση σε 95% οινόπνευμα 2 min

15 Εμβάπτιση σε 95% οινόπνευμα 2 min

16 Χρώση με διάλυμα Gills EA30 3 min

17 Εμβάπτιση σε 95% οινόπνευμα x3

1 min

18 Ξυλόλη x3 και επικάλυψη με DPX

1 min Το δείγμα παραμένει στην ξυλόλη μέχρι να επικαλυφτεί με DPX.

20

2.2 Λήψη και παρασκευή μη-γυναικολογικών δειγμάτων

Ο προσυμπτωματικός έλεγχος στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία αφορά την μικροσκοπική εξέταση κυτταρικών δειγμάτων που έχουν συλλεχθεί από διάφορα μέρη του ανθρώπινου οργανισμού, αυτό συμπεριλαμβάνει τα πτύελα, τα βρογχικά εκπλύματα, αναρροφήσεις μαστικού ιστού, νωτιαίο υγρό, υγρά από κοιλότητες του σώματος, εξιδρώματα και αναρροφήσεις λεπτής βελόνης συγκεκριμένων οργάνων. Παρακάτω παρουσιάζεται η διαδικασία παρασκευής επιχρισμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης για μη-γυναικολογικά δείγματα.

2.2.1 Διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς

Τα διαλύματα συντήρησης και μεταφοράς που χρησιμοποιούνται

στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία είναι το PreserveCyt, που περιγράψαμε πιο πάνω στην γυναικολογική κυτταρολογία(σελ. ) το οποίο αποτελεί μέσο συντήρησης των κυττάρων κατά την μεταφορά και την παρασκευή επιχρισμάτων με το ThinPrep® 2000 Processor, και το διάλυμα CytoLyt® το οποίο έχει ως βάση την μεθανόλη και είναι ένα διάλυμα συντήρησης με αιμολυτικές και βλεννολυτικές ιδιότητες, εμποδίζει την καθίζηση των πρωτεϊνών και διαφυλάσσει την μορφολογία του κυτταρολογικού δείγματος, δεν έχει σχεδιαστεί όμως για την παντελή αδρανοποίηση των μικροβίων. Αποτελεί επίσης μέσο μεταφοράς και χρησιμοποιείται κατά την προετοιμασία του δείγματος και πριν την επεξεργασία του. Τα δοχεία με CytoLyt αποθηκεύονται σε θερμοκρασίες 15-30οC, σε περίπτωση που περιέχεται κυτταρολογικό υλικό τότε αυτά μπορούν να διατηρηθούν για 8 ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου, για καλύτερες επιδόσεις όμως θα πρέπει το δείγμα να αποσταλεί αμέσως στο εργαστήριο για επεξεργασία. Οι 8 ημέρες αφορούν δείγματα τα οποία βρίσκονται μέσα σε ελάχιστη απαιτούμενη ποσότητα διαλύματος CytoLyt και αναλογία ένα μέρος διαλύματος CytoLyt προς τρία μέρη κυτταρολογικού υλικού18. Η χρήση του CytoLyt περιγράφεται πιο κάτω λεπτομερέστατα. Και τα δύο διαλύματα (PreserveCyt και CytoLyt) αφορούν επεξεργασία δειγμάτων με την μέθοδο ThinPrep.

Στην μέθοδο SurePath τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται είναι το BD CytoRich™ Red preservative και το BD CytoRich™ Blue preservative. Και τα δύο διαλύματα έχουν ως βάση την αλκοόλη και αποτελούν μέσο συντήρησης, μονιμοποίησης και μεταφοράς μη-γυναικολογικών κυτταρολογικών δειγμάτων τα οποία είτε συλλέγονται απευθείας στα διαλύματα συντήρησης (BD CytoRich™ Blue preservative ή BD CytoRich™ Red preservative) είτε αφού τα δείγματα φτάσουν στο εργαστήριο (χωρίς μονιμοποίηση) μονιμοποιούνται σε ίσες ποσότητες κυτταρολογικού υλικού-διαλύματος συντήρησης (BD CytoRich™ Red

21

preservative). Η διαφορά μεταξύ των δύο διαλυμάτων συναντάται στο ότι το BD CytoRich™ Red preservative έχει αιμολυτικές ιδιότητες και διαλυτοποιεί τις πρωτεΐνες (1mL διαλύματος CytoRich™ Red preservative μπορεί να λύσει και να σταθεροποιήσει 25-50μL ολικού αίματος), ενώ το BD CytoRich™ Blue preservative έχει σχεδιαστεί να διατηρεί τα ερυθρά αιμοσφαίρια τα οποία έχουν διαγνωστική αξία για ορισμένα μη-γυναικολογικά κυτταρολογικά δείγματα για αυτό και η προσθήκη του κυτταρολογικού υλικού στο διάλυμα αυτό πρέπει να γίνει το συντομότερο δυνατόν μετά την συλλογή του21. Το BD CytoRich™ Red preservative αποθηκεύεται σε θερμοκρασίες 15-30οC για δύο χρόνια, σύμφωνα με τους κατασκευαστές του, σε περίπτωση που περιλαμβάνει κυτταρολογικό υλικό τότε μπορεί αν αποθηκευτεί μέχρι 30 ημέρες. Έχει αποδειχτεί όμως ότι η μορφολογική σταθερότητα των δειγμάτων μπορεί να διαφυλαχτεί έως και για 6 μήνες σε θερμοκρασία δωματίου22. Επίσης και το BD CytoRich™ Blue preservative αποθηκεύεται στους 15-30οC, ενώ αν περιέχει κυτταρολογικό υλικό το δείγμα είναι σταθερό για δεκατέσσερις ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου.

2.2.2 Συλλογή και προετοιμασία δειγμάτων

Τα παρακάτω βήματα17 αφορούν δείγματα που πρόκειται να επεξεργαστούν με την μέθοδο ThinPrep*. 1. Συλλογή: Γενικά τα δείγματα φτάνουν στο εργαστήριο είτε νωπά, είτε

μέσα σε διάλυμα CytoLyt.

Δείγματα από αναρρόφηση μέσω λεπτής βελόνης (Fine Needle Aspiration, FNA) Η βέλτιστη τεχνική συλλογής δειγμάτων που έχουν ληφθεί με FNA

είναι η τοποθέτηση του δείγματος σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρησης που περιέχει 30mL διαλύματος CytoLyt.

Βλεννώδη δείγματα Τα βλεννώδη δείγματα, όπως πτύελα ή δείγματα που έχουν ληφθεί

με βουρτσάκι, συλλέγονται αμέσως σε διάλυμα CytoLyt, εάν αυτό δεν είναι δυνατό τότε τα δείγματα συλλέγονται νωπά και το CytoLyt προστίθεται το

* Δείγματα ΕΝΥ ή άλλου τύπου που προέρχονται από άτομα με Μεταδοτικές Σπογγώδεις Εγκεφαλοπάθειες, όπως η νόσος Creutzfeldt-Jakob, για τα οποία υπάρχει υποψία ότι περιέχουν μολυσματικούς παράγοντες prions ΔΕΝ επεξεργάζονται με το ThinPrep 2000. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας (World Health Organization, WHO) έχει καθορίσει ότι «επιφάνειες εργαστηριακών οργάνων που έχουν επιμολυνθεί με prions ΔΕΝ μπορούν να απολυμανθούν αποτελεσματικά χρησιμοποιώντας τις πρότυπες μεθόδους απολύμανσης.» Για αυτόν τον λόγο τα όργανα που έχουν επιμολυνθεί με prions δεν πρέπει να ξαναχρησιμοποιηθούν από τα εργαστήρια.

22

συντομότερο δυνατό. Όσο πιο σύντομα προστεθεί το CytoLyt τόσο καλύτερα διατηρείται η κυτταρολογική μορφολογία και αρχίζει η διαδικασία βλεννόλυσης. Σε περίπτωση που τα βλεννώδη δείγματα είναι 20mL και άνω τότε πριν την προσθήκη του CytoLyt προηγείται φυγοκέντρηση.

Δείγματα υγρής μορφής Ο καλύτερος τρόπος συλλογής δειγμάτων υγρής μορφής (δείγματα

από ουροποιητικό σύστημα, υγρά κοιλοτήτων σώματος, αρθρικό υγρό και υγρά κύστεων) είναι η συγκέντρωσή τους σε ειδικά δοχείο χωρίς την προσθήκη του CytoLyt. Ο τρόπος αυτός είναι ο προτιμότερος διότι το διάλυμα CytoLyt προκαλεί, σε κάποιο βαθμό, κατακρήμνιση πρωτεϊνών σε υγρά που έχουν υψηλά επίπεδα πρωτεΐνης. Εάν η προσθήκη του CytoLyt είναι απαραίτητη ώστε το δείγμα να μονιμοποιηθεί για την μεταφορά του στο εργαστήριο τότε η συλλογή μπορεί να γίνει απευθείας στο διάλυμα CytoLyt.

Δείγματα επιφανειών σώματος Τα δείγματα επιφανειών σώματος που λαμβάνονται με βουρτσάκι ή

με απόξεσμα είναι τα μόνα μη-γυναικολογικά δείγματα που συλλέγονται απευθείας στο διάλυμα PreservCyt. 2. Φυγοκέντρηση

Ο σκοπός εδώ είναι να ξεχωρίσει το κυτταρικό υλικό από το υπερκείμενο με αποτέλεσμα να προκύψει μια πιο συμπυκνωμένη μορφή των κυττάρων. Η φυγοκέντρηση μπορεί να γίνει είτε με νωπά δείγματα είτε μετά την προσθήκη του CytoLyt και ρυθμίζεται στα 600 g για 10 min. 3. Απόρριψη του υπερκείμενου και Vortex:

Το υπερκείμενο απορρίπτεται ώστε να παραμείνει μόνο το ίζημα κυττάρων που έχουν διαγνωστική αξία. Αν δεν απορριφθεί όλο το υπερκείμενο αυτό έχει ως συνέπεια την δημιουργία ενός αραιού δείγματος που συνεπάγει την παρασκευή ενός μη ικανοποιητικού επιχρίσματος. Το επόμενο βήμα είναι η ανάδευση του ιζήματος στο Vortex για 3 sec, που έχει σκοπό την τυχαιοποίηση των κυττάρων πριν την μεταφορά στο PreservCyt. 4. Αξιολόγηση του κυτταρικού ιζήματος

Αν τα κυτταρικό ίζημα έχει χρώμα λευκό, απαλό ροζ, ανοιχτό καφέ ή

είναι διαφανές τότε προστίθεται στο φιαλίδιο με το διάλυμα PreserveCyt. Αν το κυτταρικό ίζημα είναι κόκκινο ή καφέ υποδεικνύοντας την

παρουσία αίματος τότε γίνεται έκπλυση με διάλυμα CytoLyt ώστε να γίνει η απαραίτητη αιμόλυση προσθέτοντας 30mL διαλύματος CytoLyt, στην συνέχεια γίνεται φυγοκέντρηση για να μαζευτεί όλο το κυτταρικό υλικό, το υπερκείμενο απορρίπτεται και το δείγμα αναδεύεται στο Vortex ώστε να κατασταθεί ομογενές. Στην συνέχεια το δείγμα μεταφέρεται στο διάλυμα PreservCyt.

Εάν το δείγμα είναι βλεννώδες τότε γίνεται έκπλυση με 30 mL διαλύματος CytoLyt όπως παραπάνω όμως πριν την φυγοκέντρηση το δείγμα αναδεύεται στο Vortex για 5min ώστε να λυθεί η βλέννη. Ακολουθεί η

23

φυγοκέντρηση και αφού απορριφθεί το υπερκείμενο το ίζημα αναδεύεται στο Vortexκαι μεταφέρεται στο PreservCyt.

Αφού το δείγμα παραμείνει για 15 min στο διάλυμα PreservCyt, για

να απελευθερωθεί από τους λοιμογόνους παράγοντες εξαιτίας της αντιμικροβιακής δράσης του PreservCyt17, στην συνέχεια επεξεργάζεται στο ThinPrep 2000 Processor, επιλέγοντας το κατάλληλο κάθε φορά πρόγραμμα για την παρασκευή επιχρισμάτων μη γυναικολογικής κυτταρολογίας17.

Στην μέθοδο SurePath, όπως και στο σύστημα ThinPrep, τα

δείγματα φτάνουν στο εργαστήριο είτε νωπά είτε έχουν συλλεχθεί κατευθείαν στα διαλύματα μονιμοποίησης. Για τα δείγματα που επεξεργάζονται με την μέθοδο SurePath χρησιμοποιούνται τα διαλύματα BD CytoRich™ Red preservative και BD CytoRich™ Blue preservative*. Τα βήματα που ακολουθούνται είναι21: 1. Συλλογή:

Εκπλύσεις Τα δείγματα φτάνουν στο εργαστήριο νωπά ή μονιμοποιημένα στο

διάλυμα BD CytoRich™ Red preservative.

Δείγματα επιφανειών σώματος Τα οποία λαμβάνονται με ειδικό βουρτσάκι και, αν είναι απαραίτητο,

πρώτα παρασκευάζονται άμεσα παρασκευάσματα και στην συνέχεια το βουρτσάκι τοποθετείται μέσα σε 10 mL διαλύματος BD CytoRich™ Red preservative και αποστέλλεται στο εργαστήριο.

Υγρά κοιλοτήτων σώματος Σε περίπτωση που ο όγκος του διαλύματος ξεπερνά τα 100 mL τα

δείγματα μεταφέρονται νωπά στο εργαστήριο ή αν είναι απαραίτητο ψύχονται. Σε περίπτωση που ο όγκος του διαλύματος δεν ξεπερνά τα 100mL τότε τα δείγματα είτε μεταφέρονται νωπά στο εργαστήριο είτε συλλέγονται κατευθείαν σε διάλυμα BD CytoRich™ Red preservative.

Πτύελα Αν τα δείγματα λαμβάνονται νωπά τότε μονιμοποιούνται σε ίσα μέρη

διαλύματος BD CytoRich™ Blue preservative/δείγματος ή διαφορετικά συλλέγονται κατευθείαν σε 30 mL BD CytoRich™ Blue preservative.

Ούρα-Εκπλύσεις ουροδόχου κύστεως Αν το δείγμα λαμβάνεται νωπό τότε μονιμοποιείται σε ίσα μέρη

διαλύματος BD CytoRich™ Blue preservative/δείγματος ή διαφορετικά το δείγμα συλλέγεται κατευθείαν σε 30 mL BD CytoRich™ Blue preservative.

* Το BD CytoRich™ Blue preservative χρησιμοποιείται για την συλλογή δειγμάτων πτυέλων, ούρων και εκπλύσεις ουροδόχου κύστεως καθώς έχει την ιδιότητα να διατηρεί τα ερυθρά αιμοσφαίρια, η παρουσία των οποίων έχει διαγνωστική αξία για αυτά τα δείγματα.

24

Δείγματα από αναρρόφηση μέσω λεπτής βελόνης

Αν είναι απαραίτητο πρώτα παρασκευάζονται άμεσα παρασκευάσματα και στην συνέχεια η βελόνη τοποθετείται σε 10 mL διαλύματος BD CytoRich™ Red preservative ή διαφορετικά όλο το περιεχόμενο της βελόνης εμβαπτίζεται σε 10 mL διαλύματος BD CytoRich™ Red preservative. 2. Συγκέντρωση κυτταρικού υλικού

Το δείγμα αναδεύεται στο Vortex για να ομογενοποιηθεί και στην συνέχεια ελέγχεται για την παρουσία πηγμάτων, σωματιδίων και βλέννης. Σε αυτή την περίπτωση το δείγμα φιλτράρεται χρησιμοποιώντας π.χ. μια γάζα για την απομάκρυνση πηγμάτων και σωματιδίων.

Ύστερα ακολουθεί η φυγοκέντρηση του δείγματος μεταφέροντας μια ποσότητα 50 mL σε ένα σωληνάριο φυγοκέντρησης, η φυγόκεντρος ρυθμίζεται στα 600g για 10 min και στην συνέχεια το υπερκείμενο απορρίπτεται. 3. Μονιμοποίηση

Το στάδιο αυτό δεν εφαρμόζεται σε δείγματα που έχουν συλλεχθεί κατευθείαν σε διάλυμα BD CytoRich™ Red ή Blue preservative.

Ανάλογα με την προέλευση του δείγματος προστίθεται σε αυτό 5-10 mL διαλύματος BD CytoRich™ Red ή Blue preservative, αναδεύεται στο Vortex για 15 ± 5 sec και το δείγμα αφήνεται να ηρεμήσει για περίπου 30 min. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 600 g για 10 min, το υπερκείμενο απορρίπτεται και το ίζημα αναδεύεται στο Vortex για να ομογενοποιηθεί. 4. Έκπλυση

- Αν η ποσότητα του ιζήματος είναι μικρή έως αόρατη τότε προστίθενται 6 mL DI H2O (απιονισμένο νερό) στα σωληνάρια φυγοκέντρησης που περιέχουν 50 mL δείγματος (βλ. σελ. ), στην συνέχεια το μείγμα αναδεύεται στο Vortex για 15 ± 5 sec και μεταφέρεται σε σωληνάρια των 12 mL.

- Αν η ποσότητα του ιζήματος είναι μέτρια προς μεγάλη τότε μεταφέρονται 1-5 σταγόνες δείγματος σε σωληνάρια των 12 mL και προστίθενται σε αυτό 10 mL DI H2O.

- Στην συνέχεια ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 600 g για 5 min και αφού απορριφθεί το υπερκείμενο το δείγμα αναδεύεται στο Vortex για 15 ± 5 sec για να ομογενοποιηθεί. Το δείγμα στην συνέχεια είναι έτοιμο να επεξεργαστεί στο BD PrepStain™ Slide Processor για την παρασκευή μη γυναικολογικών επιχρισμάτων.

25

2.3 Αξιολόγηση επιχρισμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης στο μικροσκόπιο

Βάση πολυάριθμων ερευνών έχουν σημειωθεί ορισμένες αλλαγές από τον Γεώργιο Παπανικολάου έως σήμερα, όσον αφορά τα μορφολογικά κριτήρια των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Οι διαφορές οφείλονται κυρίως στο υγρό μέσο συντήρησης και μεταφοράς που χρησιμοποιείται στην κυτταρολογία υγρής φάσης (ΚΥΦ). Εδώ πέρα πρέπει να σημειωθεί ότι τα χαρακτηριστικά των κυττάρων δεν αλλάζουν κατά την επεξεργασία των δειγμάτων και έτσι η ερμηνεία τους γίνεται με βάση την κλασική μορφολογία. Οι μορφολογικές ομοιότητες της κυτταρολογίας υγρής φάσης με την συμβατική κυτταρολογία είναι πολλές και

υπερβαίνουν κατά πολύ τις διαφορές τους. Παρακάτω επεξηγείται ο τρόπος που γίνεται η μικροσκόπηση των δειγμάτων σε επιχρίσματα κυτταρολογίας υγρής φάσης και επίσης παρουσιάζονται κάποια χαρακτηριστικά αυτών των επιχρισμάτων. Όπως και στα συμβατικά παρασκευάσματα, η εξέταση των παρασκευασμάτων υγρής φάσης γίνεται αργά και ακολουθώντας συγκεκριμένη διαδρομή. Επειδή όμως το πεδίο ελέγχου έχει στρογγυλό σχήμα η μικροσκόπηση γίνεται επικαλύπτοντας τα οπτικά πεδία (εικόνα 2.13), πράγμα

που δεν συμβαίνει κατά την μικροσκόπηση συμβατικών παρασκευασμάτων. Πριν την

Εικόνα 2.14 Ανάμεσα στα τόσα φυσιολογικά κύτταρα βρίσκονται 2

κύτταρα μολυσμένα με HPV.

Εικόνα 2.13 Οι γκρίζες περιοχές αναπαριστούν τις περιοχές επικάλυψης οπτικών πεδίων κατά την μικροσκόπηση παρασκευασμάτων ΚΥΦ. Οι περιοχές αυτές αποτελούν το 50% του οπτικού πεδίου.

26

καθιερωμένη αξιολόγηση του επιχρίσματος, που γίνεται με αντικειμενικό φακό 10Χ, συνήθως είναι πολύ αποτελεσματικό να γίνεται ένας γρήγορος έλεγχος χρησιμοποιώντας αντικειμενικό φακό 4Χ, ώστε να αξιολογηθεί, εν συντομία, η κυτταροβρίθεια (κύτταρα φυσιολογικά και μη), η παρουσία ενδοτραχηλικών κυττάρων και τα τεχνικά χαρακτηριστικά του παρασκευάσματος. Στην κυτταρολογία υγρής φάσης η ποσοτική αξιολόγηση των μη φυσιολογικών κυττάρων δεν είναι τόσο σημαντική όσο είναι καθοριστική η παρουσία ή η απουσία τους. Οι έμπειροι κυτταροτεχνολόγοι και παθολόγοι μπορούν πολύ εύκολα να αναγνωρίσουν του διάφορους τύπους κυττάρων και στα επιχρίσματα κυτταρολογίας υγρής φάσης.

Η εξέταση παρασκευασμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης είναι μια μέθοδος που απαιτεί μεγάλη και συνεχή συγκέντρωση του τεχνολόγου σε σχέση με την εξέταση συμβατικών παρασκευασμάτων επειδή τα άτυπα κύτταρα, που είναι καθοριστικής σημασίας, μπορεί να «κρυφτούν» ανάμεσα στα φυσιολογικά κύτταρα (εικόνα 2.14) λόγω της διασποράς των κυττάρων μέσα στο υγρό συντήρησης, έτσι μπορεί ένα μη φυσιολογικό κύτταρο να βρεθεί οπουδήποτε στην εξεταζόμενη επιφάνεια του επιχρίσματος. Επιπλέον, για να είναι δυνατή η αξιολόγηση μεμονωμένων κυττάρων που δεν μπορεί να γίνει κατά την μικροσκόπηση με αντικειμενικό φακό x10, είναι αναγκαία η χρήση φακού μεγαλύτερης μεγέθυνσης (x40, x60). Αυτό γίνεται καθ’ όλη την διάρκεια μικροσκόπησης παρασκευασμάτων ΚΥΦ. Γενικά η διαδικασία εξέτασης παρασκευάσματος κυτταρολογίας υγρής φάσης απαιτεί μια μεγαλύτερη συγκέντρωση του τεχνολόγου.

Τα χαρακτηριστικά των παρασκευασμάτων ΚΥΦ, που τα καθιστούν μοναδικά, είναι: η κυτταρική ομοιογένεια των παρασκευασμάτων, το υγρό μέσο μονιμοποίησης, το μέγεθος των κυττάρων, η εικόνα του επιχρίσματος και το υπόστρωμα.

Κυτταρική ομοιογένεια: Επειδή το κυτταρικό υλικό συγκεντρώνεται σε υγρό μέσο συντήρησης και στην συνέχεια φιλτράρεται (ΤhinPrep) ή φυγοκεντρείται (SurePath) για να διαχωριστούν τα κύτταρα από το υπόλοιπο

Εικόνα 2.15 Α) χαρακτηριστική εικόνα συμβατικού παρασκευάσματος όπου η άνιση κατανομή του κυτταρικού υλικού είναι εμφανέστατη Β) παρασκεύασμα ΚΥΦ, τα κύτταρα είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα.

27

υλικό, η παρουσίαση των δειγμάτων στα παρασκευάσματα υγρής φάσης διαφέρει από τα συμβατικά. Στα συμβατικά επιχρίσματα παρουσιάζονται παχιές και λεπτές περιοχές, ξήρανση και πολλές φορές παραμόρφωση των κυττάρων (εικόνα 2.15 Α). Αντιθέτως στα επιχρίσματα ΚΥΦ το κυτταρικό υλικό είναι συγκεντρωμένο και ομοιόμορφα κατανεμημένο εντός μιας κυκλικής περιοχής. Η επικάλυψη κυττάρων παρατηρείται και στα επιχρίσματα ΚΥΦ αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό.

Υγρό μέσο μονιμοποίησης: Το υγρό μέσο συγκέντρωσης και μονιμοποίησης κυττάρων είναι αυτό που καθιστά την ΚΥΦ μια μοναδική τεχνική. Η μορφολογία των κυττάρων στα κολποτραχηλικά επιχρίσματα είναι παρόμοια και στα μη-γυναικολογικά δείγματα, όπου τα κύτταρα έχουν την τάση να στρογγυλοποιούνται μέσα στο υγρό, παρόλα αυτά οι διάφοροι τύποι κυττάρων μπορούν να διακριθούν πολύ εύκολα στα επιχρίσματα κυτταρολογίας υγρής φάσης. Τα ενδοτραχηλικά κύτταρα μπορεί να εμφανίζονται τρισδιάστατα και να συγχέονται με κύτταρα του ενδομητρίου. Επίσης πολλές φορές κατά την εξέταση του επιχρίσματος σε μεγάλη μεγέθυνση παρατηρούνται περιφερειακά των κυτταρικών συστάδων ενδοτραχηλικά κύτταρα με πασσαλοειδής διάταξη.

Το υγρό διάλυμα συντήρησης και μονιμοποίησης περιέχει αλκοόλη η οποία συντηρεί την μορφολογία του πυρήνα και όλου του κυττάρου. Ως αποτέλεσμα αυτής της ενισχυμένης συντήρησης των λεπτομερειών του κυττάρου είναι ο γρήγορος και εύκολος προσδιορισμός της προέλευσης του κυττάρου και του βαθμού ωρίμανσής του. Η καλή συντήρηση της μορφολογίας του πυρήνα αποτελεί μια από τις σημαντικότερες ιδιότητες της υγρής μονιμοποίησης. Η εικόνα του πυρήνα μπορεί να παρερμηνευτεί από τους τεχνολόγους και τους παθολόγους καθώς είναι κάπως διαφορετική σε σχέση με

Εικόνα 2.16 a)υποχρωμία μη φυσιολογικών κυττάρων σε ThinPrep παρασκεύασμα. Ένα φαινόμενο που αποτελεί αιτία ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων, σε αυτή την περίπτωση η διάγνωση στηρίζεται στις ακανόνιστες ομάδες κυττάρων και στην μορφολογία της πυρηνικής μεμβράνης. b,c)υπερχρωματικοί πυρήνες σε παρασκευάσματα b)ThinPrep και c) SurePath.

28

τα συμβατικά παρασκευάσματα. Ο πυρήνας στα επιχρίσματα ΚΥΦ παίρνει μια φυσαλιδώδη, λεπτή εμφάνιση23. Η υπερχρωμία που συναντάται στα συμβατικά παρασκευάσματα σχετίζεται με πλακώδεις αλλοιώσεις, στην ΚΥΦ όμως μπορεί να μην είναι τόσο έντονη, για αυτό και δεν πρέπει να ληφθεί ως αξιόπιστος δείκτης για την παρουσία αλλοιώσεων του πλακώδους επιθηλίου κατά την εξέταση των επιχρισμάτων (εικόνα 2.16).

Εάν παρουσιάζεται υπερχρωμία του πυρήνα τότε λαμβάνεται υπόψη και το επίχρισμα εξετάζεται περαιτέρω για την παρουσία αλλοιώσεων, σε περίπτωση όμως που δεν παρουσιάζεται αυτό δεν σημαίνει ότι ο πυρήνας δεν εμφανίζει αλλοιώσεις. Όταν σε ένα δείγμα δεν παρουσιάζεται υπερχρωμία του πυρήνα τότε ο εξεταστής θα πρέπει να στηριχτεί σε άλλα χαρακτηριστικά, όπως διακυμάνσεις στο μέγεθος και το σχήμα του πυρήνα, για την ερμηνεία υψηλού βαθμού αλλοιώσεων, λεπτομέρειες που παραβλέπονται ή δεν αξιολογούνται κατά την εξέταση συμβατικών επιχρισμάτων24.

Μέγεθος κυττάρου: Λόγω του υγρού μέσου μονιμοποίησης τα κύτταρα εμφανίζονται ελαφρώς μικρότερα από ότι στα συμβατικά παρασκευάσματα και συνήθως μεμονωμένα, ειδικά τα ενδοτραχηλικά και τα ανώριμα μεταπλαστικά κύτταρα. Αυτή η στρογγυλοποίηση των κυττάρων μεταβάλλει την αναλογία «πυρήνα προς κυτταρόπλασμα» υπέρ του πυρήνα. Η καλή μονιμοποίηση των ενδιάμεσων κυττάρων είναι πολύ χρήσιμη διότι βάση αυτών μπορεί να υπολογιστεί το μέγεθος του κυττάρου και του πυρήνα. Τα ενδιάμεσα κύτταρα αποτελούν την βάση για την ερμηνεία και αξιολόγηση των μικρών, ανώριμων, μεταπλαστικών κυττάρων. Η εξέταση αυτών των κυττάρων γίνεται σε μεγάλη μεγέθυνση ώστε να αξιολογηθεί προσεκτικά ο πυρήνας για εμφάνιση ατυπίας ειδικά σε περιπτώσεις έλλειψης υπερχρωμίας του πυρήνα. Πολλές φορές συναντούνται τρισδιάστατες δομές των κυττάρων, ένα φαινόμενο που είναι πολύ πιο έντονο στην ΚΥΦ από ότι στα συμβατικά παρασκευάσματα, και το οποίο απαιτεί από του τεχνολόγους να επανεστιάζουν συνεχώς (εικόνα 2.17) κατά την μικροσκόπηση. Για αυτόν τον λόγο πολύ ερευνητές πιστεύουν ότι ο όρος που χρησιμοποιείται: «κυτταρολογία μονοεπίπεδης στοιβάδας» πρέπει να αντικατασταθεί με τον όρο «κυτταρολογία λεπτής επίστρωσης» ή αλλιώς, όπως το ξέρουμε, Κυτταρολογία Υγρής Φάσης. Τέλος, δεδομένου ότι το αίμα έχει υποστεί λύση στα δείγματα ΚΥΦ, υπάρχουν μόνο ερυθρά αιμοσφαίρια «φαντάσματα» (ghost red cells) στα εμμηνορροϊκά δείγματα.

Εικόνα 2.17 Τρισδιάστατη δομή μη φυσιολογικών κυττάρων σε παρασκεύασμα ThinPrep. Ίδια εικόνα με τρεις διαφορετικές εστιάσεις. Η συνεχής επανεστίαση είναι απαραίτητη για να αξιολογηθούν όλα τα κύτταρα όταν σχηματίζουν τέτοιες ομάδες.

29

Εικόνα του επιχρίσματος και υπόστρωμα: Γενικά η εικόνα του επιχρίσματος ΚΥΦ διαφέρει από το συμβατικό. Το κυτταρικό υλικό είναι ενιαία και ομοιόμορφα κατανεμημένο, όμως οι σχέσεις μεταξύ των κυττάρων χάνονται και τα κύτταρα είναι τυχαία διασκορπισμένα (διασπορά). Όσον αφορά το υπόστρωμα, σε σχέση με τα συμβατικά επιχρίσματα, τα επιχρίσματα ΚΥΦ χαρακτηρίζονται γενικά από ένα καθαρό υπόστρωμα θέτοντας την διάγνωση πολύ πιο γρήγορη και εύκολη. Η συνεχής εκπαίδευση είναι πολύ σημαντική ώστε οι κυτταρολόγοι να μάθουν και να συνηθίσουν την μορφολογική εικόνα των επιχρισμάτων κυτταρολογίας υγρής φάσης.

Τα φλεγμονώδη στοιχεία είναι και αυτά ομοιόμορφα κατανεμημένα στα ΚΥΦ παρασκευάσματα και πολλές φορές βρίσκονται προσκολλημένα στα επιθηλιακά κύτταρα ενώ το υπόστρωμα εμφανίζεται «ατημέλητο» και «βρώμικο». Τα στοιχεία αυτά αποτελούν ένδειξη παρουσίας λοιμογόνου παράγοντα, κυτταρόλυσης ή/και κακοήθους νόσου.

Παρακάτω παρουσιάζεται η μορφολογική εικόνα, διαφόρων τύπων, φυσιολογικών κυττάρων και κυττάρων που έχουν υποστεί αλλοίωση εξαιτίας κάποιων νοσημάτων.

Εικόνα 2.18 Μορφολογία κυττάρων στα παρασκευάσματα ThinPrep. A) Δείγμα από υγρά περιτόναιου: θηλωματώδες ορώδες καρκίνωμα του ενδομητρίου (20x). Β) Βρογχικό απόξεσμα: αδιαφοροποίητο μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα 60x. C) FNA θυρεοειδή. Θηλωματώδες καρκίνωμα θυρεοειδούς: το σημαντικότερο κριτήριο για μια καθοριστική διάγνωση θηλωματώδους καρκινώματος είναι η κυτταροβρίθεια παρουσία φύλλων κυττάρων σε συνοχή μεταξύ τους και συστάδες θυλακιωδών κυττάρων σε χαμηλή μεγέθυνση 10x όπως παρουσιάζεται εδώ. D) FNA μαστού. Κύστη μαστού: τα καλοήθη πορογενή κύτταρα κυστικού υγρού μπορεί να παρουσιάσουν εκφυλιστική κενοτοποίηση του κυτταροπλάσματος όπως φαίνεται εδώ (60x). Ε) FNA ήπατος. Κίρρωση: καλοήθη χαλαρή συστάδα ηπατοκυττάρων με διπυρήνωση και μικρή αναλογία πυρήνα προς κυτταρόπλασμα. (40x). F) FNA παγκρέατος. Καλοήθη πορογενή κύτταρα: τα κύτταρα εδώ εμφανίζονται ενωμένα σε κυψελοειδή διάταξη με στρογγυλούς πυρήνες και καλά καθορισμένα όρια μεταξύ τους.

30

2.4 Αυτοματοποιημένα συστήματα ελέγχου

2.4.1 Ιστορική Αναδρομή

Το πρώτο αυτοματοποιημένο σύστημα προληπτικού ελέγχου στην τραχηλική κυτταρολογία έκανε την εμφάνισή του την δεκαετία του ’50. Επρόκειτο για έναν στατικό ανιχνευτή κυττάρων (cell scanner) που ονομαζόταν Cytoanalyzer το οποίο αναπτύχθηκε στις Ηνωμένες Πολιτείες από την Airborne Instruments Inc. Το σύστημα όμως απέτυχε να βρει μια θέση στην κλινική πρακτική, λόγω έλλειψης ικανοποιητικής υπολογιστικής δυνατότητας να αναλύσει τις σύνθετες εικόνες των επιχρισμάτων, αν και χρειάστηκαν παραπάνω από 5.000.000$ (πολλά χρήματα για την τότε εποχή) για την ανάπτυξή του. Παρόλο τις αποτυχίες, οι προσπάθειες συνεχίστηκαν τις δεκαετίες του ’70 και ’80, ειδικά στην Ευρώπη και Ιαπωνία με την ανάπτυξη διαφόρων υπολογιστών ανίχνευσης κυττάρων όπως το Quantimet, το BIOPEPR, το CERVIFIP, το CYBEST, το DIASCANNER, το FAZYTAN και το LEYTAS1. Μερικά από αυτά τα όργανα βρίσκονται στα μουσεία, άλλα αποτέλεσαν πρότυπο για την κατασκευή συστημάτων που χρησιμοποιούνται σήμερα.

Οι πρώτες αυτές αυτοματοποιημένες συσκευές στηριχτήκαν εξ ολοκλήρου στην ανάλυση εικόνας, εξετάζοντας ένα-ένα τα κύτταρα στο επίχρισμα χρησιμοποιώντας έναν αλγοριθμικό λογισμικό πρόγραμμα υπολογιστών. Με την ανάπτυξη της τεχνολογίας των υπολογιστών εισήχθη η τεχνητή νοημοσύνη στα συστήματα επεξεργασίας εικόνας που αποτελείται από νευρωνικά δίκτυα μέσω των οποίων είναι δυνατή η αναγνώριση των σχημάτων στις φυσικές εικόνες.

Τα τρέχοντα εμπορικά αυτοματοποιημένα συστήματα χρησιμοποιούν και τα δύο προγράμματα, δηλαδή και τα αλγοριθμικά προγράμματα και τα προγράμματα τεχνητής νοημοσύνης για την ανάλυση των επιχρισμάτων.

Τον Μάιο του 1998 ο FDA ενέκρινε το σύστημα AutoPap (Neopath Inc. Redmond Washington USA) για την χρήση του στην πρωτοβάθμια εξέταση των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, στα πλαίσια του προληπτικού ελέγχου του τραχήλου της μήτρας. Το AutoPap έλεγχε ένα-ένα τα κολποτραχηλικά επιχρίσματα και στην συνέχεια τα ταξινομούσε σύμφωνα με τον βαθμό της ατυπίας τους. Το σύστημα απέκλειε αυτόματα το 25% των επιχρισμάτων με το χαμηλότερο κίνδυνο από εκείνα που έχριζαν μικροσκοπική επανεξέταση, μειώνοντας έτσι τον φόρτο εργασίας του κυτταροτεχνολόγου κατά 25%.

Ένα άλλο σύστημα, το Papnet (Neuromedical System Inc. Amsterdam BV) αναπτύχθηκε, σχεδόν την ίδια περίοδο, ως μέθοδος για την πρωτοβάθμια εξέταση των συμβατικών τεστ Παπανικολάου. Το Papnet ανέλυε τις εικόνες των επιχρισμάτων και επέλεγε εκείνες που παρουσίαζαν

31

ενδιαφέρον. Οι εικόνες αυτές αποθηκευόντουσαν και εξεταζόντουσαν στην συνέχεια σε οθόνη υπολογιστή από έναν κυτταροτεχνολόγο, ο οποίος, εξετάζοντας αυτές τις εικόνες αποφάσιζε αν ένα επίχρισμα ήταν αρνητικό ή έπρεπε να επανεξεταστεί στο μικροσκόπιο.

Και τα δύο συστήματα μελετήθηκαν εκτενώς και οι διάφορες δοκιμές έδειξαν ότι η ευαισθησία αυτών των αυτοματοποιημένων συστημάτων ήταν τουλάχιστον ίδια με την μικροσκοπική εξέταση25-28. Τα συστήματα όμως δεν ήταν εμπορικά βιώσιμα καθώς δεν βρέθηκε να συμφέρουν οικονομικά τα περισσότερα εργαστήρια.

Οι δύο τεχνολογίες των Papnet και AutoPap δεν είναι πλέον διαθέσιμες, αγοράστηκαν από μια άλλη εταιρεία η οποία πλέον έχει βγάλει στην αγορά το FocalPoint Slide Profiler™ (BD TriPath Imaging, Burlington, NC) που εγκρίθηκε από τον FDA το 1998 για την ανάλυση συμβατικών παρασκευασμάτων και το 2001 για την ανάλυση SurePath επιχρισμάτων Παπανικολάου. Το 2003 το FDA ενέκρινε το ThinPrep Imaging System™ (Hologic Inc.) ως μέθοδο βοηθητικού ελέγχου στην πρωτοβάθμια εξέταση των επιχρισμάτων Παπανικολάου με την μέθοδο ThinPrep. Το τελευταίο σύστημα που έχει λάβει την έγκριση από το FDA είναι το BD FocalPoint® GS Imaging System, το οποίο εγκρίθηκε τον Δεκέμβρη του 2008 ως σύστημα βοηθητικού ελέγχου στην πρωτοβάθμια εξέταση κολποτραχηλικών επιχρισμάτων.

Κανένα από τα τρία συστήματα δεν έχει εγκριθεί για την ανάλυση

επιχρισμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας1.

2.4.2 FocalPoint™ Slide Profiler

Το FocalPoint™ Slide Profiler (εικόνα 2.19) είναι μια αυτοματοποιημένη συσκευή η οποία ταξινομεί τα κολποτραχηλικά επιχρίσματα χωρίς την ανθρώπινη παρέμβαση. Το σύστημα χρησιμοποιεί αλγοριθμικό λογισμικό για να μετρήσει και να αναγνωρίσει τα χαρακτηριστικά του κυττάρου όπως το μέγεθος του πυρήνα, την οπτική πυκνότητα, την αναλογία πυρήνα/κυτταροπλάσματος και το πυρηνικό περίγραμμα. Το σύστημα αφού σκανάρει τα επιχρίσματα, τα βαθμολογεί από το 0 έως το 1,0 ως προς την πιθανότητα παρουσίας

Εικόνα 2.19 FocalPoint™ Slide Profiler.

32

σημαντικών επιθηλιακών αλλοιώσεων και τα ταξινομεί σε τρεις μεγάλες κατηγορίες. Το 25%* των επιτυχώς επεξεργασμένων επιχρισμάτων για τα οποία καθορίστηκε ότι έχουν τις λιγότερες πιθανότητες να περιέχουν μη φυσιολογικά κύτταρα, δεν επανεξετάζονται και καταχωρούνται ως αρνητικά. Από το υπολειπόμενο 75% των επιχρισμάτων, για τα οποία απαιτείται μικροσκοπική εξέταση καθώς έχουν ταξινομηθεί από το σύστημα ως πιθανά να περιέχουν αλλοιώσεις, το σύστημα αναγνωρίζει 15% ως επιχρίσματα με την μεγαλύτερη πιθανότητα εύρεσης αλλοιώσεων και τα προωθεί για δεύτερη μικροσκοπική εξέταση (εικόνα 2.20). Το FocalPoint Slide Profiler έχει την ικανότητα να επεξεργαστεί συμβατικά και SurePath κολποτραχηλικά επιχρίσματα. Το σύστημα διαθέτει 8 δίσκους που το καθένα δέχεται 36 επιχρίσματα και είναι ικανό να επεξεργαστεί 288 επιχρίσματα σε 24 ώρες.

Το FocalPoint Slide Profiler δεν έχει εγκριθεί για την επεξεργασία επιχρισμάτων ασθενών που ανήκουν στην ομάδα υψηλού κινδύνου για καρκίνο του τραχήλου1, ο έλεγχος αυτών των επιχρισμάτων πρέπει να γίνει με δια χειρός μικροσκόπηση από το προσωπικό του εργαστηρίου.

†

* Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι αυτό το ποσοστό στην πραγματικότητα φτάνει το 17%.

† http://www.bd.com/tripath/labs/focalpoint_model_pop.asp

Εικόνα 2.20 Ταξινόμηση των επιχρισμάτων ύστερα από την βαθμολόγησή τους με βάση την πιθανότητα παρουσίας αλλοίωσης (0=αρνητικό, 1=αλλοίωση). Α-επιχρίσματα που βαθμολογούνται κάτω από συγκεκριμένο όριο δεν υφίστανται μικροσκοπικό έλεγχο. Β-επιχρίσματα που βαθμολογούνται πάνω από συγκεκριμένο όριο ελέγχονται από τους κυτταροτεχνολόγους. C-επιχρίσματα που απαιτούν δεύτερη επανεξέταση από τους κυτταροτεχνολόγους (έχουν την μεγαλύτερη πιθανότητα εύρεσης αλλοιώσεων).

33

2.4.3 Διαδραστικά συστήματα ελέγχου

Αυτό το πρότυπο σχέδιο ελέγχου βασίζεται στην «συνεργασία» του κυτταροτεχνολόγου με το σύστημα ελέγχου για την ερμηνεία των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Τα κύρια διαδραστικά συστήματα ελέγχου σήμερα είναι το ThinPrep Imaging System® (Cytyc, a Hologic Company) και το BD FocalPoint® GS Imaging System (BD Diagnostics - TriPath). Το καθένα από αυτά περιέχει ένα σύστημα σάρωσης των επιχρισμάτων, χρησιμοποιεί ένα αλγοριθμικό σύστημα για να επεξεργαστεί τα δεδομένα των κυττάρων, και με την βοήθεια ενός αυτόματου μικροσκοπίου και χρησιμοποιώντας άξονες Χ-Υ αναγνωρίζει αυτόματα κάθε φορά πεδία κυττάρων πάνω στο επίχρισμα τα οποία έχουν κριθεί ως σημαντικά για

Εικόνα 2.21 ThinPrep Imaging System®. Στην εικόνα φαίνεται ο ηλεκτρονικός τρόπος επισήμανσης αντικειμένων ενδιαφέροντος σε επίχρισμα ThinPrep.

34

αξιολόγηση. Ουσιαστικά πρόκειται για μια μέθοδο βοηθητικού ελέγχου στην πρωτοβάθμια εξέταση των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων η οποία αφού αναγνωρίζει πεδία πάνω στα επιχρίσματα τα οποία «κρίνει» ότι είναι σημαντικά για επανεξέταση, τα μαρκάρει ώστε ο κυτταροτεχνολόγος να ανατρέξει σε αυτά εύκολα και γρήγορα κάθε φορά που απαιτείται.

Τα διαδραστικά συστήματα ελέγχου έχουν μια θετική επίδραση στην καθημερινή πρακτική του εργαστηρίου καθώς βελτιώνεται ο τρόπος εργασίας29-30, μειώνεται η κόπωση, και αυξάνεται η απόδοση. Σε μερικές έρευνες έχει σημειωθεί περίπου 70% μείωση της εξεταζόμενης επιφάνειας ανά αρνητικό επίχρισμα31-32. Αυτό συνεπάγει μια γενική αύξηση της παραγωγικότητας του εργαστηρίου και επίσης δεν χάνεται πολύτιμος χρόνος ελέγχοντας φυσιολογικά επιχρίσματα αλλά αντιθέτως ο χρόνος αυτός αφιερώνεται στα επιχρίσματα μεγαλύτερης σημασίας και σε σημεία εκείνων που έχουν αναγνωριστεί ως δυνητικά μη φυσιολογικά.

Το ThinPrep Imaging System αποτελείται από δύο κύρια εξαρτήματα τον επεξεργαστή εικόνας και το μικροσκόπιο εξέτασης των επιχρισμάτων. Το σύστημα μπορεί να επεξεργαστεί μόνο ThinPrep παρασκευάσματα τα οποία τοποθετούνται στις «κασέτες» του επεξεργαστή (1 κασέτα δέχεται 25 πλακίδια, κάθε επεξεργαστής δέχεται 10 κασέτες). Ο επεξεργαστής μπορεί να «διαβάσει» πάνω από 300 επιχρίσματα την ημέρα αναγνωρίζοντας σε κάθε επίχρισμα 22 οπτικά πεδία (ΟΠ) με βάση διάφορα χαρακτηριστικά. Κατά την πλοήγηση του επεξεργαστή στα 22 ΟΠ εάν δεν αναγνωριστούν μη φυσιολογικά στοιχεία τότε το επίχρισμα δεν επανεξετάζεται. Εάν όμως υπάρχουν μη φυσιολογικά στοιχεία σε ένα τουλάχιστον ΟΠ τότε το επίχρισμα επανεξετάζεται από τους τεχνολόγους μέσω του συστήματος μικροσκόπηση το οποίο συνδέεται ηλεκτρονικά με τον επεξεργαστή. Τα αντικείμενα ενδιαφέροντος εντοπίζονται και επισημάνονται ηλεκτρονικά από το σύστημα (εικόνα 2.21), είτε μπορεί να γίνει με φυσικό τρόπο από τους τεχνολόγους.

Το BD FocalPoint GS* Imaging System έχει την ίδια λειτουργική φιλοσοφία με το ThinPrep Imaging System. Το σύστημα επεξεργάζεται μόνο κολποτραχηλικά επιχρίσματα SurePath τα οποία καθώς τα σκανάρει (ένα-ένα) αναγνωρίζει 10 ΟΠ στο επίχρισμα που έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα να περιέχουν αλλοιώσεις. Στην συνέχεια τα πεδία αυτά ελέγχονται μικροσκοπικά από τους τεχνολόγους και αν βρεθεί οποιαδήποτε ανωμαλία τότε επανεξετάζεται ολόκληρο το επίχρισμα. Σύμφωνα με τον κατασκευαστή το FocalPoint GS Imaging System μπορεί αν επεξεργαστεί 170 επιχρίσματα σε 8 ώρες. Καθώς έχει εγκριθεί πρόσφατα σχετικά από το FDA, δεν υπάρχουν αρκετές μελέτες σχετικές με την απόδοσή του, όμως μέχρι τώρα έχει βρεθεί ότι τα ποσοστά εξέτασης επιχρισμάτων έχουν αυξηθεί κατά 31%, έχει σημειωθεί αύξηση της ευαισθησίας και μείωση της ειδικότητας για την ανίχνευση LSIL+ και HSIL+, και επίσης η αναλογία ASCUS:SIL έχει μειωθεί σημαντικά33. Βέβαια μια πιο πρόσφατη έρευνα34 έδειξε υψηλότερα ποσοστά εύρεσης LSIL και ASCUS καθώς και καντιτίασης και βακτηριακής κολπίτιδας. Στην έρευνα αυτή η αναλογία ASCUS:SIL αυξήθηκε με την χρήση του FocalPoint GS Imaging System (από 1,4 σε 1,9) σε αντίθεση με την

* GS = guided screening.

35

προηγούμενη έρευνα. Ένα σημαντικό εύρημα αυτής της έρευνας ήταν η μείωση στα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα σε σχέση με τα αναμενόμενα ποσοστά. Χρειάζονται και άλλες μελέτες για να προσδιοριστεί η απόδοση του συστήματος, το οποίο μέχρι τώρα φαίνεται να είναι ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για την αξιολόγηση κολποτραχηλικών επιχρισμάτων σε πληθυσμό χαμηλού κινδύνου.

Με την χρήση των αυτοματοποιημένων συστημάτων στην

πρωτοβάθμια εξέταση κολποτραχηλικών επιχρισμάτων δεν εξαλείφονται τα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα, τα οποία συνεχίζουν να απαντούν στην καθημερινή πρακτική αλλά σε μικρότερο βαθμό30.

36

33 ΠΠΛΛΕΕΟΟΝΝΕΕΚΚΤΤΗΗΜΜΑΑΤΤΑΑ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ

ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ

Η Κυτταρολογία Υγρής Φάσης (ΚΥΦ) έχει σημειώσει παγκόσμια

επιτυχία. Ολοένα και περισσότερα εργαστήρια έχουν αλλάξει τον τρόπο παρασκευής και επεξεργασίας επιχρισμάτων από την συμβατική μέθοδο στην μέθοδο ΚΥΦ. Περισσότερο από το 90% των επιχρισμάτων στις Ηνωμένες Πολιτείες έχουν συλλεχθεί και επεξεργαστεί με την μέθοδο ΚΥΦ, ενώ χώρες όπως η Γαλλία, το Ηνωμένο Βασίλειο, ο Καναδάς (Οντάριο), έχουν υιοθετήσει πλήρως την τεχνολογία της κυτταρολογίας υγρής φάσης. Αυτή η μεταβολή από την συμβατική κυτταρολογία στην ΚΥΦ σημειώθηκε βάση μιας σειράς βελτιώσεων που έφερε η μέθοδος ΚΥΦ όπως η βελτίωση στην ποιότητα δείγματος, στην επαναληψιμότητα ή αναπαραγωγιμότητα, στην ευαισθησία και στην ειδικότητα καθώς και την ικανότητά του να εκτελούνται, μοριακές εξετάσεις.

Η ανταπόκριση που είχε η μέθοδος αυτή οφειλόταν στα

πλεονεκτήματά της τα οποία είναι:

Η άμεση μονιμοποίηση, με την οποία επιτυγχάνεται η διατήρηση των λεπτομερειών του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος στην καλύτερη δυνατή κατάσταση.

Όλο το υλικό που συλλέγεται είναι διαθέσιμο για μικροσκοπική αξιολόγηση

Ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα προετοιμάζεται για την κυτταρολογική αξιολόγηση, αλλά ανάλογα με τις ανάγκες, πολλαπλάσια δείγματα μπορούν να προετοιμαστούν από το ίδιο φιαλίδιο.

Το καθαρό υπόστρωμα, με αυτό τον τρόπο τα επιθηλιακά κύτταρα που έχουν ενδιαφέρον είναι λιγότερο πιθανό να «κρυφτούν».

Τα τυχαιοποιημένα κύτταρα επιστρώνονται σε ένα λεπτό στρώμα πάνω σε μια σταθερή περιοχή του πλακιδίου. Η περιοχή που καλύπτεται είναι μικρή και ο χρόνος που απαιτείται για την εξέταση του είναι μικρότερος από αυτόν που απαιτείται για την εξέταση συμβατικών παρασκευασμάτων.

Μείωση στα ποσοστά ανεπαρκών δειγμάτων.

37

Η δυνατότητα εφαρμογής μοριακών εξετάσεων όπως HPV τεστ, έλεγχο για γονόρροια και χλαμύδια.

Δυνατότητα αυτοματοποιημένης ανάλυσης των δειγμάτων.

Η μεταβολή στην ΚΥΦ έγινε βάση εκατοντάδων ερευνών που έχουν διενεργηθεί και έχουν μελετήσει την αποτελεσματικότητα της κυτταρολογίας υγρής φάσης εξετάζοντας παράγοντες όπως η ευαισθησία και η ειδικότητα, την δυνατότητα εφαρμογής πολλαπλών εξετάσεων από το ίδιο δείγμα, τα ποσοστά ανεπαρκών δειγμάτων, τη δυνατότητα αυτοματοποιημένης ανάλυσης και η εφαρμογή μοριακών εξετάσεων.

3.1 Απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης

3.1.1 Η απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στον έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων

Σκοπός της κυτταρολογίας υγρής φάσης είναι να αντικαταστήσει την συμβατική κυτταρολογία και να αποτελεί την μοναδική μέθοδο ανίχνευσης άτυπων κυττάρων, του καρκίνου του τραχήλου ή τον προκαρκινικών αλλοιώσεων (LSIL και HSIL) συν άλλων κατηγοριών.

3.1.1.1 Δημοσιευμένες έρευνες και στοιχεία που υποστηρίζουν την χρήση της κυτταρολογίας υγρής φάσης στην κλινική πράξη

Από τότε που το FDA ενέκρινε το ThinPrep Pap Test ακολούθησε

μια πληθώρα ανεξάρτητων μεταναλύσεων οι οποίες σύγκριναν την κλινική απόδοση της μεθόδου ΚΥΦ με την συμβατική μέθοδο. Οι μελέτες αξιολόγησαν ίδιους συντελεστές απόδοσης για την σύγκριση των δυο τεχνολογιών, όπως τα ποσοστά μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων και τα ποσοστά ανίχνευσης των ASCUS, LSIL και HSIL.

Επειδή οι διάφορες τεχνολογίες της κυτταρολογίας υγρής φάσης χρησιμοποιούν και διαφορετικές μεθοδολογίες, η ανάλυση μιας συγκεκριμένης τεχνολογίας ΚΥΦ σε σύγκριση με την συμβατική μέθοδο ήταν αποτελεσματικότερη περισσότερο αντιπροσωπευτική. Έτσι οι έρευνες που

38

διενεργήθηκαν από τους Abulafia και συνεργάτες35, και Bernstein και συνάδελφοι36 αξιολόγησαν την απόδοση του ThinPrep Pap test μόνο και ανέδειξαν σημαντική βελτίωση ως προς τα ποσοστά ανίχνευσης των LSIL και HSIL σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία. Οι Klinkhamer και συνάδεολφοι37 δήλωσαν ότι χρειάζονται περισσότερες έρευνες για να αναλυθεί και να ερμηνευτεί η απόδοση της τεχνολογίας SurePath, το ThinPrep Pap test έδειξε μια συνεχή βελτίωση σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία ως προς την ανίχνευση των LSIL και HSIL.

Επιπλέον μεταναλύσεις8,38 αξιολόγησαν την απόδοση διάφορων τεχνολογιών της ΚΥΦ σε σχέση με την συμβατική κυτταρολογία. Οι έρευνες αυτές, που συμπεριέλαβαν τις τεχνολογίες ΚΥΦ στο σύνολο τους, αποφάνθηκαν ότι η απόδοση της ΚΥΦ δεν είναι βέλτιστη της συμβατικής κυτταρολογίας. Οι λεπτομέρειες από αυτές τις έρευνες φαίνονται στον πίνακα 3.1. Μελέτη Τεχνολογία ΚΥΦ Αποτελέσματα μελέτης

(ΚΥΦ έναντι ΣΚ)

Nanda και συν.6

ThinPrep Υψηλότερη ευαισθησία για την ΚΥΦ όμως μελετήθηκαν μόνο 3 έρευνες

Payne και συν.3

ThinPrep/SurePath Μερικά αποτελέσματα έδειξαν βελτίωση της ευαισθησίας της μεθόδου ΚΥΦ

Bernstein και συν.36

ThinPrep Η ΤΡ ίδια με την ΣΚ ως προς την διάγνωση ASCUS (95% CI, 0.99-1.06) και καλύτερη από την ΣΚ για την διάγνωση LSIL (95% CI, 2.05-2.26) και HSIL (95% CI, 2.06-2.47)

Hartmann και συν.39

ThinPrep/SurePath Προς το παρόν τα στοιχεία είναι ανεπαρκή για να εκτιμηθεί εάν η ΚΥΦ είναι καλύτερη της ΣΚ

Sulik και συν.40

ThinPrep/SurePath Η ΚΥΦ έδειξε υψηλότερη ευαισθησία (90%; 95% CI 77–96%) από ότι η ΣΚ (79%; 95% CI:59–91%) για την ανίχνευση CIN2 και CIN+

Abulafia και συν.35

ThinPrep Η ευαισθησία του TP ήταν 76% ενάντια της ΣΚ που ήταν 68% Η ειδικότητα του TP ήταν 86% ενάντια της ΣΚ που ήταν 79%

Klinkhamer και συν.37

ThinPrep/SurePath Η ευαισθησία ως προς την ανίχνευση ASCUS ή ASCUS+ ήταν χαμηλότερη σε σχέση με την ΣΚ για το σύστημα SP. Λόγω αντικρουόμενων αποτελεσμάτων δεν υπήρχε κατάληξη ως προς την ανίχνευση LSIL, HSIL ή σοβαρότερου βαθμού με την SP. Καλύτερη ευαισθησία για το TP για την ανίχνευση ASC ή ASC+ και LSIL ή LSIL+ σε σύγκριση με την ΣΚ Πιθανόν η ΤΡ έχει υψηλότερα ποσοστά θετικών αποτελεσμάτων και μεγαλύτερη απόλυτη ευαισθησία για την ανίχνευση HSIL

39

συνέχεια

Arbyn και συν.41

ThinPrep/SurePath Ανευρέθηκαν περισσότερα LSIL σε παρασκευάσματα ΚΥΦ παρά ΣΚ Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά ως προς τα ποσοστά θετικότητας για ASCUS και HSIL Ανιχνεύτηκαν περισσότερα LSIL σε ΚΥΦ παρασκευάσματα: 80% (95% CI 52–112%) ΤΡ και 54% (95% CI 25–90%) SP Ανιχνεύτηκαν περισσότερα HSIL σε ΚΥΦ παρασκευάσματα: 72% (95% CI 42–108%) ΤΡ και 47% (95% CI 14–89%) SP Δεν σημειώθηκε μείωση στην θετική προγνωστική αξία της ΚΥΦ έναντι της ΣΚ

Davey και συν.8

ThinPrep/SurePath Δεν σημειώθηκαν διαφορές στα μη ικανοποιητικά παρασκευάσματα μεταξύ των δύο μεθόδων Η ΚΥΦ ανίχνευσε περισσότερα HSIL δείγματα από ότι η ΣΚ

Arbyn και συν38

ThinPrep/SurePath Η ευαισθησία για την ανίχνευση ASCUS, LSIL και HSIL δεν είχε σημαντική διαφορά με την ΣΚ Η ειδικότητα για την ανίχνευση LSIL και HSIL βρέθηκε να είναι στα ίδια ποσοστά μεταξύ ΚΥΦ και ΣΚ Ενώ η ειδικότητα για ASCUS ήταν χαμηλότερη στην ΚΥΦ από ότι στην ΣΚ

Πίνακας 3.1 Μεταναλύσεις οι οποίες συγκρίνουν την ΚΥΦ με την συμβατική κυτταρολογία

για την ανίχνευση τραχηλικών αλλοιώσεων.

Διευκρινίσεις: ΣΚ=συμβατική κυτταρολογία, ΤΡ=ThinPrep, SP=SurePath, + =αλλοίωση σοβαρότερου βαθμού HSIL (high grade squamous intraepithelial lesion) = Πλακώδεις ενδοεπιθηλιακές βλάβες υψηλού βαθμού. LSIL (low grade squamous intraepithelial lesion) = Πλακώδεις ενδοεπιθηλιακές βλάβες χαμηλού βαθμού. SIL (squamous intraepithelial lesion) = Πλακώδεις ενδοεπιθηλιακές βλάβες. ASCUS (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) = Άτυπα πλακώδη κύτταρα απροσδιορίστου σημασίας. CIN (cervical intraepithelial neoplasia) = Τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία.

Από μια άλλη έρευνα42 η οποία αξιολόγησε την απόδοση της ΚΥΦ, βασισμένη στην μέχρι τότε βιβλιογραφία, παρουσιάστηκαν τα εξής ευρήματα: η ΚΥΦ ανίχνευσε περισσότερα LSIL δείγματα από ότι η συμβατική κυτταρολογία σε 17 από τις 21 έρευνες που αξιολόγησαν την ThinPrep μέθοδο και σε 9 από τις 12 έρευνες που αξιολόγησαν την SurePath μέθοδο. Περισσότερα δείγματα HSIL ανιχνεύτηκαν σε 4 από 6 ThinPrep έρευνες και σε 1 από 2 SurePath έρευνες σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία. Όλες αυτές οι έρευνες χρησιμοποιούσαν την μεθοδολογία «διαχωρισμού

40

δείγματος»* (split sample). Ενώ, σε όλες τις 15 έρευνες που χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία «απευθείας στο φιαλίδιﻆ (direct to vial) ανιχνεύτηκαν περισσότερα LSIL+ δείγματα με την ΚΥΦ παρά με την συμβατική κυτταρολογία και σε όλες τις 8 έρευνες που αξιολόγησαν τα ποσοστά αναφοράς για HSIL+, η ΚΥΦ έδειξε αυξημένα ποσοστά ερμηνείας τέτοιων δειγμάτων.

Η έρευνα αξιολόγησε επίσης την ευαισθησία και ειδικότητα της μεθόδου ΚΥΦ. Από τα ευρήματα φάνηκε ότι η συνολική ευαισθησία της συμβατικής μεθόδου ήταν 71,5% ενώ της ΚΥΦ 80,1%. Έμμεση σύγκριση μεταξύ των δύο μεθόδων (ΚΥΦ και συμβατική κυτταρολογία) δεν ανίχνευσε διαφορές στην ευαισθησία, επίσης και μια μετανάλυση που συμπεριλάμβανε 6 έρευνες, οι οποίες μελετούσαν την ειδικότητα των δύο μεθόδων, δεν ανέδειξε διαφορά ως προς την ακρίβεια της μεθόδου.

ΚΥΦ / Συμβατική κυτταρολογία

HSIL+

LSIL+

ASCUS+

Ευαισθησία

57,1/55,2

79,1/75,6

90,4/88,2

Ειδικότητα 97/96,7 78,8/81,2 64,6/71,3

Πίνακας 3.2 Αποτελέσματα από τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες μελέτες που συγκρίνουν την

ευαισθησία και την ειδικότητα της ΚΥΦ με την συμβατική κυτταρολογία38

. Η ανίχνευση των HSIL δεν φαίνεται να βελτιώνεται με την ΚΥΦ.

3.1.1.2 Έρευνες του Κολλεγίου των Αμερικανών Παθολόγων

Το Κολλέγιο των Αμερικανών Παθολόγων, ΚΑΠ (College of American Pathologists) είναι ένας οργανισμός ο οποίος συνεργάζεται με εκατοντάδες εργαστήρια ανά τον κόσμο, κυρίως στις ΗΠΑ, με σκοπό να παρέχει προγράμματα διασφάλισης ποιότητας στα κλινικά εργαστήρια. Τα προγράμματα αυτά βασίζονται στην συγκέντρωση δεδομένα από όλα τα εργαστήρια με απώτερο σκοπό την θέσπιση σημείων αναφοράς των

* Στις έρευνες «διαχωρισμού δείγματος» το δείγμα αφού συλλεχθεί από την ασθενή πρώτα επιστρώνεται σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα ώστε να παρασκευαστεί επίχρισμα συμβατικής κυτταρολογίας και ύστερα το υπολειπόμενο δείγμα χρησιμοποιείται για την παρασκευή επιχρίσματος ΚΥΦ. Με αυτόν τον τρόπο όμως θεωρείται ότι μειώνεται η απόδοση της ΚΥΦ. † Στις έρευνες «απευθείας στο φιαλίδιο» το δείγμα αφού συλλεχθεί από την ασθενή

μεταφέρεται αμέσως στο φιαλίδιο με συντηρητικό υγρό για την παρασκευή επιχρισμάτων ΚΥΦ. Οι έρευνες που χρησιμοποιούν αυτή την μεθοδολογία είναι πιο αντιπροσωπευτικές των επιδόσεων της ΚΥΦ.

41

πρακτικών ποιότητας με στόχο την συνεχή βελτίωση της ποιότητας στα κλινικά εργαστήρια.

Πρόσφατα το ΚΑΠ διενήργησε μια έρευνα43 για την αξιολόγηση των πρότυπων πρακτικών στα προγράμματα τραχηλικής κυτταρολογίας. Αυτές οι έρευνες αποτέλεσαν την βάση για την θέσπιση σημείων αναφοράς στο πρόγραμμα του ΚΑΠ για την διαπίστευση των εργαστηρίων. Το αντικείμενο της έρευνας ήταν η αξιολόγηση στις αλλαγές των πρακτικών των εργαστηρίων κυτταρολογίας, η ανάλυση και η υιοθέτηση νέων τεχνολογιών και ο καθορισμός των ποσοστών αναφοράς που συμπεριλαμβάνουν την κυτταρολογία υγρής φάσης. Στην έρευνα συμμετείχαν 679 εργαστήρια τα περισσότερα εκ των οποίων χρησιμοποιούσαν είτε την ThinPrep μέθοδο είτε την SurePath μέθοδο. Στα εργαστήρια ζητήθηκε να υποβάλουν τα δεδομένα του έτους 2006, σύμφωνα με το σύστημα Bethesda 2001, για την συμβατική κυτταρολογία και την ΚΥΦ, και στην συνέχεια τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με αυτά του έτους 2003. Συνολικά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχε μια τα εργαστήρια τα οποία χρησιμοποιούσαν μόνο την συμβατική μέθοδο για την παρασκευή κολποτραχηλικών επιχρισμάτων μειώθηκαν (24.4% έναντι 13.7%) και ανάλογα σημειώθηκε αύξηση στα ποσοστά των εργαστηρίων που χρησιμοποιούσαν την μέθοδο ΚΥΦ (9.3% έναντι 25.5%). Από τα εργαστήρια τα οποία ανέφεραν ότι χρησιμοποιούν την ΚΥΦ (n = 587), περίπου το 70% (411/587) χρησιμοποιούσαν την μέθοδο ThinPrep ενώ το υπόλοιπο 30% (176/587) χρησιμοποιούσαν την μέθοδο SurePath.

Στον πίνακα 3.3 παρουσιάζεται η συνολική επίδοση των εργαστηρίων χρησιμοποιώντας τον μέσο (50ο εκατοστημόριο) των ποσοστών των εργαστηριακών αναφορών για κάθε κυτταρολογικό εύρημα ASCUS, LSIL και HSIL ανά κυτταρολογική μέθοδο. O μέσος των ποσοστών ανίχνευσης LSIL για το SurePath Pap test (2,5%) και για το ThinPrep Pap test (3,0%) ήταν σημαντικά υψηλότερα από τον μέσο των ποσοστών ανίχνευσης LSIL με την συμβατική κυτταρολογία (1,3% , Ρ<.001). Ο μέσος των ποσοστών ανίχνευσης HSIL ήταν σημαντικά υψηλότερος με την ThinPrep μέθοδο (0,6%) από ότι με την μέθοδο SurePath ή την συμβατική μέθοδο (και οι δύο 0,3% , Ρ=.05). Ο μέσος των ποσοστών ανίχνευσης ASCUS για την μέθοδο SurePath (4.1%) και την μέθοδο ThinPrep (4,9%) ήταν σημαντικά υψηλότεροι του μέσου των ποσοστών ανίχνευσης ASCUS με την συμβατική μέθοδο (2,4% , Ρ<.001).

Από αυτή την ανάλυση είναι ξεκάθαρο ότι καθεμία από τις μεθόδους ΚΥΦ παρέχει συγκεκριμένα πλεονεκτήματα από ότι η συμβατική μέθοδος για την εξέταση κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, αν και οι δύο τεχνολογίες ΚΥΦ διαφέρουν μεταξύ τους ως προς την απόδοση.

42

Κατηγορία

Συμβατικά παρασκευάσματα

SurePath παρασκευάσματα

ThinPrep παρασκευάσματα

ASCUS 2,4 4,1 4,9 LSIL 1,3 2,5 3,0 HSIL 0,3 0,3 0,6 Μη ικανοποιητικά 1,0 0,3 1,1

Πίνακας 3.3 Μέσος ποσοστών των εργαστηριακών αναφορών (50

ο εκατοστημόριο)

για τις τέσσερις μεγάλες κυτταρολογικές κατηγορίες κολποτραχηλικών επιχρισμάτων συμβατικής κυτταρολογίας, SurePath και ThinPrep.

3.1.1.3 Βασικές μελέτες (pivotal studies) σύγκρισης των τεχνολογιών κυτταρολογίας υγρής φάσης με την συμβατική κυτταρολογία

ThinPrep Pap test

Μια βασική μελέτη44 που αξιολογούσε την μέθοδο ThinPrep έδειξε ότι το τεστ αυτό προσέφερε 65% αύξηση (Ρ<.001) στα ποσοστά διάγνωσης LSIL ή υψηλότερου βαθμού αλλοίωσης, και απέφερε βελτίωση ως προς την ποιότητα του δείγματος σε σχέση με τα συμβατικά κολποτραχηλικά επιχρίσματα (P<.001). Το συμπέρασμα της μελέτης ήταν ότι η ThinPrep μέθοδος απέφερε μια στατιστικά σημαντική βελτίωση στον έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων επί της συμβατικής μεθόδου. Πολλές μεταγενέστερες έρευνες αιτιολόγησαν αυτά τα ευρήματα. Οι Díaz-Rosario και Kabawat βρήκαν ότι η ανίχνευση των LSIL (71,7% , P<.001) και HSIL (102.5% , P <.001) με την μέθοδο ThinPrep είχε αυξηθεί σημαντικά συγκρίνοντας πάντα με την συμβατική μέθοδο. Οι Hatch και συνεργάτες45 κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι με την μέθοδο ThinPrep τα ποσοστά ανίχνευσης των HSIL (59,7%) ήταν υψηλότερα της συμβατικής μεθόδου (Ρ<.001). Επίσης και η ανίχνευση των LSIL βρέθηκε να είναι σημαντικά καλύτερη της συμβατικής (Ρ<.01).

Άλλες έρευνες ανέδειξαν την βελτιωμένη ευαισθησία της μεθόδου για την ανίχνευση αλλοιώσεων του αδενικού επιθηλίου του τραχήλου της μήτρας και αδενοκαρκινώματος46-51, πράγμα που οδήγησε στην έγκριση της μεθόδου από τον FDA ως κατάλληλη τεχνολογία για την ανίχνευση αυτών των αλλοιώσεων. SurePath Pap test

Με την χρήση της μεθόδου SurePath αυξήθηκαν τα ποσοστά ανίχνευσης των LSIL 47% (Ρ=.0011) και HSIL 116% (Ρ=.0002) σε σχέση με την συμβατική κυτταρολογία52. Μια μεταγενέστερη έρευνα ανέφερε αντίστοιχα αποτελέσματα όπου με την μέθοδο SurePath σημειώθηκε αύξηση

43

στα ποσοστά ανίχνευσης των ASCUS 75,1% , LSIL 107,2% και HSIL 64,4% (Ρ<.00001)53.

3.1.2 Η απόδοση της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στον έλεγχο επιχρισμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας

Αν και η κυτταρολογία υγρής φάσης έχει ευνοϊκές συνέπειες όσον αφορά τα κολποτραχηλικά επιχρίσματα, ωστόσο, στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία, έρευνες που συγκρίνουν την διαγνωστική ακρίβεια και την μορφολογία αυτών των επιχρισμάτων έχουν βγάλει διάφορα αποτελέσματα.

Από μια έρευνα του ΚΑΠ54 βρέθηκε ότι η διάγνωση στην αποφολιδωτική γαστρεντερική κυτταρολογία ήταν ακριβέστερη σε δείγματα ΚΥΦ από ότι σε άλλου τύπου παρασκευάσματα. Συγκεκριμένα, η ακριβής διάγνωση της κακοήθειας σημείωσε ποσοστό 88,5% σε άλλου τύπου παρασκεύασμα και 95,9% σε παρασκευάσματα ThinPrep (TP). Η ίδια αύξηση στα ποσοστά συμφωνίας, μεταξύ των δύο μεθόδων, σημειώθηκε και στα ποσοστά ανίχνευσης του αδενοκαρκινώματος αλλά όχι για το καρκίνωμα του πλακώδους επιθηλίου. Η διαφορά ήταν στατιστικά σημαντική για γαστρικά και οισοφαγικά δείγμα αλλά όχι και για τα δείγματα χολής*. Η ίδια επίδοση σημειώθηκε και στα καλοήθη δείγματα αλλά όχι στο ίδιο βαθμό, υποδεικνύοντας ότι τα παρασκευάσματα ΤΡ έχουν μεγαλύτερο αντίκτυπο στην ευαισθησία παρά στην ειδικότητα όσον αφορά δείγματα γαστρεντερικής κυτταρολογίας.

Και άλλες έρευνες55-57 μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας (υγρά κοιλοτήτων σώματος και δείγματα από απορρόφηση μέσω λεπτής βελόνης) έχουν δείξει ίση ή καλύτερη επίδοση της ΚΥΦ σε σχέση με τα συμβατικά παρασκευάσματα. Σε αυτές τις αναφορές ήταν δύσκολο να αποδειχθεί στατιστικά σημαντικότερη διαγνωστική ακρίβεια αν και η ΚΥΦ ήταν η προτιμότερη μέθοδος λόγω της ενισχυμένης μορφολογικής εικόνας των χαρακτηριστικών των κυττάρων.

Σε δύο άλλες μεγάλες έρευνες βρέθηκε ενισχυμένη διαγωνιστική απόδοση σε περιτοναϊκά και πυελικά δείγματα ThinPrep από ότι σε άλλου τύπου παρασκευάσματα ίδιας προέλευσης58, παρόλο που δεν βρέθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά όταν συγκρίθηκαν τα συνολικά ποσοστά των υγρών του σώματος ως σύνολο, μεταξύ των δύο μεθόδων (81% για TP και 77% για συμβατικά παρασκευάσματα).

Οι Laucirica και συνεργάτες59 απέδειξαν ότι η διάγνωση ουροθηλιακού καρκινώματος υψηλού βαθμού ήταν, τις περισσότερες φορές, σωστή σε δείγματα ούρων που είχαν επεξεργαστεί με την μέθοδο ΚΥΦ από ότι με την συμβατική μέθοδο (τα δείγματα παρουσίασαν συμφωνία με την

* Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν με βούρτσα.

44

διάγνωση αναφοράς: 92% για συμβατικά παρασκευάσματα, 94,6% για SurePath και 96,5% για ThinPrep).

Μια μεγάλη έρευνα60 (n=1118) που διενεργήθηκε ειδικά για κυτταρολογικά δείγματα χοληδόχου πόρου και παγκρέατος, τα οποία συλλέχθηκαν με βουρτσάκι, ανέδειξε την στατιστικά σημαντική διαφορά στην ευαισθησία και την ακρίβεια των δειγμάτων ThinPrep σε σχέση με άλλου τύπου παρασκευάσματα (ευαισθησία: 59,7% έναντι 28,1% αντίστοιχα, ακρίβεια: 78,8% έναντι 68,2% αντίστοιχα). Άλλες αντίστοιχες αλλά μικρότερες έρευνες61-62 απέτυχαν να αποδείξουν μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της ΚΥΦ και συμβατικών παρασκευασμάτων αλλά όμως διευκρινίσθηκε ότι η προτιμότερη μέθοδος εξέτασης των δειγμάτων ήταν η ΚΥΦ λόγω της ενισχυμένης εμφάνισης των μορφολογικών χαρακτηριστικών των κυττάρων. Επίσης σε μια έρευνα που συμπεριλάμβανε 98 κυτταρολογικά δείγματα χολής, οι Minamiguchi και συνάδελφοι63 βρήκαν χαμηλότερα ποσοστά ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων σε ThinPrep παρασκευάσματα χολής από ότι σε συμβατικά παρασκευάσματα.

Πρόσφατες έρευνες έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι η διαγνωστική ακρίβεια της ΚΥΦ και της συμβατικής κυτταρολογίας είναι παρόμοια όσον αφορά την αξιολόγηση δειγμάτων μαστού από FNAΒ. Οι Dey P και συνεργάτες64 έδειξαν ότι τα παρασκευάσματα μαστού ΚΥΦ παρουσιάζουν καλά μονιμοποιημένα κύτταρα, καθαρό υπόστρωμα, διατηρώντας όμως παράλληλα όλα τα χαρακτηριστικά του που κάνουν την διάγνωση του καρκίνου ή του ινοαδενώματος δυνατή. Όμως οι Bédard YC και συνεργάτες65 μελετώντας 7464 δείγματα μαστού από FNAB για να συγκρίνουν τις δύο μεθόδους κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι δύο μέθοδοι δεν παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές ως προς την ακρίβεια. Μια άλλη μεγάλη έρευνα66 που μελετούσε κυτταρολογικά δείγματα αναπνευστικού συστήματος επίσης συμπέρανε ότι δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς την ακρίβεια μεταξύ των δύο μεθόδων, όμως η ΚΥΦ βρέθηκε να ευνοείται λόγω τεχνικών χαρακτηριστικών όπως το καθαρό υπόστρωμα, η καλή μονιμοποίηση των κυττάρων και η ομοιόμορφη κατανομή τους στο επίχρισμα, στοιχεία που έκαναν την διάγνωση πιο εύκολη. Η έρευνα των Cochand-Priollet και συνεργατών67 έδειξε ότι η ακρίβεια της συμβατικής μεθόδου ήταν ανώτερη της ΚΥΦ σε δείγματα θυρεοειδούς από FNA καθώς οι τεχνολόγοι δυσκολεύτηκαν να ερμηνεύσουν διάφορα ευρήματα στα επιχρίσματα ΚΥΦ.

3.1.3 Συμπέρασμα

Γενικά από τις διάφορες μεταναλύσεις η κυτταρολογία υγρής φάσης έχει δείξει να έχει καλύτερη απόδοση από την συμβατική κυτταρολογία. Συνολικά η ακρίβεια της μεθόδου φαίνεται να είναι καλύτερη από της συμβατικής μεθόδου σημειώνοντας αύξηση στην ευαισθησία, ενώ η

45

ειδικότητα είτε παραμένει στα ίδια επίπεδα είτε έχει αυξηθεί. Τα ποσοστά ανίχνευσης των χαμηλού βαθμού αλλοιώσεων του πλακώδους επιθηλίου έχουν αυξηθεί σημαντικά με την χρήση της ΚΥΦ, όπως επίσης και τα ποσοστά ανίχνευσης των ASCUS. Όμως όσον αφορά την ανίχνευση των HSIL τα ποσοστά των ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων σε αυτή την κατηγορία φαίνεται να είναι υψηλότερα σε σχέση με τις άλλες κατηγορίες, πράγμα που υποδηλώνει μια δυσκολία στην αναγνώριση αυτών των κυττάρων. Αυτό ίσως να οφείλεται στην διαφορετική εμφάνιση και στην παρουσία άλλων ιδιαίτερων χαρακτηριστικών των HSIL σε παρασκευάσματα ΚΥΦ σε σχέση με τα συμβατικά παρασκευάσματα68. Ωστόσο όμως, η μέθοδος έχει παρουσιάσει συνολική μείωση στα ποσοστά των ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων68-69. Γενικά η ΚΥΦ έχει δείξει υψηλότερη θετική προγνωστική αξία (ppv) από ότι η συμβατική κυτταρολογία.

Επίσης και στα δείγματα μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας η ακρίβεια της ΚΥΦ φάνηκε να είναι, τις περισσότερες φορές, ανώτερη της συμβατικής κυτταρολογίας, σημειώνοντας υψηλότερα ποσοστά ακριβής διάγνωσης και συμφωνίας με τα αποτελέσματα αναφοράς σε διάφορες έρευνες, αυξάνοντας έτσι την ευαισθησία και την ειδικότητα της μεθόδου, μόνο όμως σε εκείνες τις περιπτώσεις που ο κυτταροπαθολόγος έχει επαρκή εκπαίδευση και εμπειρία με την ΚΥΦ70.

3.2 Επάρκεια δειγμάτων

Η αξιολόγηση της επάρκειας των δειγμάτων θεωρείται από πολλούς ως το σημαντικότερο στοιχείο του προγράμματος διασφάλισης ποιότητας του συστήματος Bethesda.

Για να ερμηνευτεί σωστά ένα κολποτραχηλικό επίχρισμα θα πρέπει να περιλαμβάνει επαρκή αριθμό κυττάρων του πλακώδους επιθηλίου. Σύμφωνα με το σύστημα Bethesda λοιπόν τα συμβατά επιχρίσματα πρέπει να περιέχουν 8000-12000 ορατά και καλά διατηρημένα πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα ενώ, ένα κολποτραχηλικό επίχρισμα ΚΥΦ πρέπει να περιέχει τουλάχιστον 5000 ορατά και καλά διατηρημένα πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα για να θεωρηθεί επαρκές. Ο αριθμός αυτός έχει προκύψει βάση μελετών οι οποίες έδειξαν ότι σε επιχρίσματα με λιγότερο αριθμό κυττάρων είναι λιγότερο πιθανό να ανευρεθούν μη φυσιολογικά κύτταρα71-73. Παρόλα αυτά, μια προκαταρτική μελέτη, η οποία περιλαμβάνεται στις κατευθυντήριες γραμμές του συστήματος Bethesda, έδειξε ότι είναι λιγότερο πιθανό να ανευρεθούν μη φυσιολογικά κύτταρα σε επίχρισμα ΚΥΦ του οποίου ο συνολικός αριθμός κυττάρων του δεν υπερβαίνει τα 20 00074. Έχοντας υπόψη αυτή την έρευνα, το σύστημα Bethesda επιτρέπει, για τα επιχρίσματα που ο αριθμός κυττάρων κυμαίνεται από 5 000 έως 20 000, ένα «σχόλιο ως δείκτη ποιότητας» στις εκθέσεις αναφοράς όπου οι κλινικοί γιατροί είναι αυτοί που αποφασίζουν εάν είναι απαραίτητη η επανάληψη της εξέτασης71.

46

Επίσης, οι McQueen και Duval75 κατά την έρευνά τους έδειξαν ότι σε ένα επίχρισμα ΚΥΦ πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 87 άτυπα κύτταρα ώστε η ανίχνευσή τους να γίνει με βεβαιότητα. Όμως σύμφωνα με μαθηματικές πράξεις αυτό είναι δυνατό μόνο σε επιχρίσματα με αριθμό κυττάρων τουλάχιστον 10 000. Παρόλα αυτά η πλειοψηφία των εργαστηρίων που χρησιμοποιούν την μέθοδο κυτταρολογίας υγρής φάσης έχουν υιοθετήσει το σύστημα Bethesda για την αναφορά των αποτελεσμάτων τους.

Άλλοι παράγοντες που μπορεί να καθιστούν ένα δείγμα ανεπαρκές (ή μη ικανοποιητικό) είναι η παρουσία υπερβολικού αριθμού ερυθροκυττάρων ή φλεγμονωδών στοιχείων τα οποία προκαλούν συσκότιση αποκρύπτοντας πολλές φορές τα μη φυσιολογικά κύτταρα. Επίσης η απουσία κυττάρων της ζώνης μετάπτωσης καθιστά το δείγμα κατά Bethesda «ικανοποιητικό αλλά περιορισμένο» κατά το οποίο το δείγμα ελέγχεται αλλά σημειώνεται ότι δεν υπάρχουν ενδοτραχηλικά κύτταρα.

3.2.1 Ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων και οι αιτίες που τα προκαλούν

Ενώ πολλές έρευνες, συγκρίνοντας την Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης με την συμβατική κυτταρολογία, υποστηρίζουν ότι η ακρίβεια μεταξύ των δύο μεθόδων είναι ίδια, η μείωση στα ποσοστά των μη ικανοποιητικών δειγμάτων με την χρήση της ΚΥΦ αποτελεί ένα αδιάσειστο πλεονέκτημα της μεθόδου σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία.

Σε περίπτωση μη ικανοποιητικών δειγμάτων ο έλεγχος των επιχρισμάτων δεν μπορεί να ολοκληρωθεί με αποτέλεσμα να προκαλείται άγχος και δυσφορία στις γυναίκες ασθενείς και επίσης να σπαταλούνται αναλώσιμα υλικά πράγμα που έχει οικονομικό αντίκτυπο στο εργαστήριο και στους ασθενείς. Η ΚΥΦ μειώνει τα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων μειώνοντας τον αριθμό των περιπτώσεων που είναι ανεπαρκή λόγω φλεγμονωδών στοιχείων και αίματος που επισκιάζουν το επίχρισμα, και λόγω ανομοιογενούς κατανομής των κυττάρων ή κακής μονιμοποίησής τους.

Ο κύριος λόγος μη ικανοποιητικών δειγμάτων φαίνεται να είναι ο ανεπαρκής αριθμός κυττάρων, πράγμα που αποδεικνύεται από πολλές έρευνες. Οι Siebers και συνεργάτες76 βρήκαν ότι με την χρήση της ΚΥΦ σημειώθηκε σημαντική βελτίωση στην επάρκεια των δειγμάτων, με την ΚΥΦ να σημειώνει μείωση του ποσοστού των μη ικανοποιητικών δειγμάτων από 1,1% (συμβατικά παρασκευάσματα) σε 0,3%, ενώ όσον αφορά τα δείγματα τα οποία δεν έφεραν ενδοτραχηλικά κύτταρα βρέθηκε να σημειώθηκε αύξηση κατά 22% συγκρίνοντας με την συμβατική μέθοδο. Επίσης η έρευνα απέδειξε ότι ο κύριος λόγος μη ικανοποιητικών δειγμάτων αποτελεί η εύρεση ανεπαρκούς αριθμού κυττάρων στο επίχρισμα, και με την χρήση της ΚΥΦ

47

Κατάταξη δείγματος

Κ. Υγρής Φάσης Αρ. (%)

Συμβατική Κ. Αρ. (%)

Μη ικανοποιητικό Αίμα Φλεγμονώδη στοιχεία Ανεπαρκής αρ. κυττάρων Ανεπαρκής μονιμοποίηση Μηχανική βλάβη Κυτταρόλυση Λεπτές περιοχές Λιγοστά πλακώδη κύτταρα, υπερισχύουν τα ενδοεπιθηλιακά Σύνολο μη ικανοποιητικών δειγμάτων

0 (0.00)

12 (0.03) 136 (0.30)

0 (0.00) 1 (0.00) 0 (0.00) 0 (0.00)

4 (0.01)

153 (0.33)

111 (0.28) 84 (0.22)

183 (0.47) 15 (0.04) 11 (0.03)

4 (0.01) 4 (0.01)

22 (0.06)

434 (1.11)

Ικανοποιητικό αλλά περιορισμένο (ΙΑΠ)

Απουσία ενδοεπιθηλιακών κυττάρων Αίμα Φλεγμονώδη στοιχεία Ανεπαρκής αρ. κυττάρων Ανεπαρκής μονιμοποίηση Μηχανική βλάβη Κυτταρόλυση Λεπτές περιοχές Λιγοστά πλακώδη κύτταρα, υπερισχύουν τα ενδοεπιθηλιακά Σύνολο ΙΑΠ δειγμάτων

7001 (15.20) 25 (0.05)

109 (0.24) 423 (0.92)

0 (0.00) 1 (0.00) 3 (0.01) 5 (0.01)

20 (0.04)

7587 (16.47)

4864 (12.47) 514 (1.32) 815 (2.09) 321 (0.82) 56 (0.14) 10 (0.03) 55 (0.14) 63 (0.16)

47 (0.12)

6745 (17.29)

Ικανοποιητικό

38 326 (83.20)

31 831 (81.60)

Συνολικός αριθμός δειγμάτων

46 066

39 010

Πίνακας 3.4 Αιτίες κατάταξης δειγμάτων στις κατηγορίες «μη ικανοποιητικό» και

«ικανοποιητικό αλλά περιορισμένο».

σχεδόν μηδενίζονται οι άλλες αιτίες που είναι υπεύθυνες για την εμφάνιση μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων όταν αυτά επεξεργάζονται με την συμβατική μέθοδο (πίνακας 3.4). Οι Lee και συνεργάτες44 όμως βρήκαν μια αύξηση 19% στα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων ΚΥΦ, που οφειλόταν κυρίως στον ανεπαρκή αριθμό κυττάρων. Το εύρημα αποδόθηκε στον σχεδιασμό της έρευνας (split-sample) όπου πρώτα παρασκευάζονται συμβατικά επιχρίσματα και στην συνέχεια τα επιχρίσματα ΚΥΦ, οπότε το κυτταρικό υλικό είναι λιγότερο. Επίσης βρέθηκε 68% αύξηση των δειγμάτων που δεν περιείχαν ενδοτραχηλικά κύτταρα σε σχέση με τα αντίστοιχα ευρήματα στην συμβατική κυτταρολογία. Η «direct to vial» έρευνα των Corkill και συνεργατών77 έδειξε ότι τα ποσοστά εύρεσης δειγμάτων που δεν περιέχουν ενδοτραχηλικά κύτταρα ήταν παρόμοια μεταξύ των δύο μεθόδων, δηλώνοντας ότι «είναι αναμενόμενο τα ποσοστά αυτά να παραμείνουν ίδια ενώ η ΚΥΦ αντικαθιστά την συμβατική μέθοδο, καθώς ο τρόπος συλλογής

48

του δείγματος (σπάτουλα/βουρτσάκι ή cervex Brush) παραμένει ίδιος». Οι Duggan και συνεργάτες78 βρήκαν ότι τα δείγματα που δεν περιείχαν ενδοτραχηλικά κύτταρα σημείωσαν αύξηση 47% με την χρήση της ΚΥΦ και επίσης βρήκαν ότι ο ανεπαρκής αριθμός κυττάρων αποτελούσε την συχνότερη αιτία μη ικανοποιητικών δειγμάτων και για την ΚΥΦ και για την συμβατική κυτταρολογία. Τα ευρήματα αυτά αποδόθηκαν στην απειρία των δειγματοληπτών στην χρήση της καινούργια συσκευής δειγματοληψίας που χρησιμοποιείται στην μέθοδο ΚΥΦ. Οι Moriarty και συνεργάτες79

πραγματοποίησαν μια έρευνα η οποία συμπεριλάμβανε 674 εργαστήρια στις ΗΠΑ, το κύριο εύρημα της οποίας ήταν ότι ο ανεπαρκής αριθμός κυττάρων, είτε τα δείγματα επεξεργάστηκαν με την συμβατική μέθοδο είτε με την μέθοδο ΚΥΦ, αποτελεί τον κυριότερο λόγο μη ικανοποιητικών δειγμάτων. Πιο πρόσφατα οι Alsharif και συνεργάτες80 ερευνώντας τις αιτίες και την σημασία των μη ικανοποιητικών αποτελεσμάτων με την μέθοδο SurePath βρήκαν τα ίδια αποτελέσματα με τις προηγούμενες έρευνες.

Ο ανεπαρκής αριθμός κυττάρων που παρουσιάζεται σε ορισμένα δείγματα έχει συσχετιστεί επίσης και με την λήψη του δείγματος και την μεταφορά του από την συσκευή δειγματοληψίας στην αντικειμενοφόρο πλάκα. Αυτές οι «αδυναμίες» μπορεί να λάβουν χώρα και κατά την επεξεργασία του δείγματος με την μέθοδο ΚΥΦ. Ένας άλλος λόγος κατά τον οποίον επηρεάζονται τα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων θεωρείται η μη σωστή αξιολόγηση της κυτταροβρίθειας ή η ανακριβής χρήση των κριτηρίων κυτταροβρίθειας από τους κυτταροτεχνολόγους76. Επίσης το κατώτερο όριο κυτταροβρίθειας που υιοθετεί το κάθε εργαστήριο επηρεάζει τα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων λόγω ανεπαρκούς αριθμού κυττάρων στο επίχρισμα, δηλαδή αν το κατώτερο όριο είναι πολύ χαμηλό, τότε αυτό αποτελεί αιτία ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων. Σε περίπτωση που το κατώτερο όριο είναι πολύ υψηλό, αυτό οδηγεί σε πολύ αυξημένα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων, αυξάνοντας το άγχος των ασθενών και οδηγώντας σε περιττά έξοδα τόσο για τις ασθενείς όσο και για το εργαστήριο, επίσης αυξάνεται και το φόρτο εργασίας των εργαστηρίων αφού θα πρέπει να επαναλάβουν την εξέταση.

Η κατοχύρωση έγκυρων κριτηρίων κυτταροβρίθειας σε παγκόσμια κλίμακα είτε πρόκειται για την μέθοδο ΚΥΦ είτε για την συμβατική μέθοδο, είναι μείζονος σημασίας και σε αυτό έχει παίξει σπουδαίο ρόλο το σύστημα Bethesda θεσπίζοντας κριτήρια για την αξιολόγηση κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Έτσι έχουν λυθεί πολλά προβλήματα επικοινωνίας μεταξύ των ιατρών κυτταρολόγων, των εργαστηρίων και των κλινικών ιατρών και επίσης η δουλειά των επιδημιολόγων που συγκρίνουν την αποτελεσματικότητα των διαφόρων προγραμμάτων προληπτικού ελέγχου του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, έχει γίνει πολύ πιο εύκολη. Η ποικιλία στην ορολογία εμπόδιζε την ουσιαστική συζήτηση μεταξύ των εργαστηρίων, επηρέαζε την αντιμετώπιση του ασθενούς και την χρησιμοποίηση των βέλτιστων μεθόδων για την περίθαλψή του.

Όσον αφορά τα δείγματα τα οποία χαρακτηρίζονται «ικανοποιητικά αλλά περιορισμένα» λόγω έλλειψης ενδοτραχηλικών κυττάρων τα αποτελέσματα των διαφόρων ερευνών είναι αντικρουόμενα. Οι παράγοντες που μπορεί να οδηγήσουν σε αυξημένα ποσοστά τέτοιων δειγμάτων είναι

49

ίδια όπως και για τα μη ικανοποιητικά δείγματα76. Ένας λόγος μπορεί να είναι η ανεπαρκής μεταφορά όλων των ενδοτραχηλικών κυττάρων από την συσκευή δειγματοληψίας (cervex Brush) στο φιαλίδιο με το συντηρητικό υγρό λόγω του ότι τα ενδοτραχηλικά κύτταρα μπορεί να παγιδευτούν στην ενδοτραχηλική βλέννα η οποία παραμένει στις τρίχες της βούρτσας και δεν ξεπλένεται στο υγρό. Σύμφωνα με το σύστημα Bethesda σε ένα κολποτραχηλικό επίχρισμα ΚΥΦ ή συμβατικής κυτταρολογίας θα πρέπει να υπάρχουν τουλάχιστον 10 ενδοτραχηλικά κύτταρα ώστε το δείγμα να θεωρηθεί επαρκές ως προς την περιεκτικότητα σε κύτταρα που προέρχονται από την ζώνη μετάπτωσης. Το 1990 η απουσία ενδοτραχηλικών δειγμάτων αποτελούσε δείκτης για επανάληψη της εξέτασης, σήμερα η απουσία των εν λόγω κυττάρων δεν έχει σοβαρές συνέπειες76.

Όσον αφορά τα δείγματα μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας, στις

περισσότερες έρευνες συμπεραίνεται ότι με την χρήση της ΚΥΦ τα ποσοστά ανεπαρκών δειγμάτων έχουν σημειώσει αύξηση όταν συγκρίνεται με την συμβατική μεθοδο67,81-84. Αυτό κυρίως εξηγείται από το ότι τα διαγνωστικά μορφολογικά χαρακτηριστικά της μεθόδου ΚΥΦ παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές με την συμβατική μέθοδο και οι κυτταρολόγοι δεν είναι ακόμα ικανοί να αξιολογήσουν απόλυτα σωστά αυτά τα επιχρίσματα. Παρόλα αυτά γενικά η μέθοδος ΚΥΦ προτιμάται σε σχέση με την συμβατική κυτταρολογία για την αξιολόγηση επιχρισμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας λόγω των ιδιοτήτων της, όπως καλή διατήρηση των κυτταρικών λεπτομερειών και το καθαρό υπόστρωμα65,81-83. Η χρήση της ΚΥΦ ως συμπληρωματική της συμβατικής μεθόδου φάνηκε να είναι το ίδιο ή και περισσότερο αποτελεσματική από ότι η χρήση μόνο της συμβατικής μεθόδου για την αξιολόγηση αυτών των παρασκευασμάτων με θετικές συνέπειες στα

Εικόνα 3.1 Εικόνες από δύο επιχρίσματα ΚΥΦ τα οποία χαρακτηρίζονται ως «μη ικανοποιητικά» λόγω ανεπαρκούς αριθμού κυττάρων. Α) ThinPrep, αντιπροσωπευτική εικόνα οπτικού πεδίου με 10x φακό, περιέχει 40 ορατά και καλά διατηρημένα πλακώδη κύτταρα B) SurePath, το επίχρισμα αυτό περιέχει λιγότερα από 8 κύτταρα ανά οπτικό πεδίο 40x.

50

ποσοστά μη ανεπαρκών επιχρισμάτων. Η καθιέρωση κριτηρίων για την αξιολόγηση επιχρισμάτων ΚΥΦ μη γυναικολογικής κυτταρολογίας θεωρείται απαραίτητη.

3.3 Οι επιδόσεις των κυτταροπαθολόγων στην ερμηνεία επιχρισμάτων Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης

Αποτελέσματα πολλών κλινικών μελετών έχουν δείξει ότι η ερμηνεία των παρασκευασμάτων ΚΥΦ είναι ακριβέστερη από την ερμηνεία παρασκευασμάτων συμβατικής κυτταρολογίας καθώς απαντάνε λιγότερα σφάλματα κατά την εξέτασή τους36,44,85-86. Συγκεκριμένα όσον αφορά τα κολποτραχηλικά επιχρίσματα η ακριβής ερμηνεία των επιχρισμάτων ΚΥΦ ήταν ίδια ή ανώτερη της συμβατικής μεθόδου. Τα ευρήματα όμως έχουν δείξει μια δυσκολία των κυτταροπαθολόγων να ερμηνεύσουν HSIL (πίνακας 3.5) και το πλακώδες καρκίνωμα σε επιχρίσματα ΚΥΦ. Κάποιες πιθανές εξηγήσεις για αυτό μπορεί να είναι ότι ενώ η μορφολογία των LSIL στα παρασκευάσματα ΚΥΦ είναι σχεδόν παρόμοια με την μορφολογία τους σε συμβατικά παρασκευάσματα, η κυτταρομορφολογία των HSIL φέρει πιο ιδιαίτερα χαρακτηριστικά στα παρασκευάσματα ΚΥΦ86, π.χ. σε παρασκευάσματα ΚΥΦ τα κύτταρα που έχουν υποστεί αλλοίωση υψηλού βαθμού εμφανίζονται ως απομονωμένα μικρά κύτταρα με πυρήνα μικρότερου μεγέθους. Ενώ το πλακώδες καρκίνωμα μπορεί να αγνοηθεί σε παρασκευάσματα ΚΥΦ καθώς τα μη κερατινοποιημένα κύτταρά του μπορεί να μοιάζουν, σε μικρή μεγέθυνση, με καλοήθη πλακώδη μεταπλασία86. ΚΥΦ ΣΚ Διαγνωστική

Πιστοποιημένοι

Μη πιστοποιημένοι

Πιστοποιημένοι

Μη πιστοποιημένοι

ομάδα n

%

n

%

n

%

n

%

Αρνητικό 1850 1,14 230 2,61 3321 1,66 1249 3,04 LSIL 743 2,02 90 8,89 1011 2,57 384 7,29 HSIL 1204 2,82 162 4,94 2975 1,41 1034 2,42 Σύνολο 3797 1,84 482 4,56 7307 1,68 2667 3,41*

Πίνακας 3.5 Ποσοστά ασυμφωνίας των απαντήσεων των κυτταροπαθολόγων ανά

διαγνωστική ομάδα και κατάσταση πιστοποίησης στην ΚΥΦ.

* Renshaw et al. The Significance of Certification in Liquid-Based Cytology and Performance in the College of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in Cervicovaginal Cytopathology. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:1269–1272.

51

Σε μια έρευνα87 που αξιολογούσε την σημασία της πιστοποίησης των εργαστηρίων στην κυτταρολογία υγρής φάσης βρέθηκε ότι η πιστοποίηση των κυτταρολόγων και κυτταροπαθολόγων σχετίζεται απόλυτα με μια σημαντική μείωση στα ποσοστά ασυμφωνίας κατά την ερμηνεία επιχρισμάτων ΚΥΦ. Μάλιστα η πιστοποίηση στην ΚΥΦ είχε αντίκτυπο ακόμα και στην ερμηνεία επιχρισμάτων συμβατικής κυτταρολογίας καθώς βρέθηκε ότι κυτταροπαθολόγοι, οι οποίοι είχαν εκπαιδευτεί για να ερμηνεύσουν ΚΥΦ επιχρίσματα, σημείωσαν μειωμένα ποσοστά σφαλμάτων και κατά την αξιολόγηση συμβατικών παρασκευασμάτων.

Και στην μη- γυναικολογική κυτταρολογία τα ευρήματα είναι παρόμοια, η ΚΥΦ είναι ανώτερη της συμβατικής κυτταρολογίας σε όλες τις διαγνωστικές κατηγορίες εκτός από τις περιπτώσεις πλακώδους καρκινώματος54. Στα μη-γυναικολογικά δείγματα η ΚΥΦ είναι προτιμότερη διαγνωστική μέθοδος από την συμβατική κυτταρολογία λόγω των τεχνικών χαρακτηριστικών όπως είναι το καθαρό υπόστρωμα και η ομοιογενής διασπορά των κυττάρων στο επίχρισμα που κάνουν την διάγνωση πιο εύκολη για τους κυτταρολόγους. Γενικά η ακρίβεια της μεθόδου ΚΥΦ είναι ανώτερη της συμβατικής88, όμως υπάρχουν μερικά μειονεκτήματα της μεθόδου όπως είναι τα διαφορετικά μορφολογικά χαρακτηριστικά όσον αφορά τα θραύσματα των κυττάρων (ρήξη των θηλωματωδών ομάδων και αυξημένος επιμερισμός των κυττάρων), μικρότερα κύτταρα με μικρότερους πυρήνες λόγω του ότι τα κύτταρα παίρνουν μια πιο στρογγυλοποιημένη μορφή μέσα στο υγρό διάλυμα συντήρησης, και η απώλεια διαγνωστικά σημαντικού υλικού του υποστρώματος (η κολλοειδής μορφή του υποστρώματος, η βλέννα, χονδορμυξοειδής στρωματική ουσία)54. Η απώλεια των χαρακτηριστικών του υποστρώματος έχει μεγάλη σημασία για την διάγνωση ορισμένων όγκων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας καθώς η διάγνωσή τους στηρίζεται πολλές φορές στα ευρήματα αυτά. Με την τεχνολογία της ΚΥΦ όμως οι κυτταρολόγοι πρέπει να βασιστούν εξολοκλήρου στα μορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων, για τα οποία θα πρέπει να θεσπιστούν διαγνωστικά κριτήρια.

Τα τεχνικά χαρακτηριστικά της ΚΥΦ όπως η μονιμοποίηση, η μεταφορά και η συντήρηση του κυτταρολογικού υλικού σε υγρό μέσο αποφεύγοντας έτσι το στέγνωμα των επιχρισμάτων στον αέρα (artifacts), ο αυτοματοποιημένος τρόπος παρασκευής επιχρισμάτων, η μικρή περιοχή εξέτασης (20mm ThinPrep, 13 mm SurePath) που μειώνει τον χρόνο εξέτασης ανά επίχρισμα, και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της ΚΥΦ όπως το καθαρό υπόστρωμα, η ομοιογενής κατανομή των κυττάρων, η βελτιωμένη παρουσία των κυττάρων στο επίχρισμα και η ελάχιστη κυτταρική επικάλυψη που υφίστανται, κάνουν την διάγνωση πιο εύκολη και αποτελεσματική μειώνοντας το φόρτο εργασίας του εργαστηρίου.

Λόγω όλων αυτών των διαφορών της ΚΥΦ με την συμβατική κυτταρολογία συνεπάγεται ότι η εκπαίδευση των κυτταροτεχνολόγων και κυτταροπαθολόγων είναι απαραίτητη πριν την εισαγωγή της μεθόδου στα εργαστήριά τους.

52

3.4 Επικουρικές εξετάσεις σε δείγματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης

Ένα άλλο μεγάλο πλεονέκτημα της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης (ΚΥΦ) είναι η δυνατότητα εφαρμογής επιπρόσθετων εξετάσεων στο υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό όπως, επιπλέον επιχρίσματα, ανοσοϊστοχημικές εξετάσεις ή εφαρμογή μοριακών εξετάσεων89-93.

Έρευνες έχουν δείξει ότι η παρασκευή επιπλέον κολποτραχηλικών επιχρισμάτων στο υπολειπόμενο υλικό ΚΥΦ οδηγεί σε μείωση των ποσοστών των μη ικανοποιητικών δειγμάτων και στην ανίχνευση περισσότερων περιπτώσεων ASCUS94-95. Αυτό δεν αναιρεί την ακρίβεια του πρώτου παρασκευάσματος παρόλα αυτά είναι ένα στοιχείο που θέλει επιπλέον διερεύνηση.

Η ανίχνευση για χλαμύδια του τραχώματος (Chlamydia Trachomatis), γονόρροια (Neisseria Gonorrhoeae), και κυρίως για τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων (Human papilloma virus, HPV) είναι οι συχνότερες εξετάσεις που εφαρμόζονται σε υπολειπόμενα κολποτραχηλικά δείγματα ΚΥΦ καθώς αποτελούν τα τρία πιο κοινά σεξουαλικώς μεταδιδόμενα νοσήματα.

Οι καινούργιες διαγνωστικές εργαστηριακές μέθοδοι για την ανίχνευση αυτών των μολυσματικών παραγόντων βασίζονται στην ανίχνευση του νουκλεϊκού οξέως (DNA), δηλαδή βασίζονται στην ανίχνευση και ταυτοποίηση μιας ακολουθίας DNA ειδική για τον κάθε μολυσματικό παράγοντα με ή χωρίς τον πολλαπλασιασμό του DNA με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR). Οι μέθοδοι που χρησιμοποιούν την ενίσχυση του ιικού γονιδιώματος μέσω PCR, είναι εξαιρετικά ευαίσθητες και ικανές να ανιχνεύσουν ακόμα και ένα μόνο αντίγραφο του DNA στόχου. Οι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι η Hybrid Capture 2 (HC2) και η μέθοδος PCR.

Το συντηρητικό διάλυμα με βάση την αλκοόλη που χρησιμοποιείται στην ΚΥΦ αποδεικνύεται από πολλές έρευνες ότι είναι ένα σταθερό μέσο για την ανίχνευση αυτών των λοιμώξεων90-92,96 και ότι ένα δείγμα είναι αρκετό για την παρασκευή κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, για την ανίχνευση HPV, C. Trachomatis και Ν. Gonorrhoeae91 με μοριακές μεθόδους.

Οι κοινές κατευθυντήριες γραμμές του 2001 στις ΗΠΑ για την διαχείριση των γυναικών με μη φυσιολογικά κυτταρολογικά ευρήματα παρουσίασαν την εξέταση HPV DNA σε υπολειπόμενα δείγματα ΚΥΦ, ως την προτιμότερη μέθοδο διαχείρισης γυναικών με ASCUS με την αιτιολογία ότι οι γυναίκες ασθενείς δεν χρειάζεται να ξαναεπισκεφτούν τον γιατρό τους για συμπληρωματική εξέταση, και αυτό αποτελεί ένα τεράστιο πλεονέκτημα.

Άλλες επιπλέον εξετάσεις που μπορεί να γίνουν από το υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό ΚΥΦ είναι η παραγωγή κύβων παραφίνης τόσο για γυναικολογικά όσο και για μη-γυναικολογικά δείγματα και η εφαρμογή σε αυτά ανοσοϊστοχημικών εξετάσεων.

53

3.5 Αυτοματοποίηση στην ανάλυση επιχρισμάτων γυναικολογικής κυτταρολογίας

Το Pap τεστ υπήρξε ένα εξαιρετικά επιτυχές εργαλείο ανίχνευσης

του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Ο δια χειρός έλεγχος των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων μπορεί να επηρεαστεί αρνητικά από κάποιους παράγοντες όπως η έλλειψη εργαστηριακού προσωπικού, συγκεκριμένα κυτταροτεχνολόγων σε αυτή την περίπτωση, εργονομικά προβλήματα και από τις επιπτώσεις των ψευδο-αρνητικών περιπτώσεων. Σαν αποτέλεσμα, με την ανάπτυξη της τεχνολογίας αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε η αυτοματοποίηση στον πρωτοβάθμιο έλεγχο των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Τα αυτοματοποιημένα συστήματα ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων έχουν αναπτυχθεί στο πλαίσιο δύο μεγάλων συστημάτων: i) εκείνα που εκτελούν τον πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων χωρίς την παρέμβαση του κυτταροτεχνολόγου και ii) εκείνα τα οποία «απαιτούν» την παρέμβαση του κυτταρτεχνολόγου για την ερμηνεία των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Τα συστήματα αυτά είναι το BD FocalPoint Slide Profiler, το ThinPrep Imaging System και το BD FocalPoint GS (ο τρόπος λειτουργίας τους αναλύθηκε σε προηγούμενο κεφάλαιο).

Από την χρήση αυτών των συστημάτων οι κυτταροτεχνολόγοι έχουν επωφεληθεί από την βελτίωση της εργασίας γενικά, την μειωμένη κόπωση, και την αυξημένη απόδοση. Αυτά συνεπάγουν αύξηση τη παραγωγικότητας του εργαστηρίου, περισσότερο χρόνο αφιερωμένο σε επιχρίσματα που φέρουν δύσκολες διαγνωστικές περιπτώσεις και σε συγκεκριμένα σημεία πάνω στα επιχρίσματα όπου ανιχνεύονται τα μη-φυσιολογικά στοιχεία από τα αυτοματοποιημένα συστήματα. Ως αποτέλεσμα όλων αυτών έχει σημειωθεί αύξηση της ευαισθησίας για την ανίχνευση αλλοιώσεων. Καθώς όμως αυξάνεται ο αριθμός των επιχρισμάτων που ελέγχονται πρέπει να καθιερωθούν και όρια όσον αφορά τον φόρτο εργασίας (αριθμός επιχρισμάτων που ελέγχονται καθημερινά)97.

Ενώ ο ψηφιακός τρόπος ανάλυσης των επιχρισμάτων εισάγεται σε ένα εργαστήριο, διάφορα προβλήματα μπορεί να λάβουν χώρα μέχρι το προσωπικό να εξοικειωθεί με την καινούργια μέθοδο και τις καινούργιες εργαστηριακές συσκευές, π.χ. στην αρχή οι κυτταροτεχνολόγοι μπορεί να δυσκολεύονται να χρησιμοποιήσουν τις συσκευές αλλά και να ανιχνεύσουν μη φυσιολογικά στοιχεία με την καινούργια τεχνική κ.α.

Οι περιορισμοί των βοηθητικών αυτοματοποιημένων συστημάτων ελέγχου αποδίδονται στην καμπύλη μάθησης που συναντάται κατά την εφαρμογή μιας καινούργια τεχνολογίας στην κλινική πράξη, και καθώς αυτό αποτελεί, σε μεγάλο βαθμό, ένα ανθρώπινο φαινόμενο, έχει παρατηρηθεί κυρίως στα διαδραστικά συστήματα. Ένα παράδειγμα είναι τα αρνητικά ευρήματα όσον αφορά την διαγνωστική επίδοση των συστημάτων, όπως η αύξηση που παρατηρήθηκε αρχικά στα ποσοστά των επιχρισμάτων με ASCUS29 ή όπως η μείωση που παρατηρήθηκε στα ποσοστά εύρεσης του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων στα επιχρίσματα με ASCUS98 για τα οποία όμως στην συνέχεια διαπιστώθηκε ότι οφείλονται στην καμπύλη μάθησης και

54

στην εξοικείωση του εργαστηριακού προσωπικού με την καινούργια τεχνολογία.

Ο πίνακας 3.6 99 συμπεριλαμβάνει μια λίστα από αντιπροσωπευτικές δημοσιεύσεις που έλαβαν χώρα το χρονικό διάστημα 1995-2008, οι οποίες εξέταζαν την αποτελεσματικότητα των αυτοματοποιημένων συστημάτων ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων.

Χρον/γία

Συστήματα πρωτοβάθμιου ελέγχου/Διαδραστικά

Κύριο εύρημα

1995100 AutoPap® -Καλύτερη επίδοση όσον αφορά τα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα κατά την επανεξέταση επιχρισμάτων

199928 AutoPap® -Ανιχνεύτηκαν περισσότερα HSIL

2001101 AutoPap® -Αυξημένη ευαισθησία μεθόδου για την επαναξιολόγηση της ταξινόμησης των LSIL+

2002102 AutoPap® -Ανίχνευση όλων των επιχρισμάτων που φέρουν HSIL+

2004103 BD FocalPoint Slide Profiler®

-Υψηλά ποσοστά ανίχνευσης HSIL επιχρισμάτων

2005104 ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση SIL

200698 ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία ανίχνευσης SIL, αυξημένη ευαισθησία ανίχνευσης HSIL με σημείο αναφοράς την βιοψία

2007105 BD FocalPoint GS® -Υψηλή ευαισθησία για την ανίχνευση SIL

2007106 ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση SIL 200730 ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία ανίχνευσης SIL, με

ελάττωση ποσοστού ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων, αυξημένο ποσοστό κυτταροτεχνολόγων που δηλώνουν ικανοποιημένοι από την εργασία

200732 ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη παραγωγικότητα

200729 ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη ευαισθησία για την ανίχνευση SIL 200731 ThinPrep® Imaging System -Αυξημένη παραγωγικότητα

2008107 ThinPrep® Imaging System -Αμετάβλητα ποσοστά εύρεσης ASCUS και θετικών HPV DNA αποτελεσμάτων

Πίνακας 3.6 Συμπεράσματα δημοσιεύσεων από την αξιολόγησή τους για τα

αυτοματοποιημένα συστήματα ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων.

Οι επιδόσεις αυτών των σύγχρονων συστημάτων ήταν, μέχρι τώρα, πολύ θετικές επιδιώκοντας μια συνεχή ανάπτυξη και τελειοποίηση των συστημάτων με απώτερο σκοπό να χρησιμοποιηθούν από τα παθολογοανατομικά εργαστήρια σε παγκόσμια κλίμακα. Όπως προκύπτει

55

από τις έρευνες αυτές (πίνακας 3.6) το κύριο πλεονέκτημα από την χρήση των αυτοματοποιημένων συστημάτων ελέγχου είναι η αυξημένη ευαισθησία όσον αφορά την ανίχνευση της ενδοεπιθηλιακής αλλοίωσης του πλακώδους επιθηλίου λόγω της ακριβής και ευαίσθητης μεθόδου κατάταξης, που περιέχουν τα συστήματα πρωτοβάθμιου ελέγχου και διαδραστικού ελέγχου. Με την χρήση των αυτοματοποιημένων συστημάτων επιτυγχάνεται:

- μείωση του αριθμού ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων - και/ή αύξηση στην παραγωγικότητα. Τα πλεονεκτήματα των ψηφιακών εικόνων συμπεριλαμβάνουν την

δυνατότητα εξέτασης των επιχρισμάτων χωρίς την παρουσία της αντικειμενοφόρου πλάκας, επιτρέποντας τον σχολιασμό πάνω στην εικόνα και την ικανότητα ταχείας μετάδοσής της ηλεκτρονικά για διάφορους λόγους (εκπαιδευτικούς, ελέγχου ποιότητας, σε συνέδρια κ.ά.). Στον τομέα της κυτταρολογίας οι ψηφιακές εικόνες χρησιμοποιούνται κυρίως στον αυτοματοποιημένο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, για εκπαιδευτικούς λόγους και για εξάσκηση των κυτταροτεχνολόγων και κυτταροπαθολόγων (π.χ. online ψηφιακοί άτλαντες). Επιπλέον, υπάρχουν σημαντικές δυνατότητες χρήσης των ψηφιακών εικόνων στον έλεγχο επάρκειας στην γυναικολογική κυτταρολογία. Στο άμεσο μέλλον οι ψηφιακές εικόνες στην κυτταρολογία πιθανόν να χρησιμοποιηθούν για την ταχεία ανάκτηση και εξέταση αρχειοθετημένων κλινικών περιπτώσεων που έχουν ελεγχθεί με την ψηφιακή μέθοδο (π.χ. ψηφιακές βιβλιοθήκες), για τον έλεγχο δειγμάτων μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας που έχουν επεξεργαστεί με την μέθοδο κυτταρολογίας υγρής φάσης (π.χ. δείγματα ούρων και δείγματα κοιλοτήτων σώματος) και στην επικοινωνία (π.χ. τηλεδιασκέψεις) και παράλληλα θα συνεχίζουν να παίζουν σπουδαίο ρόλο στην εξάσκηση των κυτταροτεχνολόγων, στην εκπαίδευση (κυρίως σε διεθνή επίπεδο), στην πιστοποίηση των πρωτοβάθμιων εξετάσεων και στην συνεχή εκπαίδευση και συντήρηση της επάρκειας και πιστοποίησης. Γενικά ο έλεγχος και η τελική διάγνωση κυτταρολογικών δειγμάτων στο μέλλον ενδέχεται να πραγματοποιηθούν εξολοκλήρου μέσω οθόνης υπολογιστή και όχι στο οπτικό μικροσκόπιο99.

Η αυτοματοποίηση στα εργαστήρια κυτταρολογίας στοχεύει στην ανταπόκριση σημερινών και μελλοντικών προκλήσεων, τέτοιες είναι ο αυξημένος φόρτος εργασίας και η έλλειψη έμπειρων κυτταροτεχνολόγων. Ενώ αυτά είναι προβλήματα που παρουσιάζονται ανά τον κόσμο, πρόσφατα έχουν εκφραστεί αντίθετοι προβληματισμοί108-109. Με την προοπτική ότι η ανάλυση HPV DNA θα αποτελέσει εξέταση πρωτοβάθμιου ελέγχου κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, με την ανάπτυξη του εμβολίου για HPV, και την συνιστώμενη επέκταση του διαστήματος ελέγχου σε συγκεκριμένες υποομάδες ασθενών, ο αριθμός των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων που θα ελέγχονται θα μειωθεί σημαντικά στο μέλλον με αποτέλεσμα να μειωθεί και ο αριθμός του απαιτούμενου προσωπικού στα εργαστήρια. Σε αυτή την περίπτωση η χρήση ψηφιακών εικόνων που θα παράγονται από συγκεκριμένα αυτοματοποιημένα συστήματα και θα μεταδίδονται μέσω του Internet παρέχει την δυνατότητα αποτελεσματικού και ταχέως ελέγχου ατόμων που θα ανήκουν σε αυτές τις υποομάδες99. Η πολυφασματική

56

ανάλυση εικόνας αποτελεί ένα αναδυόμενο εργαλείο που χρησιμοποιεί πληροφορίες που αντλεί από τις εικόνες σχετικές με το χώρο και το φάσμα, ώστε να ταξινομεί τις εικόνες που μπορεί να χρησιμοποιηθούν στην διαφοροποίηση μεταξύ καλοηθών και κακοηθών κυττάρων. Μια τέτοια τεχνολογία ανάλυσης εικόνας προς το παρόν διερευνάται στην ανίχνευση κακοήθειας σε δείγματα από αναρρόφηση99.

Η Κυτταρολογία Υγρής Φάσης έχει προσφέρει σπουδαίο ρόλο στην ανάπτυξη της αυτοματοποίησης στον πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων αφού η ύπαρξη της τεχνολογίας αυτής οφείλεται κατά κύριο λόγο στην ανάγκη να καταστεί δυνατή η αυτοματοποίηση στην γυναικολογική κυτταρολογία. Οι κυτταρολόγοι και κυτταροπαθολόγοι στο μέλλον θα αντιμετωπίσουν μεγάλες διαφορές στην καθημερινή κλινική τους πράξη καθώς η αξιολόγηση, η επανεξέταση, η πρόσβαση σε επιχρίσματα θα γίνεται ψηφιακά οποτεδήποτε και οπουδήποτε και να βρίσκονται, απλά αρκεί να έχουν έναν υπολογιστή97.

57

44 ΕΕΦΦΑΑΡΡΜΜΟΟΓΓΗΗ ΜΜΟΟΡΡΙΙΑΑΚΚΩΩΝΝ ΜΜΕΕΘΘΟΟΔΔΩΩΝΝ ΣΣΕΕ

ΔΔΕΕΙΙΓΓΜΜΑΑΤΤΑΑ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ

ΦΦΑΑΣΣΗΗΣΣ ΚΚΑΑΙΙ ΗΗ ΧΧΡΡΗΗΣΣΗΗ ΤΤΟΟΥΥΣΣ ΣΣΤΤΗΗΝΝ

ΔΔΙΙΑΑΓΓΝΝΩΩΣΣΗΗ ΤΤΟΟΥΥ ΚΚΑΑΡΡΚΚΙΙΝΝΟΟΥΥ:: ΠΠΡΡΟΟΚΚΛΛΗΗΣΣΕΕΙΙΣΣ

ΚΚΑΑΙΙ ΠΠΡΡΟΟΟΟΠΠΤΤΙΙΚΚΕΕΣΣ

Η Κυτταρολογία Υγρής Φάσης έχει εξελιχθεί τις δύο τελευταίες δεκαετίες ως η εναλλακτική μέθοδος της συμβατικής κολποτραχηλικής κυτταρολογίας και ως εναλλακτική ή συμπληρωματική μέθοδος διάγνωσης της μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας με αναφορές στην αύξηση της ευαισθησίας και την μείωση στα ποσοστά μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων3,6,35-36,40-41. Η ικανότητα της μεθόδου να παρέχει και να διατηρεί υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό για αρκετές εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου προσφέρει την δυνατότητα εφαρμογής ανοσοκυτταροχημικών και μοριακών εξετάσεων.

4.1 Ο ρόλος της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης στην ανίχνευση μοριακών δεικτών για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Υπάρχουν πάνω από 100 τύποι του ιού των ανθρώπινων

θηλωμάτων (HPV) τα οποία διαφέρουν μεταξύ τους γενετικά και μολύνουν διαφορετικά σημεία του σώματος με αποτέλεσμα οι εκδηλώσεις της νόσου να ποικίλουν. Μια συγκεκριμένη ομάδα των HPV, που αναφέρονται ως ογκογόνοι τύποι υψηλοί κινδύνου, έχουν αναγνωριστεί, είτε μεμονωμένοι είτε σε συνδυασμούς, ως την αναγκαία αλλά όχι ικανή αιτία καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (ΚΤΜ). Στο 95-100% των περιπτώσεων ΚΤΜ έχει

58

ανιχνευτεί DNA του ιού (HPV-DNA), και μόνο ένα μικρό ποσοστό θεωρείται ότι προκαλείται από άλλους μηχανισμού που δεν σχετίζονται με τον ιό. Ο HPV προκαλεί προκαρκινικές αλλοιώσεις στον τράχηλο της μήτρας οι οποίες ταξινομούνται ως πλακώδη ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση χαμηλού βαθμού (Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion, LSIL) και πλακώδη ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση υψηλού βαθμού (High-grade Squamous Intraepithelial Lesion, HSIL). Στην Ευρώπη εμφανίζονται ετησίως 817.000 περιπτώσεις LSIL και 187.000 περιπτώσεις HSIL110.

Η λοίμωξη από τον HPV είναι ένα από τα πιο συχνά σεξουαλικώς μεταδιδόμενα νοσήματα παγκοσμίως. Το γενετικό υλικό του HPV αποτελείται από δίκλωνο DNA και κωδικοποιεί σειρά πρώιμων ρυθμιστικών πρωτεϊνών (Early region: E6, E7, E1, E2, E4 και E5) και δύο δομικές πρωτεΐνες του καψιδίου (Late region: L1 και L2). Επίσης, περιλαμβάνει και μία ρυθμιστική περιοχή (Long Control Region - LCR).

4.1.1 Μοριακή διάγνωση του HPV

Η επιβεβαίωση της ιογενούς προέλευσης του ΚΤΜ, η βελτίωση των διαγνωστικών κυτταρολογικών τεχνικών και η έλευση του υγρού μέσου συντήρησης κυτταρολογικών δειγμάτων (ΚΥΦ) άνοιξαν τον δρόμο στην ανάπτυξη νέων και ενδιαφερουσών επιλογών για την βελτίωση του προγράμματος προσυμπτωματικού ελέγχου για τον ΚΤΜ.

Η ανίχνευση του HPV από διάφορες μοριακές μεθόδους έχει προταθεί ως συμπληρωματική ή ανεξάρτητη μέθοδος πρωτοβάθμιου ελέγχου με πολλά πιθανά πλεονεκτήματα. Η εξέταση ανίχνευσης του αιτιολογικού παράγοντα του ΚΤΜ προσφέρει την δυνατότητα να εντοπιστούν οι γυναίκες εκείνες με υψηλό κίνδυνο εμφάνισης ΚΤΜ, ενώ βρίσκονται υπό λανθάνουσα ή υποκλινική μόλυνση, αρκετούς μήνες έως χρόνια, πριν ο ιός κάνει την εμφάνισή του στο τεστ Παπανικολάου. Τα τελευταία 25 χρόνια έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι ανίχνευσης του HPV-DNA σε κυτταρολογικά δείγματα. Οι αρχικές μέθοδοι στηρίχτηκαν στην τεχνολογία άμεσης ανίχνευσης υβριδισμού όπως το dot blot, Southern blot, in situ Hybridization οι οποίες όμως εκτός του ότι ήταν χρονοβόρες και αύξαναν τον φόρτο εργασίας, απαιτούσαν και μεγάλες ποσότητες DNA για την εκτέλεσή τους. Την θέση τους πήρε η τεχνολογία ενίσχυσης η οποία διακρίνεται σε: i) δοκιμασίες ενίσχυσης στόχου (π.χ. PCR) και ii) δοκιμασίες ενίσχυσης σήματος (Hybrid capture 2, HC2) που αποτελεί και την μόνη μέθοδο που έχει λάβει την έγκριση του FDA για την ανίχνευση του HPV. Hybrid capture 2

Η HC2 αποτελεί δοκιμή ενίσχυσης σήματος με υβριδισμό του DNA για την ποιοτική ανίχνευση του γονιδιώματος υψηλού κινδύνου τύπων του ιού. Δεν μπορεί ωστόσο να αναγνωρίσει ποιος συγκεκριμένος τύπος του

59

HPV είναι παρόν. Η μέθοδος αναγνωρίζει συγκριμένο γονιδίωμα 13ών τύπων HPV υψηλού κινδύνου χρησιμοποιώντας ανιχνευτή RNA του οποίου η αλληλουχία είναι συμπληρωματική του συγκεκριμένου στόχου. Τα υβρίδια DNA-RNA που σχηματίζονται αναγνωρίζονται από την φθορίζουσα ουσία που προστίθεται στην συνέχεια η οποία εκπέμπει φως. Η ένταση του φωτός είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA του HPV που είναι παρόν στο δείγμα που εξετάζεται.

To 2003 αξιολογήθηκε η απόδοση του Hybrid Capture 3, που πιθανόν να αποτελέσει τη νέα γενιά του HC2, ως προς την ικανότητα ανίχνευσης τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας βαθμού 3 (cervical intraepithelial neoplasia, CIN3) και καρκίνου. Η HC3 σχεδιάστηκε για να ελαχιστοποιήσει την διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με μη-στοχευόμενους τύπους HPV. Η HC3 έδειξε υψηλότερη ευαισθησία από την HC2 αλλά ίδια ειδικότητα για την ανίχνευση CIN2+111. Η μέθοδος αυτή δεν έχει βγει ακόμα στην αγορά112.

Ένα άλλο τεστ που χρησιμοποιεί την ίδια τεχνολογία είναι το Cervista HR HPV (Hologic, Bedford, Massachusetts) το οποίο έχει εγκριθεί από τον FDA για την ποιοτική ανίχνευση του DNA 14ων υψηλού κινδύνου τύπων του HPV σε κολποτραχηλικά δείγματα. PCR

Η PCR βασίζεται στην επαναλαμβανόμενη αντιγραφή μιας ακολουθίας στόχου του DNA στις δύο άκρες τις οποίας συγκεκριμένοι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές αρχίζουν την διαδικασία αντιγραφής του DNA. Λόγω του πολλαπλασιασμού του DNA στόχου, ακόμα και πολύ μικρές ποσότητες μπορούν ν ανιχνευτούν, η ευαισθησία της μεθόδου είναι πολύ υψηλή. Με την μέθοδο PCR μπορεί να ανιχνευτούν ακολουθίες από διάφορους τύπους του HPV. Η μέθοδος της PCR μπορεί να ανιχνεύσει περισσότερα δείγματα τα οποία φέρουν μόλυνση HPV και έχουν φυσιολογική ή ASCUS κυτταρολογική εξέταση, από ότι η HC2, αλλά έχουν ίδια απόδοση όσον αφορά την ταυτοποίηση του ιού113.

Πρόσφατα έχουν γίνει διαθέσιμα, το κατασκευασμένο για εμπορικούς λόγους τεστ που βασίζεται στην τεχνολογία του PCR, το Amplicor® HPV test (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) το ποίο αναγνωρίζει μια ομάδα από 13 υψηλού κινδύνου τύπους του HPV (high risk, hr HPV) ταυτόχρονα (η μέθοδος αυτή δεν έχει λάβει ακόμη την έγκριση από τον FDA), και το Linear Array HPV test, τα οποία χρησιμοποιούνται στην ανίχνευση και τον προσδιορισμό γονότυπων HPV. Οι μέθοδοι έχουν παρουσιάσει σε διάφορες δοκιμές υψηλότερη ευαισθησία αλλά χαμηλότερη ειδικότητα από ότι η HC2 για την ανίχνευση των hr HPV112.

Μια άλλη μέθοδος που χρησιμοποιεί την τεχνολογία του PCR είναι το Cobas 4800 HPV (Roche Diagnostics) το οποίο έχει σχεδιαστεί για την in vitro ποιοτική ανίχνευση 14 τύπων υψηλού κινδύνου του HPV.

Και οι δύο μοριακές μέθοδοι μπορούν να εφαρμοστούν σε δείγματα

κυτταρολογίας υγρής φάσης.

60

4.1.2 Παραδείγματα εφαρμογής του HPV DNA test στον πρωτοβάθμιο έλεγχο

Οι πρώτες σημαντικές εφαρμογές της ανίχνευσης του HPV DNA στην κλινική πράξη ήταν στην διαλογή και διαχείριση των γυναικών με μη φυσιολογικά ευρήματα στην κυτταρολογική τους εξέταση (ASCUS), στην διαλογή ασθενών που βρίσκονταν στην εμμηνόπαυση και το κολποτραχηλικό τους επίχρισμα έδειχνε LSIL, και ως μέθοδος παρακολούθησης γυναικών που έλαβαν θεραπεία για την αντιμετώπιση της CIN114-116. Σκοπός της ανάλυσης του DNA-HPV ως συμπληρωματική της κυτταρολογική εξέτασης, είναι η ανίχνευση μεταξύ των ασυμπτωματικών γυναικών με λανθάνουσα ή υποκλινική λοίμωξη. Πληθώρα ερευνών έχουν αποδείξει ότι η εξέταση ανίχνευσης του HPV είναι πιο ευαίσθητη από την κυτταρολογική εξέταση αλλά με αντίθετα αποτελέσματα όσον αφορά την ειδικότητα. Αυτό σημαίνει ότι αν και η χρήση της εξέτασης για HPV αυξάνει τα ποσοστά ανίχνευσης γυναικών που παρουσιάζουν μεγαλύτερο κίνδυνοι ανάπτυξης καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, η εξέταση αυτή δεν μπορεί να αντικαταστήσει την κυτταρολογική εξέταση και να χρησιμοποιηθεί ως η μοναδική μέθοδος στον πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων για την ανίχνευση του ΚΤΜ.

Έτσι οι έρευνες στράφηκαν σε μια εναλλακτική μεθοδολογία η οποία συμπεριλάμβανε την χρήση της ανάλυσης για HPV-DNA ως συμπληρωματική της ΚΥΦ σε γυναίκες άνω των 30 ετών. Η λογική αυτού του συνδυασμού στηρίχτηκε στο ότι ο HPV αποτελεί την κύρια αιτία εμφάνισης του ΚΤΜ και στην πολύ υψηλή αρνητική προγνωστική αξία (95-100%) του συνδυασμού HPV DNA με την ΚΥΦ. Έρευνες έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός μοριακής βιολογίας με την ΚΥΦ μπορεί να έχει θετικά αποτελέσματα στη αύξηση του χρονικού διαστήματος προσυμπτωματικού ελέγχου των γυναικών των οποίων τα αποτελέσματα και των δυο εξετάσεων είναι αρνητικά. Η παράταση του χρονικού διαστήματος ελέγχου σε συνδυασμό με πιο ευαίσθητες τεχνικές, όπως η ΚΥΦ έναντι της συμβατικής κυτταρολογίας, θα αποτελέσει την στρατηγική που θα επιφέρει την πλέον συμφέρουσα ισορροπία μεταξύ οφέλους και κόστους117. Στις ΗΠΑ ο συνδυασμός εξετάσεων HPV-DNA και ΚΥΦ έχει ενταχθεί στον πρόγραμμα προσυμπτωματικού ελέγχου γυναικών άνω των 30 ετών από το 2001 και αποτελεί μέθοδος διαλογής των γυναικών, με κυτταρολογικά ευρήματα ASCUS, που θα παραπεμφθούν για κολποσκόπηση ξεχωρίζοντας εκείνες με HPV DNA εξέταση θετικές καθώς έχουν περισσότερες πιθανότητες ανάπτυξης ΚΤΜ.

Καθώς ο HPV είναι υπεύθυνος για το 95% των περιπτώσεων καρκίνου της μήτρας, οι μελέτες έχουν ερευνήσει και μια άλλη προσέγγιση στον προσυμπτωματικό έλεγχο. Οι περισσότερες έρευνες (πίνακας 4.1) που έχουν αξιολογήσει την απόδοση της κυτταρολογίας (συμβατικής ή ΚΥΦ) και της εξέτασης για HPV (PCR ή HC2) για την ανίχνευση αλλοιώσεων CIN2+ και καρκίνου της μήτρας έχουν καταλήξει σε τρία κοινά συμπεράσματα: για την ανίχνευση αλλοιώσεων CIN2+ ή ΚΤΜ, η χρήση της εξέτασης HPV DNA είναι πιο ευαίσθητη (88-98% έναντι 51-86%) και έχει υψηλότερη αρνητική

61

προγνωστική αξία από ότι η κυτταρολογική εξέταση, η ειδικότητα της εξέτασης HPV DNA είναι χαμηλότερη από ότι της κυτταρολογικής εξέτασης (83-94% έναντι 92-99%), και ότι η ευαισθησία και η αρνητική προγνωστική αξία του συνδυασμού των δύο μεθόδων είναι 100%112. Οπότε, στόχος είναι ο προσυμπτωματικός έλεγχος να αρχίζει με την πιο ευαίσθητη και αυτοματοποιημένη μέθοδος όπως είναι το τεστ ανίχνευσης HPV DNA και στην συνέχεια να χρησιμοποιηθεί η εξέταση με μεγαλύτερη ειδικότητα, όπως είναι η κυτταρολογική, για την διάγνωση και την διαλογή των γυναικών118. Την βάση αυτής της μεθοδολογίας αποτελούν τα ευρήματα ότι στην Ευρώπη οι πλειοψηφία των γυναικών με LSIL φέρουν hrHPV τύπους, οπότε αυτή η καινούργια προσέγγιση θεωρείται ότι θα είναι αποτελεσματικότερη όσον αφορά των γυναικείο πληθυσμό της Ευρώπης.

Χρησιμοποιώντας την εξέταση HPV-DNA ως τον μοναδικό τρόπο προσυμπτωματικού ελέγχου σημαίνει ότι το ποσοστό γυναικών που θα χρειαστούν περαιτέρω εξέταση θα μειωθεί με αποτέλεσμα να μειωθεί το κόστος μέσω: μείωσης του αριθμού των υπαλλήλων που απασχολούνται σε ένα εργαστήριο, θα μειωθεί ο απαραίτητος χρόνος διάγνωσης, θα μειωθούν τα περιστατικά που λαμβάνουν περιττή θεραπεία και επιπλέον τα χρονικά διαστήματα ελέγχου θα μπορούν να παραταθούν. Το πλεονέκτημα της ΚΥΦ να παρέχει υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό για πρόσθετες εξετάσεις δίνει ένα σημαντικό προβάδισμα στην μεθοδολογία συνδυασμού των εξετάσεων καθώς η ασθενής δεν είναι υποχρεωμένη να επιστρέψει στον γιατρό ώστε να συλλεχθεί επιπλέον δείγμα όταν αυτό χρειάζεται, γεγονός που έχει οικονομικό όφελος για την ασθενή και το εργαστήριο112.

Οι τρέχουσες ευρωπαϊκές κατευθυντήριες γραμμές του ελέγχου ποιότητας στο πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων προτείνουν την εφαρμογή πειραματικού προγράμματος με την χρήση έγκυρων τεστ ανίχνευσης HPV DNA, και αν το πρόγραμμα αποδειχθεί αποτελεσματικό, τότε, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές, η μεθοδολογία θα πρέπει να υιοθετηθεί119.

Αποδεικνύεται λοιπόν ότι, εάν ο συνδυασμός HPV DNA και ΚΥΦ εφαρμοστεί ευρέως, τότε τα αποτελέσματα θα είναι ευεργετικά. Τα ποσοστά ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων αναμένεται να μειωθούν δραματικά, οι ασθενείς των οποίων και οι δύο εξετάσεις είναι αρνητικές θα ελέγχονται ανά μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, και οι ασθενείς που θα προσδιορίζεται ότι ανήκουν στην ομάδα υψηλού κινδύνου θα παρακολουθούνται τακτικά. Αυτά τα αποτελέσματα θα ωφελήσουν τους ασθενείς, τους γιατρούς καθώς και το σύστημα υγείας.

62

Ευαισθησία (95% CI) Ειδικότητα (95% CI)

Έρευνα n HC2 Κυτταρ.: ASCUS+

HC2 και κυτταρ.

HC2 Κυτταρ.: ASCUS+

HC2 και κυτταρ.

Ανίχνευση CIN3+

Petry et al120

7908 97.3 (83.2–99.6)

46.0 (30.8–61.9)

100 (93.7–100)

95.2 (93.4–96.5)

98.0 (96.7–98.8)

94.9 (93.1–96.2)

Kulasingam et al121

774 86.0 (59.7–96.9)

49.7 (32.9–71.5)

49.7 (32.9–71.5)

83.0 (76.8–87.1)

86.4 (84.8–88.1)

94.7 (92.8–96.1)

Ανίχνευση CIN2+

Bigras and de Marval121

13.842 97.0 (91.8–99.4)

58.7 (48.6–68.2)

ΔΑ 92.4 (91.9–92.9)

96.9 (96.6–97.2)

ΔΑ

Cárdenas- Turanzas et al122

1850 69 (41–89)

44 (20–70)

ΔΑ 93 (91–95)

94 (92–95)

ΔΑ

Coste et al123

3080 96 (88–100)

65 (50–80)

76 (59–93)

85 (83–87)

98 (98–99)

97 (97–98)

Kulasingam et al121

774 62.7 (31.4–93.2)

38.3 (19.3–63.3)

38.3 (19.3–63.3)

83.0 (76.6–87.2)

86.4 (84.7–88.3)

95.0 (93.0–96.4)

Mayrand et al124

9977 97.4 (ΔΑ)

56.4 (ΔΑ)

100 (ΔΑ)

94.3 (ΔΑ)

97.3 (ΔΑ)

92.5 (ΔΑ)

Petry et al120

7908 97.8 (86.3–99.7)

43.5 (30.0–58.0)

100 (93.7–100)

95.3 (93.5–96.6)

98.0 (96.7–98.8)

93.8 (91.8–95.3)

*

Πίνακας 4.1 Η απόδοση των μεθόδων εξέτασης στον πρωτοβάθμιο έλεγχο με την χρήση της

εξέτασης HPV και τον συνδυασμό ανίχνευσης HPV και κυτταρολογίας σε γυναίκες άνω των 30 ετών.

Διευκρινήσεις: ΔΑ = δεν αξιολογήθηκαν, Κυτταρ. = κυτταρολογία, (+) = υψηλότερου βαθμού αλλοίωση, CI (Confidence Interval) = διάστημα εμπιστοσύνης

* Whitlock E.P. et al., Liquid-Based Cytology and Human Papillomavirus Testing to Screen for Cervical Cancer: A Systematic Review for the U.S. Preventive Services Task Force. Ann Intern Med. 2011;155:687-697

63

4.1.3 Μοριακοί δείκτες

Η ευαισθησία των μεθόδων ανίχνευσης HPV DNA είναι υψηλή όμως δεν μπορούν να διακρίνουν τις παροδικές λοιμώξεις από τις επίμονες λοιμώξεις, έτσι στερούνται ειδικότητας. Για αυτό τον λόγο, το ενδιαφέρον στράφηκε προς τη μελέτη και αξιολόγηση μοριακών δεικτών που είναι πιο ειδικοί και ικανοί να αναγνωρίσουν τις γυναίκες που είναι επιρρεπής στην εξέλιξη της νόσου. Οι δείκτες αυτοί θα πρέπει να αναγνωρίζουν τα διαφορετικά στάδια της κυτταρικής μεταβολής (απάλειψη του ιού, επίμονη λοίμωξη, εξέλιξη της νόσου) που σχετίζονται με την HPV λοίμωξη και πρέπει να δίνουν υψηλή θετική προγνωστική αξία όσον αφορά την πρόγνωση της εξέλιξης της νόσου από αλλοίωση σε ΚΤΜ. Τέτοιοι πιθανοί δείκτες είναι: το ιικό φορτίο του HPV, η μεθυλίωση του DNA, η ακολουθία του HPV-DNA που ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή, η τελομεράση και το mRNA των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7. Μερικοί από αυτούς τους δείκτες έχουν εξεταστεί ελάχιστα στην βιβλιογραφία και έχει αποδειχτεί ότι η έκφραση τους δεν μπορεί να σχετιστεί με την καθοριστική διάγνωση και διαλογή των γυναικών με ASCUS λόγω χαμηλής ειδικότητας. Οι δείκτες οι οποίοι έχουν μελετηθεί εκτενώς στην βιβλιογραφία και έχουν δοκιμαστεί για την διαγνωστική τους αξία στις προκαρκινικές αλλοιώσεις, καθώς συμμετέχουν στον κυτταρικό κύκλο και στην απορρύθμισή του από τον HPV, είναι οι: p16INK4a

Οι κύκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (cyclin-dependent kinases, CDK) και οι αναστολείς των CDK αποτελούν τα βασικά μόρια που ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο και συντονίζουν την σύνθεση του DNA, τον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και την κυτταρική διαίρεση. Ο αναστολέας p16INK4a εμποδίζει την αλληλεπίδραση του CDK4/6 με την κυκλίνη D1, σταματώντας έτσι την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου από την φάση G1 στην φάση S. Στα κύτταρα που έχουν υποστεί HPV λοίμωξη παρατηρείται αυξημένη έκφραση κυκλινών οι οποίες ανταγωνίζονται την p16. Προσπαθούν δηλαδή να συνδεθούν με τις CDK ώστε να ευνοηθεί η συνέχιση του κυτταρικού κύκλου. Στην συνέχεια η σύνδεση CDK4/6-κυκλίνηςD απενεργοποιεί με χημικό τρόπο (φωσφορυλίωση) το ρετινοβλάστωμα pRb. Έτσι

Εικόνα 4.1 Θετική χρώση p16INK4a

υψηλού βαθμού αλλοίωσης σε δείγμα ΚΥΦ. (200x)

64

απελευθερώνονται οι μεταγραφικοί παράγοντες, γεγονός που οδηγεί σε ανεξέλεγκτη κυτταρική ανάπτυξη δηλαδή σε καρκίνο.

Η χρησιμότητα της ανίχνευσης της υπερέκφρασης του p16 με ανοσοκυτταροχημικές μεθόδους σε δείγματα ΚΥΦ έχει αναδειχθεί σε πολλές δοκιμές και έχει γίνει ευρέως αποδεκτή, ειδικά ως συμπληρωματική ανάλυση για την διαλογή γυναικών που η κυτταρολογική τους εξέταση δείχνει αμφίβολη ή ήπια αλλοίωση125-136. Στην διαλογή γυναικών με ASCUS ή LSIL έχει αποδειχθεί ότι η ανοσοκυτταροχημική χρώση του p16 σε δείγματα ΚΥΦ μπορεί να αποδώσει ίδια ποσοστά ευαισθησίας για την ανίχνευση των CIN2+ όσο και η HPV ανάλυση, αλλά σημειώνοντας υψηλότερη ειδικότητα125.

Έρευνες CIN1 CIN2 CIN3 Καρκίνος

Sano, 1998137 Klaes, 2002138

Agoff, 2003139

Wang, 2004140

Hu, 2005 141

Benevolo, 2006142

Focchi, 2007143

Σύνολο

8/15 (53%) 15/17 (88%) 43/76 (57%) 27/75 (36%) 20/45 (44%) 17/54 (31%) 80/88 (91%)

252/470 (54%)

16/17 (94%) 10/10 (100%) 60/80 (75%) 12/19 (63%) 43/46 (93%) 9/10 (90%)

33/33 (100%) 247/287 (86%)

27/27 (100%) 43/43 (100%)

103/113 (91%) 19/19 (100%) 51/51 (100%) 11/11 (100%) 32/32 (100%)

391/404 (96%)

38/39 (97%) 46/46 (100%) 47/53 (89%)

8/8 (100%) 44/47 (94%)

257/269 (96%)

Πίνακας 4.2 Ποσοστά ανοσοϊστοχημικής χρώσης p16 σε δείγματα κυτταρολογίας υγρής

φάσης από διάφορες έρευνες151

.

Το γεγονός όμως ότι και άλλα κύτταρα όπως τα ενδοτραχηλικά, ενδομητριακά, πλακώδη μεταπλαστικά ή ατροφικά κύτταρα μπορεί να εμφανίσουν p16 ανοσοαντίδραση, άρα χρώση αυτών των κυττάρων, οδήγησε στην ανάπτυξη συστήματος βαθμολόγησης με βάση την πυρηνική αλλοίωση σε κύτταρα που εμφανίζουν ανοσοκυτταροχημική χρώση p16: i) βαθμός 1: φυσιολογικός πυρήνας, ii)βαθμός 2: ελαφρώς αλλοίωση του πυρήνα, iii) βαθμός 3: καθαρά αλλοίωση του πυρήνα, iv) βαθμός 4: σοβαρή αλλοίωση του πυρήνα. Χρησιμοποιώντας αυτή την βαθμολόγηση έρευνες έχουν δείξει ότι η p16INK4a ανοσοκυτταροχημική χρώση των hrHPV σε δείγματα ΚΥΦ έδιναν σημαντικά υψηλότερη βαθμολογία από ότι τα αρνητικά δείγματα και τα δείγματα που περιείχαν χαμηλού κινδύνου τύπους του HPV134. Άλλες έρευνες έδειξαν αυξημένα ποσοστά ανίχνευσης CIN2/CIN3 με την χρήση ανοσοκυτταροχημικής χρώσης p16INK4a σε παρασκευάσματα κύβων παραφίνης από δείγματα που έχουν επεξεργαστεί με την μέθοδο ThinPrep126 (πίνακας 4.2). Η ανοσοκυτταροχημική χρώση p16INK4a σε δείγματα ΚΥΦ, φαίνεται να είναι ένα χρήσιμο και αξιόπιστο προγνωστικό εργαλείο για την ανίχνευση κυττάρων που έχουν μολυνθεί με hrHPV τύπους σε συνδυασμό με την κυτταρολογική εξέταση.

65

Ki-67 Η Ki-67 πρωτεΐνη εκφράζεται σε φυσιολογικές συνθήκες στην βασική

και παραβασική στιβάδα κυττάρων κατά την διαδικασία του πολλαπλασιασμού. Η έκφραση της Ki-67 χρησιμοποιείται στην διαφορική διάγνωση μεταξύ αρνητικών ατροφικών κυττάρων και θετικών νεοπλαστικών κυττάρων στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Η έκφραση της πρωτεΐνης αυτής πέρα από το εσωτερικό 1/3 του τραχηλικού επιθηλίου παρατηρείται σε περιπτώσεις CIN ή καρκίνου.

Η ανοσκυτταροχημική χρώση Ki-67 φαίνεται μπορεί να εφαρμοστεί σε δείγματα κυτταρολογίας υγρής φάσης καθώς η ακρίβεια του τεστ φτάνει σε καλά επίπεδα όταν συγκρίνεται με άλλες τεχνικές. Επίσης η χρώση αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως συμπληρωματική εξέταση, μαζί με άλλους δείκτες, στην ΚΥΦ για την διάγνωση HSIL144. Δείκτες ενσωμάτωσης και ιικό φορτίο

Το ιικό φορτίο των υψηλού κινδύνου τύπων του HPV έχει προταθεί ως ένας χρήσιμος δείκτης για να διακριθούν οι λοιμώξεις που έχουν κλινική σημασία. Μεταξύ των γυναικών που έχουν HPV-DNA θετικό, υψηλότερο ιικό φορτίο έχει βρεθεί σε εκείνες που φέρουν κυτταρολογικές αλλοιώσεις145-146. Έρευνες όμως που διεξάχθηκαν σε δείγματα ΚΥΦ έδειξαν ότι η σχέση αυτή ισχύει μόνο γιο τον υψηλού κινδύνου τύπο HPV-16, καθώς στους άλλους τύπους πολλές φορές δεν βρέθηκε σχέση ποσότητας ιικού φορτίου και βαθμού σοβαρότητας της λοίμωξης147-149.

Η ενσωμάτωση του ιικού γονιδιώματος στο γονιδίωμα του ξενιστή γίνεται στο Ε2 γονίδιο του HPV. Αυτή η αποδιοργάνωση της φυσιολογικής του λειτουργίας προκαλεί εντονότερη μεταγραφή των ογκογονιδίων Ε6 και Ε7. Κατά την επισωμική μορφή το DNA των Ε2 και Ε6 ανευρίσκεται σε ίσες ποσότητες, ενώ, μετά την ενσωμάτωση το Ε2 βρίσκεται σε μικρότερη ποσότητα. Αυτό σημαίνει ότι η μείωση στην ποσότητα του DNA κατά την αναλογία Ε2/Ε6, η οποία αξιολογείται με την real-time PCR, θα μπορούσε να αποτελέσει έναν αξιόλογο δυναμικό δείκτη της εξέλιξης της νόσου. Τα δείγματα ΚΥΦ φαίνεται να παρέχουν άριστης ποιότητας κυτταρικό υλικό για

Εικόνα 4.2 Ανοσοκυτταροχημική χρώση Ki-67. Ομάδα ανοσοθετικών κυττάρων υψηλού βαθμού αλλοίωσης.

66

τον προσδιορισμό αυτών των δεικτών ακόμα και μετά το πέρας 14ων ημερών149-151.

Έρευνα CIN2/CIN3 Διηθητικός καρκίνος

Rose, 1995 Nakagawa, 1995 Kraus, 2006 Lie, 2005 Molden, 2005 Sotlar, 2004 Σύνολο

19/19 (100%)

225/291 (77%) 13/14 (93%) 95/109 (87%)

352/433 (81%)

28/28 (100%) 31/31 (100%) 199/204 (98%) 20/20 (100%)

278/283 (98%)

Πίνακας 4.3 Ποσοστά ανίχνευσης του mRNA των Ε6/Ε7 σε δείγματα κυτταρολογίας

υγρής φάσης με διάγνωση CIN2/CIN3 και καρκίνωμα151

.

L1

Ένας άλλος δείκτης αποτελεί ο L1. L1 ονομάζεται η κύρια πρωτεΐνη του καψιδίου των HPV αλλά είναι και το όνομα του αντισώματος που παράγεται ενάντια των πρωτεϊνών του καψιδίου του HPV-16 που εκφράζονται κατά την πρώιμη παραγωγική φάση του κύκλου ζωής του ιού και χάνεται σταδιακά κατά την καρκινογένεση. Επομένως η έκφραση του αντισώματος αυτού λειτουργεί με έναν αντίστροφο τρόπο, από ότι οι υπόλοιποι μοριακοί δείκτες, όσον αφορά την παρουσία της σε σχέση με την εξέλιξη της νόσου.

Μια πρόσφατη έρευνα η οποία χρησιμοποιούσε δείγματα ΚΥΦ ανέφερε ότι υψηλότερα ποσοστά χρώσης L1 εμφανίζονται σε περιπτώσεις LSIL, που σημαίνει ενεργή HPV λοίμωξη152. Επιπλέον ο συνδυασμός των αντισωμάτων L1 και p16INK4a σε δείγματα ΚΥΦ έχει προταθεί ως δείκτης πρόγνωσης για περιπτώσεις LSIL. Μάλιστα σε μια πρόσφατη προοπτική μελέτη αποδείχτηκε η γραμμική σχέση της έκφρασης του L1 με την εξέλιξη ή την υποχώρηση της LSIL σε λοίμωξη HPV153. Βέβαια αυτά αποτελούν καινούργια ευρήματα και χρήζουν περεταίρω μελέτης.

4.1.4 Νέοι τρόποι προσέγγισης στην πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας με σημαντική προγνωστική αξία

4.1.4.1 Διπλή χρώση p16INK4a/ Ki-67

Πολλές έρευνες έχουν μελετήσει περισσότερους από έναν μοριακό δείκτη από το ίδιο δείγμα. Οι έρευνες που αξιολόγησαν τον ρόλο των

67

p16INK4a και Ki-67 ως συμπληρωματικές εξετάσεις σε δείγματα ΚΥΦ, απέδειξαν ότι η ακρίβεια διάγνωσης των HSIL και πλακώδους καρκίνου βελτιώθηκε142,151,154, επιτρέποντας μια σαφέστερη και πιο αξιόπιστη διάγνωση. Μια άλλη έρευνα155 ερεύνησε 500 δείγματα ΚΥΦ και βρήκε ότι η ανοσκυτταροχημική χρώση για Ki-67 ενίοτε βάφει και φυσιολογικά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα τα οποία όμως ήταν αρνητικά με την χρώση p16INK4a. Από την άλλη, οι περιπτώσεις πλακώδους μεταπλάσεως δίνουν ανοσοαντίδραση για p16INK4a αλλά όχι και για Ki-67. Στην ίδια έρευνα, 199 δείγματα ΚΥΦ με κυτταρολογική διάγνωση αρνητική ή ASCUS αλλά με θετικό HPV-DNA, βάφτηκαν με ανοσκυτταροχημική χρώση για p16INK4a και Ki-67 και οι ερευνητές διαπίστωσαν ότι ο συνδυασμός τους έχει χρήσιμη προγνωστική αξία για τις γυναίκες με κυτταρολογικά ευρήματα ASCUS. Ως αποτέλεσμα αυτής της έρευνας ήταν η δημιουργία μιας καινούργιας ανοσοκυτταροχημικής διπλής χρώσης η οποία ανιχνεύει ταυτοχρόνως την έκφραση των p16INK4a και Ki-67 σε δείγματα ΚΥΦ τραχήλου156-157. Η διπλή χρώση p16INK4a/ Ki-67 παρουσίασε ίδια ευαισθησία με την p16INK4a, αλλά σαφώς καλύτερη ειδικότητα156. Η αύξηση της ειδικότητας οφείλεται στο γεγονός ότι υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν είναι δυνατή η έκφραση και των δύο μοριακών δεικτών στο ίδιο κύτταρο, καθώς η p16INK4a είναι μια πρωτεΐνη με ογκοκατασταλτική λειτουργία, ενώ ο Ki-67 αποτελεί ένας δείκτης πολλαπλασιασμού των κυττάρων, και η δράση τους είναι ανταγωνιστική. Ένα πιθανό πλεονέκτημα της διπλής χρώσης θα μπορούσε να είναι η ελαχιστοποίηση ή η εξάλειψη της ανάγκης για κυτταρολογική εξέταση, με αποτέλεσμα να εξαλειφτούν τα ψευδο-αρνητικά αποτελέσματα λόγω σφαλμάτων κατά την μικροσκόπηση των επιχρισμάτων και να ανοίξει τον δρόμο στην περεταίρω ανάπτυξη των αυτοματοποιημένων συστημάτων ελέγχου στο μέλλον. Ως αποτέλεσμα οι έρευνες έχουν δείξει ότι η διπλή χρώση p16INK4a/ Ki-67 ως συμπληρωματική της ΚΥΦ στο πρόγραμμα προσυμπτωματικού ελέγχου θα μπορούσε να αποτελέσει έναν αξιόλογο δείκτης πρόγνωσης για τον ΚΤΜ, όμως απαιτούνται ακόμα περισσότερες έρευνες για να αποδειχθεί η πραγματική του αξία.

4.1.4.2 Διάγνωση του ΚΤΜ ανιχνεύοντας το mRNA των E6/E7

Όπως περιγράφτηκε και πιο πάνω η ενσωμάτωση του ιικού γονιδιώματος στο γονιδίωμα του ξενιστή έχει ως συνέπεια την συνεχή και απορυθμισμένη έκφραση των ιικών ογκογονιδίων Ε6/Ε7. Επίμονη έκφραση των Ε6/Ε7 συνεπάγει, κατά κανόνα, καρκινογένεση λόγω HPV λοίμωξης και τα τεστ που ανιχνεύουν το mRNA των E6/E7 φαίνεται να είναι πολλά υποσχόμενα για την αύξησης της ειδικότητας των εξετάσεων για HPV. Έρευνες έχουν δείξει ότι το υγρό συντήρησης και μονιμοποίησης που χρησιμοποιείται στην τεχνολογία ΚΥΦ αποτελεί αξιόπιστο υλικό για την ανίχνευση του mRNA χρησιμοποιώντας την τεχνολογία NASBA (Nucleic acid

68

sequence based amplification) ή την τεχνική RT-PCR158. Σε μια άλλη έρευνα159 η οποία μελετούσε την απόδοση της εξέτασης για την ανίχνευση του mRNA των Ε6/Ε7 του HPV σε σύγκριση με την απόδοση της εξέτασης για την ανίχνευση HPV-DNA (HC2), βρέθηκε ότι η εξέταση ανίχνευσης του mRNA των Ε6/Ε7 σε δείγματα ΚΥΦ εμφανίζει ίδια ευαισθησία αλλά υψηλότερη ειδικότητα και θετική προγνωστική αξία από ότι η HPV-DNA ανάλυση.

Στην αγορά κυκλοφορούν διάφορες δοκιμές ανίχνευσης του mRNA των Ε6/Ε7 οι οποίες στηρίζονται στην αντίστροφη μεταγραφή με PCR (RT-PCR) και χρησιμοποιούνται για τους τύπους HPV-16 και HPV-18. Τώρα κυκλοφορούν στην αγορά τα Nuclisens EasyQ HPV (ή PreTect HPV-Proofer®, όπως είναι γνωστή σε μερικές χώρες) και το Aptima® HPV. Και οι δύο δοκιμές είναι συμβατές με δείγματα ΚΥΦ. Η πρώτη μέθοδος βασίζεται στην ενίσχυση συγκεκριμένης ακολουθίας νουκλεϊκού οξέος (NASBA) για την ανίχνευση του μRNA των Ε6/Ε7 πέντε τύπων του HPV (16, 18, 31, 33 και 45). Η μέθοδος σε συνδυασμό με την ΚΥΦ έχει αποδειχθεί πολλά υποσχόμενη διατηρώντας στα ίδια επίπεδα την ευαισθησία αλλά αυξάνοντας την ειδικότητα από 50% στο 85% για την ανίχνευση CIN2+ αλλοιώσεων όταν συγκρίθηκε με την HPV-DNA ανάλυση160-161. Η δεύτερη μέθοδος στηρίζεται στην ενίσχυση στόχου νουκλεϊκού οξέος για την ποιοτική ανίχνευση του mRNA των Ε6/Ε7 14ων τύπων HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68) σε δείγματα ΚΥΦ. Η μέθοδος δίνει πληροφορίες για την απουσία ή παρουσία του ιού αλλά δεν προσδιορίζει τον συγκεκριμένο τύπο HPV που είναι παρόν.

Οι μέθοδοι ανίχνευσης του mRNA των Ε6/Ε7 θεωρούνται ως ιδανικές για την μελλοντική εφαρμογή τους στον πρωτοβάθμιο έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων καθώς αυξάνουν την ειδικότητα χωρίς να μειώνουν την ευαισθησία για την ανίχνευση αλλοιώσεων που πιθανόν να εξελιχθούν σε CIN2+ από HPV λοίμωξη, μειώνοντας έτσι το άγχος αλλά και το κόστος για τις γυναίκες που έχουν παροδικές λοιμώξεις.

4.2 Μοριακοί δείκτες για την ανίχνευση του θυρεοειδούς καρκινώματος σε δείγματα Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης

Το θηλώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς (ΘΚΘ) αποτελεί τον συχνότερο τύπο κακοήθειας που εμφανίζεται στον θυρεοειδή αδένα. Η κυτταρολογική διάγνωση του ΘΚΘ θεωρείται ιδιαίτερα αξιόπιστη και επιτρέπει την οριστική διάγνωση και προγραμματισμένη θεραπεία καθώς αυτές στηρίζονται σε συγκεκριμένα κυτταρομορφολογικά χαρακτηριστικά. Όμως αυτά τα χαρακτηριστικά μπορεί να εμφανιστούν και σε άλλες αλλοιώσεις του θυρεοειδούς καλοήθεις και κακοήθεις. Σε αυτές τις περιπτώσεις η ανοσοκυτταροχημεία παίζει σπουδαίο ρόλο προκειμένου να

69

διευκολύνει το αβέβαιο αποτέλεσμα και βοηθάει στην αποφυγή διαγνωστικών κρυφών κινδύνων (pitfalls).

Αν και η κυτταρολογία αναρρόφησης μέσω λεπτής βελόνης (Fine-needle aspiration cytology, FNAC) είναι ευρέως αποδεκτή ως πρωταρχική διαγνωστική διαδικασία των όζων του θυρεοειδούς, μερικές δημοσιευμένες έρευνες αναφέρονται κυρίως στην εφαρμογή ανοσοκυτταροχημείας στην τεχνική υγρής φάσης162. Σύμφωνα με τελευταίες μελέτες έχει προταθεί ότι μερικοί διαγνωστικοί και προγνωστικοί δείκτες βελτιώνουν την διαγνωστική ακρίβεια του ΘΚΘ, αυτοί είναι οι: Cytokeratin-19 (CK-19), HBME-1, Galectin-3, CD44, CD56, E-cadherin, c-erbB-2, p21cip1, p27kip1, και p16ink4a163-169.

Η προεγχειριτική ακριβής διάγνωση του ΘΚΘ είναι πολύ σημαντική καθώς βάση αυτής καθορίζεται ο τρόπος που θα αντιμετωπιστεί ο καρκίνος. Η διάγνωση από FNA δείγματα είναι σχετικά εύκολη αφού η νόσος παρουσιάζει καθορισμένα διαγνωστικά χαρακτηριστικά, όπως πυρηνικές αυλακώσεις, θυλοειδή φύλλα, μονοστρωματικά φύλλα κυττάρων, πολυπυρηνικά γιγαντοκύτταρα και ενδοπυρηνικά κυτταροπλασματικά έγκλειστα. Όμως δεν είναι πάντα δυνατή η παρατήρηση αυτών των χαρακτηριστικών. Επιπλέον, πολλές φορές η διάκριση μεταξύ καλοήθους και κακοήθους θηλώδους και θυλακιώδους νεοπλασίας είναι αμφισβητήσιμη. Αυτός είναι και ο λόγος της εμφάνισης κρυφών κινδύνων170. Η διάκριση του ΘΚΘ από τις άλλες αλλοιώσεις, που μοιράζονται μερικά χαρακτηριστικά, έχει κλινική σημασία και σπουδαίο ρόλο σε αυτό παίζει η ανοσοκυτταροχημεία163,171.

Από την βιβλιογραφία έχει βρεθεί ότι σε περιπτώσεις ΘΚΘ, οι δείκτες CK-19, Galectin-3, CD-44, και HBME1 εκφράζονται έντονα164,166,172-176. Επιπλέον η έκφραση των CD-56 και E-cadherin έχει βρεθεί να χάνεται σε περιπτώσεις ΘΚΘ.

Έχει αναφερθεί ότι η CK-19, μια πρωτεΐνη του κυτταροσκελετού, αυξάνεται σημαντικά σε περιπτώσεις ΘΚΘ και βοηθάει στον διαχωρισμό του ΘΚΘ από καλοήθη ή άλλα κακοήθη καρκινώματα του θυρεοειδούς163. Μια ισχυρή χρώση η μια χρώση λόγω ανοσοέκφρασης της μεμβράνης θεωρείται δείκτης ΘΚΘ, όμως εστιακή χρώση CK-19 μπορεί να βρεθεί και σε περιπτώσεις καλοήθους αλλοίωσης. Η Galectin-3 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που παίζει σπουδαίο ρόλο κατά στην οργανογένεση. Ανευρίσκεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και εμπλέκεται στην ρύθμιση μεταξύ των κυττάρων (κύτταρου-κυττάρου) και μεταξύ κυττάρου-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Η Galectin-3 χρώση θεωρείται θετική όταν χρωματίζονται είτε η κυτταροπλασματική μεμβράνη είτε ο πυρήνας. Πολλές έρευνες έχουν δείξει ότι η χρώση Galectin-3 αποτελεί έναν χρήσιμο δείκτη των κακοήθων όζων του θυρεοειδούς αν και πολλές έρευνες έχουν παρουσιάσει αντίθετα αποτελέσματα177. Το CD-44, ένα μόριο προσκόλλησης, έχει σχετιστεί με την προσκόλληση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και την παλιννόστηση λεμφοκυττάρων. Η CD-44 παρουσιάζει μεταβλητή έκφραση σε ΘΚΘ, στα οποία εμφανίζεται διάχυτη κυτταροπλασματική χρώση ή έντονη χρώση της κυτταρικής μεμβράνης172. Ο HBME1 είναι ένας δείκτης των μεσοθηλιακών κυττάρων και εκφράζεται σε περιπτώσεις κακοήθους θυλακιωδών όγκων του θυρεοειδούς. Πρόσφατα έχει χρησιμοποιηθεί και ως ανοσοδείκτης σε περιπτώσεις ΘΚΘ με αυξημένη έκφραση. Ωστόσο αυτή η θετική

70

ανοσοέκφραση δεν σημαίνει αποκλειστικά θηλώδης διαφοροποίηση178, όμως εκφράζεται σε υψηλό ποσοστό περιπτώσεων ΘΚΘ. Το CD-56, ένα νευρωνικό μόριο προσκόλλησης, παρουσιάζεται στα θυλακιώδη επιθηλιακά κύτταρα του φυσιολογικού θυρεοειδούς. Σε περιπτώσεις όμως ΘΚΘ αυτό απουσιάζει164,172. Η διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη E-cadherin παίζει κεντρικό ρόλο στην ακεραιότητα του επιθηλίου, στην προσκόλληση και διαφοροποίηση των κυττάρων και στην διατήρηση της κυτταρικής πολικότητας και της κυτταρικής δομής. Η δυσλειτουργία του σχετίζεται με την εμφάνιση και την μετάσταση όγκου179. Από τις έρευνες προκύπτει ότι η απώλεια της έκφρασης των CD-56 και E-cadherin μπορεί να αποτελεί ένα αντικειμενικό διαγνωστικό εργαλείο και μπορεί αν είναι εξαιρετικά χρήσιμες στην διάγνωση του ΘΚΘ, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις με αμφίβολη κυτταρολογική εμφάνιση172. Επίσης ο συνδυασμός των CK-19, CD-44, HBME1 και Galectin-3, θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναν πιθανό δείκτη της παρουσίας της νόσου. Ιδιαίτερη σημασία έχει δοθεί στον συνδυασμό των μοριακών δεικτών HBME1 και Galectin-3 καθώς θωρείται ο καλύτερος συνδυασμός για τον διαχωρισμό καλοηθών από κακοηθών αλλοιώσεων (πίνακας 4.4). Η απόδοσή τους φαίνεται να είναι εξαιρετική, παρουσιάζοντας αυξημένη ευαισθησία και ειδικότητα180.

Δείκτης n Ευαισθησία Ειδικότητα PPV NPV GAL-3 + HBME1 142 90.7% 75.0% 69.0% 93.0% GAL-3 + CK-19 142 83.6% 75.3% 71.8% 85.9% HBME1 + CK-19 142 82.0% 72.8% 69.4% 84.3% GAL-3 +HBME1 +CK-19 213 85.2% 74.4% 70.1% 87.7%

Πίνακας 4.4 Σύγκριση της ευαισθησίας, ειδικότητας, PPV και NPV της έκφρασης μεταξύ

συνδυασμένων δεικτών σε αλλοιώσεις του θυρεοειδούς. Διευκρινήσεις: PPV (positive predictive value) = θετική προγνωστική αξία, NPV (negative predictive value) = αρνητική προγνωστική αξία.

Άλλοι πιθανοί δείκτες αποτελούν οι μεταλλάξεις που συμβαίνουν

κατά την ανάπτυξη του ΘΚΘ. Από όλες τις γενετικές μεταλλάξεις που λαμβάνουν χώρα, και σχετίζονται με τον όγκο του θυρεοειδούς, οι περισσότερο μελετημένες αποτελούν η σημειακή μετάλλαξη του πρωτοογκογονιδίου RET που προκαλεί το μυελοειδές καρκίνο του θυρεοειδούς (κληρονομική μετάλλαξη) , η σποραδική μετάλλαξη που προκαλεί γενετικό σφάλμα στην οικογένεια των πρωτεϊνών RAS, και η μετάλλαξη BRAF η οποία αποτελεί την πιο κοινή από τις σωματικές μεταλλάξεις του ΘΚΘ και πιθανός μια από τις πιο σημαντικές γενετικές μεταλλάξεις που έχουν ανευρεθεί σε έρευνες για τον καρκίνο του θυρεοειδούς181. Η ανακάλυψη των μεταλλάξεων που συμβαίνουν στον

71

καρκίνο του θυρεοειδούς είναι σημαντική για την κατανόηση του τρόπου με τον οποίον σχηματίζεται ο καρκίνος αλλά η χρήση τους ξεχωριστά ως μοριακοί δείκτες δεν είναι πρακτικός τρόπος διάγνωσης της κακοήθειας. Από την άλλη όμως η συνδυασμένη χρήση τους θα μπορούσε να αποτελέσει μια πολλά υποσχόμενη μέθοδος προγνωστικών δεικτών.

Το κυτταρολογικό υλικό που χρησιμοποιείται στην συμβατική κυτταρολογία δεν είναι διαθέσιμο για επιπλέον διερεύνηση είτε λόγω ανεπαρκής κυτταροβρίθειας, είτε λόγω παρουσίας περίσσιων ποσοτήτων αίματος, βλέννης ή φλεγμονωδών στοιχείων. Αυτό το κενό καλύπτει η κυτταρολογία υγρής φάσης με την τεχνολογία της λεπτής επίστρωσης. Η ποιότητα της ανοσοκυτταροχημικής αντίδρασης σε παρασκευάσματα ΚΥΦ, όσον αφορά την μορφολογική λεπτομέρεια, και η καθαρότητα του υποστρώματος είναι καλύτερη της συμβατικής κυτταρολογίας. Η ΚΥΦ προσφέρει την δυνατότητα δημιουργίας αρχειοθέτησης του υλικού και της εφαρμογής νέων τεχνικών, όπως η ανοσοκυτταροχημεία στο ίδιο δείγμα, στοιχείο που δίνει την δυνατότητα επιπλέον και μελλοντικής επανεκτίμησης. Ο χρυσός κανόνας της ανοσοκυτταροχημείας, προκειμένου να οδηγήσει σε μια ακριβή διάγνωση, είναι η χρήση μιας ομάδας, τουλάχιστον δύο ή τριών δεικτών, σε συνδυασμό με την κυτταρομρφολογία174,182 για την διάγνωση του ΘΚΘ. Η ΚΥΦ έχει αξιολογηθεί και πιστοποιηθεί σε πολλές έρευνες ως μέθοδος προεγχειρητικής διάγνωσης των όζων του θυρεοειδούς182. Η μέθοδος αυτή είναι αναπαραγώγιμη, μπορεί να εφαρμοστεί από το προσωπικό με ελάχιστη εκπαίδευση, είναι ασφαλής, γρήγορη και προσφέρει την δυνατότητα μιας ακριβής εφαρμογής της ανοσοκυτταροχημείας για την έρευνα νεοπλασματικών αλλοιώσεων του θυρεοειδούς.

Όλοι αυτοί οι μοριακοί δείκτες συστήνονται μόνο ως συμπληρωματικοί της κυτταρολογικής μορφολογικής εικόνας για την διάγνωση της κακοήθειας αφού η χρήση τους ως ανεξάρτητοι δείκτες δεν είναι, έως τώρα, επαρκής για να τεθεί η διάγνωση.

4.3 Εξελίξεις στην κυτταρολογία του καρκίνου του μαστού

Ο καρκίνος του μαστού είναι ο συχνότερος καρκίνος στις γυναίκες και προσβάλλει κάθε χρόνο πολλά εκατομμύρια σε όλο τον πλανήτη. Στην Ελλάδα εμφανίζονται περίπου 3500 νέες περιπτώσεις καρκίνου του μαστού το χρόνο183. Προς το παρόν υπάρχουν τρόποι να περιορισθεί, όχι όμως και να επιλυθεί το πρόβλημα ολοκληρωτικά. Τρόποι βασισμένοι στην πρόοδο των απεικονιστικών μεθόδων (ψηφιακή μαστογραφία, ΜRΙ), της κυτταρολογίας και της γενετικής, σε συνδυασμό με την προληπτική εξέταση των μαστών για έγκαιρη ανίχνευση.

Ο ρόλος της κυτταρολογίας είναι πολύ σημαντικός τόσο στο πεδίο της πρώιμης και όψιμης διάγνωσης, όσο και στην παροχή σημαντικών πληροφοριών προεγχειρητικών, (τύπος, προγνωστικοί/προβλεπτικοί

72

παράγοντες), διεγχειρητικών (εντυπώματα όγκου/φρουρού λεμφαδένα) και μετεγχειρητικών (υποτροπές, μεταστάσεις). Οι προγνωστικοί παράγοντες σχετίζονται με την πορεία της νόσου ανεξάρτητα από το είδος της θεραπευτικής αγωγής ενώ οι προβλεπτικοί επηρεάζουν την πορεία της νόσου ανάλογα με την επιλογή και εφαρμογή ενός συγκεκριμένου θεραπευτικού σχήματος. Οι περισσότερο χρήσιμοι προβλεπτικοί παράγοντες σε επίπεδο ρουτίνας είναι: ER, PR, Her-2/neu ή C-erbB-2, P-53 και Ki-67. Ανίχνευση της ενίσχυσης του πρωτοογκογονιδίου Her-2neu θεωρήθηκε σημαντικής προγνωστικής σημασίας βιολογικός δείκτης.

Όπως και στον θυρεοειδή αδένα έτσι και στον μαστό η FNA αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο στην διάγνωση των ψηλαφιστών και μη-ψηλαφιστών αλλοιώσεων του μαστού. Αποτελεί μια ασφαλή, γρήγορη και σχετικά φθηνή και ανώδυνη διαδικασία.

Οι παλαιότεροι και πλέον εδραιωμένοι μοριακοί προγνωστικοί παράγοντες στον καρκίνο του μαστού είναι οι ορμονικοί υποδοχείς, συγκεκριμένα οι υποδοχείς οιστρογόνων (ER) και οι υποδοχείς προγεστερόνης (PR). Η κατάσταση των ορμονικών υποδοχέων θεωρείται θετική όταν τουλάχιστον ο ένας από τους δύο τύπους υποδοχέων είναι θετικός (είτε οι οιστρογονικοί είτε οι προγεστερονικοί είτε και οι δύο). Για την ανάλυση της κατάστασης των ορμονικών υποδοχέων στον καρκίνο του μαστού αρχικά χρησιμοποιήθηκαν βιοχημικές μέθοδοι, οι οποίες επέτρεπαν τη μέτρηση των επιπέδων του κάθε υποδοχέα σε διάλυμα που προέκυπτε από επεξεργασία και τελικά ρευστοποίηση μέρους του πρωτογενούς όγκου. Σήμερα, ο προσδιορισμός των ορμονικών υποδοχέων στον πρωτογενή όγκο γίνεται πιο εύκολα και πιο αντικειμενικά με τη χρήση ανοσοϊστοχημικών μεθόδων.

Το γονίδιο ERBB2 ή HER2 ή HER2/neu βρίσκεται στο χρωμόσωμα 17. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει, ότι ο πολλαπλασιασμός των αντιγράφων του γονιδίου αυτού στο γονιδίωμα των καρκινικών κυττάρων σχετίζεται με πτωχή πρόγνωση και σχετική αντίσταση στην κυτταροτοξική χημειοθεραπεία. Ο πολλαπλασιασμός των αντιγράφων του ERBB2 στον πρωτογενή όγκο μπορεί να διαπιστωθεί με ανοσοϊστοχημική χρώση. Η εξέταση αυτή θεωρείται αρνητική όταν η χρώση αποβεί αρνητική ή ασθενώς θετική (+) και θετική όταν η χρώση αποβεί ισχυρά θετική (+++). Όταν η χρώση αποβεί μετρίως θετική (++), τότε θα πρέπει να πραγματοποιηθεί επιπρόσθετη ανάλυση με φθορίζοντα in situ υβριδισμό (FISH – Fluorescent in situ Hybridization).

H FISH όμως έχει περιορισμούς, όπως: η εφαρμογή της φέρει την ανάγκη συνοδείας της από ένα συγκεκριμένο σύστημα απεικόνισης φθορισμού, περιορισμένη μορφολογική αξιολόγηση σε σχέση με όλο το ιστολογικό υλικό και ασταθές σήμα ανίχνευσης. Αυτά τα θέματα έχουν αντιμετωπιστεί με την ανάπτυξη εναλλακτικών μεθοδολογιών in situ υβριδισμού που βασίζονται σε στρατηγικές ανίχνευσης που μπορεί να εκτιμηθούν με μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου αντί μικροσκόπιο φθορισμού184.

Ο χρωμογόνος in situ υβριδισμός (chromogenic in situ hybridization, CISH) αποτελεί μια εναλλακτική του FISH για την ανίχνευση του ενισχυμένου HER2/neu σε μαστικό ιστό που χρησιμοποιεί χρωμογόνο αντί φθορίζουσα ουσία για την ανίχνευση του υβριδισμένου γονιδίου. Μια άλλη τεχνική η silver

73

in situ hybridization (SISH), παράγει διακριτά σημεία της εναπόθεσης του μετάλλου από την ενζυμική δράση της υπεροξειδάσης επιτρέποντας καλύτερη ποσοτική αξιολόγηση του αριθμού των αντιγράφων του γονιδίου. Η χρήση της συνδυασμένης μορφής του CISH και SISH ή αλλιώς διπλός in situ υβριδισμός φωτεινού πεδίου (brightfield double in situ hybridization, BDISH) για την εξέταση της κατάστασης του HER2/neu στο καρκίνο του μαστού επιτρέπει την απαρίθμηση του χρωμοσώματος 17 και του γονιδίου HER2/neu στον ίδιο πυρήνα και το αποτέλεσμα είναι συγκρίσιμο με την τεχνική δια χειρός διπλής χρώσης FISH184. Η μέθοδος BDISH είναι μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική της FISH μεθόδου184-186.

Η ανίχνευση της έκφρασης όλων αυτών των δεικτών εφαρμόζεται με επιτυχία και αξιοπιστία σε κυτταρολογικά υλικά με την τεχνική της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης. Σύμφωνα με αποτελέσματα ερευνών η BDISH εφαρμόζεται εύκολα σε δείγματα ΚΥΦ, πράγμα που έχει μεγάλη σημασία διότι με την χρήση της καινούργιας μεθόδου σκοπός είναι η αντιμετώπιση του προβλήματος των ψευδο-θετικών αποτελεσμάτων που δημιουργούνται με την μέθοδο ICC. H BDISH φαίνεται να προσφέρει μια πιο αντικειμενική ερμηνεία της κατάστασης του γονιδίου HER2/neu κυρίως με την χρήση της ΚΥΦ187 διότι συντηρεί το γενετικό υλικό στην αρχική του κατάσταση ακόμα και μετά το πέρας 6 μηνών.

Έρευνες έχουν δείξει ότι δείγματα που λαμβάνονται από FNA και συλλέγονται και επεξεργάζονται με την μέθοδο ΚΥΦ αποτελούν αξιόπιστη πηγή υλικού για τους διάφορους τύπους ανάλυσης και ανίχνευσης του DNA, RNA και πρωτεϊνών ακόμα και μήνες μετά την συλλογή του δείγματος αρκεί αυτό να διατηρηθεί σωστά188. Με αυτόν τον τρόπο είναι εφικτή η δημιουργία τράπεζας γενετικού υλικού, πράγμα ανεκτίμητο για τις μελλοντικές έρευνες.

74

55 ΣΣΧΧΕΕΣΣΗΗ ΚΚΟΟΣΣΤΤΟΟΥΥΣΣ--ΑΑΠΠΟΟΤΤΕΕΛΛΕΕΣΣΜΜΑΑΤΤΙΙΚΚΟΟΤΤΗΗΤΤΑΑΣΣ

ΤΤΗΗΣΣ ΚΚΥΥΤΤΤΤΑΑΡΡΟΟΛΛΟΟΓΓΙΙΑΑΣΣ ΥΥΓΓΡΡΗΗΣΣ ΦΦΑΑΣΣΗΗ

Για να εκτιμηθεί η σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας της

κυτταρολογίας υγρής φάσης, ώστε αυτή να αποτελέσει την πρωταρχική μέθοδο στον πρωτοβάθμιο κολποτραχηλικό έλεγχο, πρέπει να αξιολογηθούν διάφοροι παράγοντες όπως η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου, ο χρόνος ανάλυσης του επιχρίσματος και το κόστος των σχετικών αναλώσιμων και εξοπλισμών του εργαστηρίου και αυτά να συγκριθούν στην συνέχεια με την μέθοδο της συμβατικής κυτταρολογίας.

Έχει αποδειχθεί ότι η ευαισθησία της μεθόδου έχει αυξηθεί με την ΚΥΦ ενώ η ειδικότητα παραμένει στα ίδια επίπεδα συγκριτικά με την συμβατική κυτταρολογία. Άλλοι παράγοντες που έχουν βελτιωθεί και σχετίζονται με το κόστος είναι: η παραγωγικότητα του εργαστηρίου λόγω του μειωμένου χρόνου εξέτασης ανά επίχρισμα (η επιφάνεια εξέτασης ΚΥΦ επιχρισμάτων είναι μικρότερη από αυτή των συμβατικών επιχρισμάτων), και ο συνολικός αριθμός επιχρισμάτων που εξετάζονται λόγω μείωσης στα ποσοστά μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων (από 9% σε 1,6%) οπότε λαμβάνονται, επεξεργάζονται και ερμηνεύονται λιγότερα επιχρίσματα. Όσον αφορά τα αναλώσιμα υλικά αυτά αφορούν τα υλικά που χρησιμοποιούνται κατά την δειγματοληψία και επεξεργασία (υγρά μονιμοποίησης, φίλτρα κ.λπ.) του δείγματος. Συγκριτικά με την συμβατική κυτταρολογία τα αναλώσιμα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ΚΥΦ είναι πιο ακριβά189. Ο παρακάτω πίνακας 5.1 παρουσιάζει ενδεικτικά το συνολικό κόστος εφαρμογής της ΚΥΦ σε εθνικό επίπεδο στο Ηνωμένο Βασίλειο, όπως παρουσιάστηκε σε μια έρευνα η οποία διενεργήθηκε για να αξιολογήσει την εισαγωγή της ΚΥΦ στο εθνικό σύστημα υγείας του Ηνωμένου Βασιλείου189.

75

Κόστος τεχνολογίας (€)

Συμβατική ΚΥΦ

Τ3000 Τ2000 PrepStain

Κόστος λήψης δείγματος Κόστος διαχείρισης* Κόστος εξοπλισμού παρασκευής Κόστος προσωπικού παρασκευής Κόστος αναλώσιμων Κόστος εξέτασης επιχρισμάτων Άλλες δαπάνες εργαστηρίου$

Συνολικό κόστος ανά επίχρισμα Διαφορά με την συμβατική κυτ.

39.400 15.400

250 120

1.300 11.600 43.300

111.370

37.500 14.300 2.500

250 19.300 8.600

40.100

122.550 11.180

37.500 14.300 1.600 2.000

19.300 8.600

40.100

123.400 12.030

37.500 14.300 1.100

980 11.900 8.600

40.100

114.480 3.110

Πίνακας 5.1 Κόστος εφαρμογής της ΚΥΦ σε εθνικό επίπεδο στο Ηνωμένο Βασίλειο.

Διευκρινίσεις: οι τιμές αφορούν εργαστήρια που έχουν την ικανότητα να εξετάσουν 60.000 επιχρίσματα το χρόνο, επίσης λαμβάνεται υπόψη ότι το ποσοστό μη ικανοποιητικών επιχρισμάτων έχει μειωθεί από 9% στο 1,6% με την χρήση της ΚΥΦ. *γραμματειακές λειτουργίες $χώροι αποθήκευσης, εκπαίδευση προσωπικού, γραμματειακοί υπάλληλοι κ.ά.

Σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία η ΚΥΦ είναι πιο ακριβή

μέθοδος για το εργαστήριο άρα και για τον ασθενή. Το αυξημένο κόστος των καινούργιων τεχνολογιών μπορεί να

δικαιολογηθεί μόνο σε περίπτωση που η απόδοσή τους είναι αρκετά καλύτερη από τις τρέχουσες μεθόδους. Αν και συνολικά οι έρευνες που έχουν διεξαχθεί αποδεικνύουν ότι η ΚΥΦ βελτιώνει την ευαισθησία ενώ η ειδικότητα παραμένει σταθερή (κεφάλαιο 3.1), από την άλλη αρκετές είναι και εκείνες οι έρευνες που υποστηρίζουν ότι η χρήση της ΚΥΦ δεν επιφέρει τέτοια δραματική βελτίωση στην ευαισθησία που να δικαιολογεί το κόστος της190. Ωστόσο στα ευρήματα όλων των σχετικών ερευνών συμπεριλαμβάνονται: η στατιστικά σημαντική μείωση στα ποσοστά μη ικανοποιητικών δειγμάτων και η ικανότητα να εφαρμοστούν πολλαπλά επιχρίσματα αλλά και επιπλέον εξετάσεις (π.χ. μοριακές) από το υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό στο φιαλίδιο με το συντηρητικό υγρό, στοιχεία που έχουν θετικές οικονομικές επιπτώσεις τόσο για το εργαστήριο (λιγότερα επιχρίσματα συλλέγονται, επεξεργάζονται και εξετάζονται) όσο και για τον ασθενή (δεν επισκέπτεται ξανά τον γιατρό για την λήψη επιπλέον δείγματος).

Πολυάριθμες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι με την χρήση της εξέτασης HPV βελτιώνεται η ευαισθησία σε μεγάλο ποσοστό συγκριτικά με την κυτταρολογία αλλά με αντίθετες επιπτώσεις όσον αφορά την ειδικότητα. Για αυτόν τον λόγο οι μελέτες έχουν καταλήξει στο συμπέρασμα ότι ο συνδυασμός των δύο τεχνολογιών αποτελεί την καλύτερη λύση. Στις ΗΠΑ ο πρωτοβάθμιος έλεγχος συμπεριλαμβάνει την χρήση της ΚΥΦ σε συνδυασμό

76

με την HPV DNA ανάλυση σε γυναίκες άνω των 30 ανά τρία χρόνια. Άλλες χώρες στην Ευρώπη συμπεριλαμβάνουν στον κολποτραχηλικό έλεγχο την κυτταρολογική εξέταση (συμβατική ή ΚΥΦ) και επιπλέον HPV DNA ανάλυση σε περιπτώσεις ASCUS κάθε χρόνο, και επίσης ακόμα αξιολογείται η περίπτωση εφαρμογής της HPV DNA ανάλυσης ως πρωταρχική μέθοδος στον έλεγχο των κολποτραχηλικών επιχρισμάτων κάθε δύο ή τρία χρόνια.

Αποτελέσματα ερευνών (εικόνα 5.1) έχουν δείξει ότι η χρήση της ΚΥΦ κάθε δύο με τρία χρόνια σε συνδυασμό με την HPV DNA ανάλυση σε περιπτώσεις ASCUS ή η χρήση της HPV DNA ανάλυσης σε συνδυασμό με την κυτταρολογία σε γυναίκες άνω των 30 ετών είναι πολύ πιο αποτελεσματικές και λιγότερο δαπανηρές μέθοδοι ελέγχου από ότι η χρήση της συμβατικής κυτταρολογίας κάθε χρόνο191-192. Γενικά όλες οι έρευνες καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι ο έλεγχος που εφαρμόζεται σε μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα του ενός έτους σε συνδυασμό με την χρήση πιο ευαίσθητων μεθόδων (παρά μόνο συμβατικής κυτταρολογίας) είναι πολύ πιθανό να επιφέρει μια εύλογη ισορροπία μεταξύ κόστους και όφελους192-197.

Εικόνα 5.1 Διαφορές κόστους και προσδόκιμου ζωής ανάλογα με τις διάφορες στρατηγικές ελέγχου. Οι στρατηγικές που βρίσκονται στην καμπύλη απόδοσης κυριαρχούν εκείνων που βρίσκονται δεξιά της καμπύλης επειδή είναι πιο αποτελεσματικές και είτε κοστίζουν λιγότερο είτε έχουν μία πιο ελκυστική σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας από την αμέσως επόμενη βέλτιστη στρατηγική. Η σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας αντιστοιχεί στην κλίση της γραμμής που συνδέει τις δύο στρατηγικές ελέγχου που συγκρίνονται, αυτή η κλίση γίνεται απότομη όταν σημειώνεται αύξηση του προσδόκιμου ζωής ανά δολάριο

193.

77

Επίσης και η εισαγωγή των αυτοματοποιημένων συστημάτων ανάλυσης κολποτραχηλικών επιχρισμάτων έχει θετικό αντίκτυπο στην σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας καθώς με την αύξηση στην ευαισθησία και ειδικότητα (κεφάλαιο 3.5), την μειωμένη ανάγκη εργαστηριακού προσωπικού, τον μειωμένο χρόνο ανάλυσης ανά επίχρισμα και όλα αυτά σε συνδυασμό με τα πλεονεκτήματα που επιφέρει η εφαρμογή της ΚΥΦ και της HPV DNA ανάλυσης στον πρωτοβάθμιο κολποτραχηλικό έλεγχο, η σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας αναμένεται να φτάσει σε άρτια επίπεδα στο μέλλον ωφελώντας τόσο τα εργαστήρια όσο και τους ασθενείς.

78

66 ΣΣΥΥΜΜΠΠΕΕΡΡΑΑΣΣΜΜΑΑ

Το τεστ Παπανικολάου έχει αναγνωριστεί ευρέως ως μια αποτελεσματική μέθοδος για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (ΚΤΜ). Παρόλα αυτά, περιπτώσεις όπως διφορούμενες και ανακριβείς διαγνώσεις είναι ένα συχνό φαινόμενο και οι αιτίες είναι: το ευρύ φάσμα ευαισθησίας (30%-87%) και το ποσοστό των ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων (14% έως 33%) που οφείλονται στους περιορισμούς κατά την δειγματοληψία του δείγματος και την παρασκευή του επιχρίσματος. Η απάντηση σε αυτούς τους περιορισμούς ήρθε με την εισαγωγή της Κυτταρολογίας Υγρής Φάσης, το πρώτο μεγάλο βήμα στον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας μετά την ανακάλυψη του τεστ Παπανικολάου. Η καινούργια αυτή τεχνολογία σημείωσε περαιτέρω μείωση στα περιστατικά καρκίνου τραχήλου της μήτρας.

Αν και ακόμα μέχρι και σήμερα υπάρχουν διαφωνίες όσον αφορά την αποτελεσματικότητα της μεθόδου και αν αυτή έχει επιφέρει βελτίωση στον κολποτραχηλικό έλεγχο σε σύγκριση με την συμβατική κυτταρολογία, τα πλεονεκτήματα της ΚΥΦ υπερτερούν της κλασικής μεθόδου και την καθιστούν ως την προτιμότερη μέθοδο συλλογής, επεξεργασίας και παρασκευής επιχρισμάτων γυναικολογικής και μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας.

Τα πλεονεκτήματα που κατέστησαν την μέθοδο αυτή δημοφιλή και την καθιέρωσαν ως την πρωταρχική μέθοδο στον πρωτοβάθμιο κολποτραχηλικό έλεγχο σε χώρες όπως οι Ηνωμένες Πολιτείες, το Ηνωμένο Βασίλειο, η Γαλλία και ο Καναδάς, είναι:

Η άμεση μονιμοποίηση, με την οποία επιτυγχάνεται η διατήρηση των

λεπτομερειών του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος στην καλύτερη δυνατή κατάσταση.

Όλο το υλικό που συλλέγεται είναι διαθέσιμο για μικροσκοπική αξιολόγηση

Ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα προετοιμάζεται για την κυτταρολογική αξιολόγηση, αλλά ανάλογα με τις ανάγκες, πολλαπλάσια δείγματα μπορούν να προετοιμαστούν από το ίδιο φιαλίδιο.

79

Το καθαρό υπόστρωμα, με αυτό τον τρόπο τα επιθηλιακά κύτταρα που έχουν ενδιαφέρον είναι λιγότερο πιθανό να «κρυφτούν».

Τα τυχαιοποιημένα κύτταρα επιστρώνονται σε ένα λεπτό στρώμα πάνω σε μια σταθερή περιοχή του πλακιδίου. Η περιοχή που καλύπτεται είναι μικρή και ο χρόνος που απαιτείται για την εξέταση του είναι μικρότερος από αυτόν που απαιτείται για την εξέταση συμβατικών παρασκευασμάτων.

Μείωση στα ποσοστά ανεπαρκών δειγμάτων. Η δυνατότητα εφαρμογής μοριακών εξετάσεων όπως HPV τεστ,

έλεγχο για γονόρροια και χλαμύδια. Δυνατότητα αυτοματοποιημένης ανάλυσης των δειγμάτων

Συνολικά στην γυναικολογική κυτταρολογία η ακρίβεια της μεθόδου

φαίνεται να είναι καλύτερη από της συμβατικής μεθόδου σημειώνοντας αύξηση στην ευαισθησία, ενώ η ειδικότητα είτε παραμένει στα ίδια επίπεδα είτε έχει αυξηθεί. Τα ποσοστά ανίχνευσης των χαμηλού βαθμού αλλοιώσεων του πλακώδους επιθηλίου έχουν αυξηθεί σημαντικά με την χρήση της ΚΥΦ, όπως επίσης και τα ποσοστά ανίχνευσης των ASCUS ευρημάτων. Όμως όσον αφορά την ανίχνευση των HSIL τα ποσοστά των ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων σε αυτή την κατηγορία φαίνεται να είναι υψηλότερα σε σχέση με τις άλλες κατηγορίες, πράγμα που υποδηλώνει μια δυσκολία στην αναγνώριση αυτών των κυττάρων. Όμως, η μέθοδος έχει παρουσιάσει συνολική μείωση στα ποσοστά των ψευδο-αρνητικών αποτελεσμάτων. Στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία οι επιδόσεις της ΚΥΦ είναι πολλά υποσχόμενες. Η εκπαίδευση των κυτταρολόγων στην ανάλυση αυτών των επιχρισμάτων είναι κρίσιμο σημείο καθώς τα μη-γυναικολογικά επιχρίσματα ΚΥΦ παρουσιάζουν μεγάλες διαφορές με αυτά των συμβατικών παρασκευασμάτων. Παρόλα αυτά, η ΚΥΦ φαίνεται να είναι η προτιμότερη μέθοδος για τον κυτταρολογικό έλεγχο ανάμεσα στους κυτταρολόγους και κυτταροπαθολόγους καθώς, εκτός των άλλων, φέρει σημαντικές βελτιώσεις στο ποσοστό των ανεπαρκών δειγμάτων, μειώνοντάς το σημαντικά, και επίσης δίνει την δυνατότητα αυτοματοποίησης στην ανάλυση των επιχρισμάτων με την χρήση ειδικών συστημάτων όπως είναι: το ThinPrep Imaging System για την ανάλυση ThinPrep κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, το BD FocalPoint Slide Profiler και το BD FocalPoint GS για την ανάλυση SurePath κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Με την χρήση των αυτοματοποιημένων συστημάτων ανάλυσης εικόνας έχει σημειωθεί αύξηση της ειδικότητας και της ευαισθησίας για την ανίχνευση αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας, έχει σημειωθεί αύξηση της παραγωγικότητας και της απόδοσης του προσωπικού και κατά συνέπεια του εργαστηρίου στο σύνολό του.

Καθώς ο τομέας της διαγνωστικής κυτταρολογίας οδεύει με γοργά βήματα προς το μέλλον με την εφαρμογή μοριακών μεθόδων και την ανακάλυψη της άμεσης σχέσης ορισμένων μοριακών δεικτών με την γέννηση ή εξέλιξη νεοπλασμάτων, η τεχνολογία της κυτταρολογίας υγρής φάσης φέρνει ένα τεράστιο προβάδισμα στην ανάπτυξη αυτών των καινούργιων μεθόδων. Η ΚΥΦ έχει την δυνατότητα εφαρμογής πολλαπλών εξετάσεων από το ίδιο δείγμα αφού έχει αποδειχτεί ότι συντηρεί σε εξαιρετική κατάσταση

80

τόσο τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων όσο και το νουκλεϊκό οξύ τους, καθιστώντας έτσι την ανίχνευση του DNA, RNA και πρωτεϊνών των κυττάρων εφικτή ακόμα και μετά το πέρας αρκετών εβδομάδων, αρκεί το δείγμα να συντηρηθεί σωστά σε κατάλληλο περιβάλλον.

Επειδή στο 95-100% των περιπτώσεων ΚΤΜ έχει ανευρεθεί το DNA του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων, ο έλεγχος για την ανίχνευσή του σε κυτταρολογικά επιχρίσματα αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι προσυμπτωματικού ελέγχου. Μετά την ανάπτυξη της τεχνολογίας της ΚΥΦ και την κατανόηση των δυνατοτήτων που αυτή προσφέρει, από το 2001 στις ΗΠΑ το πρόγραμμα κολποτραχηλικού ελέγχου γυναικών άνω των 30 περιέχει: έλεγχο με την τεχνολογία της ΚΥΦ και συμπληρωματική HPV DNA ανάλυση από το υπολειπόμενο κυτταρολογικό υλικό κάθε 3 χρόνια με την χρήση της μοριακής μεθόδου HC2, ενώ για τις γυναίκες που είναι κάτω των 30 ο έλεγχος γίνεται με την μέθοδο ΚΥΦ κάθε 2-3 χρόνια και η HPV DNA ανάλυση εφαρμόζεται μόνο σε περίπτωση εύρεσης ASCUS στα κυτταρολογικά τους αποτελέσματα. Με βάση τις σχετικές έρευνες αυτός βρέθηκε να είναι ο πιο αποτελεσματικός τρόπος διαχείρισης των γυναικών που συμμετέχουν στον προσυμπτωματικό έλεγχο αφού παρέχει την καλύτερη δυνατή σχέση μεταξύ οφέλους (προσδόκιμο ζωής) – κόστους. Μια άλλη προσέγγιση αποτελεί η χρήση της HPV DNA ανάλυσης ως πρωταρχική μέθοδος στον προσυμπτωματικό έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων σε δείγματα που λαμβάνονται με την μέθοδο ΚΥΦ και στην συνέχεια, όταν απαιτείται, εφαρμογή κυτταρολογικής εξέτασης για την διαλογή γυναικών. Δεδομένου ότι η HPV DNA ανάλυση είναι πιο ευαίσθητη μέθοδος συγκριτικά με την κυτταρολογική (συμβατική ή ΚΥΦ) και λαμβάνοντας υπόψη τα ευρήματα διαφόρων ερευνών τα οποία δείχνουν ότι η πλειοψηφία των γυναικών στην Ευρώπη οι οποίες φέρουν LSIL αλλοίωση έχουν hrHPV τύπο, οι ερευνητές θεωρούν ότι αυτή η προσέγγιση θα αποτελέσει την ιδανικότερη μεθοδολογία ελέγχου για τον ΚΤΜ στον γυναικείο πληθυσμό της Ευρώπης.

Πέραν της HPV DNA ανάλυσης, έχει προταθεί η χρήση διαφόρων μοριακών δεικτών σε δείγματα ΚΥΦ για τον έλεγχο ή την πρόβλεψη εξέλιξης των HPV αλλοιώσεων σε καρκίνο. Οι μοριακοί αυτοί δείκτες είναι: η πρωτεΐνη p16INK4a , η υπερέκφραση της οποίας δείχνει αλλοιώσεις CIN η έκφραση της πρωτεΐνης πολλαπλασιασμού Ki-67, η οποία σε

περιπτώσεις ανίχνευσής της στην διάμεση και επιφανειακή στιβάδα δηλώνει αλλοίωση CIN ή καρκίνο

το ιικό φορτίο των hrHPV τύπων, υψηλό ιικό φορτίο σημαίνει παρουσία αλλοίωσης CIN, η σχέση αυτή έχει αποδειχτεί κυρίως για τον τύπο HPV-16.

Δείκτες ενσωμάτωσης και η αναλογική τους σχέση, π.χ. η υπερέκφραση των ιικών δεικτών Ε6 και Ε7 και η μείωση στην ποσότητα του DNA κατά την αναλογία Ε2/Ε6, η οποία αξιολογείται με την real-time PCR, δηλώνει εξέλιξη της νόσου.

Η έκφραση της πρωτεΐνης του καψιδίου του HPV, L1, η ανίχνευση της οποίας δηλώνει αλλοιώσεις CIN (κυρίως σε περιπτώσεις LSIL) και η σταδιακή της μείωση είναι δείκτης εξέλιξης της νόσου.

Άλλοι τρόποι προσέγγισης αποτελούν οι μοριακές δοκιμές οι οποίες εφαρμόζονται σε δείγματα που έχουν συλλεχθεί με την τεχνολογία ΚΥΦ και

81

ανιχνεύουν συνδυασμούς μοριακών δεικτών όπως είναι η διπλή ανοσοκυτταροχημική χρώση p16INK4a/ Ki-67, η οποία θεωρείται ότι αποτελεί έναν αξιόλογο δείκτη πρόγνωσης του ΚΤΜ, και μοριακές δοκιμές οι οποίες ανιχνεύουν το mRNA των ιικών ογκογονιδίων Ε6 και Ε7, που αποτελεί στοιχείο της ενσωμάτωσης του ιικού DNA στο DNA του ξενιστή και του πολλαπλασιασμού του υβριδίου. Οι μέθοδοι συνδυασμού μοριακών προγνωστικών δεικτών αποτελούν ιδανικοί υποψήφιοι για την μελλοντική εφαρμογή τους στο προσυμπτωματικό έλεγχο για τον ΚΤΜ, καθώς αυξάνουν την ευαισθησία αλλά και την ειδικότητα ανίχνευσης αλλοιώσεων που πιθανόν να εξελιχθούν σε CIN2+ ή καρκίνο.

Καθώς όμως, μέχρι σήμερα, δεν έχει αποδειχθεί η αξιοπιστία και η πλήρης διαγνωστική αξία αυτών των μοριακών δεικτών ώστε να χρησιμοποιηθούν ως μοναδικοί προγνωστικοί δείκτες του ΚΤΜ, μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο ως συμπληρωματικοί δείκτες σε συνδυασμό με την κυτταρολογική εξέταση. Δεδομένου λοιπόν των πλεονεκτημάτων της ΚΥΦ, δηλαδή την δυνατότητα αυτοματοποιημένης ανάλυσης κολποτραχηλικών επιχρισμάτων, την δυνατότητα εφαρμογής πολλαπλών εξετάσεων από το ίδιο δείγμα, την άριστη συντήρηση των DNA, RNA και πρωτεϊνών του κυττάρου για αρκετές εβδομάδες, σε συνδυασμό με την εφαρμογή συμπληρωματικών εξετάσεων ανίχνευσης μοριακών δεικτών, που έχουν δείξει εξαιρετικά ποσοστά ευαισθησίας και ειδικότητας και πολύ υψηλή αρνητική προγνωστική αξία, τα περιστατικά καρκίνου τραχήλου της μήτρας ενδέχεται να σημειώσουν σημαντική μείωση. Η μοριακή διάγνωση του καρκίνου δεν έχει περιοριστεί όμως μόνο στην γυναικολογική κυτταρολογία αλλά αποτελεί ένας πολλά υποσχόμενος τρόπος διάγνωσης και στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία όπως είναι η διάγνωση του καρκίνου του θυρεοειδούς και του μαστού. Ενώ η ΚΥΦ κερδίζει ολοένα και περισσότερο έδαφος ως μέθοδος συλλογής και επεξεργασίας μη-γυναικολογικών δειγμάτων παράλληλα πολλοί είναι εκείνοι που συνεχίζουν να εκδηλώνουν τις ανησυχίες τους για την εφαρμογή της τεχνολογίας αυτής στην διάγνωση αλλοιώσεων καρκίνου του θυρεοειδούς και μαστού. Η ΚΥΦ παρέχει την δυνατότητα μοριακών εξετάσεων για την ανίχνευση έκφρασης διαφόρων πρωτεϊνών αλλά και μεταλλάξεων που έχουν ανιχνευτεί στο γενετικό υλικό καρκινικών κυττάρων. Η ανίχνευσή τους γίνεται με ανοσκυτταροχημικές χρώσεις όπως ο φθορίζον in situ υβριδισμός (FISH), ενώ για την ανίχνευση των αλλαγών που υφίσταται το γονιδίωμα των καρκινικών κυττάρων μαστού τελευταία εφαρμόζονται όλο και πιο πολύ οι περισσότερο οικονομικά αποδοτικές μέθοδοι, που χρησιμοποιούν την τεχνολογία της FISH αλλά έχουν κάποιες διαφορές, αυτές είναι: ο χρωμογόνος in situ υβριδισμός (CISH) που χρησιμοποιεί χρωμογόνο αντί φθορίζουσα ουσία και ο silver in situ υβριδισμός (SISH). Η νεότερη μέθοδος, όπως ο συνδυασμός των δύο συστημάτων CISH και SISH (brightfield double in situ hybridization, BDISH) έχει αποδειχθεί μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική της FISH μεθόδου για την ανίχνευση γενετικών αλλαγών σε καρκινικά κύτταρα μαστού. Όλες αυτές οι καινούργιες μέθοδοι θεωρούνται χρήσιμες, απλές και εύκολα αναπαραγώγιμες με πολύ καλά αποτελέσματα όσον αφορά την σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας. Η εφαρμογή τους σε

82

δείγματα κυτταρολογίας υγρής φάσης έχει αποδειχτεί ότι είναι πιο ακριβής και έχει βρεθεί ότι μειώνονται αισθητά τα ψευδο-θετικά αποτελέσματα.

Γενικά η κυτταρολογία υγρής φάσης έχει αποδειχτεί ένα πολύ δυναμικό διαγνωστικό εργαλείο. Η χρήση της έχει βελτιώσει την διάγνωση του καρκίνου εισάγοντας νέες δυνατότητες και αποτελώντας την βάση για την εφαρμογή νέων μεθόδων που αναμένεται να οδηγήσουν την διαγνωστική κυτταρολογία από την κυτταρομορφολογική διάγνωση στην μοριακή διάγνωση.

83

ΠΠΕΕΡΡΙΙΛΛΗΗΨΨΗΗ

Το τεστ Παπανικολάου έχει αναγνωριστεί ευρέως ως μια αποτελεσματική μέθοδος για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Οι διάφοροι περιορισμοί της μεθοδολογίας αυτής όμως οδήγησαν στην ανάπτυξη νέας τεχνικής η οποία αναμένεται να ενισχύσει τον προσυμπτωματικό έλεγχο για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, αυτή είναι η Κυτταρολογία Υγρής Φάσης. Η ΚΥΦ έγινε αμέσως αποδεκτή και υιοθετήθηκε από πολλά εργαστήρια. Πλέον χρησιμοποιείται ευρέως, σχεδόν σε όλες τις ανεπτυγμένες χώρες για τον έλεγχο κολποτραχηλικών επιχρισμάτων. Επιπλέον, η χρήση της έχει εισαχθεί και στην μη-γυναικολογική κυτταρολογία για την διάγνωση καρκίνων σε δείγματα όπως θυρεοειδή και μαστού. Η τεχνική (συλλογή κυτταρικού υλικού σε υγρό μέσο συντήρησης και μεταφοράς) έχει εγκριθεί από τον FDA και έχει αποδειχτεί ότι με την χρήση της έχουν αυξηθεί τα ποσοστά ανίχνευσης των τραχηλικών αλλοιώσεων αυξάνοντας την ευαισθησία ενώ η ειδικότητα παραμένει σε ίδια επίπεδα. Η επεξεργασία και ανάλυση των επιχρισμάτων ΚΥΦ, τα οποία έχουν ληφθεί με αναρρόφηση μέσω λεπτής βελόνης, έχει αποδειχτεί μια πολύ επιτυχημένη μεθοδολογία με πολύ καλά αποτελέσματα, η χρήση της όμως δεν είναι τόσο διαδεδομένη όπως στην γυναικολογική κυτταρολογία καθώς υπάρχουν ακόμα αντιπαραθέσεις όσον αφορά την αποτελεσματικότητα της μεθόδου σε δείγματα μη-γυναικολογικής κυτταρολογίας. Παρόλα αυτά η ΚΥΦ προσφέρει αδιαμφισβήτητα πλεονεκτήματα, τα οποία αποτέλεσαν την αιτία υιοθέτησής της στα προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου σε αρκετές χώρες. Τα πλεονεκτήματα αυτά είναι η δραματική μείωση στο ποσοστό μη ικανοποιητικών δειγμάτων, δυνατότητα αυτοματοποίησης τόσο στην επεξεργασία όσο και στην ανάλυση (κολποτραχηλικά παρασκευάσματα) των επιχρισμάτων με συνέπεια να βελτιωθεί η απόδοση του εργαστηρίου, εύκολη και γρήγορη δια χειρός ανάλυση των επιχρισμάτων, λόγω των τεχνικών χαρακτηριστικών της, και δυνατότητα επικουρικών εξετάσεων στο υπολειπόμενο κυτταρικό υλικό. Οι έρευνες έχουν δείξει ότι η τεχνική ΚΥΦ εκτός του ότι παρέχει πολύ καλή συντήρηση των μορφολογικών χαρακτηριστικών των κυττάρων, συντηρεί σε άριστη κατάσταση και το νουκλεϊκό οξύ των κυττάρων (DNA και RNA). Δεδομένου λοιπόν της δυνατότητας εφαρμογής επικουρικών εξετάσεων σε συνδυασμό με την ικανότητα διατήρησης τόσο των μορφολογικών χαρακτηριστικών όσο και του γονιδιώματος των κυττάρων, η ΚΥΦ αποτελεί μια κατάλληλη μέθοδος για την εφαρμογή μοριακών εξετάσεων και παράλληλα αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο για μελλοντικές έρευνες.

84

AABBSSTTRRAACCTT

The Pap test is widely recognized as an effective method to prevent

cervical cancer. However, various limitations of this methodology led to the

development of a new technique that is expected to enhance cervical

cytology screening, the Liquid-based cytology (LBC). LBC was immediately

accepted and endorsed by many laboratories and is now extensively used

throughout the developed world for cervical cytology screening. Furthermore,

its use has been introduced to non-gynecological cytology for the diagnosis

of cancer, e.g. thyroid and breast cancer. The LBC technique (collection of

cellular material in liquid medium for preservation and transport) was

approved by FDA and had demonstrated increased detection rates for

cervicovaginal lesions increasing sensitivity while specificity remains the

same. Processing and screening LBC slides, which are obtained by fine-

needle aspirations, has been proved a very successful methodology with

good results. Its use though it is not widespread in non-gynecologic cytology

as it is in gynecologic cytology, as there are still controversies regarding the

effectiveness of the method when used in such samples. Nevertheless, LBC

has major advantages which were the cause for introducing it in screening

programs in several countries. Such advantages are the significant decrease

in unsatisfactory rates, the ability of automation in both processing and

analyzing (cervicovaginal specimen) smears, thus improving laboratory

performance, easy and rapid manual analysis, because of its technical

features, and the ability of ancillary tests on the residual LBC specimen.

Besides providing a good preservation of morphologic features of the cells,

studies have shown that LBC also provides an excellent preservation of

nucleic acid (DNA and RNA). Given the ability of ancillary tests and the

excellent preservation of cell genome, LBC is an appropriate method for the

application of molecular test and is a useful tool for future research.

85

ΒΒΙΙΒΒΛΛΙΙΟΟΓΓΡΡΑΑΦΦΙΙΑΑ

11.. Edmund S. Cibas, Barbara S. Ducatman. «Cytology: Diagnostic principals and clinical correlates», 3rd ed., Elsevier, 2009. ISBN 978-1-4160-5329-3

22.. McGoogan E. Liquid-based cytology: the new screening test for cervical cancer Control. Journal of Family Planning and Reproductive Health Care 2004; 30(2): 123–125

33.. Payne N, Chilcott J, McGoogan E. Liquid-based Cytology in Cervical Screening: A Rapid and Systematic Review. Southampton, UK: The National Co-coordinating Centre for Health Technology Assessment, 2000.

44.. Fahey MT, Irwig L, Macaskill P. Meta-analysis of Pap test accuracy. Am J Epidemiol 1995; 141: 680–689

55.. American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) Committee Opinion. New Pap test screening techniques. Int J Gynecol Obstet 1998; 63: 312–314.

66.. Nanda K, McCrory DC, Myers ER, Bastian LA, Hasselblad V, Hickey JD, Matchar DB. Accuracy of the Papanicolaou test in screening for and follow-up of cervical cytologic abnormalities: a systematic review. Ann Intern Med. 2000 May 16;132(10):810-9

77.. Ronco G, Cuzick J, Pierotti P, et al.: Accuracy of liquid-based versus conventional cytology: Overall results of new technologies for cervical cancer screening: randomized controlled trial. BMJ 2007;335(7609):28

88.. Davey E, Barratt A, Irwig L, et al.: Effect of study design and quality on unsatisfactory rates, cytology classifications, and accuracy in liquid-based versus conventional cervical cytology: A systematic review. Lancet 2006;367(9505):122-132

99.. Britt-Marie Ljung. Thyroid Fine-Needle Aspiration: Smears Versus Liquid-based Preparations. Cancer Cytopath. 2008; 114:144-148

1100.. Afify AM, Liu J, Al-Kafaji BM. Cytologic artifacts and pitfalls of thyroid fine-needle aspiration using ThinPrep. Cancer (Cancer Cytopathol). 2001;93:179–186.

1111.. Michael CW, Hunter B. Interpretation of fine-needle aspirates processed by the ThinPrep technique: cytologic artifacts and diagnostic pitfalls. Diagn Cytopathol. 2000;23:6–13.

1122.. Frost AR, Sidway MK, Ferfelli M, et al. Utility of thin-layer preparations in thyroid fine-needle aspiration. Cancer (Cancer Cytopathol). 1998;84:17–25.

1133.. Reinhard Bollmann. Liquid-based cytology for risk-adapted cervical screening. Gynakol Geburtsmed Gynakol Endokrinol 2008;4(2): 164–180. www.akademos.de/gyn. ISSN 1614-8533

86

1144.. M. Arbyn et al. European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening: recommendations for collecting samples for conventional and liquid-based cytology. Cyt. 2007;18:133–139.

1155.. Martin-Hirsch P. and colleagues. Efficacy of cervical-smear collection devices: a systematic review and meta-analysis. Lancet 1999; 354: 1763–70

1166.. Papanicolaou Technique Approved Guidelines (NCCLS Document GP15-A2)

1177.. ThinPrep® 2000 System Operator’s Manual, CYTYC. 2007

1188.. SurePath® Collection Product Insert – 779-07084-00 Rev. F, Becton, Dickinson and Company 2011: 3 www.bd.com

1199.. Monsonego J. Emerging issues of HPV infections: From science to practice. Basel, Karger, 2006: 149

2200.. PrepStain® System Product Insert – 779-07085-00 Rev. F, Becton, Dickinson and Company 2011: 1 www.bd.com

2211.. BD CytoRich™ Non-Gyn, Non-Gynecological Applications Procedures & Protocols, BD Diagnostics, 2007

2222.. CytoRich™ Red preservative Fluid Product Insert - 779-10004-02 REV C. F, Becton, Dickinson and Company 2011: 1 www.bd.com

2233.. Renshaw ΑΑ, Mody DR, Walsh M, Bentz JS, Colgan TJ. The significance in certification in Liquid based cytology. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:1269–1272

2244.. ThinPrep Pap Test morphology. Reference Atlas. Section one. Microscopic evaluation of ThinPrep Slides. Deanna K. Iverson. [www.cytologystuff.com]

2255.. Wilbur DC, Prey MU, Miller WM, Pawlick GF, Colgan TJ. The AutoPap System for primary screening in cervical cytology. Comparing the results of a prospective, intended-use study with routine practice. Acta Cytol 1998;42:214–20

2266.. Koss LG, Sherman ME, Cohen MB, Anes AR, Darragh TM, Lemos LB, et al. Significant reduction in the rate of false-negative cervical smears with a neural network-based technology (PAPNET Testing System). Hum Pathol 1997;28:1196–203

2277.. Ashfaq R, Liang Y, Saboorian MH. Evaluation of PAPNET system for rescreening of negative cervical smears. Diagn Cytopathol 1995;13:31–6

2288.. Bibbo M, Hawthorne C, Zimmerman B. Does. Use of the AutoPap assisted primary screener improve cytologic diagnosis? Acta Cytol 1999;43:23-6. [PUBMED]

2299.. Lozano R. Comparison of computer-assisted and manual screening of cervical cytology. Gynecol Oncol 2007;104:134-8. [PUBMED]

3300.. Miller FS, Nagel LE, Kenny-Moynihan MB. Implementation of the ThinPrep imaging system in a high-volume metropolitan laboratory. Diagn Cytopathol 2007;35:213-7. [PUBMED

3311.. Schledermann D, Hyldebrandt T, Ejersbo D, Hoelund B. Automated screening versus manual screening: A comparison of the ThinPrep imaging system and manual screening in a time study. Diagn Cytopathol 2007;35:348-52. [PUBMED]

3322.. Roberts JM, Thurloe JK, Bowditch RC, Hyne SG, Greenberg M, Clarke JM, et al . A three-armed trial of the ThinPrep imaging system. Diagn Cytopathol 2007;35:96-102. [PUBMED]

3333.. Wilbur DC et al. he Becton Dickinson FocalPoint GS Imaging System. Am J Clin Pathol 2009; 132: 767-775.

3344.. Anqelique W. Levi et al. Implementation of FocalPoint GS location-guided imaging system. Cancer (Cancer Cytopathol) 2011;120

3355.. Abulafia O, Pezzullo JC, Sherer DM. Performance of ThinPrep liquid-based cervical cytology in comparison with conventionally prepared Papanicolaou smears: a quantitative survey. Gynecol Oncol. 2003;90:137-144

87

3366.. Bernstein SJ, Sanchez-Ramos L, Ndubisi B. Liquid-based cervical cytologic smear study and conventional Papanicolaou smears: a metaanalysis of prospective studies comparing cytologic diagnosis and sample adequacy. Am J Obstet Gynecol. 2001;185:308-317

3377.. Klinkhamer PJ, Meerding WJ, Rosier PF, Hanselaar AG. Liquid-based cervical cytology. Cancer. 2003;99:263-271

3388.. Arbyn M, Bergeron C, Klinkhamer P, et al. Liquid compared with conventional cervical cytology: a systematic review and meta-analysis. Obstet Gynecol. 2008;111:167-177

3399.. Hartmann KE, Hall SA, Nanda K, Boggess JF, Zolnoun D. Screening for Cervical Cancer. Systematic Review No. 25. Rockville, MD: Agency for Healthcare Research and Quality; 2002

4400.. Sulik S, Kroeger K, Schultz J. et al. Are fluid-based cytologies superior to the conventional Papanicolaou test? A systematic review. J Fam Pract 2001; 50: 1040-1046

4411.. Arbyn M, Buntinx F, Van Ranst M, Paraskevaidis E, Martin-Hirsch P, Dillner J (2004) Virologic versus cytologic triage of women with equivocal Pap smears: a meta-analysis of the accuracy to detect high-grade intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst 96(4): 280–293

4422.. Cox JT. Liquid-based cytology: evaluation of effectiveness, cost-effectiveness, and application to present practice. J Natl Compr Canc Netw. 2004 Nov;2(6):597-611

4433.. Eversole GM, Moriarty AT, Schwartz MR, et al. Practices of participants in the College of American Pathologists interlaboratory comparison program in cervicovaginal cytology, 2006. Arch Pathol Lab Med. 2010;134:331-335

4444.. Lee KR, Ashfaq R, Birdson GG, et al. Comparison of conventional Papanicolaou smears and a fluid-based, thin-layer system for cervical cancer screening. Obstet Gynecol. 1997;90:278-284

4455.. Hatch KD, Sheets E, Kennedy A, et al. Multicenter direct to vial evaluation of a liquidbased pap test. J Low Genit Tract Dis. 2004;8:308-312

4466.. Ashfaq R, Gibbons D, Vela C, et al. ThinPrep Pap test. Accuracy for glandular disease. Acta Cytol. 1999;43:81-85

4477.. Bai H, Sung CJ, Steinhoff MM. ThinPrep Pap test promotes detection of glandular lesions of the endocervix. Diagn Cytopathol. 2000;23:19-22

4488.. Carpenter AB, Davey DD. ThinPrep Pap test: performance and biopsy follow-up in a university hospital. Cancer. 1999;87:105-112

4499.. Guidos BJ, Selvaggi SM. Detection of endometrial adenocarcinoma with the ThinPrep Pap test. Diagn Cytopathol. 2000;23:260-265

5500.. Schorge JO, Hossein Saboorian M, Hynan L, Ashfaq R. ThinPrep detection of cervical and endometrial adenocarcinoma: a retrospective cohort study. Cancer. 2002;96:338-343

5511.. Wang N, Emancipator SN, Rose P, et al. Histologic follow-up of atypical endocervical cells. Liquid-based, thin-layer preparation vs. conventional Pap smear. Acta Cytol. 2002;46:453-457

5522.. Marino JF, Fremont-Smith M. Direct-to-vial experience with AutoCyte PREP in a small New England regional cytology practice. J Reprod Med. 2001;46:353-358

5533.. ] Fremont-Smith M, Marino J, Griffin B, et al. Comparison of the SurePath liquid-based Papanicolaou smear with the conventional Papanicolaou smear in a multisite direct-to-vial study. Cancer. 2004;102:269-279

5544.. Clayton et al. Comparison of ThinPrep Preparations to Other Preparation Types in Gastrointestinal Cytology. Arch Pathol Lab Med. 2010;134:1116–1120

88

5555.. Bishop JW, MacFarlane K, Cheubront D, et al. Cell recovery and appearance in thin-layer preparations in nongynecologic cytology. Anal Quant Cytol Histol. 1998;20(4):229–237

5566.. Elsheikh TM, Kirkpatrick JL, Wu HH. Comparison of ThinPrep and cytospin preparations in the evaluation of exfoliative cytology specimens. Cancer (Cancer Cytopathol). 2006;108(3):144–149

5577.. Leung CS, Chiu B, Bell V. Comparison of ThinPrep and conventional preparations: nongynecologic cytology evaluation. Diagn Cytopathol. 1997;16(4):368–371

5588.. Moriarty AM, Schwartz MR, Ducatman BS, et al. A liquid concept—do classic preparations of body cavity fluid perform differently than ThinPrep cases? Arch Pathol Lab Med. 2008;132(11):1716–1718

5599.. Laucirica R, Bentz JS, Souers RS, et al. Do liquid-based preparations of urinary cytology perform differently than classically prepared cases: observations from the College of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in Nongynecologic Cytology. Arch Pathol Lab Med. 2010;134(1):19–22

6600.. Volmar KE, Vollmer RT, Routbort MJ, et al. Pancreatic and bile duct brushing cytology in 1000 cases: review of findings and comparison of preparation methods. Cancer. 2006;108(4):231–238

6611.. Siddiqui MT, Gokaslan ST, Saboorian MH, et al. Comparison of ThinPrep and conventional smears in detecting carcinoma in bile duct brushings. Cancer. 2003;99(4):205–210

6622.. Ylagan LR, Liu LH, Maluf HM. Endoscopic bile duct brushing of malignant pancreatic biliary strictures: retrospective study with comparison of conventional smear and ThinPrep techniques. Diagn Cytopathol. 2003;28(4):196–204

6633.. Minamiguchi S, McEvoy R, Fraig M, et al. Bile duct brushings on ThinPrep: experience with 68 specimens. Diagn Cytopathol. 2004;30(4):292–293

6644.. DEY P., LUTHRA U. K., GEORGE J., ZUHAIRY F., GEORGE S. S., HAJI B. I. Comparison of ThinPrep and conventional preparations on fine needle aspiration cytology material, Acta Cytol, 2000, 44(1):46–50

6655.. BÉDARD Y. C., POLLETT A. F., Breast fine-needle aspiration. A comparison of ThinPrep and conventional smears, Am J Clin Pathol, 1999, 111(4):523–527

6666.. RANA D. N., O’DONNELL M., MALKIN A., GRIFFIN M., A comparative study: conventional preparation and ThinPrep 2000 in respiratory cytology, Cytopathology, 2001, 12(6):390–398

6677.. COCHAND-PRIOLLET B., PRAT J. J., POLIVKA M., THIENPONT L., DAHAN H., WASSEF M., GUILLAUSSEAU P. J., Thyroid fine needle aspiration: the morphological features on ThinPrep slide preparations. Eighty cases with histological control, Cytopathology, 2003, 14(6):343–349

6688.. Renshaw et al. Comparison of Performance of Conventional and ThinPrep Gynecologic Preparations in the College of American Pathologists Gynecologic Cytology Program. Arch Pathol Lab Med. 2004;128:17–22

6699.. Linder J, Zahniser D. ThinPrep Papanicolaou testing to reduce false-negative cervical cytology. Arch Pathol Lab Med. 1998;122:139–144

7700.. LEE K. R., PAPILLO J. L., ST. JOHN T., EYERER G. J. A., Evaluation of the ThinPrep processor for fine needle aspiration specimens, Acta Cytol, 1996, 40(5):895–899

7711.. Solomon D, Nayar R. The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology: Definitions, Criteria and Explanatory Notes, 2nd edn. New York: Springer-Verlag; 2004

7722.. ] Geyer JW, Carrico C, Bishop JW. Cellular constitution of Autocyte PREP_ cervico-vaginal samples with biopsy-confirmed HSIL. Acta Cytol 2000;44:505

89

7733.. Studeman KD, Ioffe OB, Puszkiewicz J, Sauvegeot J, Henry MR. Effect of cellularity on the sensitivity of detecting squamous lesions in liquid-based cervical cytology. Acta Cytol 2003;47:605–10

7744.. Bolick DR, Kerr J, Staley BE, Ke Lin K. Effect of cellularity in the detection rates of high grade and low grade squamous intraepithelial lesions. Acta Cytol 2002;46:922–3

7755.. McQueen F. Duval E. The definition of an adequately cellular LBC specimen. Cytopathology 2006;17:168–74

7766.. Siebers, Klinkhamer, Vedder, Arbyn, Bulten. Causes and Relevance of Unsatisfactory and Satisfactory but Limited Smears of Liquid-Based Compared With Conventional Cervical Cytology. Arch Pathol Lab Med. 2012;136:76–83;doi: 10.5858/arpa.2011-0113-OA

7777.. Corkill M, Knapp D, Martin J, Hutchinson ML. Specimen adequacy of ThinPrep sample preparations in a direct-to-vial study. Acta Cytol. 1997;41(1):39–44

7788.. Duggan MA, Khalil M, Brasher PMA, Nation JG. Comparative study of theThinPrep Pap test and conventional cytology results in a Canadian cohort. Cytopathology. 2006;17(2):73–81

7799.. Moriarty AT, Clayton AC, Zaleski S, et al. Unsatisfactory reporting rates. Arch Pathol Lab Med. 2009;133(12):1912–1916

8800.. Alsharif M, McKeon DM, Gulbahce HE, Savik K, Pambuccian SE. Unsatisfactory SurePath liquid-based Papanicolaou tests. Cancer Cytopathol. 2009;117(1):15–26

8811.. Martin H. Luu, Andrew H. Fischer, Latha Pisharodi, Christopher L. Owens. Improved Preoperative Definitive Diagnosis of Papillary Thyroid Carcinoma in FNAs Prepared With Both ThinPrep and Conventional Smears Compared With FNAs Prepared With ThinPrep Alone. Cancer (Cancer Cytopathol) 2011;119:68–73

8822.. Andra R. Frost, Mary K. Sidawy, Mary Ferfelli, Sana O. Tabbara, M, Nicole A. Bronner, Keith R. Brosky, Mark E. Sherman. Utility of Thin-Layer Preparations in Thyroid Fine-Needle Aspiration. Cancer (Cancer Cytopathol) 1998;84: 17–25

8833.. Alaa M. Afify, Jing Liu, Basim M. Al-Khafaji. Cytologic Artifacts and Pitfalls of Thyroid Fine-Needle Aspiration Using ThinPrep. Cancer (Cancer Cytopathol) 2001;93:179–186

8844.. Jeremy R. Parfitt, C. Meg McLachlin, Michele M. Weir. Comparison of ThinPrep and Conventional Smears in Salivary Gland Fine-Needle Aspiration Biopsies. Cancer (Cytopathol) 2007;111:123–9

8855.. Chhieng DC, Talley LI, Roberson J, et al. Interobserver variability: Comparison between liquid-based and conventional preparations in gynecologic cytology. Cancer (Cytopathol). 2002;96:67–73

8866.. Wilbur DC, Dubeshter B, Angel C, Atkison KM. Use of thin-layer preparations for gynecologic smears with emphasis on the cytomorphology of high grade intraepithelial lesions and carcinomas. Diagn Cytopathol. 1996;14:201– 211

8877.. Renshaw et al The Significance of Certification in Liquid-Based Cytology and Performance in the College of American Pathologists Interlaboratory Comparison Program in Cervicovaginal Cytopathology. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:1269–1272

8888.. de Luna R, Eloubeidi MA, Sheffield MV, Eltoum I, Jhala N, Jhala D, Chen VK, Chhieng DC. Comparison of ThinPrep® and conventional preparations in pancreatic fine-needle aspiration biopsy. Diagn. Cytopathol. 2004;30:71–76

8899.. Belinson JL, Qiao YL, Pretorius RG, Zhang WH, Rong SD, Huang MN, et al. Shanxi Province cervical cancer screening study. II: Self-sampling for high-risk

90

human papillomavirus compared to direct sampling for human papillomavirus and liquid based cervical cytology. Int J Gynecol Cancer 2003;13:819–26

9900.. Ronco G, Segnan N, Giorgi-Rossi P, Zappa M, Casadei GP, Carozzi F, et al. Human papillomavirus testing and liquid-based cytology: results at recruitment from the new technologies for cervical cancer randomized controlled trial. J Natl Cancer Inst 2006;98:765–74

9911.. Emilia H. Koumans, et al. Comparison of Methods for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Using Commercially Available Nucleic Acid Amplification Tests and a Liquid Pap Smear Medium. J. Clinc. Microb. 2003;4: 1507–1511

9922.. Chernesky et al. Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Infections in North American Women by Testing SurePath Liquid-Based Pap Specimens in APTIMA Assays. J. Clin. Microbiol. 2007, 45(8):2434

9933.. Chernesky et al. Abilities of APTIMA, AMPLICOR, and ProbeTec Assays To Detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in PreservCyt ThinPrep Liquid-Based Pap Samples. J. Clin. Microbiol. 2007, 45(8):2355

9944.. Shahidul Islam et al. Reprocessing unsatisfactory ThinPrep Papanicolaou test specimens increases sample adequacy and detection of significant cervicovaginal lesions. Cancer Cytopath. 2004 ;102:67–73

9955.. Grapsa et al. Repeat Processing of Residual ThinPrep Pap Tests: Sampling of the Vial May Not Be Invariably Homogeneous. Acta Cytologica 2011;55:213-217

9966.. Sin Hang Lee et al. Molecular tests for human papillomavirus (HPV), Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in liquid-based cytology specimen. BMC Women's Health 2009, 9:8

9977.. Khalbuss WE, Pananowitz L, Parwani AV. Digital imaging in cytopathology. Pathology research international. Volume 2011, article ID 264683, 10 pages, Doi: 10.4061/2011264683

9988.. Dziura B, Quinn S, Richard K. Performance of an imaging system vs. manual screening in the detection of squamous intraepithelial lesions of the uterine cervix. Acta Cytol 2006;50:309-11

9999.. Pantanowitz L, Maryanne Hornish, Robert A Goulart. The impact of digital imaging in the field of cytopathology. CytoJournal 2009;6:6 [SIENCE DIRECT]

110000.. Colgan TJ, Patten SF, Lee JS. A clinical trial of the AutoPap 300 QC System for quality control of cervicovaginal cytology in the clinical laboratory. Acta Cytol 1995;39:1191-8

110011.. Alasio LM, Alphandery C, Grassi P, Ruggeri M, De Palo G, Pilotti S. Performance of the AutoPap Primary Screening System in the detection of high-risk cases in cervicovaginal smears. Acta Cytol 2001;45:704-8. [PUBMED]

110022.. Teach WD. Validation of AutoPap primary screening system sensitivity and high-risk performance. Acta Cytol 2002;46:296-302

110033.. Parker EM, Foti JA, Wilbur DC. FocalPoint slide classification algorithms show robust performance in classification of high-grade lesions on SurePath liquid-based cervical cytology slides. Diagn Cytopathol 2004;30:107-10. [PUBMED]

110044.. Biscotti CV, Dawson AE, Dziura B, Galup L, Darragh T, Rahemtulla A, et al . Assisted primary screening using the automated ThinPrep imaging system. Am J Clin Pathol 2005;123:281-7. [PUBMED]

110055.. Passamonti B, Bulletti S, Camilli M, D′Amico MR, Di Dato E, Gustinucci D, et al . Evaluation of the FocalPoint GS System performance in an Italian population-based screening of cervical abnormalities. Acta Cytol 2007;51:865-71. [PUBMED]

91

110066.. Chivukula M, Saad RS, Elishaev E, White S, Mauser N, Dabbs DJ. Introduction of the ThinPrep Imaging System™ (TIS): Experience in a high volume academic practice. CytoJournal 2007;4:6

110077.. Thrall MJ, Russell DK, Bonfiglio TA, Hoda RS. Use of the ThinPrep® Imaging System does not alter the frequency of interpreting Papanicolaou tests as atypical squamous cells of undetermined significance. Cytojournal 2008;24;5:10

110088.. Eltoum IA, Roberson J. Impact of HPV testing, HPV vaccine development, and changing screening frequency on national Pap test volume: Projections from the National Health Interview Survey (NHIS). Cancer 2007;111:34-40. [PUBMED]

110099.. Eltoum IA, Roberson J. Impact of expected changes in national papanicolaou test volume on the cytotechnology labor market: an impending crisis. Am J Clin Pathol 2007;128:665-70. [PUBMED]

111100.. Πανοτοπούλου-Φλαμπουράρη Ε. HPV και καρκίνος του τραχήλου της μήτρας. Η φυσική ιστορία της λοίμωξης βάσει επιδημιολογικών και κλινικών δεδομένων. http://www.ddy.gr/LinkClick.aspx?fileticket=7SXRAx5D15E%3D&tabid=108&mid=465&language=en-US

111111.. Castle et al. Comparison between Prototype Hybrid Capture 3 and Hybrid Capture 2 Human Papillomavirus DNA Assays for Detection of High-Grade Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cancer. J. Clin Microbiol. 2003;41(9):4022–4030

111122.. Davy Vanden Broeck. «Human Papillomavirus and Related Diseases – From Bench to Bedside – Research Aspects», InTech, Rijeka, Croatia, 2012, ISBN 978-953-307-855-7

111133.. Huang et al. Comparsion between the Hybrid Capture II test and an SPF1/GP6+ PCR-Based Assay for Detection of Human Papillomavirus DNA in Cervical Swab Samples

111144.. Jain S, Tseng C-J, Horng S-G, Soong Y-K, Pao CC. Negative predictive value of human papillomavirus test following conization of the cervix uteri. Gynecol Oncol. 2001;82:177–180

111155.. Lin C-T, Tseng C-J, Lai C-H, et al. Value of human papillomavirus deoxyribonucleic acid testing after conization in the prediction of residual disease in the subsequent hysterectomy specimen. Am J Obstet Gynecol. 2001;184:940– 945

111166.. Paraskevaidis E, Koliopoulos G, Alamanos Y, Malamou-Mitsi V, Lolis ED, Kitchener HC. Human papillomavirus testing and the outcome of treatment for cervical intraepithelial neoplasia. Obstet Gynecol. 2001;98:833–836

111177.. Goldie SJ, Kim JJ, Wright TC. Cost-effectiveness of human papillomavirus DNA testing for cervical cancer screening in women aged 30 years or more. Obstet Gynecol. 2004;103(4):619-31

111188.. Arbyn, M., Martin-Hirsch, P., Buntinx, F., Van Ranst, M., Paraskevaidis, E. & Dillner, J.. Triage of women with equivocal or low-grade cervical cytology results: a meta-analysis of the HPV test positivity rate. J Cell Mol Med, 2009;13(4):648-659

111199.. Arbyn, M., Sankaranarayanan, R., Muwonge, R., Keit,a N., Dolo, A., Mbalawa, C.G., Nouhou, H., Sakande. B., Wesley, R., Somanathan, T., Sharma, A., Shastri, S. & Basu, P.. Pooled analysis of the accuracy of five cervical cancer screening tests assessed in eleven studies in Africa and India. Int J Cancer 2008;1;123(1): 153-160

112200.. Petry KU, Menton S, Menton M, van Loenen-Frosch F, de Carvalho Gomes H, Holz B, et al. Inclusion of HPV testing in routine cervical cancer screening for women above 29 years in Germany: results for 8466 patients. Br J Cancer. 2003;88:1570-7. [PMID: 12771924]

92

112211.. Bigras G, de Marval F. The probability for a Pap test to be abnormal is directly proportional to HPV viral load: results from a Swiss study comparing HPV testing and liquid-based cytology to detect cervical cancer precursors in 13,842 women. Br J Cancer. 2005;93:575-81. [PMID: 16136031]

112222.. Ca´rdenas-Turanzas M, Nogueras-Gonzalez GM, Scheurer ME, Adler- Storthz K, Benedet JL, Beck JR, et al. The performance of human papillomavirus high-risk DNA testing in the screening and diagnostic settings. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17:2865-71. [PMID: 18843032]

112233.. Coste J, Cochand-Priollet B, de Cremoux P, Le Gale`s C, Cartier I, Molinie´ V, et al; French Society of Clinical Cytology Study Group. Cross sectional study of conventional cervical smear, monolayer cytology, and human papillomavirus DNA testing for cervical cancer screening. BMJ. 2003;326:733. [PMID: 12676841]

112244.. Mayrand MH, Duarte-Franco E, Rodrigues I, Walter SD, Hanley J, Ferenczy A, et al; Canadian Cervical Cancer Screening Trial Study Group. Huma papillomavirus DNA versus Papanicolaou screening tests for cervical cancer. N Engl J Med. 2007;357:1579-88. [PMID: 17942871]

112255.. Denton et al. The Sensitivity and Specificity of p16INK4aCytology vs HPV Testing for Detecting High-Grade Cervical Disease in the Triage of ASC-US and LSIL Pap Cytology Results. American Journal of Clinical Pathology, 2010;134: 12-21

112266.. Akpolat I, Smith DA, Ramzy I, Chirala M, Mody DR. The utility of p16INK4a and Ki-67 staining on cell blocks prepared from residual thin-layer cervicovaginal material. Cancer. 2004; 102: 142–149

112277.. Bibbo M, Klump WJ, DeCecco J, Kovatich AJ. Procedure for immunocytochemical detection of P16INK4A antigen in thin-layer, liquid-based specimens. Acta Cytol. 2002; 46: 25–29. PubMed

112288.. Bibbo M, DeCecco J, Kovatich AJ. P16INK4A as an adjunct test in liquid-based cytology. Anal Quant Cytol Histol. 2003; 25: 8–11. PubMed

112299.. Guo M, Hu L, Baliga M, He Z, Hughson MD. The predictive value of p16(INK4a) and Hybrid Capture 2 human papillomavirus testing for high-grade cervical intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol. 2004; 122: 894–901. PubMed

113300.. Murphy N, Ring M, Killalea AG, et al. p16INK4A as a marker for cervical dyskaryosis: CIN and cGIN in cervical biopsies and ThinPrep smears. J Clin Pathol. 2003; 56: 56–63

113311.. Nieh S, Chen SF, Chu TY, Lai HC, Fu E. Expression of p16 INK4A in Papanicolaou smears containing atypical squamous cells of undetermined significance from the uterine cervix. Gynecol Oncol. 2003; 91: 201–208

113322.. Nieh S, Chen SF, Chu TY, Lai HC, Fu E. Expression of p16INK4A in Pap smears containing atypical glandular cells from the uterine cervix. Acta Cytol. 2004; 48: 173–180

113333.. Pientong C, Ekalaksananan T, Swadpanich U, et al. Immunocytochemical detection of p16INK4a protein in scraped cervical cells.Acta Cytol. 2003; 47: 616–623

113344.. Sahebali S, Depuydt CE, Segers K, et al. P16INK4a as an adjunct marker in liquid-based cervical cytology. Int J Cancer. 2004; 108:871–876

113355.. Saqi A, Pasha TL, McGrath CM, Yu GH, Zhang P, Gupta P. Overexpression of p16INK4A in liquid-based specimens (SurePath) as marker of cervical dysplasia and neoplasia. Diagn Cytopathol. 2002; 27: 365–370

113366.. Yoshida T, Fukuda T, Sano T, Kanuma T, Owada N, Nakajima T. Usefulness of liquid-based cytology specimens for the immunocytochemical study of p16 expression and human papillomavirus testing: a comparative study using simultaneously sampled histology materials. Cancer. 2004; 102: 100–108

93

113377.. Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, Fukuda T, Nakajima T. Expression status of p16 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions. Am J Pathol 1998;153:1741 – 8

113388.. Klaes R, Benner A, Friedrich T, et al. p16INK4a immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia. Am J Surg Pathol 2002;26:1389 – 99

113399.. Agoff SN, Lin P, Morihara J, Mao C, Kiviat NB, Koutsky LA. p16(INK4a) expression correlates with degree of cervical neoplasia: a comparison with Ki-67 expression and detection of high-risk HPV types. Mod Pathol 2003;16:665 – 73

114400.. Wang SS, Trunk M, Schiffman M, et al. Validation of p16INK4a as a marker of oncogenic human papillomavirus infection in cervical biopsies from a population-based cohort in Costa Rica. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev2004;13:1355 – 60

114411.. Hu L, Guo M, He Z, Thornton J, McDaniel LS, Hughson MD. Human papillomavirus genotyping and p16INK4a expression in cervical intraepithelial neoplasia of adolescents. Mod Pathol 2005;18:267 – 73

114422.. Benevolo M, Mottolese M, Marandino F, et al. Immunohistochemical expression of p16(INK4a) is predictive of HR-HPV infection in cervical low-grade lesions. Mod Pathol 2006;19:384 – 91

114433.. Focchi GR, Silva ID, Nogueira-de-Souza NC, Dobo C, Oshima CT, Stavale JN. Immunohistochemical expression of p16(INK4A) in normal uterine cervix, nonneoplastic epithelial lesions, and low grade squamous intraepithelial lesions. J Low Genit Tract Dis 2007; 11:98 – 104

114444.. Sahebali E., Ki-67 immunocytochemistry in liquid based cervical cytology: useful as an adjunctive tool? J Clin Pathol 2003;56:681-686

114455.. Lilli, F.B.(2005). Determination of human papillomavirus (HPV) load and type in highgrade cervical lesions surgically resected from HIV-infected women during followup of HPV infection. Clin Infect Dis 40, 451-457

114466.. Xi, L.F., Hughes, J.P., Castle, P.E., Edelstein, Z.R., Wang, C., Galloway, D.A., Koutsky, L.A., Kiviat ,N.B. & Schiffman, M. (2011). Viral load in the natural history of human papillomavirus type 16 infection: a nested case-control study. J Infect Dis 15;203(10): 1425-1433

114477.. Denis, F., Hanz, S. & Alain, S.(2008). Clearance, persistence and recurrence of HPV infection. Gynecol Obstet Fertil 36: 430-440

114488.. Zappacosta, R., Caraceni, D., Ciccocioppo, L., Ottaviantonio, M., Conti, F., Andreozzi, S., Petrucci, F. & Rosini S. (2010). Is HPV-DNA testing a useful tool in predicting low grade squamous intraepithelial lesion outcome? A retrospective longitudinal study. Int J Immunopathol Pharmacol 23(1): 317-326

114499.. Cuschieri et. al., Assessment of human papillomavirus mRNA detection over time in cervical specimens collected in liquid based cytology medium. 2005;124(1-2):211-215

115500.. Powell et al. Recovery of human papillomavirus nucleic acids from liquid-based cytology media. 2006;137(1):58-62

115511.. Cuschieri et. al., Human Papillomavirus mRNA and p16 Detection as Biomarkers for the Improved Diagnosis of Cervical Neoplasia. Cancer Epidemiol Biomarkers PrevOctober 2008 17; 2536

115522.. Xiao W, Bian M, Ma L, Liu J, Chen Y, Yang B, Wu Q: Immunochemical analysis of human papillomavirus L1 capsid protein in liquidbased cytology samples from cervical lesions. Acta Cytol 2010; 54: 661–667

115533.. Sarmadi S, Izadi-Mood N, Pourlashkari M, Yarandi F, Sanii S: HPV L1 capsid protein expression in squamous intraepithelial lesions of cervix uteri and its relevance to disease outcome. Arch Gynecol Obstet 2011, E-pub ahead of print

94

115544.. Yu L , Wang L , Zhong J, Chen S: Diagnostic value of p16INK4A, Ki-67, and human papillomavirus L1 capsid protein immunochemical staining on cell blocks from residual liquid-based gynecologic cytology specimens. Cancer Cytopathol 2010; 118: 47–55

115555.. Sahebali S, Depuydt CE, Boulet GA, Arbyn M, Moeneclaey LM, Vereecken AJ, Van Marck EA, Bogers JJ: Immunocytochemistry in liquid-based cervical cytology: analysis of clinical use following a cross-sectional study. Int J Cancer 2006; 118: 1254–1260

115566.. Schmidt D, Bergeron C, Denton KJ, Ridder R: p16/Ki-67 dual-stain cytology in the triage of ASCUS and LSIL Papanicolaou cytology: results from the European Equivocal or Mildly Abnormal Papanicolaou Cytology Study. Cancer Cytopathol 2011; 119: 158–166

115577.. Petry KU, Schmidt D, Scherbring S, Luyten A, Reinecke-Luthge A, Bergeron C, Kommoss F, Loning T, Ordi J, Regauer S, Ridder R: Triaging Pap cytology negative, HPV positive cervical cancer screening results with p16/Ki-67 Dual-stained cytology. Gynecol Oncol 2011; 121: 505–509

115588.. Dixon et al. Isolation of RNA from residual BD SurePath™ liquid-based cytology specimens and detection of HPV E6/E7mRNA using the PreTect™ HPV-Proofer assay. 2008;154(1-2):220-222

115599.. Coquillard et al. Quantification of intracellular HPV E6/E7 mRNA expression increases the specificity and positive predictive value of cervical cancer screening compared to HPV DNA. 2011;120(1):89-93

116600.. Molden, T., Nygard, J.F., Kraus, I., Karlsen, F., Nygard, M., Skare, G.B., Skomedal, H., Thoresen, S.O. & Hagmar, B. (2005). Predicting CIN2+ when detecting HPV mRNA and DNA by PreTect HPV-proofer and consensus PCR: A 2-year follow-up of women with ASCUS or LSIL Pap smear. Int J Cancer 10: 973-977

116611.. Benevolo, M., Vocaturo, A., Caraceni, D., French, D., Rosini, S., Zappacosta, R., Terrenato, I., Ciccocioppo, L., Frega, A. & Giorgi Rossi, P. (2011) Sensitivity, Specificity, and Clinical Value of Human Papillomavirus (HPV) E6/E7 mRNA Assay as a Triage Test for Cervical Cytology and HPV DNA Test. J Clin Microbiol 49(7): 2643-2650

116622.. E. D. Rossi,M. Rafaeli, C.Minimo et al., “Immunohistochemicalevaluation of thyroid neoplasms in Thin-Layer smears from fine needle aspiration biopsies,” Cancer Cytopathology,vol. 105, no. 2, pp. 87–95, 2005

116633.. M.-E. Nga, G. S. Lim, C. H. Son, and M. P. Kumarasinghe, “HBME-1 and CK19 are highly discriminatory in the cytological diagnosis of papillary thyroid carcinoma,” Diagnostic Cytopathology, vol. 36, no. 8, pp. 550–556, 2008

116644.. D. El Demellawy, A. Nasr, and S. Alowami, “Application of CD56, P63 and CK19 immunohistochemistry in the diagnosis of papillary carcinoma of the thyroid,” Diagnostic Pathology, vol. 3, no. 1, article no. 5, 2008

116655.. M. L. Prasad, N. S. Pellegata, Y. Huang, H. N. Nagaraja, A. De La Chapelle, and R. T. Kloos, “Galectin-3, fibronectin- 1, CITED-1, HBME1 and cytokeratin-19 immunohistochemistry is useful for the differential diagnosis of thyroid tumors,” Modern Pathology, vol. 18, no. 1, pp. 48–57, 2005

116666.. D. El Demellawy, A. L. Nasr, S. Babay, and S. Alowami, “Diagnostic utility of CD56 immunohistochemistry in papillary carcinoma of the thyroid,” Pathology Research and Practice, vol. 205, no. 5, pp. 303–309, 2009

116677.. A. Naito, H. Iwase, T. Kuzushima, T. Nakamura, and S. Kobayashi, “Clinical significance of E-cadherin expression in thyroid neoplasms,” Journal of Surgical Oncology, vol. 76, no. 3, pp. 176–180, 2001

95

116688.. L. S. Freudenberg, S. Sheu, R. G¨orges et al., “Prognostic value of c-erbB-2 expression in papillary thyroid carcinoma,” NuklearMedizin, vol. 44, no. 5, pp. 179–180, 2005

116699.. C. Zafon,G.Obiols, J. Castellv´ı, S. Ramon Y Cajal, J. A. Baena, and J. Mesa, “Expression of p21cip1, p27kip1, and p16 INk4a cyclin-dependent kinase inhibitors in papillary thyroid carcinoma: correlation with clinicopathological factors,” Endocrine Pathology, vol. 19, no. 3, pp. 184–189, 2008

117700.. A. N. Haberal, S. Toru, O. O¨ zen, Z. Arat, and B. Bilezikc¸i, “Diagnostic pitfalls in the evaluation of fine needle aspiration cytology of the thyroid: correlation with histopathology in 260 cases,” Cytopathology, vol. 20, no. 2, pp. 103–108, 2009

117711.. L. Griffith, C. G. Chiu, A.M. Gown, S. J. M. Jones, and S. M. Wiseman, “Biomarker panel diagnosis of thyroid cancer: a critical review,” Expert Review of Anticancer Therapy, vol. 8, no. 9, pp. 1399–1413, 2008

117722.. Pazaitou-Panayiotou Κ. et al. The Immunocytochemistry Is a Valuable Tool in the Diagnosis of Papillary Thyroid Cancer in FNA’s Using Liquid-Based Cytology. [Διαδίκτυο]: Journal of Oncology Volume 2010 (2010), Article ID 963926, 5 pages

doi:10.1155/2010/963926. http://www.hindawi.com/journals/jo/2010/963926/

117733.. J. Y. Kim, H. Cho, B. D. Rhee, and H.-Y. Kim, “Expression of CD44 and cyclin D1 in fine needle aspiration cytology of papillary thyroid carcinoma,” Acta Cytologica, vol. 46, no. 4, pp. 679–683, 2002

117744.. M. R. Nasr, S. Mukhopadhyay, S. Zhang, and A.-L. A. Katzenstein, “Immunohistochemical markers in diagnosis of papillary thyroid carcinoma: utility of HBME1 combined with CK19 immunostaining,” Modern Pathology, vol. 19, no. 12, pp. 1631–1637, 2006

117755.. D. L. Segev, D. P. Clark, M. A. Zeiger, and C. Umbricht, “Beyond the suspicious thyroid fine needle aspirate: a review,” Acta Cytologica, vol. 47, no. 5, pp. 709–722, 2003

117766.. A. Bartolazzi, F. Orlandi, E. Saggiorato et al., “Galectin-3-expression analysis in the surgical selection of follicular thyroid nodules with indeterminate fine-needle aspiration cytology: a prospective multicentre study,” The Lancet Oncology, vol. 9, no. 6, pp. 543–549, 2008

117777.. L. J. Mills, D. N. Poller, and C. Yiangou, “Galectin-3 is not useful in thyroid FNA,” Cytopathology, vol. 16, no. 3, pp. 132– 138, 2005

117788.. K. T. Mai, R. Bokhary, H. M. Yazdi, J. Thomas, and A. S. Commons, “Reduced HBME-1 immunoreactivity of papillary thyroid carcinoma and papillary thyroid carcinoma-related neoplastic lesions with H¨urthle cell and/or apocrine-like changes,” Histopathology, vol. 40, no. 2, pp. 133–142, 2002

117799.. A. Mitselou, E. Ioachim, D. Peschos et al., “E-cadherin adhesion molecule and syndecan-1 expression in various thyroid pathologies,” Experimental Oncology, vol. 29, no. 1, pp. 54–60, 2007

118800.. Husain A Saleh et al., Differential expression of galectin-3, CK19, HBME1, and Ret oncoprotein in the diagnosis of thyroid neoplasms by fine needle aspiration biopsy. CytoJournal 2009, 6:18

118811.. Grogan R.H. et al., The Evolution of Biomarkers in Thyroid Cancer—From Mass Screening to a Personalized Biosignature. Cancers 2010; 2: 885-912

118822.. D. K. Das and P. N. Sharma, “Diagnosis of papillary thyroid carcinoma in fine needle aspiration smears: factors that affect decision making,” Acta Cytologica, vol. 53, no. 5, pp. 497–506, 2009

118833.. Βαλερή Ρ. M., «Εξελίξεις στην κυτταρολογική διάγνωση του καρκίνου του μαστού», 9o Πανελλήνιο συνέδριο Κλινικής Κυτταρολογίας, Αθήνα, 2011

96

118844.. Gruver AM, Peerwani Z, Tubbs RR. Out of the darkness and into the light: bright field in situ hybridisation for delineation of ERBB2 (HER2) status in breast carcinoma. J Clin Pathol. 2010;63(3):210–219

118855.. Nitta H, Hauss-Wegrzyniak B, Lehrkamp M, et al. Development of automated brightfield double in situ hybridization (BDISH) application for HER2 gene and chromosome 17 centromere (CEN 17) for breast carcinomas and an assay performance comparison to manual dual color HER2 fluorescence in situ hybridization (FISH). Diagn Pathol. 2008;3:41

118866.. Pedersen et al., he Correlation Between Dual-color Chromogenic In Situ Hybridization and Fluorescence In Situ Hybridization in Assessing HER2 Gene Amplification in Breast Cancer. Diagnostic Molecular Pathology. 2009;18(2):96-102

118877.. Vocaturo et al., Chromogenic In Situ Hybridization to Detect HER-2/neu Gene Amplification in Histological and ThinPrepR-Processed Breast Cancer Fine-Needle Aspirates: A Sensitive and Practical Method in the Trastuzumab Era. The Oncologist 2006;11:878–886

118888.. Tisserand, et al., ThinPrep_-Processed Fine-Needle Samples of Breast Are Effective Material for RNA- and DNA-Based Molecular Diagnosis. Cancer (Cancer Cytopathol) 2003;99:223–32

118899.. Moss S.M. et al., Evaluation of HPV/LBC Cervical Screening Pilot Studies. 2006 http://ia201120.eu.archive.org/ea/20060731065549/http://www.cancerscreening.nhs.uk/cervical/evaluation-hpv-2006feb.pdf

119900.. Whitlock EP. Et al., Liquid-Based Cytology and Human Papillomavirus Testing to Screen for Cervical Cancer: A Systematic Review for the U.S. Preventive Services Task Force. Ann Intern Med. 2011;155:687-697

119911.. Kim J, Wright TC, Goldie SJ. Cost-effectiveness of alternative triage strategies for atypical squamous cells of undetermined significance. JAMA. 2002;287:2382–90

119922.. Goldie et al., Cost-Effectiveness of Human Papillomavirus DNA Testing for Cervical Cancer Screening in Women Aged 30 Years or More. Obstet Gynecol 2004;103:619 –31

119933.. Goldie et al., Cost-Effectiveness of Human Papillomavirus DNA Testing for Cervical Cancer Screening in Women Aged 30 Years or More. Obstet Gynecol 2004;103:619 –31

119944.. Cuzick J, Pasieni P, Davies, P, Adams J, Normand C, Frater A, et al. A systematic review of the role of human papillomavirus testing within a cervical screening programme. Health Technol Assess 1999;3:14

119955.. Hutchinson ML, Berger BM, Farber FL. Clinical and cost implications of new technologies for cervical cancer screening: the impact of test sensitivity. Am J Manage Care 2000;6:766–80

119966.. Mandelblatt JS, Lawrence WF, Womack SM, Jacobson D, Yi B, Hwang YT, et al. Benefits and costs of using HPV testing to screen for cervical cancer. JAMA 2002;287:2372–81

119977.. Myers E, McCrory D, Nanda K, Matchar D. Mathematical model for the natural history of human papillomavirus infection and cervical carcinogenesis. Am J Epidemiol 2000;151:1158 –71