3. การศึกษา Charge Variants 7.9.60dmsc2.dmsc.moph.go.th/net/BDMS/data/593171.pdf · 2017-12-15 · ปลายสายโปรตีน ... terminal ของ heavy

นพนธตนฉบบ วกรมวทยพ2560;59(3):171-180

171วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 59 ฉบบท 3 กรกฎาคม - กนยายน 2560

การศกษา Charge Variants ในยาชววตถ

เพอการรกษาชนดโมโนโคลนอลแอนตบอด

ดวย Capillary Isoelectric Focusing

วชชดา จรยะพนธ ฐตาภรณ ภตภนโยวฒน และสายวรฬ จดรกตตนนทสถาบนชววตถ กรมวทยาศาสตรการแพทย ถนนตวานนท นนทบร 11000

Accepted for publication, 24 July 2017

บทคดยอ โมเลกลของโมโนโคลนอลแอนตบอดในยาสำาเรจรปอาจมหลายแบบเนองจากประจทแตกตางกน (charge heterogeneity) หากมการเปลยนแปลงอาจสงผลตอความคงสภาพของยา การออกฤทธ และ/หรอกระตนภมคมกน ทกอใหเกดอนตราย ดงนนคณภาพของยาแตละรนตองม charge variants ทสมำาเสมอ จงไดทำาการศกษาชนดของ charge variants ของยาโมโนโคลนอลแอนตบอดชนดสำาเรจรป 14 ชอการคาทขนทะเบยนในประเทศไทยดวยเทคนค Capillary Isoelectric Focusing ผลการศกษาจากอเลกโทรฟโรแกรมพบวายาโมโนโคลนอลแอนตบอดทกชนดม isoforms ทง 3 แบบและตรงตาม isoforms ของสารมาตรฐาน คา pI ของ isoforms อยในชวง 6 - 10 โดย pI ของพคชนด basic และ acidic พค อยในชวง 9.48 – 6.70 และ 9.24 - 6.40 ตามลำาดบ นอกจากนพบวายาอางองมความคงตวดกวายาคลายคลง จากการเปรยบเทยบ isoforms เมอเกบทอณหภม 37°C นาน 5 วน สรปไดวาตวอยางยาโมโนโคลนอลแอนตบอดทสงตรวจ ประกอบการขนทะเบยนม charge variants ตรงตามสารมาตรฐานทจดแจง อยางไรกตามภาครฐควรพจารณาแนวทาง การตดตามการเฝาระวงดานคณภาพของยาโมโนโคลนอลแอนตบอดรนอนๆ รวมทงความคงสภาพของยาชววตถคลายคลง

172 วารสารกรมวทยาศาสตรการแพทยปท 59 ฉบบท 3 กรกฎาคม - กนยายน 2560

Charge Variants Analysis of Biotherapeutic Monoclonal Antibody Wichuda Jariyapan et al.

บทนำา

โมโนโคลนอลแอนตบอด (monoclonal antibody: mAb) ทผลตเปนยารกษาโรคดวยเทคโนโลยชวภาพ

เปนยา Biotherapeutic products (BTP) ในการผลตมโอกาสไดโมเลกลของยาทแตกตางกน ความแตกตางหนงท

จะพบไดคอโมเลกล mAb ในยาสำาเรจรปอาจมประจทแตกตางกน (charge variants)(1) ซงเปนผลจากการทำางานของ

เอนไซมหรอปฏกรยาอน (enzymatic และ nonenzymatic modifications) หลายปฏกรยา เชน glycosylation,

glycation, deamidation, oxidation, disulfide bond formation หรอการปรบแตงชนดของกรดอะมโนท

ปลายสายโปรตน (C-/N-terminal amino acids modification) และ peptide bond cleavage เปนตน

ซงเปนความแตกตางเลกนอย (microheterogeneity) โดยอาจเกดระหวางขบวนการผลตในเซลลหรอเกดในขบวนการ

ทอยนอกเซลลขนอยกบชนดของปฏกรยาเหลานน รวมถงเกดระหวางการทำาใหบรสทธและขณะเกบรกษาททำาใหเกด

การปรบแตงโมเลกลโปรตน(2)

variants บางชนดอาจไมกอใหเกดผลดานความปลอดภย บางชนดอาจกระทบตอประสทธภาพของยา

เมอนำาไปใชมากหรอนอยแลวแตชนดของโปรตนนน อยางไรกตาม charge variants ของยา mAb มความสำาคญ

ในแงทมผลตอความคงตวและการออกฤทธทางชวภาพ การเปลยนแปลงสดสวนของชนดประจบนโมเลกลเพยง

เลกนอยสะทอนถงโครงสรางทเปลยนแปลงและอาจสงผลตอความคงตวของยาหรอกระตนภมคมกนทเปนอนตราย(3,4)

ขณะเดยวกนยา mAb มกระบวนการผลตทซบซอน มโอกาสเบยงเบนจากมาตรฐานหากควบคมการผลตไมดกอาจ

ไดยาทมคณภาพไมตรงตามทออกแบบไว ปจจบนยา mAb ทใชในประเทศไทยเปนยานำาเขาทงหมดจากประเทศตางๆ

ทงจากโรงงานใหญทจำาหนายยาไปทวโลกและโรงงานขนาดเลกทผลตยาชววตถคลายคลง (biosimilars) ทจำาหนายยา

ในเขตอนนอกเหนอจากยโรปและเมรกา ดงนนในการควบคมคณภาพผลตภณฑนจงตองมการตรวจวเคราะหดาน

charge variants ของยา mAb รวมกบการวเคราะหหวขออนๆ หากมการเปลยนแปลงกระบวนการผลตหรอเกบรกษา

ยาเปนเวลานานอาจทำาใหเกดการเปลยนแปลงโมเลกล ซงอาจไมมผลตอการเปลยนแปลงประจ แตบางชนด เชน การตด

กรดอะมโนไลซนท C - terminal ของ heavy chain ออกอยางไมสมบรณจงทำาใหมการเปลยนแปลงประจ เกดการจบเปนวง

(cyclization) ของ glutamine ท N-terminal หรอมปฏกรยา oxidation เปลยน methionine เปน methionine

sulfoxide ทำาใหได basic variants สวน acidic variants เกดจากการเตมนำาตาลกรดไซอะลก (sialic acid)

ในสวน Fc และปฏกรยา deamidation เชน จากกรดอะมโนแอสพาราจนเปนกรดแอสปารตก เปนตน(5,6) ปจจบน

ผผลตและภาครฐใหความสำาคญกบความสมพนธของโครงสรางโมเลกลกบประสทธภาพการออกฤทธของ mAb

ซงการเปลยนแปลงประจอาจไมกระทบตอการออกฤทธของยา แตเนองจากปจจบนยงมขอมลดานนจำากด จงตอง

ตดตามตรวจสอบความสมำาเสมอของคณลกษณะทางประจ

เทคนคทมประสทธภาพในการตรวจวเคราะหดานประจ คอ อเลกโทรโฟรซสแบบแคปลลาร(7-9) (capillary

electrophoresis: CE) ชนด isoelectric focusing (cIEF) โดยพจารณาจากคา isoelectric point (pI) ซงแสดงเปน

isoforms มทงแบบ acidic variants และ basic variants นอกเหนอ จากโมเลกลหลก (main peak) ทมคาประจรวมเปน

ศนยในสนามไฟฟาและเปรยบเทยบ isoforms กบสารมาตรฐานรวมการวเคราะหคณลกษณะดานอนๆ วตถประสงคของ

งานวจยนเพอศกษาคณลกษณะ charge variants ของยา mAb ชนดตางๆ ทนำาเขามาจำาหนายในประเทศไทย

ดวยเทคนค cIEF เพอตรวจสอบยนยนคณลกษณะของยาวาเปนไปตามทจดแจงในการขนทะเบยนยา และเพอศกษา

เปรยบเทยบคณลกษณะดานประจของยา mAb ชนดคลายคลงกบยาอางอง เพอใหไดขอมลสำาหรบการเฝาระวง

หลงจำาหนายเพอใหประชาชนไดรบยาทดและปลอดภย


การศกษา Charge Variants ในยาชววตถเพอการรกษาชนดโมโนโคลนอลแอนตบอด วชชดา จรยะพนธ และคณะ

วสดและวธการ

สารเคม

สารเคมและสารละลายทใชเปนชนด analytical grade ทง Anolyte (200 mM Phosphoric

Acid), Catholyte (300 mM Sodium Hydroxide), Chemical Mobilizer (350 mM Acetic Acid),

Cathodic Stabilizer (500 mM Arginine), Anodic Stabilizer (200 mM Iminodiacetic Acid), Urea

Solution (4.3 M Urea), 3 M Urea-cIEF Gel, Pharmalyte 3 - 10 carrier ampholytes (GE

Healthcare # 17 - 0456 - 01)

เครองมอและอปกรณ

เครองอเลกโทรโฟรซสแบบแคปลลาร รน PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System

(Beckman Coulter, USA) โดยโปรแกรมประมวลผล 32 Karat Software version 9.1 patch และ PA 800 plus

Software version 1.1 patch ใชแคปลลารแบบ neutral-coated ขนาดเสนผานศนยกลางภายใน 50 μm

ความยาวทงหมด (L) 30.2 cm และเครองวดคาการดดกลนแสงชนด UV 280 nm สารละลาย cIEF gel

ตวอยางและสารมาตรฐาน

ยาชววตถเพอการรกษาสำาเรจรปชนดโมโนโคลนอลแอนตบอดจำานวน 14 ชอการคา (brands) คอ ชนด

A-N ทขนทะเบยนเพอจำาหนายในประเทศไทยสำาหรบการรกษาโรคชนดตางๆ เชน โรคตดเชอ มะเรงเตานม

มะเรงลำาไสใหญ มะเรงเมดเลอดขาว โรคขออกเสบ โรคกระดกพรนและโรคปลอกประสาทอกเสบ เปนตน โดย 1

ชนดเปนยาคลายคลง (Biosimilars) และอก 13 ชนดเปนยาตนแบบ (originators) ซงม 1 ชนดเปนยาอางอง

(reference product) ของยาคลายคลง ซงไดรบจากผผลตรวมทงสารมาตรฐานของ mAb ทง 14 ชนด ตวอยาง

ทงหมดเปนทงชนดผงแหงและนำา เกบท 2 - 8°C

โปรตนอางองมาตรฐาน (cIEF peptide markers: pI 10.0, 9.5, 7.0, 5.5, 4.1 # A58481) จาก

Beckman Coulter; USA

การเตรยมตวอยางและสารมาตรฐาน

ละลายตวอยางและสารมาตรฐานดวยนำาสำาหรบยาฉดใหมความเขมขน 10 mg/mL เตม 10 μL ลงใน

หลอด micro tube ทมสารเหลานในหลอด คอ 3 M urea-cIEF Gel ปรมาตร 200 μL carrier ampholytes

ปรมาตร 12.0 μL cathodic stabilizer ปรมาตร 20.0 μL anodic stabilizer ปรมาตร 2.0 μL และ pI มาตรฐาน

2 ชนด ทมคา pI ใกลเคยงกบตวอยาง ชนดละ 2.0 μL ผสมใหเขากนโดยใช vortex mixer ประมาณ 15 วนาท แลว

นำาไปปนในเครองปนเหวยง 6,600 rpm ประมาณ 20 วนาท เพอใหฟองอากาศหายไปกอนทำาการทดสอบ

เตรยมโปรตนอางองมาตรฐาน (cIEF peptide markers) โดยปเปต 3 M urea-cIEF Gel ปรมาตร

200 μL ใสใน micro tube แลวเตม pharmalyte 3 - 10 carrier ampholytes ปรมาตร 12.0 μL cathodic

stabilizer ปรมาตร 20.0 μL anodic stabilizer ปรมาตร 2.0 μL จากนนเตม pI markers 10.0, 9.5, 7.0,

5.5 และ 4.1 ชนดละ 2.0 μL ผสมใหเขากน นำาไปปนในเครองปนเหวยงประมาณ 20 วนาท เพอใหฟองอากาศ

หายไปกอนนำาไปทดสอบ



วธการ

วเคราะหตวอยางตามสภาวะทกำาหนดดงน ลางทอแคปลลารดวย 4.3 M urea solution โดยใชความดน

50.0 psi นาน 3 นาท และลางดวยนำาทความดน 50.0 psi นาน 2 นาท แลวจงฉดตวอยางทความดน 25.0 psi

เปนเวลา 99 วนาท จากนนเปนการแยกสารโดยชวง focusing step ใชความตางศกย 25.0 kV นาน 15 นาท และ

ขนตอน mobilization step ปรบความตางศกยเปน 30.0 kV นาน 30 นาท จงสนสดการแยก และลางแคปลลาร

ดวยนำาทความดน 50.0 psi 2 นาท และใหความตางศกยลดลงเปน 15.0 kV เพอเตรยมการฉดตวอยางครงตอไป

โปรตนทมคา pI สงกวาคา pH จะมประจบวก โปรตนทมคา pI ตำากวา pH จะมประจลบ เมอเคลอนท

ไปถงตำาแหนงใดทประจรวมบนโมเลกลเปนศนย โปรตนจะหยดการเคลอน ณ จดนคอคา pI แสดงผลอเลกโทร-

ฟโรแกรมเปนพคซงมความหมายทงตำาแหนงซงบอกเวลาทใชในการเคลอนท (migration time: MT) ความสง (peak

height) และพนทใตพค (peak area) ทบอกถงปรมาณพคทขนาดใหญหรอสงทสดจะเปนพคหลก (major peak/

main peak) ซงจะเปนโปรตนทมปรมาณมากทสดและมกจะมพคอนประกอบตามชนดขององคประกอบในตวอยาง

ทวเคราะหโดยพคทอยดานขวาของพคหลกจะมคา pH ตำากวาพคหลกเรยกเปน acidic peak และในดานตรงกนขาม

คา pH สงกวาพคหลกคอ basic peak ในการตรวจเอกลกษณของโปรตนจะคำานวนหาคา pI ของตวอยางจาก

MT ซงคา pI และอเลกโทรฟโรแกรมของตวอยางตองตรงกบสารมาตรฐานชนดนนๆ ซงเปนไปตามขอกำาหนด

ของยา (product specification) นอกจากนไดทำา forced degradation ของ mAb ของยาชนดคลายคลง

โดยการอนในตอบท 37°C นาน 1 - 5 วน เพอศกษาเปรยบเทยบกบยาอางอง โดยทกตวอยางทำาการวเคราะห 2 ซำา

ผล

ผลการวเคราะห mAb ทง 14 ชนดดวย cIEF นาน 30 นาทไดอเลกโทรฟโรแกรมแสดง isoforms

ของตวอยางแตละชนด ในภาพรวม isoforms มคา pI ภาพ รวมอยในชวง 6 - 10 (ตารางท 1) เปนกลมของพค

ทมความสง จำานวนพคและคา MT แตกตางกน (ภาพท 1) โดยเรมปรากฏพคแรกทประมาณ 20 นาทเปนตนไป

เชน ตวอยาง mAb ชนด A โดยตวอยางทกชนดม charge variants ทง 3 รปแบบ คอชนด basic และ acidic

นอกเหนอจากพคหลกซงเปนพคทสงทสด โดย pI ของพคชนด basic และ acidic พค อยในชวง 9.48 - 6.70 และ

9.24 - 6.40 ตามลำาดบ (ตารางท 2) เมอวเคราะหเปรยบเทยบกบสารมาตรฐาน พบวา mAb ทกตวอยางมอเลกโทรฟโรแกรม

ตรงกบสารมาตรฐานของตวเอง ทงลกษณะรปแบบการกระจายตว จำานวนพค และความสงของพคทสอดคลองกน

ซงไดแสดงผลการเปรยบเทยบของ mAb ชนด I และ C เปนตวอยาง (ภาพท 2) สวนการศกษา forced degrada-

tion ของ mAb ชนด H และ I พบวาลกษณะของอเลกโทรฟโรแกรมของชนด I แตกตางไปจากเดมคอมจำานวน

พคเพมมากขนจาก (ภาพท 3)

ตารางท 1 คา pI ของตวอยาง mAb 14 ชนด

products pI main peak

M 6 - 7

C G H I K L 7 - 8

B D E N J 8 - 9

A F 9 - 10





ภาพท 1 อเลกโทรฟโรแกรมของตวอยาง mAb ทง 14 ชนด (ชนด A-N)

ภาพท 2 ลกษณะของอเลกโทรฟโรแกรมจาก cIEF (A) ของยา mAb ชนด I และ (B) mAb ชนด C เมอ

เปรยบเทยบกบสารมาตรฐาน

ตารางท 2 ชวงคา pI ของ isoforms จากเทคนค cIEF ของตวอยาง ทง 14 ชนด

products pI basic peak main peak pI acidic peak

A 9.41 - 9.34 9.24 9.13 - 8.93

B 8.81 - 8.62 8.48 8.35 - 7.95

C 7.94 7.85 7.63 - 7.4

D 8.69 - 8.50 8.36 - 8.29 8.11 - 8.06

E 8.37 8.18 8.01 - 7.65

F 9.48 - 9.42 9.30 9.24 - 8.99

G 7.76 7.67 7.56

H 7.46 - 7.33 7.19 7.08 - 7.00

I 7.46 - 7.33 7.20 7.14 - 7.01

J 8.11 8.01 - 7.93 7.83 - 7.56

K 7.43 - 7.36 7.30 7.11 - 6.99

L 6.70 6.57-6.50 6.40

M 8.85-8.66 8.38 8.23

N 9.04 8.92 8.84-8.61

range 9.48-6.70 9.30-6.50 9.13-6.40



วจารณ

ตวอยางยา mAb จำานวน 14 ชนด (A-N) ทนำามาศกษา 13 ชนดเปนยาอางองและหนงชนดเปนยา

คลายคลงทขอขนทะเบยนเพอจำาหนายในประเทศไทยสำาหรบรกษาโรคชนดตางๆ เชน โรคตดเชอ มะเรงเตานม

มะเรงลำาไสใหญ มะเรงเมดเลอดขาว โรคขออกเสบ โรคกระดกพรน และโรคปลอกประสาทอกเสบ เปนตน

การศกษานวเคราะห charge variants ดวยเทคนคอเลกโทรโฟรซสแบบแคปลลารชนด cIEF ทได

ตรวจสอบความถกตองแลว(10) และไดใชในการวเคราะหตวอยาง mAb ทกชนดดวยสภาวะเดยวกน ผลการวเคราะห

mAb ทกชนดได charge variants ทม isoforms ทง 3 แบบ คอชนดพคหลก ชนด basic และชนด acidic

variants แสดงถงความหลากหลายของประจบนโมเลกลของยา ถอวาเปนความแตกตางเพยงเลกนอย (microhet-

erogeneity) ซงพบไดในโมเลกลของโปรตน ในการวเคราะหไดเตม pI markers 2 ชนด ซงอยในชวงคา pI 10.0

- 5.5 เพอการคำานวณคา pI ของ isoforms จากโปรแกรมของเครองมอ cIEF ตามทเหมาะสมกบชนดตวอยาง iso-

forms ทไดแสดงใหเหนวา mAb เกอบทกชนดเปน basic variants (ตารางท 1) คอ มอเลกโทรฟโรแกรมอยระหวาง

pI markers 7.0 - 10.0 (ภาพท 1) ม 1 ชนดท pI ของพคหลกเปนชนด acidic variant คอ mAb ชนด M

จากการเปรยบเทยบกบสารมาตรฐานพบวา mAb ทกชนดมอเลกโทรฟโรแกรมของ isoforms ตรงกบ

สารมาตรฐานของตวเอง ซงไดแสดงผลจาก mAb ชนด I และC เปนตวอยาง (ภาพท 2) แสดงวาตวอยางและ

สารมาตรฐานมโครงสรางทมเอกลกษณตรงกน เนองจากหากอเลกโทรฟโรแกรมของตวอยางเปลยนแปลงจากเดม

หรอของยาแตละรนแตกตางกน หรอแตกตางจากสารมาตรฐานจะทำาใหทราบวามความผดปกตของโมเลกล(1) ซง

สาเหตอาจเกดจากโครงสรางทเปลยนแปลงไป เชน จากลำาดบกรดอะมโนทแตกตางหรอเกดการเปลยนแปลงทาง

เคมของโมเลกลหลงการผลต หรอในระหวางการเกบรกษาเปนเวลานาน ในขณะทผลการตรวจสอบความบรสทธอาจ

เปนไปตามเกณฑและการตรวจสอบการออกฤทธของยาอาจไมพบการเปลยนแปลงน

เมอเปรยบเทยบการวเคราะห isoforms ของ mAb จากงานวจยอนดวยเทคนค cIEF(11-15) เชน ตวอยาง

E(12) ซงมสภาวะ cIEF แตกตางกน พบวารปแบบของอเลกโทรฟโรแกรม และความสงของพคหลกเหมอนกนและ

อยในชวง pI marker 8.4 - 10.0 เชนเดยวกน แตมความแตกตางของตำาแหนงพคเลกนอย เนองจากผลการศกษา

นมคา MT ทเรมในชวงเวลาทชากวา และมจำานวนพคชนด acidic variants มากกวา ซงเกดไดจากหลายสาเหต

เชน จากปฏกรยา deamidation ของกรดอะมโนไลซนทปลายสายโปรตน (C-terminal) หรอมการเตมนำาตาล

กรดไซอะลก รวมทงอาจเกดสลายตวและการจบตวกนของโปรตน (aggregation)(3,15,16) ในโมเลกลของยารนทสงมา

ตรวจน

ภาพท 3 ลกษณะอเลกโทรฟโรแกรมของ mAb H ยาอางอง (A) และชนดคลายคลง mAb I (B) เมอเกบท

37 °C นาน 5 วน



เนองจากประเทศไทยมประกาศของสำานกงานคณะกรรมการอาหารและยาวาดวยการขนทะเบยนยา

คลายคลงในป 2556(17) ดงนนยา mAb ชนดใดทขนทะเบยนกอนป 2556 แมจะเปนยาคลายคลงกจะขนทะเบยนเปน

ยาใหม จงไมมขอมลการศกษาเปรยบเทยบความคลายคลงระหวางยาตนแบบทใชเปนยาอางองของยาคลายคลงแสดงไว

ในการขนทะเบยน ซงไดแก mAb ชนด I จงไดทำาการศกษาเปรยบเทยบความคลายคลงดานประจในการทดสอบเดยวกน

(head-to-head comparison) ผลคอไดอเลกโทรฟโรแกรมตรงตามยาอางอง คอ mAb ชนด H แสดงถงโครงสรางท

คลายคลงกน (ภาพท 1) แตทนาสนใจคอผลจากการทดลอง forced degradation โดยการอนตวอยางในตอบท 37 °C

นาน 5 วน พบวาอเลกโทรฟโรแกรมของยาอางองยงคงเดมสวนของยาคลายคลงคอ mAb ชนด I เปลยนแปลง

ไปจากเดมอยางชดเจนจากจำานวนพคทเพมมากขนในสวนของ acidic variants (ภาพท 3) เมอพจารณาสตรตำารบ

ของยาอางองและยาคลายคลงพบวาไมแตกตางกน ดงนนความคงตวทแตกตางกนนอาจเกดจากกระบวนการผลต

ทแตกตางกน เชน จากปฏกรยาทางเคม deamidation หรอการตดกรดอะมโนไลซนบน C-terminal หรอการเตม

นำาตาลกรดไซอะลกในสวน Fc เปนตน

สรป

การรกษาโรคดวยยาชววตถ Biotherapeutic product ชนด mAb ตองการการวเคราะหคณภาพของยา

เพอใหมนใจในคณภาพ ประสทธภาพและความปลอดภย แมวาการศกษานจะมตวอยาง mAb แตละชอการคาเพยง

1 รน แตผลการศกษา charge variants ของยา mAb ทง 14 ชอการคาทขนทะเบยนในประเทศไทยพบวายาทกชอ

การคามคณลกษณะเปนไปตามมาตรฐานทจดแจง และผลการเปรยบเทยบความคลายคลงดานประจเปนประโยชนสำาหรบ

การเฝาระวงและตรวจสอบคณภาพของยาเหลานในรนตอ ๆ ไปทนำามาจำาหนายในประเทศ ซงภาครฐจะตองวางแผน

การเฝาระวงความสมำาเสมอของคณภาพและความคงตวตอไป

กตตกรรมประกาศ

งานวจยนไดรบเงนสนบสนนจากกรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข

เอกสารอางอง

1. Liu H, Gaza-Bulseco G, Falu D, Chumsae C, Sun J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J Pharm Sci 2008; 97(7): 2426-47.

2. Beck A, Wagner-Rousset E, Ayoub D, Van Dorsselaer A, Sanglier-Cianferani S. Characterization of therapeutic antibodies and related products. Anal Chem 2013; 85(2): 715-36.

3. Zhao SS, Chen DDY. Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics. Electrophoresis 2014; 35(1): 96-108.

4. Liu X, Sosic Z, Krull IS. Capillary isoelectric focusing as a tool in the examination of antibodies, peptides and proteins of pharmaceutical interest. J Chromatogr A 1996; 735(1-2): 165-90.

5. Mack S, Cruzado-Park ID, Ratnayake CK. High Resolution cIEF of therapeutic monoclonal antibodies: a platform method covering pH 4-10 (A-12026A). [online]. Fullerton, CA: Beckman Coulter; 2014. [cited 2013 Dec 16]. Available from: https://sciex.com/Documents/tech%20notes/ A-12026A.pdf

6. Tang S, Nesta DP, Maneri LR, Anumula KR. A method for routine analysis of recombinant immunoglobulins (rIgGs) by capillary isoelectric focusing (cIEF). J Pharm Biomed Anal 1999; 19(3-4): 569-83.



7. ฐตาภรณ ภตภณโยวฒณ, วชชดา จรยะพนธ, สายวรฬ จดรกตตนนท, ธรนารถ จวะไพศาลพงศ. การพฒนาวธการตรวจเอกลกษณของโมโนโคลนอลแอนตบอดดวยวธแคปลลารไอโซอเลกทรกโฟกสซง (cIEF). ว เภสชศาสตรอสาน 2558; 11(2): 45-54.

8. Santora LC, Krull IS, Gran K. Characterization of recombinant human monoclonal tissue necrosis factor-α antibody using cation-exchange HPLC and capillary isoelectric focusing. Anal Biochem 1999; 275: 98-108.

9. Hunt G, Moorhouse KG, Chen AB. Capillary isoelectric focusing and sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis of recombinant humanized monoclonal antibody HER2. J Chromatogr A 1996; 744(1-2): 295-301.

10. Hunt G, Hotaling T, Chen AB. Validation of a capillary isoelectric focusing method for the recombinant monoclonal antibody C2B8. J Chromatogr A 1998; 800(2): 355-67.

11. López-Morales CA, Miranda-Hernández MP, Juárez-Bayardo LC, Ramírez-Ibáñez ND, Romero-Díaz AJ, Piña-Lara N, et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. BioMed Res Int 2015; 2015: 1-10.

12. Bandyopadhyay S, Mahajan M, Mehta T, Singh AK, Parikh A Gupta AK, et al. Physicochemical and functional characterization of a biosimilar adalimumab ZRC-3197. Biosimilars 2015; 5: 1-18.

13. Khawli LA, Goswami S, Hutchinson R, Kwong ZW, Yang J, Wang X, et al. Charge variants in IgG1: Isolation, characterization, in vitro binding properties and pharmacokinetics in rats. mAbs 2010; 2(6): 613-24.

14. Neergaard MS, Nielsen AD, Parshad H, Van De Weert M. Stability of monoclonal antibodies at high-concentration: head-to-head comparison of the IgG1 and IgG4 Subclass. J Pharm Sci 2014; 103(1): 115-27.

15. Ito T, Tsumoto K. Effects of subclass change on the structural stability of chimeric, humanized, and human antibodies under thermal stress. Protein Sci 2013; 22(11): 1542-51.

16. ประกาศสำานกงานคณะกรรมการอาหารและยา เรอง เอกสารหลกฐานการขอขนทะเบยนตำารบยาชววตถคลายคลง. ราชกจจานเบกษา เลมท 130 ตอนพเศษ 174 ง (ลงวนท 4 ธนวาคม 2556).



Charge Variants Analysis of Biotherapeutic

Monoclonal Antibody by Capillary

Isoelectric Focusing

Wichuda Jariyapan Titaporn Pootipinyowat and Saywarul JadoonkittinanInstitute of Biological Product, Department of Medical Sciences, Tiwanon Road, Nonthaburi 11000,

Thailand.

ABSTRACT Monoclonal antibody molecules of therapeutic finished products could have variations due to their charge variants. Changes of charge profile could alter drug stability, bioactivity and/or induce harmful immunogenicity. Therefore, each batch should contain a consistent charge variant profile. This study was conducted to analyse charge heterogeneity of 14 brands of therapeutic monoclonal antibodies registered in Thailand using cIEF technique. The electropherogram results of all products showed 3 isoforms and complied with their reference material isoforms. Their pI range was within 7 - 10, while pI ranges of basic and acidic variants were 9.48 - 6.70 and 9.24 - 6.40, respectively. In addition, reference product showed better stability than its biosimilars when compared to their isoforms after incubation at 37 °C for 5 days. In conclusion, the therapeutic monoclonal antibodies registered in Thailand contained charge variants according to their reference materials; however, quality monitoring of lots of those therapeutic monoclonal antibody drug products should be considered including stability of biosimilars

Keywords: monoclonal antibodies, charge variants, biosimilars, capillary isoelectric focusing