AO DE LA PROMOCIN DE LA INDUSTRIA RESPONSABLE Y DEL COMPROMISO
CLIMTICO
FACULTAD DE AGRONOMIA
CURSO
: BiotecnologaDOCENTE:Ing. Cesar Puicon Aazco.
TEMA
: Cultivo de tejidos en camote.ALUMNA:Holgun Quispe Adriano
EmilioPiura -2014
CULTIVO DE TEJIDOS EN CAMOTE Ipomoea batata1 Ventajas de la
tcnica de cultivo de tejidos
2 Introduccin de material in vivo a in vitro
3 Aisla~ento de meristemas
4 Hicropropagacin
5 Conservacin a largo plazo
6 Hedios de cultivo
7 Ref~renciasEl cultivo de tejidos permite la propagacin clonal
rpida de un gran nmero de plntulas en un perodo breve y la
conservacin de germoplasma, bajo condiciones controladas, en
espacios pequeos y con poca mano de obra.En este documento se
describen las ventajas, las metodologias y los materiales ~sados en
cultivo de tejidos que se emplean en el Centro Internacional de la
Papa (CIP) y se analizan las tcnicas de aislamiento de meristemas,
la micropropagacin y el almacenamiento a largo plazo.
La batata (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Est considerada en el
stimo puesto en las estadsticas de FAO (1978) como cultivo
alimenticio en el mundo.
1 VENTAJAS DE LA TECNICA DE CULTIVO DE TEJIDOSEl ClP mantiene
una coleccin de entradas. Su mantenimiento clonal existe un riesgo
de prdida por climticas dusfavorables. Por eso,siguientes
ventajas:
germoplasma de batat~ de ms de 5000 en el campo es muy costoso y
adems enfermedades infecciosas o condiciones su mantenimiento in
vitro ofrece las Menores costos de mano de obra ausencia de
infecciones de campo Proteccin contra condiciones ambientales
desfavorables Acceso oportuno al material en conservacin Acceso
oportuno al material para eliminacin de patgenos
Disponibilidad permanente de material para propagacin
Exportacin (cuando est libre de patgenos).
En el ClP hasta la fecha, se mantienen in vitro 2 800 entradas
de la coleccin de germoplasma de batata.En el presente texto, al
nominar a l. batatas, se utilizar el trmino de batata.
2 INTRODUCClON DE MATERIAL IN VITROLa planta madre in vivo debe
ser proveniente de invernadero, tener entre uno a dos meses de
edad, poseer ptimas condiciones de sanidad, y no tener yemas
laterales muy brotadas (en todo caso no deben ser includas). En la
planta madre se cortan los tallos y se eliminan las hojas dejando
un pedazo de pecolo cubriendo las yemas; los tallos se cortan en
segmentos, de 2 a 3 cm de longitud, cada uno con una yema axilar y
una porcin de entrenudo detrs de la yema, para manipularla
fcilmente. Antes de enviarlos al Laboratorio o in vitro, estos
segmentos de tallo son tratados con un acaricida de amplio espectro
(que destruya los diferentes estadios desarrollo de los caros) como
Morestan-Baye~ (Chinometonat) al 0,5 %,durante 10 minutos. Lvego,
se elimina el acaricida lavando los segmentos de tallo con agua
corriente y depositndolos en un envase limpio que se tapa con un
plato de petri hasta que se empiece el proceso de desInfeccin
superficial.Para la desinfeccin superficial de los segmentos de
tallo se elimina el agua corriente del vaso, se agrega alcohol de
96% y se les deja en l por dos segundos; se elimina el alcohol y se
agrega inmediatamente una solucin de hipoclorito de calcio de 2,5 %
(llevado a pH 8 con Hel). Tambin se puede utilizar hipoclorito de
sodio o leja. De ser posible, agregar unasgotas ce un agente
dispersante-adherente como Twepn 20 80 (4 gotas/L desolucion). Se
lleva el vaso adonde despus de 15 minutos,
la cmara de transferencia de flujo laminar, bajocondiciones
aspticas, se elimina elhipoclorito y se lava tres
veces con agua estril; despus del ltim0lavado, para aminorar la
fenolizacin de los explantes, se dejan stos sumergidos en solucin
estril de cido ascrbico 100 ppm hasta el momento de la escisin.En
estas condiciones se procede a realizar la escisin de yemas
eliminando el mayor nmero de hojuelas y primordios foliares, de tal
manera que las porciones escindidas sean lo ms pequeas posibles.Se
considera 0,6 mm un tamao ptimo, pero el tamao del explante puede
ser mayor si no se cuenta con facilidades para la exisin (por
ejemplo: microscopio estereoscpico).
Las yemas son sembradas en el medio d~ cultivo HHB-I y se
mantienen en ella por un perodo de 15 das. Luego, se transfieren al
medio HHB-II, donde se desarrollan como plntulas en un perodo que
vara entre 30 y 60 das. Al
cabo de este tiempo, se puede propagar por nudos individuales en
el medioHPB.Para la primera etapa de proparacin se utilizan tubos
de 16 x 125 mm ypara la segunda, tubos de 18 x 150 25 x 150
mm.Debido a que en estos casos se usan porciones meristemticas
mayores de 0,6 mm, es probable que en algn material se presente
contaminacin con bacterias saprfitas principalmente. Dado el caso
se puede proceder de dos maneras:1 Si se tiene un
microscopiomeristema3 entre 0,4 mm a 0,6
estereoscpico, proceder a escindirmm y a sembrarlos en el medio
deintroduccin (HHB-I), haciendoHHB-II.
transferencias semanales al medio2Se puede tratar de erradicar
las bacterias o levaduras mediante el uso de antibiticos que se
pueden incorporar al medio. En caso de bacterias se recomienda usar
Rifampicina (Rimactn 300 CIBA) a una concentracin de 40 ppm.La
Rifampicina en solucin concentr.ada(12 COO ppm) y esterilizadapor
filtracin, se coloca en pequeos cuadrados de papel filtro estril (5
x 5 mm), los cuales St dejan secar en la cmara de flujo laminar; se
colocan aproximadamenate 0,03cm3 de solucin concentrada por cada
cuadrado de papel.Se recomienda no utilizarlos despus de siete das
de haberlos preparado, ya que pierden progresivamene su
eficacia.
Este trabajo debe realizarse bajo condiciones de asepsia. Los
cuadrados de papel son introducidos en el medio de cultivo junto a
la yema sembrada, y sta debe ser transferida a medio fresco con
otro papel-antibitico cada 3 a 5 das. Tambin se pueden usar otros
antibiticos como Cefoxitina (Mefoxin t1erck) en dosis de 500
ppm.
En el caso de que la contaminacin :~ea por levaduras, se
recomienda usar Amphotericin B en dosis de 0.25 ppm a 0,5 ppmr
siguiendo en todos los casos el mismo sistema del papel de filtro.3
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MERISTEMASEl meristema es un tejido
compuesto por clulas en divisin y constituye el punto activo de
crecimiento de las yemas. El domo de la yema contiene las clulas
meristemticas y est rodeada por primordios foliares y hojas
primarias. Las clulas del meristema se dividen y forman los nuevos
tejidos. La nutricin de la seccin disectada es proporcionada por el
medio artificial.El aislamiento de la zona meristemtica en
condiciones aspticas y su cultivo en un medio nutritivo adecuado
permte el desarrollo de plntulas, siguiendo un patrn de
diferenciacin al del que presenta una planta normal.la diseccina
del meristem es un proceso delicado que exige prctica y se realiza
principalmente con el objeto de erra3iccr virus. Lasecuenciade la
diseccinse muestrafotogrficamente es
llevada acabo como sigue:
Se cortan los tallos de la planta en segmentos conteniendo cada
uno uronudo con su yema axilar, este material se desinfecta con
Merestan (Bayer) e hipoclorito de sodio, de igual forma como se
realiza para la introduccin de material "in vitro.Despus de
enjuagar el material con agua destilada,bajo un microscopio de
diseccin 'J con la ayuda de una aguja estilete I se eliminan las
hojas que rodean el punto de crecimientohasta quede slamente la
cpula de la yema y dos o tres foliares.La cpula con los primordios
foliares son disectados con un bistur 1 transferidos al medio de
cultivo HMB-I. El meristema disectado estransferido semanalmente a
medio fresco HHB-II, en este medio al cabo de 6semanas el meristema
se subcultivadas en el ~edio cultivo).
diferencia en plntula. Estas plntulas son de propagacin (ver
seccin 6: Medios deTermoter4pia: En el CIP, previamente plantas se
someten durante un mes ahoras y 320C por ocho horas bajo luz
ala escisin de meristemas, las termoterapia de 3aoC por
dieciseisconstante. Este tratamiento a altatemperatura ha aumentado
la eficiencia en el proceso de produccin de material libre de
virus.Despus de la termoterapia, para la escisin de meristemas, se
puede utilizar indistintamente yemas axilares o apicales.4
MICROPROPAGACION
El objetivo de la micropropagacin es obtener un gran nmero de
plantas clonales en un perodo corto. En el CIP se siguen los
siguientes mtodos:Propagacin por nudos. Se basa en que el nudo de
una plntula in vitro colocado en un medio de cultivo apropiado
induce el desarrollo de la yema aY-ilardel nudo obtenindose como
resultado una nueva plntula in vitro. Es importante notar que este
tipo de propagacin se basa en el desarrollo de la yema axilar que
es una estructura morfolgica ya existente. La condicin
nutricional-hormonal del medio simplemente juega un papel en la
ruptura del reposo de la yema axilar y promueve su rpido
desarrollo. Seusa el medio de propagacin descrito e: la seccin 6.Es
importante tener mucho cuidado de no regeneracin de plntulas,
porque estogentica del genotipo.
permitir la formacin de callos y tiende a afectar la
3tabilidadLas plntulas se desarrollan bajo condiciones de das
largos (16 horas ie luz a 45 uE/m2/seg2 3000 lux) y con
temperaturas de 25 Oc a 28 oC. Bajo estas condiciones los niveles
de micLopropagacin son rpidos y cada nudose desarrollar como una
plntula que logra alcanzar todo el largo del tubo de prueba y est
lista para el subcultivo despus de seis semanas. Las plntulas in
vitro de batata producidas transferidasa condiciones in vivo,
ya
directamente a camas en el campo. (Figura 4)
en e3ta forma son fcilmente sea a pequeas macetas o
Propagacin por segmentos de tallo en medio lquido. De igual
manera que con la papa, es posible micropropagar batata en envases
o frascos por medio de cultivi lquido (Figura 5). Para ello, se
preparan segmentos de tallo que tengan 5 a 8 nudos y se remueven
tanto el pice como las races de la plntula por propagar. Estos
segmentos son sembrados en un medio lquido que contiene cido
gibberlico para romper el reposo de todas la yemasaxilares a lo
largo del segmento de tallo. Los nudos brotan y entre 3 a 4semanas
se desarrollan En nuevas plntulas que pueden ser usadas como
material inicial para la propagacin por nudos simples o,
nuevamente, por medio de segmentos de tallo en medio lquido,
dependiendo de las necesidades del programa. Someter los cultivos a
agitacin puede acelerar y favorecer el desarrollo de las nuevas
plntulas, aunque esto no es imprescindible.
5 CONSERVACION A LARGO PLAZOLa conservacin a largo plazo es
doblemente importante, para la propagacin y para la conservacin. En
un cultivo propagado clonalmente es importante que cada propgulo no
sufra alteraciones genticas, no importa que stas sean pequeas, ya
que se pueden acumular en el cultivo de una generacin a la otra y
pueden originar cambios mayores que afectaran la unifor~idad y la
produccin.
En el caso de conservacin de clones de germoplasma, es vital
hacer un anlisis detallado de la estabilidad gentica del cultivo.
El almacenamiento clonal de germoplasma incluye el mantenimiento de
combinaciones especficas de genes (genotipos). Si una plntula sale
de almacenamiento con una combinacin gent:ca diferente, la validez
del mtodo de almacenamiento debe ser cuestionada. La habilidad para
detectar cambios genticos durante la propagacin y el mantenimiento
dependen de los mtodos usados para ello.
En muchas colecciones de germoplasma se evalan los genotipos
almacenados rutinariamente en base a las caiactersticas morfolgicas
de las plntulas cuando stas crecen bajo condiciones controladas. Si
las plantas muestran caracteres morfolgicos diferentes, por
ejemplo, la forma de hoja, el color de las races reservantes, etc,
es evidente que algn cambio gentico ha ocurrido. Sin embargo, un
cambio en un gen, como por ejemplo, de resistencia a virus, no
podra ser detectado por observacin de
cambiosmorfolgicos.Nuevosmtodos, como el anlisis del polimo~fismo
por fragmentos de restriccin
(RFLP) estn siendo usados como vas ms sensitivas para
determinarcambios genticos. Es importante que los bancos de
germoplasmay programas de semillas usen los mtodos de mayor
sensibilidad paradeterminar la fidelidad gentica de sus sistemas de
propagacin yalmacenamiento.Hedios restrictivos del crecimiento. En
muchos aos de investigacin, se ha logrado el desarrollo de medios
de propagacjn para batata paraoptimizar el crecimiento rpido in
vitro.
Pero en el caso de laconservacin, el objetivo es manteniendo la
viabilidad de
limitar el los cultivos.
crecimiento a un mnimo, Poreste medio es posiblemaximizar el
tiempo entre transferencias (subcultivos) de las plntulas in vitro.
En el CIP, por ejemplo, las transferencias del material de batata
en conservacin se realizan una vez cada ao para la mayora de clones
y en algunos casos solo una vez cada ao y medio.
Los experimentos que se realizan en laboratorio, tendientes a
limitar el crecimiento in vitro de la batata, se basan en el uso de
retardantes hormonales del crecimiento, por ejemplo, el ABA (cido
abscisico), inhibidores del crecimiento como el B995, el cce
(cloruro de clorocolir.a),o regul~dores osmticos, con la adicin de
az6cares poco asimilables, tales como el manitol o el sorbitol.
La dificultad en este tipo de estudios es que diferentes
genotipos van a reaccionar en forma distinta bajo estas
condiciones. Cuando una coleccin de germoplasma tiene que ser
mantenida in vitro, el objetivo de los estudios debe de ser el
desarrollo de un medio de conservacin suficientemente amplio para
aplicarlo a un gran n6mero de genotipos.
El medio de almacenamiento no debe permitir la induccin de
callos pues stos pueden producir alteraciones genticas.
Muchos medios de almacenamiento han sido reportados para batata.
En el CIPactualmente, se estA usando el medio descrito en el
Apndice 6.Restricin
de temperatura para almacenamiento. El grado de crecimiento de
plntulasin vitro pup.de ser restringido reduciendr. la temperatura
de incubacin.
Una temperatura adecuada para lograr un buen crecimiento in
vitro de la batata est entre 280C y 30oC si la temperatura es de
80C, el tiempo de supervivencia es menos de un mes. Para los
genotipos estudiados hasta la fecha la temperatura ptima sera de
lSoC, pero sto necesitaconfirmacin.Como en el caso de otros
cultivos mantenidos in vitro, por ejemplo yuca, papa, etc., es
posible aplicar tanto la temperatura ms baja como los retardantes
de crecimiento al mismo tiempo. El uso de estrs osmtico y baja
temperatura (lSoC) es por ahora la mejor y menos costosa ~orma de
mantener una cole~cin de germoplasma de batata.6 MEDIOS DE
CULTIVO
Los medios de cultivo utilizados para este trabajo estn basados
en las sales de Hurashige-Skoog (1962) y en las de Gambo~g 8-5
(1968).
Kedio para introduccin in vi tro (HMB-I).Pantotenato de
calcio2ppm
Acido gibberlico20ppm
Acido ascrbico100ppm
Nitrato de calcio100ppm
Putrescina Hel20ppm
L-Arginina100ppm
Agua de coco1%
Sacarosa5%
Agar 0,7X
Phytagel/Gelrite0,25%
Medio para transferencia de Meristemas o yelll
(HMB-II).Pantotenato de calcio2ppm
Acido gibberlico15ppm
Acido ascrbico100ppm
Nitrato decalcio100pprn
Putrescinaaci20ppm
L-Arginina100ppm
Sacarosa5%
Agar 0,7%
Phytagel/Gelrite0,25%
Pantotenatc de calcio2ppm
Acido gibberlico10ppm
L-Arginina100ppm
Acido ascrbico200ppm
Putresdna BCl20ppm
Sacarosa3%
Agar 0,8%
Phytagel/Gelrite0,3%
Hedio para conservacin (HeB).Glucosa2%
Sorbitol2%
PutrescinaBCl20ppm
Phytagel/Glrite0,4%
Para todos los medios de cultivo se usa el pH = 5,8Nota:Estos
medios de cultivo se han elaborado para lograr un desarrollo
uniforme para una coleccin de germoplasre con un gran nmero de
variedades.Si se trabaja con pocas variedades, es recomendable
utilizar medios de cultivo simples, como las sales de Hurashige y
Skoog ms cido gibberlico y sacarosa slamente.7 REFERENCIASAlconero,
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