Estudios de ADN

Aplicación Forense,

Paternidad y Parentesco

Dr. Hugo TorioMSc. en Biotecnología Molecular (TUM)

Laboratorio CURIEAsunción – Paraguay

Tel: 200 447

Microsatélites

Short Tandem Repeat

En genética, los microsatélites son secuencias de ADN

en las que un fragmento se repite de manera

consecutiva.

La variación en el número de repeticiones crea

diferentes alelos.

Generalmente se encuentran en zonas no codificantes

del ADN.

Marcadores de STR Cromosomas Somáticos: D16S539, D7S820 D13S317,

F13A01, FESFPS, vWA, CSF1PO, TPOX, TH01, PENTA E, PENTA D, D8S1179, D3S1358, D5S818, F13B, LPL

Cromosoma X: DXS8378, DXS10135, DXS10148; DXS7132, DXS10074, DXS10079; HPRTB, DXS10101, DXS10103; DXS7423, DXS10134, DXS10146

Cromosoma Y: DYS389II, DYS439, DYS389I, DYS385a/b, DYS19, DYS437, DYS392, DYS390, DYS438, DYS393, DYS391

Información sobre STRs

http://www.cstl.nist.gov/strbase/

Other Names Chromosomal

Location

GenBank Accession

UniSTS: none reported 21q22.3

Chr 21; 43.880 Mb (May

2004, NCBI Build 35)

AP001752; has 13

repeats

Penta D

Repeat: [AAAGA] = top strand

Información sobre STRs

http://www.cstl.nist.gov/strbase/

Reported Primers Ref. PCR Primer Sequences

Set 1 Promega PowerPlex 16 (JOE labeled) primer

sequences

5'-[JOE]-GAAGGTCGAAGCTGAAGTG-3'

5'-ATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAG-

3'

Penta D

PCR Product Sizes of Observed Alleles

Allele (Repeat #) Set 1 Repeat Structure

7 399 bp [AAAGA]7

8 404 bp [AAAGA]8

9 409 bp [AAAGA]9

Mutation Rate: 0.14%

Frecuencias alélicas (STRs)http://www.promega.com/products/pm/genetic-identity/population-

statistics/allele-frequencies/

Caso X

De 12 Marcadores Moleculares (5 no coinciden)

(1) D16S539

Padre PAB HOR C+

12

11 11

12

12 11 13 9 13 11

(2) D7S820

PAB HOR C+

12

11

9

11

12 11 9* 11 9

* Alelos homocigotos

Padre

(3) D13S317

PAB HOR C+

12

9

8

12 9 11 9 13 9

Padre

(4) F13A01

PAB HOR C+

5 5

4

5* 4 3.2 5 4

* Alelos homocigotos

Padre

(5) FESFPS

PAB HOR C+

12

11

10

12

12 11 12 11 13 12

Padre

(6) vWA

PAB HOR C+

15

14

16

15 14 18 14 16 14

Padre

(7) CSF1PO

PAB HOR C+

12

11

9

10

12 11 13 12 13 12

Padre

(8) TPOX

PAB HOR C+

10

8

9

8

10 8 13 8 13 8

Padre

(9) TH01

PAB HOR C+

9.3

7

9.3

9.3 7 9 8 8 7

Padre

(10) LPL

PAB HOR C+

12

1010

12

12 10 10 9 12 9

Padre

(11) F13B

PAB HOR C+

9

8

10

9 8 9 6 10 9

Padre

(12) Penta E

14

12

5

PAB HOR C+

12* 16 14 14 12

* Alelos homocigotos

Padre

InformeAUTO CARATULADO: JUAN PABLO MORÁN AMARILLA

PRUEBA DE PCR FENOTIPOS OBSERVADOS CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE PATERNIDAD

Marcadores de STR Alegado Padre Menor Madre X Y Indice de paternidad X/Y

D16S539 12 11 13 9 13 11 0 0 EXCLUYE

D7S820 12 11 9* 11 9 0 0 EXCLUYE

D13S317 12 9 11 9 13 9 0 0 EXCLUYE

F13A01 5* 4 3.2 5 4 0 0 EXCLUYE

FESFPS 12 11 12 11 13 12 0,5 0 EXCLUYE

vWA 15 14 18 14 16 14 0 0 EXCLUYE

CSF1PO 12 11 13 12 13 12 0,25 0 EXCLUYE

TPOX 10 8 13 8 13 8 0,25 0 EXCLUYE

TH01 9.3 7 9 8 8 7 0 0 EXCLUYE

LPL 12 10 10 9 12 9 0,25 0 EXCLUYE

F13B 9 8 9 6 10 9 0 0 EXCLUYE

Penta E 12* 16 14 14 12 0 0 EXCLUYE

ÍNDICE DE PATERNIDAD TOTAL (IP TOTAL) = EXCLUYE

PROBABILIDAD DE PATERNIDAD = EXCLUYE

* Alelos homocigotos

Cromosoma XAUTO CARATULADO: EJEMPLO

PRUEBA DE PCR HAPLOTIPOS OBSERVADOS CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE HERMANDAD

Marcadores X-STR A. Hermana Hermana X Y Indice de hermandad X/Y

DXS8378 11 10 11

0,25 0,00945 26,45503DXS10135 27 21 23 21

DXS10148 27.1 26.1 27.1 25.1

DXS7132 16 14 14 12

0,25 0,00663 37,70739DXS10074 17 8 17 16

DXS10079 19 18 19 18

HPRTB 14 11 13 11

0,25 0,01061 23,56268DXS10101 30.2 29.2 30.2 28.2

DXS10103 19 17 19 16

DXS7423 16 15 15 14

0,25 0,00386 64,76684DXS10134 39 36 39 38

DXS10146 29 27 27 25

ÍNDICE DE HERMANDAD TOTAL (IH TOTAL) = 1522341

PROBABILIDAD DE HERMANDAD = 99,99993%

*Frecuencias de Haplotipos : http://www.chrx-str.org

Cromosoma Y

*Frecuencias de Haplotipos : http://www.yhrd.org

AUTO CARATULADO: EJEMPLO

PRUEBA DE PCR HAPLOTIPO OBSERVADO CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE HERMANDAD

Marcadores Y-STR A. Hermano Hermano X Y Indice de hermandad X/Y

DYS389II 30 30

1 0,00003602 27762

DYS439 12 12

DYS389I 13 13

DYS385a/b 10 14 10 14

DYS19 14 14

DYS437 15 15

DYS392 13 13

DYS390 24 24

DYS438 12 12

DYS393 13 13

DYS391 11 11

ÍNDICE DE HERMANDAD (IH) TOTAL = 27762

PROBABILIDAD DE HERMANDAD = 99,99640%

Aplicación Forense

Aplicación Forense

Cementerio

InformeAUTO CARATULADO: EJEMPLO

PRUEBA DE PCR FENOTIPOS OBSERVADOS CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE PATERNIDAD

Marcadores de STR Muestra Ósea Hija Madre X Y Indice de paternidad X/Y

D16S539 13 11 12 11 11 9 0 0 EXCLUYE

D7S820 12 10 11 11 0 0 EXCLUYE

D13S317 12 10 13 9 13 9 0 0 EXCLUYE

F13A01 3.2 5 3.2 5 3.2 0,5 0,225 2,22222

FESFPS 12 11 12 11 12 11 0,5 0,154 3,24675

vWA 17 18 18 17 0 0 EXCLUYE

CSF1PO 13 11 12 10 10 0 0 EXCLUYE

TPOX 12 8 11 11 8 0 0 EXCLUYE

TH01 8 7 9 8 9 0,5 0,107 4,67290

PENTA E 7 5 11 5 20 5 0 0 EXCLUYE

PENTA D 14 10 12 12 11 0 0 EXCLUYE

D8S1179 12 12 10 14 10 0,5 0,126 3,96825

D3S1358 18 16 17 14 17 16 0 0 EXCLUYE

D5S818 12 11 12 11 12 11 0,5 0,157 3,18471

F13B 8 6 10 8 10 9 0,25 0,129 1,93798

LPL 12 10 11 10 11 10 0,25 0,502 0,49801

HPRTB 11 14 13 13 0 0 EXCLUYE

ÍNDICE DE PATERNIDAD TOTAL (IP TOTAL) = EXCLUYE

PROBABILIDAD DE PATERNIDAD = EXCLUYE

Mancha de SangreAUTO CARATULADO: MUESTRAS M4/M5*

PRUEBA DE PCR FENOTIPOS OBSERVADOS CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE MATERNIDAD

Marcadores de STR Madre del fallecido Muestras M4/M5 X Y Indice de Maternidad X/Y

D16S539 13 11 11 9 0,25 0,202 1,23762

D7S820 11 9 12 10 0 0 EXCLUYE

D13S317 11 13 12 0 0 EXCLUYE

F13A01 7 6 7 3.2 0,25 0,227 1,10132

FESFPS 11 11 10 0,5 0,452 1,10619

vWA 18 17 17 16 0,25 0,267 0,93633

CSF1PO 13 12 14 11 0 0 EXCLUYE

TPOX 8 11 8 0,5 0,562 0,88968

TH01 7 6 8 6 0,25 0,290 0,86207

PENTA D 9 13 9 0,5 0,186 2,68817

ÍNDICE DE MATERNIDAD TOTAL (IP TOTAL) = EXCLUYE

PROBABILIDAD DE MATERNIDAD = EXCLUYE

*Obs: Las muestras M4 y M5 fueron procesadas individualmente. Ambas presentan el mismo perfil genético.

Monozygotic (MZ) twins are considered being genetically identical, therefore theycannot be differentiated using standard forensic DNA testing.

Here we describe how identification of extremely rare mutations by ultra-deep nextgeneration sequencing can solve such cases.

We sequenced DNA from sperm samples of two twins and from a blood sample of the child of one twin.

Bioinformatics analysis revealed five single nucleotide polymorphisms (SNPs) present in the twin father and the child, but not in the twin uncle.

The SNPs were confirmed by classical Sanger sequencing.

Our results give experimental evidence for the hypothesis that rare mutations willoccur early after the human blastocyst has split into two, the origin of twins, and thatsuch mutations will be carried on into somatic tissue and the germline.

The method provides a solution to solve paternity and forensic cases involvingmonozygotic twins as alleged fathers or originators of DNA traces.

Finding the needle in the haystack: Differentiating “identical” twins in

paternity testing and forensics by ultra-deep next generation

sequencing

Forensic Science International: Genetics

Volume 9, Pages 42–46, March 2014

J. Weber-Lehmann, E. Schilling, G. Gradl, D.C. Richter, J.

Wiehler, B. Rolf

Resultados

Chromosome 04

snp188267982

Chromosome 06

snp41885722

Chromosome 11

snp68781324

Chromosome 14

snp103545720

Chromosome 15

cnp57884799

Mother buccal

mucosaC/C A/A C/C G/G C/C

Child blood C/T (50/50) G/A (50/50) C/T (50/50) A/G (50/50) C/T (50/50)

Twin uncle sperm C/C A/A C/C G/G C/C

Twin uncle buccal

mucosaC/C A/A C/C G/G C/C

Twin uncle blood C/C A/A C/C G/G C/C

Twin father sperm C/T (80/20) G/A (70/30) C/T (80/20) A/G (50/50) C/T (50/50)

Twin father buccal

mucosaC/T (80/20) G/A (75/25) C/C A/G (60/40) C/T (50/50)

Twin father blood C/C A/A C/C G/G C/T (80/20)

Genotypes of the identified SNPs in mother, child and twins. The SNP number refers to an

alignment to the human genome sequence build GRCh37.p10. The figures given in brackets next to

the genotypes are the mixture ratios in % and were estimated from the Sanger sequencing results.

Resultados

NGS results of the SNP on chromosome 4. Results for child, twin uncle and

twin father are visualized with the IGV Viewer. The SNP is in the middle of the

panel (color code: C blue, T red, A green, G brown) and is highlighted with a

red arrow.

Resultados

Sequence of the SNP on chromosome 04. The SNP has position

snp188,267,982. The affected position is highlighted with a red arrow.

LABORATORIO CURIE

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Estudio de material genético ADN/ARN

Muchas gracias por la atención

Dr. Hugo Torio: hftorio@yahoo.com