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Propiedades Químicas de Aminoácidos y Proteínas Wilson Cardona G., Roberto Amarís A., y Diego Espinal Z. Sesión 23 PROPIEDADES QUÍMICAS DE AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS Objetivos 1. Reconocer los aminoácidos y las proteínas utilizando los reactivos de ninhidrina y de Biuret, respectivamente. 2. Realizar con la solución de albúmina los siguientes ensayos: a. Prueba de coagulación utilizando varios agentes. b. Pruebas de precipitación con cationes. 3. Determinar el punto isoeléctrico de la caseína. 4. Identificar la presencia de núcleos aromáticos en las proteínas (reacción xantoprotéica). 5. Identificar la presencia de triptófano, tirosina y aminoácidos azufrados en las proteínas. Aspectos teóricos Las proteínas son el primer grupo de compuestos orgánicos de importancia biológica. Forman las dos terceras partes del peso seco de las células y son imprescindibles en todos los procesos que se tienen en los seres vivos. Algunas transportan pequeñas moléculas e iones al interior de las células. Otras, como los anticuerpos, reconocen y neutralizan sustancias extrañas al organismo, como los virus y las bacterias. Otras intervienen en la generación y transmisión de los impulsos nerviosos. La función primaria de las proteínas es formar, unir y proteger la estructura de los organismos vivos, en contraste con los carbohidratos, que se utilizan primordialmente como fuente de energía y con los lípidos, que son los constituyentes de las membranas celulares y que también se utilizan como fuente de energía. La hidrólisis ácida, básica o enzimática de las proteínas de todos los seres vivos producen veinte -L-aminoácidos, los cuales se muestran en la siguiente tabla: Aminoácidos contenidos en los seres vivos Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Serina Treonina Fenilalanina Tirosina Triptófano Cisteina Metionina Ácido aspártico Ácido glutámico Asparagina Glutamina Lisina Arginina Histidina prolina 1. -L-aminoácidos: Son una clase de compuestos orgánicos que contienen simultáneamente un grupo amino, -NH 2 (unido al carbono alfa) y un grupo carboxílico, -COOH. La naturaleza del grupo R, depende de la estructura de cada -L-aminoácido. Como los aminoácidos contienen un grupo ácido y un grupo básico, presentan una reacción ácido- base y se encuentran principalmente en la forma de un ion bipolar o zwitterión: Manual de Prácticas de Química Orgánica 102

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Propiedades Químicas de Aminoácidos y Proteínas Wilson Cardona G., Roberto Amarís A., y Diego Espinal Z.

Sesión 23

PROPIEDADES QUÍMICAS DE AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS

Objetivos

1. Reconocer los aminoácidos y las proteínas utilizando los reactivos de ninhidrina y de Biuret, respectivamente.

2. Realizar con la solución de albúmina los siguientes ensayos:a. Prueba de coagulación utilizando varios agentes.b. Pruebas de precipitación con cationes.

3. Determinar el punto isoeléctrico de la caseína.4. Identificar la presencia de núcleos aromáticos en las proteínas (reacción xantoprotéica).5. Identificar la presencia de triptófano, tirosina y aminoácidos azufrados en las proteínas.

Aspectos teóricos

Las proteínas son el primer grupo de compuestos orgánicos de importancia biológica. Forman las dos terceras partes del peso seco de las células y son imprescindibles en todos los procesos que se tienen en los seres vivos. Algunas transportan pequeñas moléculas e iones al interior de las células. Otras, como los anticuerpos, reconocen y neutralizan sustancias extrañas al organismo, como los virus y las bacterias. Otras intervienen en la generación y transmisión de los impulsos nerviosos.

La función primaria de las proteínas es formar, unir y proteger la estructura de los organismos vivos, en contraste con los carbohidratos, que se utilizan primordialmente como fuente de energía y con los lípidos, que son los constituyentes de las membranas celulares y que también se utilizan como fuente de energía. La hidrólisis ácida, básica o enzimática de las proteínas de todos los seres vivos producen veinte -L-aminoácidos, los cuales se muestran en la siguiente tabla:

Aminoácidos contenidos en los seres vivos Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Serina Treonina Fenilalanina Tirosina Triptófano

Cisteina Metionina Ácido aspártico Ácido glutámico Asparagina Glutamina Lisina Arginina Histidina prolina

1. -L-aminoácidos: Son una clase de compuestos orgánicos que contienen simultáneamente un grupo amino, -NH2 (unido al carbono alfa) y un grupo carboxílico, -COOH. La naturaleza del grupo R, depende de la estructura de cada -L-aminoácido. Como los aminoácidos contienen un grupo ácido y un grupo básico, presentan una reacción ácido- base y se encuentran principalmente en la forma de un ion bipolar o zwitterión:

Los -L-aminoácidos se unen entre sí, mediante enlaces amídicos o péptídicos, para producir los péptidos, y estos, a su vez, se unen para formar los polipéptidos ó proteínas.

2.Proteínas: Son polímeros naturales (polipéptidos) de alto peso molecular conformados por -L-aminoácidos:

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La mayoría de las proteínas tienen tres niveles de organización denominados: estructuras primarias, secundarias y terciarias. Unas pocas presentan un cuarto nivel denominado estructura cuaternaria.

3. Reacciones características de aminoácidos y proteínas.

a. Reacción de Ninhidrina: La ninhidrina, (hidrato de tricetohidrindeno) un agente oxidante, reacciona con los α-aminoácidos a un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color azul-púrpura. Esta reacción se efectúa también con aminas primarias y amoníaco pero sin desprendimiento de CO2.Los aminoácidos: prolina e hidroxiprolina, también reaccionan con la ninhidrina, pero en este caso se obtiene un color amarillo. El complejo coloreado sirve como base para la detección y la medición cuantitativa de α-L-aminoácidos.

b. Reacción Xantoprotéica: El ácido nítrico concentrado reacciona con algunas proteínas que contengan en su estructura aminoácidos con anillos aromáticos (por ejemplo, la queratina de la piel), dando un color amarillo que se oscurece hasta anaranjado cuando se añade un álcali. Esta reacción es positiva para las proteínas que contienen fenilalanina, tirosina o triptófano.

c. Reacción de Hopkins-Cole: el reactivo de Hopkins-Cole está formado por una mezcla de ácido sulfúrico concentrado con ácido glioxílico; este, reacciona con proteínas que contengan triptófano dando un complejo color violeta.

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d. Reacción de aminoácidos azufrados: Los aminoácidos que contengan azufre, como es el caso de la cisteina y la metionina, reaccionan con acetato de plomo en medio básico formando un precipitado negruzco de sulfuro de plomo.

e. Reacción de Ehrlich: La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los aminoácidos se puede identificar mediante su reacción con ácido sulfanílico y nitrito de sodio por formación de colorantes azoicos fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia de tirosina e histidina libres o formando péptidos y proteínas.

f. Prueba de Biuret: Las sustancias que contengan dentro de la molécula varios grupos amida muy cercanos dan una coloración, usualmente violeta-púrpura, cuando se les adiciona una pequeña cantidad de sulfato de cobre (II) en medio alcalino. La coloración se debe a la formación de un complejo de coordinación entre el Cu2+ y los grupos amida de las uniones peptídicas.

Las proteínas, proteosas y peptonas, dan positiva esta prueba. A medida que progresa la hidrólisis de una proteína, el color producido en la prueba de Biuret se decolora gradualmente a rosa y después desaparece ya que los péptidos más pequeños y los aminoácidos no dan la coloración.

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g. Punto Isoeléctrico: Las proteínas y los aminoácidos son compuestos anfóteros, pueden reaccionar en medio ácido o básico así:

La presencia de las cargas negativas o positivas netas anteriores causan la migración de las proteínas en un campo eléctrico. Existe un pH en cual la carga neta es igual a cero y la proteína no se desplaza en el campo eléctrico, ese valor de pH se conoce como punto isoeléctrico (P.I).

La mayoría de las proteínas muestran una solubilidad mínima en su punto isoeléctrico; la caseína por ejemplo, es la principal proteína encontrada en la leche y se puede separar ajustando el pH en el P.I de la caseína.

h. Precipitación: En la purificación de proteínas es a menudo de interés separarlas de otras moléculas de la solución por procesos de precipitación catiónica y aniónica. En la precipitación la actividad biológica de las proteínas se preserva, y esto se tiene muy en cuenta en proteínas como enzimas u hormonas proteícas, ya que las condiciones biológicas pueden ser cuidadosamente controladas.

A un pH de 7 y por encima de él, las proteínas están normalmente cargadas negativamente, así que la adición de cationes metálicos neutralizan la carga y la proteína se precipita. La precipitación por iones de metales pesados, como son: Hg2+, Pb2+ ó Ag+, es, por lo tanto, más efectiva a valores de pH neutros o ligeramente alcalinos, pero la solución no puede ser muy alcalina, porque se corre el riesgo de que se precipiten hidróxidos de los metales.

El precipitado es frecuentemente soluble en un exceso de iones de metal pesado, ya que tal exceso confiere a las partículas cargas positivas estables.

i. Desnaturalización de las proteínas: Este es un proceso por el cual el ordenamiento espacial de ella cambia, de la estructura ordenada de la molécula nativa a una configuración tridimensional más desordenada.

Durante la desnaturalización se rompen los enlaces de hidrógeno y los hidrofóbicos, hay un incremento en la entropía o grado de desorden de la molécula con pérdida de la actividad biológica. Además, la proteína se vuelve menos soluble.

La desnaturalización puede ocurrir debido a un gran número de factores, algunos de los cuales se dan a continuación:

a. Físicos: Calor, presión, rayos X y ultravioletab. Químicos: Extremos de pH y solventes orgánicosc. Biológicas: Enzimas proteícas

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Materiales:

Beaker Probeta Leche Tubos de ensayo

Pinzas para tubo de ensayo Baño maría Papel indicador universal

Sustancias:

Acido Acético 10 % Acido clorhídrico concentrado Acido nítrico concentrado Acido sulfúrico concentrado Acido glioxílico Hidróxido de sodio al 50 % Nitrato de plata al 2 % Acido sulfanilico 0.5% Nitrito de sodio 20% Reactivo de Hopking Cole (solución al

25% de acido glioxilico en acido acético)

NH4OH 0.2M Tirosina al 1% Sulfato de cobre al 2 % Etanol Albumina y Solución de albúmina

(albumina diluida 10 veces) Glicina al 2 % Reactivo de ninhidrina Reactivo de Biuret Acetato de plomo al 2%

Sección experimental

1. Prueba de Ninhidrina: En tres tubos de ensayo coloque 10 gotas de las siguientes soluciones acuosas:

Tubo 1: Glicina Tubo 2: LecheTubo 3: Albúmina diluida

A cada tubo adicione 3 gotas del reactivo de ninhidrina y caliente al baño maría. Observe y anote los resultados. Residuos orgánicos no halogenados.

2. Reacción Xantoprotéica: En tres tubos de ensayo coloque 10 gotas de las siguientes soluciones acuosas:

Tubo 1: Glicina Tubo 2: LecheTubo 3: Albúmina diluida

A cada tubo adicione 5 gotas de ácido nítrico (HNO3) concentrado y caliente al baño maría hasta cambio de coloración. Alcalinice la mezcla adicionando gota a gota hidróxido de sodio al 25 %. Observe y anote los resultados. Residuos orgánicos no halogenados.

3. Prueba de Hopkins-Cole: En tres tubos de ensayo coloque 10 gotas de las siguientes soluciones acuosas:

Tubo 1: Glicina

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Tubo 2: LecheTubo 3: Albúmina diluida

A cada tubo adicione 10 gotas del reactivo de Hopkins Cole. Mezcle bien y adicione a cada tubo por las paredes lenta y cuidadosamente, sin agitación, 5 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La formación de un anillo violeta en la interfase es prueba positiva para triptófano. Residuos orgánicos no halogenados.

4. Reacción de los aminoácidos azufrados: En tres tubos de ensayo coloque 10 gotas de las siguientes soluciones acuosas:

Tubo 1: Glicina Tubo 2: LecheTubo 3: Albúmina

A cada tubo adicione 3 gotas de hidróxido de sodio al 25 % y 5 gotas de acetato de plomo al 2 %. Caliente la mezcla de reacción al baño maría por 10 minutos. Observe y anote los resultados. Residuos orgánicos con metales.

5. Reacción de Erlrich. Adicione a cada tubo en el siguiente orden: 10 gotas de acido sulfanilico y 10 gotas de nitrito de sodio, mezcle bien y deje reposar 5 minutos. Luego a cada tubo agregue 10 gotas de:

Tubo 1: Tirosina Tubo 2: LecheTubo 3: Albúmina (concentrada)

Agite y agregue a cada tubo 5 gotas de NH4OH. Observe y anote los resultados.

6. Prueba de Biuret: En tres tubos de ensayo coloque 10 gotas de las siguientes soluciones acuosas:

Tubo 1: Glicina Tubo 2: LecheTubo 3: Albúmina

A cada tubo adicione 5 gotas de hidróxido de sodio al 25 % y 5 gotas del reactivo biuret. Observe y anote los resultados. Residuos orgánicos con metales.

7. Punto Isoeléctrico: Coloque en un beaker pequeño 20 mL de leche y adiciónele 20 mL de agua. Caliente la mezcla hasta unos 50 ºC, enfríe y adicione gota a gota ácido acético al 10 %, agitando después de cada adición. Observe la separación de la cuajada constituida fundamentalmente por caseína. Con un papel indicador determine el valor aproximado del punto isoeléctrico de la caseína. Compare el valor obtenido del PI con el reportado. Residuos no halogenados.

8. Precipitación: En dos tubos de ensayo, coloque en cada uno, respectivamente, 10 gotas de las siguientes soluciones:

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Tubo 1: Leche Tubo 2: Albúmina

A cada tubo adicione 5 gotas de nitrato de plata (AgNO3) al 2 %. Observe y anote los resultados.

Repita el proceso anterior con sulfato de cobre (CuSO4) al 2%. Compare los resultados obtenidos. Residuos orgánicos con metales.

9. Desnaturalización de proteínas: En cuatro tubos de ensayo coloque 10 gotas de la solución acuosa de albúmina y proceda de la siguiente manera: el tubo 1 caliéntelo gradualmente en baño maría y observe la temperatura de coagulación; a los otros tres tubos adicione, respectivamente:

Tubo 2: 20 gotas de etanol. Residuos orgánicos no halogenados.

Tubo 3: 5 gotas de ácido clorhídrico (HCl) concentrado. Residuos orgánicos halogenados.

Tubo 4: 5 gotas de hidróxido de sodio (NaOH) 50 %. Residuos orgánicos no halogenados.

Agite y observe si se produce coagulación.

Preguntas

1. Dibuje la estructura de la valina en una solución con pH ácido y un pH básico.2. ¿Por qué se utiliza frecuentemente la clara de huevo como antídoto para el envenenamiento con

plomo y mercurio? 3. ¿La presencia de albúmina en la orina indica que el paciente tiene nefritis. Sugiera un método para

detectar albúmina en la orina?4. ¿Cuál es la evidencia experimental que pone de manifiesto que la estructura tridimensional de las

proteínas determina su actividad biológica?5. ¿Qué y cuáles son los aminoácidos esenciales?

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