1

PEMBUATAN DNA REKOMBINAN

2

Nama enzim restriksi

o  Berdasarkan nama organisme dari mana enzim diisolasi, mis.: n  Eco dari Escherichia coli n  Hin dari Haemophilus influenzae n  Hae dari Haemophilus aegyptius

o  Diikuti oleh nama strain (bila perlu) o  Diikuti oleh angka Romawi

n  Menunjukkan ada lebih dari satu macam enzim restriksi dihasilkan dari organisme tersebut

3

Cara kerja enzim restriksi

o Mengkatalisis hidrolisis ikatan fosfodiester dari DNA.

4

Pemotongan DNA oleh enzim restriksi

o Memotong DNA pada n  urutan spesifik = urutan pengenalan

(recognition sequence) n  lokasi spesifik = sisi restriksi (restriction site)

o Hasil pemotongan n  Simetris: urutan pengenalan palindrom n  Tidak simetris: urutan pengenalan panjang dan

bukan palindrom

5

Hasil pemotongan enzim restriksi o  Simetris

n  Ujung lancip

n  Ujung tumpul

n  Ujung lancip

o  Tidak simetris n  BstXI

6

Contoh beberapa macam enzim restriksi tipe II

o  HindII o  HindIII o  PstI o  MboI (frekuensi tinggi) o  SmaI o  Xma I o  PspAI

n  Py =T atau C; Pu = A atau G) n  Isoskizomer = Dua enzim restriksi yang dapat mengenali

urutan DNA yang sama yang berasal dari organisme berbeda → sisi restriksi bisa sama atau berbeda

o  GTPy PuAC o  A AGCTT o  CTGCA G o  N GATCN o  CCC GGG o  C CCGGG o  C CCGGG

Palindrom : Go hang a salami! I’m a lasagna hog

7

Pemotongan dan penyambungan kembali DNA

o  Pemotongan DNA: 5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’

EcoRI

5’- NNNG AATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAA GNNN -5’

o  Penyambungan 5’- NNNG OH PAATTCNNN -3’

kembali 3’- NNNCTTAAP OHGNNN -5’

ligase

5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’ 4-9

8

Menyambung DNA

o  Ligase Berasal dari Bacteriophage (T4)

9

Ligasi ujung tumpul

o  Ujung tumpul dapat diligasi dengan ujung tumpul o  Ujung lancip dapat dijadikan ujung tumpul:

n  Ujung 5’ yang ssDNA: dengan DNA polimerase I dan dNTP n  Melepaskan bagian yang ssDNA dengan T4 DNA

polimerase p Mempunyai aktivitas DNA polimerase 5’ → 3’ p Mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’

n  Hasil ligasi tidak dapat dipotong lagi pada sisi yang sama

o  Ligasi ujung tumpul tidak seefisien ligasi ujung lancip

10

Ligasi ujung lancip

o  Ujung ssDNA sama/komplementer, DNA dapat diligasi n  BamHI 5’ -.....G ↓ GATCC.....-3’ n  BclI 5’ -.....A ↓ GATCT.....-3’ n  Sau3AI 5’ -..... ↓ GATC .....-3’ n  BstYI 5’ -.....R ↓ GATCY .....-3’

o  Bila DNA hasil pemotongan BamHI diligasi dengan DNA hasil pemotongan BclI, hasil ligasinya dapat dipotong dengan enzim apa?

11

VEKTOR KLONING (1)

o Molekul DNA yang: n  dapat bereplikasi sendiri di dalam sel n  dimana DNA asing dapat dimasukkan n  Ada marker:

p  untuk mendeteksi adanya vektor p  untuk mendeteksi adanya DNA asing

o Macam-macam marker n  gen resistensi antibiotik n  gen lacZ (β-galaktosidase) n  gen untuk sintesis asam amino

12

VEKTOR KLONING (2)

o Plasmid o Virus

n  Bakteriofag lambda n  Bakteriofag M13

o Kombinasi dari plasmid dan virus n  Kosmid n  Phagemid

o  BAC (bacterial artificial chromosome)

13

Dasar pemilihan vektor

n  Ukuran DNA asing yang akan dimasukkan ke dalam sel

n  Galur sel inang yang akan digunakan n  Eksperimen yang akan dilakukan setelah

kloning p Apakah gen akan diekspresi? p Apakah diperlukan modifikasi pasca translasi pada

protein yang akan dihasilkan?

14

Plasmid

o  dsDNA o  berbentuk lingkaran tertutup o  1 – 200 kb o  Jumlah plasmid di dalam sel: 1 – 700 (tergantung

macam plasmidnya) o  Vektor kloning

n  Sisi pemotongan enzim restriksi yang unik n  Marker seleksi kehadiran plasmid (resistensi

antibiotik) n  Marker seleksi kehadiran DNA sisipan (lacZ) n  pBR322, pUC10

o  Shuttle vector n  Dapat bereplikasi di dalam > 1 spesies n  YEp24 dapat bereplikasi di E. coli & ragi

15

Plasmid pBR322

o  Marker seleksi: gen resistensi tetrasiklin dan ampisilin

o  Ori = origin of replication, sekuens yang memungkinkan plasmid dapat menggandakan diri dalam bakteri

o  DNA disisipkan ke dalam sisi kloning: n  BamHI: sensitif tetrasiklin n  PstI: sensitif ampisilin

p BR322

a mpr te t r

o ri

Ec o RIHind III

Ba m HI

Sa lIPstI

Ava I

Pvu I

4 ,36  kb

16

Plasmid pUC18/pUC19

o  Sisi kloning dalam gen lacZ

o  Ada IPTG & Xgal n  lacZ aktif n  Xgal berubah

menjadi biru o  Seleksi biru-putih

p UC 18 /p UC 19

a mpr la c Z

o ri

EcoSacKpnSmaXma

RIIIII

BamXboSalAccHinPstSphHin III

HIIIIcIIIId

2 ,69  kb

lac I

MC S

17

18

Blue-White Colony Selection

19

IPTG-XGal

20

Vektor kloning khusus

o Vektor ekspresi n  Gen asing diekspresi & produksi protein tinggi n  Promoter n  Sisi pengikatan ribosom (SD) n  Kodon start dekat sisi kloning n  Signal terminasi transkripsi

o Vektor untuk mempelajari daerah regulator pada DNA n  Reporter gene (gen pelapor)

21

Vector ekspresi pKK233-2

Marker seleksi

Promoter tac

RBS

Sisi pengenalan enzim restriksi yang unik

Txn = terminator

Tidak ditunjukkan: ori replikasi DNA

22

Ekspresi gen dari promoter yang kuat dan dapat diregulasi

o Transkripsi merupakan titik kontrol yang paling penting n  Dikontrol oleh promoter dari gen

o Dua sifat penting dari promoter n  Kuat

p  Afinitas tinggi terhadap RNA polimerase p  Ikatan kuat - sering ditranskripsi p  Ikatan lemah - RNA polimerase lepas

tidak ada transkripsi n  Dapat diregulasi

p  Kapan gen diekspresi dapat dikontrol p  gunakan induser / ko-represor

23

Promoter yang penting dalam vektor ekspresi E. coli o  lac (atau lacUV5) o  trp o  tac (atau trc) o pL dari fag λ o gen 10 dari fag T7

24

tac (trc) promoter

o Hibrid dari promoter lac dan trp daerah -35 dari trp daerah -10 dari lac n  terpisah 16 pb = promoter tac n  terpisah 17 bp = promoter trc

o  3x lebih kuat dari trp o 10x lebih kuat dari lac

25

Promoter λ pL

o promoter pL diregulasi oleh represor λ o  represor λ dikode gen cI o Digunakan gen cI mutan

n  Mutasi kondisional n  Mutan sensitif suhu

p  28-30°C = suhu permisif n  fenotipe normal n  Tidak ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI

p  42°C = suhu restriktif n  mutan •  ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI

26

Regulasi oleh promoter pL

pcI cI oL pL

protein cI aktif

mRNA

A) 30°C

gen target

27

Regulasi oleh promoter pL

pcI cI - ts oL pL

protein cI aktif

mRNA

B) 42°C

gen target

protein cI tidak aktif

28

Promoter gen 10 fag T7

o Semua promoter fag T7 (termasuk gen 10) memerlukan RNA Polimerase T7 untuk ekspresinya

n  Letakkan gen RNA Pol T7 di bawah kontrol promoter lac dalam sel E.coli

n  Letakkan Gen target di bawah kontrol promoter gen 10

29

Promoter gen 10 fag T7

pro lac Gen RNA Pol T7

pro g10 Gen target

Protein target

Induser RNA Pol T7

T7 RNA Pol

30

Promoter gen 10 fag T7

o Ekspresi gen RNA polimerase T7 dikontrol oleh induser operon lac n  Laktosa (allolaktosa) ATAU n  IPTG (iso-propil thio galaktosida)

p Tidak dimetabolisasi seperti laktosa p Tidak dipotong oleh β-galaktosidase

Transformasi

o Transformasi n  Memasukkan DNA ke dalam sel n  Sel ditransformasi,

sedangkan DNA mentransformasi sel

o Transforman n  Sel yang telah ditransformasi

o Efisiensi transformasi = n  Jumlah transforman / µg DNA plasmid

Transformasi dengan metode CaCl2

o Bakteri n  ditumbuhkan sampai <108 sel/ml

(pertengahan fase logaritmik) n  Diberi perlakuan dengan CaCl2 dingin n  Diberi kejutan panas yang singkat.

o Perlakuan ini menyebabkan sel bakteri menjadi kompeten untuk sementara, sehingga dapat menerima DNA dari luar sel

Setelah transformasi sel bakteri

o Bakteri ditumbuhkan o Seleksi sel bakteri yang berhasil ditransformasi

plasmid n  Medium diberi antibiotik n  Bakteri perlu diberi kesempatan untuk mengekspresi

gen resistensi antibiotik yang ada di plasmid sebelum antibiotik ditambahkan pada medium pertumbuhan bakteri

o Seleksi bakteri yang berhasil ditransformasi dengan plasmid rekombinan