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LABORATÓRIO CLINICO ..................................................... 2

Fase pré-analítica ........................................................ 2 Fase analítica ............................................................... 2 Fase pós-analítica ........................................................ 2

CONTROLE EGARANTIA DA QUALIDADE .......................... 2 Padronização no laboratório ....................................... 2

Padronização dos processos pré-analíticos ................... ... 2 Padronização dos processos analíticos ............................ 2 Padronização dos processos pós-analíticos ..................... 3

ERROS EM EXAMES .......................................................... 4 Erros na etapa pré-analítica ........................................ 4 Erros na etapa analítica ............................................... 4 Erros na etapa pós-analítica ........................................ 4

COLETA DE SANGUE .......................................................... 4

TUBOS A VÁCUO .......................................................... ..... 5 Análise bioquímica e sorológica (tubo amarelo) ......... 5 Análise hematológica (tampa roxa) ............................ 5 Análise glicêmica (tampa cinza) .................................. 5 Análise de coagulação (tampa azul) ............................ 5

HEMOGRAMA ................................................................... 5

Método manual ........................................................... 6 Métodos automatizados .............................................. 6

Contagem de eritrócitos e plaquetas ............................... 6 Dosagem de hemoglobina .................... ..................... ....... 6 Contagem global de leucocitos ........................................ 7

ERITROGRAMA ............................................................ ..... 7 Índices eritrocitométricos ............................................ 7

Volume Corpuscular Médio (VCM) ..................... .............. 8 Hemoglobina corpuscular média (HCM) .......................... 8

Concentração da hemoglobina corpuscular médica(ChCM) ............................................................................. 8 RDW (red cell distribution width) ................... .................. 8

Hematócrito ............................................................ ..... 8 LEUCOGRAMA ............................................................. ..... 8

Contagem diferencial................................................... 9 Esfregaço sanguíneo .................................................... 9 Coloração ........................................................ ............. 9

IMUNOLOGIA .................................................................... 9

TERMOS ......................................................................... 10 Afinidade e avidez ...................................................... 10 Anticorpos policlonais e monoclonais ........................ 10

MÉTODOS SOROLÓGICOS .............................................. 10 Método de aglutinação ............................................. 10

TESTE DE FLOCULAÇÃO .................................................. 11 Aglutinação de cristais de colesterol ...................... ... 11

ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS (ELISA) .......................... 11 Método imunoenzimáticos para detecção deanticorpos .................................................................. 11 Medida da avidez de igG ........................................... 11 Método imunoenzimáticos para detecção deantígenos ................................................................... 12

Reação de Western-Blot ............................................ 12

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LABORATÓRIO CLÍNICO A estrutura organizacional de um laboratório clínicodeve contemplar as necessidades processuais dasfases pré-analíticas e pós-analíticas , tanto no quediz respeito aos aspectos arquitetônicos, quanto emrelação aos equipamentos, equipe técnica etecnologia de informação. A tendência atual é aconstrução de plataformas laboratoriaishorizontalizadas e flexíveis, com o máximo deintegração processual e metodológica. Talintegração é facilitada pela implantação do sistemade otimização laboratorial.

Fase pré-analíticaEstudos recentes têm apontado fatores pré-analíticos como responsáveis por até 70% dos errosregistrados num laboratório clinico. Antes da coletade qualquer material biológico para realização deexames laboratoriais, é importante conhecer,controlar e se possível, eliminar algumas variáveisque possam interferir nos resultados, entre ascausas comuns de variabilidade pré-analítica, temse: gravidez, atividade física, período neonatal einfância, idade avançada, postura, dieta, uso dedrogas terapêuticas ou de abuso, infusão defármacos, hemólise, lipemia, jejum, torniquete evariação crônobiológica.

Fase analíticaNa fase analítica, as grandes preocupaçõesreferem-se aos reagentes, equipamentos gerais, eespecíficos e qualidade da água usada nolaboratório (água reagente).O processo analítico deve ser referenciado nasinstruções de uso do fabricante, em referênciasbibliográficas ou em pesquisa cientifica validaconduzida pelo laboratório. Assim, deve se zelarpela utilização de metodologias que reúnamsensibilidade, especificidade e custo-efetividadeadequados e estas, quando implantada, devemseguir rigorosamente as especificações dofabricante. A validação interna é considerada etapaessencial e preliminar à introdução de qualquermetodologia analítica no laboratório.

Fase pós-analíticaO laudo de um exame laboratorial deve conter osseguintes itens: Identificação do laboratório; Endereço e telefone do laboratório; Identificação do responsável; Identificação do profissional que liberou o

exame; Data da coleta da amostra; Data da emissão do laudo; Nome do exame, tipo de amostra e método

analítico; Resultado do exame e unidade de medição; Valores de referência, limitações técnicas da

metodologia e dados para interpretação.

CONTROLE EGARANTIA DA QUALIDADEÉ um conjunto de processos que visa à obtençãode resultados laboratoriais confiáveis. Um programade garantia da qualidade adequado deve abrangeras fases pré-analíticas, analítica e pós-analítica. Oresponsável técnico do laboratório deve elaboraruma lista abrangendo todos os análitos e todos ossistemas analíticos que usa. Para cada sistemaanalítico, deve haver um plano para controle internoe para controle externo. O programa de garantia econtrole ou de proficiência que será usado, afrequência de seu uso e os limites e critérios deaceitabilidade dos resultados. Todas as atividadesreferentes à garantia da qualidade devem serregistradas, e analisadas criticamente de formaregular que possibilite a investigação de causasreais de problemas que impactem a confiabilidadedas análises.

Padronização no laboratórioNa realização de um exame laboratorial temos queconsiderar as etapas pré-analítica, analíticas e pós-analíticas. Para obtermos qualidade nos examesaté a liberação do laudo. A padronização nolaboratório tem a finalidade de prevenir, detectar,identificar e corrigir erros ou variações que possamocorrer em todas as fases da realização do teste. Apadronização tem o objetivo de estabelecer umamaneira padronizada todas as etapas envolvidas narealização de um determinado exame.

Padronização dos processos pré-analíticos

Os processos pré-analíticos são difíceis demonitorar e controlar porque grande parte delespode ocorrer fora do laboratório. Considerando osvários fatores que podem afetar, os seusresultados, o laboratório deve fornecer instruçõesescritas aos clientes para evitar prováveis erros nafase pré-analítica. Os principais erros na fase pré-analítica são: Identificação : as amostras biológicas precisam

estar devidamente identificadas, nome dopaciente, data e hora da coleta, tipo de material;

Coleta da amostra : na coleta da amostrabiológica é importante que os profissionaisresponsáveis tenham conhecimentosnecessários dos erros e variações que podemocorrer antes, durante e após a obtenção damesma.

Padronização dos processos analíticos As variações analíticas na realização de um examelaboratorial devem ser muito bem controladas paraassegurar que os resultados sejam precisos eexatos. Os métodos analíticos, antes de serem

implantados na rotina laboratorial, devem seranalisados em relação aos seguintes critérios: Confiabilidade : precisão, exatidão,

sensibilidade, especificidade, linearidade; Praticidade : volume e tipo de amostra,

duração do ensaio, complexidademetodológica, estabilidade dos reagentes,

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robustez, necessidade de equipamentos, custoe segurança pessoal.

Padronização dos processos pós-analíticosOs processos pós-analíticos consistem nas etapasexecutadas após a realização do exame: Cálculo dos resultados; Análise de consistência dos resultados; Armazenamento de material ou amostra do

paciente; Transmissão e equipamento de resultados; Consultoria técnica.

GRAFICO DE CONTROLE DE LEVEY-JENNINGOs gráficos de controle de Levey-Jennin passarama ser usados no LC a partir de técnicas de controledesenvolvida para a indústria.Henry e Segalove difundiram aplicação dos gráficosde controle de LJ, analisando simultaneamenteamostras controle (valores desconhecidos).

O gráfico é confeccionado através de linhasespecificando o valor médio para o analito na linhacentral, e os limites de controle estabelecidos (1, 2e 3 desvio padrão) para identificar e mostrartendências dos resultados encontrados. As fases envolvidas nos gráficos de controle de LJsão: Adquirir amostras controle no mercado ou

prepara-las no próprio laboratório; Amostras controle adquiridos no mercado já

vem com a média e os limites aceitáveis deERRO (LAE) ou limite de controle previamentedeterminados.

Quando a amostra controle for do própriolaboratório: Analisar a amostra controle para o analito a ser

controlados no mínimo 20 dias diferentes. Calcular a médio e o desvio padrão a partir dos

resultados obtidos. Estabelecer os limitesaceitáveis de erros (LAE) ou limites de controle.

SISTEMA DE MULTIREGRAS DE WESTGARDUsa também amostras controle e gráfico de

controle. As multirregras de Westgard e cols. sãomuito boas para descobrir e interpretar alteraçõesdiscretas que ocorrem nos dados de controle. Assim como no sistema de LJ, as multirregras deWestgard podem ser trabalhadas através de gráficocontrole. O gráfico de controle de Westgard étraçado com várias linhas de limites especificadosassim: média +-1s, média +- 2s. média +- 3s, quepermite a aplicação de normas adicionas decontrole.Esse método proporciona uma interpretação maisestruturada, o que possibilita uma melhor detecção

de erros nos ensaios.1:3s uma observação exceder a média 3 : E umaregra de rejeição de resultados. Quando ocorrer umresultado da amostra controle excedendo o limite de+- 3s deve-se rejeitar os resultados e procurar oerro ao acaso. Diagnosticar, resolver o problema e

repetir as análises dos testes e das amostrascontrole. fazer nova interpretação.

1:2s- uma observação exceder a média 2s : éconsiderada uma regra de alerta. quando ocorrerum resultado da amostra controle excedendo olimite de +-2s procurar erro ao acaso e repetir abateria de análises. interpretada como um aviso depossíveis problemas sem a necessidade derepetição da bateria de exames.2:2s duas observação consecutivas do controleexcedem a média + 2s ou a média 2s : é umaregra de rejeição de resultados. quando foremencontrados 2 resultados da amostra controleexcedendo o limite de +- 2s, deve-se rejeitar osresultados, repetir a bateria de analises e procurarerro sistemático.R:4s – uma observação do controle excede amedia e o seguinte exceder a média-2s : étambém uma regra de rejeição de resultados.quando for encontrado num dia 1 resultado daamostra controle excedendo o limite de +2s e no diaseguinte o resultado exceder também o limite de 2sou vice-versa, deve-se rejeitar os resultados, repetira bateria de análises e procurar erro ao acaso.4:1s- quatro observações consecutivas docontrole excedem a média +1s ou a média 1s :regra de rejeição. Quando forem obtidos4resultados consecutivos da amostra controleexcedendo o limite de +-1s, devem-se rejeitar osresultados, e procurar erros sistemáticos.10: média – dez observações consecutivas docontrole estão do mesmo lado da média (acimaou abaixo): regra de rejeição. quando foremobtidos 10 resultados consecutivos da amostracontrole de um só lado da média (abaixo ou acima)deve-se rejeitar os resultados, e procurar errossistemáticos.

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ERROS EM EXAMESErros na etapa pré-analítica

1. Erros na solicitação do exame : escrita ilegível,interpretação errado do exame, erro naidentificação do paciente, falta de orientação porparte do médico ou do laboratório paradeterminados exames;

2. Erros na coleta da amostra : identificaçãoerrada do paciente, trocas de amostras;

Paciente não preparado corretamente: falta de jejum, horário da coleta incorreta, tempo decoleta de amostra de urina incorreta;

Uso de anticoagulante errado, volume daamostra, inadequada para os exames;

Hemólise e lipemia intensa estarãoprolongadas;

Transporte e armazenamento da amostraincorreta;

Contaminação de tubos, frascos e tampas.

Erros na etapa analíticaTroca das amostras;Erros de pipetagem: pipetas não aferidas,milhadas, volume incorreto;Reagentes e padrões: contaminados, malconservados, com validade vencida, erros nopreparo dos reagentes, concentração errada;Presença de interferentes na amostra:medicamentos, lipemia, hemólise, icterícia;Equipamentos : não calibrados (erros no protocolode automação, cubeta, comprimento de ondaerrado;

Erros nos cálculos de concentrações, nas unidades,não são considerados diluições.

Erros na etapa pós-analíticaIdentificação errada do paciente, transcrição dedados incorretos, resultado ilegível, unidadeserradas, não identificação das substânciasinterferentes. Especificidade e prescrição do testenão adequada. Erros na interpretação dosresultados.

COLETA DE SANGUEÉ de alto valor para o diagnóstico e tratamento de

vários processos patológicos. O sangue é

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constituído de elementos sólidos (célulassanguíneas ), substâncias líquidas ( soro, plasma )e elementos gasosos ( 8O e CO2). Os materiaisusados para a coleta de sangue são importantes,pois, auxiliam num melhor resultado dos exames aoreduzir a ocorrência de erros na coleta e podem serfatores de interferência na fase pré-analítica. Érecomendado o uso de sistemas fechados,composto por um dispositivo que permita aaspiração, usando agulhas de duas pontas que seconectam ao tubo de análise para onde o sangue édrenado. As vantagens do uso do sistema fechadopara coleta são:

Facilidade no manuseio: o tubo para coleta contémvácuo calibrado, que está relacionado com aproporção entre a quantidade de volume do sanguecoletado com anticoagulante;

Segurança e conforto do paciente; Segurança ao profissional da saúde: minimizam os

riscos de contaminações, uma vez que o sangueentra diretamente no recipiente de coleta.

TUBOS A VÁCUOSão de uso único, devem ter seu interior estéril epossuir vácuo calibrado, com quantidade deanticoagulante proporcional ao volume de sangue aser aspirado.

Análise bioquímica e sorológica (tuboamarelo)

Nesse tipo de análise deverá ser colhida umaamostra de soro. Esta será obtida através da coleta

em tubo sem anticoagulante para que ocorra oprocesso de coagulação. Essa coleta deve ser feitano tubo de tampa amarela com gel. Este tubocontém ativador de coagulo, e deve-se,homogeneizar o tubo por inversão de 5 a 8 vezespara evitar hemólise, manter em repouso naposição vertical por 30 minutos para retrair ocoágulo e seguir a centrifugação a 3.000 rpmdurante 10 minutos.

Análise hematológica (tampa roxa)Nessa análise, deverá ser colhida uma amostra de

sangue total. Esta será obtida através da coleta emtubo de EDTA de tampa roxa . Ele contémanticoagulante especifico para evitar a coagulação.

Análise glicêmica (tampa cinza)Nessa análise, deverá ser colhida uma amostra deplasma. Esta será obtida através da coleta em tubocom a tampa cinza . Este tubo contém fluoreto desódio com EDTA, o sangue colhido comanticoagulante deve ser cuidadosamentehomogeneizado, para evitar hemólise e a

coagulação do sangue. Colhe-se por punçãovenosa o frasco a vácuo que punciona a veia comseringa e coletar 3 ml de sangue.

Análise de coagulação (tampa azul)Nessa análise, deve ser colhida uma amostra deplasma. Esta será obtida através da coleta em tubo de

tampa azul com citrato. Este tubo contém citrato desódio, o sangue colhido com anticoagulante deve sercuidadosamente homogeneizado, para evitarhemólise e a coagulação do sangue.

Tabela 1: as cores indicam o tipo de coagulante ou detratamento que o tubo recebeu.

Tabela 2: tu bo s a vácu o: ( a ) EDTA ; ( b ) hep ar in a; ( c ) fl uo re to ; ( d )citrato; ( e ) nen hu m .

HEMOGRAMAHemograma é um exame que avalia as célulassanguíneas de um paciente. Ou seja,O hemograma

Cores Aditivo Mecanismode ação

Amostra Aplicação

T. Azul

Citrato Liga20CaSanguetotal ouplasma

Exame decoagulação.

T.Vermelha

Com ousem

ativadorde

coagulo esem gel

separador.

O ativadoracelera a

coagulaçãoSoro

Examessorológicos,bioquímicos

ehormonais.

T. Amarela

Com ou

semativadorde

coagulo esem gel

separador.

O ativadoracelera acoagulação

Soro Examessorológicos,bioquímicos

ehormonais.

T. Verde

Heparina Inibe

trombinaSanguetotal ouplasma

Examesbioquímicos.

T. Roxa

EDTA Liga20CaSanguetotal ouplasma

Examesbioquímicos.

T. Cinza

Fluoreto/EDTA

Inibe adegradaçãoda glicose

PlasmaExames deglicose elactato.

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é o conjunto de análise de parâmetro quantitativo emorfológicos das células sanguíneas, composto deEritrograma, Leucograma e contagem de plaquetas. A determinação dos vários parâmetros quecompõem o hemograma pode ser feita de duasformas: Manual; Automatizada.

Método manual A contagem de células é realizada diluindo-se osangue e depositando-se a diluição numhemocitometro ou camada de contagem de células(câmara de Neubauer), as contagens sãorealizadas num ou mais retículos, específicos paracada elemento figurado e os resultados expressosem número de células mm cúbico, em unidadesconvencionais, ou litros, no caso de unidadeinternacionais.Dosagem de bilirrubina : o sangue é diluído numasolução com cianeto de potássio e ferrocianeto depotássio, que converte a hemoglobina emcianometahemoglobina. A seguir, a absorbância dasolução é medida em espectrofotômetro, emcomprimento de onda de 540nm e a dosagem dahemoglobina obtida pela comparação da absorçãoda solução frente a uma curva de calibração. Oresultado é expresso em g/dl ou d/l.Hematócrito : é medido, manualmente, pelacentrifugação, de um tubo capilar com o sanguetotal do paciente. Após a centrifugação, a altura dacoluna de eritrócitos compactadas é medida e

comparada com a altura da coluna do sangue total,agora separada em três camadas eritrócitos,leucócitos, plaquetas e plasma. O percentual dovolume ocupado pela coluna de eritrócitos é o valordo hematócrito expresso em percentual ou emfração do volume total.

Fig ur a 1:rep res entação d a cen tri fug ação d o s ang ue t otal par aob tenção de hem atócr ito . ( a ) m en is co; ( b ) p la sm a; ( c ) p laquet ase leucócitos; ( d ) hem atóc ri to s .

Métodos automatizadosO hemograma é realizado em equipamentosautomatizados, que apresentam grande exatidão,

precisão e rapidez para a contagem de células, aimpedância elétrica foi o primeiro método a sermuito usado, até os dias de hoje. O método ébaseado na resistência que os eritrócitos eplaquetas impõem a condução de uma correnteelétrica entre dois eletrodos mergulhados, numasolução eletrolítica, há um eletrodo no interior deum tubo com uma pequena abertura que secomunica com o recipiente onde está a solução naqual se pretende contar as células.Se nenhuma célula há na abertura do tubo, acorrente elétrica se faz sem obstáculos entre doiseletrodos. Entretanto, se há alguma célula naabertura do tubo, ocorre uma oposição ao fluxo docorrente elétrica.Os analisadores hematológicas contam com umsistema de tubos internos e câmaras. Para que ascélulas sejam contadas, o sague diluído contidosnas câmaras é aspirado para dentro do tubo, deforma que se faz um fluxo de um volume pré-determinado da diluição contida na câmara paradentro do tubo. Durante esse fluxo, todas ascélulas que passam pela abertura do tubo gerampulsos de resistência elétrica, que não só sãocontados, permitindo a quantificação das células,mas também avaliados pela magnitude, fornecendoa determinação de volume da célula que passoupelo tubo de abertura.

Contagem de eritrócitos e plaquetasRealizados num único sistema, isto é, num mesmotubo e câmara do equipamento. O sangue é diluído

com solução isotônica, portanto, incapaz depromover a lise dos eritrócitos, na câmara dediluição, e a diluição aspirada. Todas as partículascom volume de 1 ou 2 a 20 fenolititros Fl. Sãocontados como plaquetas e aqueles com volume de35 ou 50 a 200 Fl, como eritrócitos. Esse métodopermite, a construção de histogramas, gráficos quedemonstram a distribuição da frequência dascélulas quanto ao tamanho.

Figura 2: histogr ama de eritrócitos e plaquetas, demons trandomicrocitose.

Dosagem de hemoglobinaÉ realizada a partir da diluição feita, para acontagem de leucócitos, por método colorimétrico,

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após diluição do sangue com solução que lisa oseritrócitos e conversão da hemoglobina emcianometaglobina.

Figura 3: histogr ama de eritrócitos e plaquetas, demons trandoplaquetas gig antes.

Contagem global de leucocitosÉ realizada no sangue diluído e hemolisado. Acâmara onde ocorreu hemólise segue-se um tubopelo qual a solução é aspirado. Por impedânciaelétrica, as células com volume entre 35 e 450fl sãocontados como leucocitos alguns equipamentos quenão dispõem dicitometro de fluxo usam o volumedos leucocitos para fazer uma contagem diferencialem três grupos: Linfócitos; Monócitos; Eosinófilos; Basófilos; Neutrófilos.

Essa contagem de três partes é muito inferioràquela realizada pelos analisadores hematológicos,que exigem sempre a contagem manual deleucocitos pelo exame do esfregaço sanguíneo. Acontagem diferencial de leucocitos é realizada porum ou mais dos seguintes métodos, pelosdiferentes equipamentos disponíveis.

Figura 4: representação esquemática da separação dosleucócitos por citometria de fluxo.

Absorção da luz : alguns analisadoresassociam a dispersão da luz um segundo canal,com uma reação citoquimica na qual aperoxidase de neutrófilos, eosinófilos emonócitos é detectada;

Condutividade elétrica : os granulocitos sãoidentificados pela condutividade de umacorrente elétrica de alta frequência: Impedância elétrica;

Radiofrequência; Fluorescência do DNAERITROGRAMA

Diante de um ou mais sintomas de anemia, deve-seavaliar o número de glóbulos vermelhos, a taxa dehemoglobina e o hematócrito. Se a taxa dehemoglobina for inferior a 12g/100ml para o

homem, 11g/100ml para mulher e criança, éindicado um hemograma completo, para avaliar asérie vermelha e branca, pelo índice eritrocitáriopodemos determinar a hemoglobina média dosglóbulos (relação entre a hemoglobina e o númerode glóbulos HbCM), o volume médio dos glóbulos(relação entre o hematócrito e o número de glóbulosvermelho VCM) e a concentração média dahemoglobina nos glóbulos (relação entre ahemoglobina e o hematócrito CHbCM), quepermitem distinguir as anemias hipocrômicas dasnormocrômicas.

Índices eritrocitométricos A faixa normal da quantidade de eritrócitos para umhomem adulto normal é de 4,5 a 6,5 milhões pormm3, e para a mulher é de 3,9 a 5,6 milhões pormm3. A hemoglobina (Hb) e o hematócrito (Ht)variam conforme a idade, o sexo, a altitude do local,etc. A hemoglobina é medida em gramas pordecilitro (g/dl) e representa a quantidade daproteína por unidade de volume do sangue. Ohematócrito representa a proporção dos eritrócitosno total do sangue é medido em porcentagem ( %).Com o resultado obtido do número de eritrócitos, dahemoglobina e do hematócrito, podemos calcularoutras médias ou índices chamadoshematimétricos, como: Volume Corpuscular Médio (VCM) tamanho da

hemácia: Hemoglobina Corpuscular médio (HbCM) cor da

hemácia, e a concentração da hemoglobina

corpuscular média (CHbCM).O volume corpuscular médio é a relação que existeentre o volume globular obtida e o número deeritrócitos. O resultado obtido é dado em micracúbicos (μ 3). A hemoglobina corpuscular média é dada pelarelação entre o valor da hemoglobina obtida emgramas por 100dl e a contagem dos eritrócitos. Oresultado é em pictogramas ( pg) ou micrograma(μ g). A concentração da hemoglobina corpuscular médiaé calculada pela ação entre a hemoglobina obtida

em glicosídeo volume globular. O resultado obtido édado em porcentagem ( %). A medida do valor da hemoglobina é o exame maisimportante para se avaliar a série vermelha.Quando os valores da hemoglobina estiveremabaixo dos valores normais, pode se diagnosticaruma anemia.Os valores da hemoglobina superiores aos normaisquando acompanhadas por aumento de eritrócitospermitem diagnosticar uma policitemia. A análise do número de eritrócito, hematócrito e asvárias relações entre eles fornecem os chamadosíndices hematimétricos que permitem interpretarpelos valores encontrados no hemograma asvariações da série vermelha.

O VCM é importante para definir se a anemia épredominantemente de eritrócitos de pequenovolume, isto é, microcitica ou de grande volume,macrocitica.

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A HbCM se refere à quantidade hemoglobina emcada eritrócito e fornece a informação do tipo deanemia: hipocrômicas, com pouca hemoglobina, ouhipercrômica, com muita hemoglobina. Aassociação da determinação do volume ehemoglobina de cada eritrócito fornece elementospara caracterização de certas anemias como amicrocistica hipocrômicas das deficiências de ferroe das talassemias.

Indivíduos Eritrócitosmilhões/mm 3 emoglobina(g/100dl) Hematócrito(%)Recém-nascidos 4-5,4 13,5-18,6 44-12%

Crianças(3 meses) 6,5-6,7 9,5-12,5 32-44%Crianças (2 anos) 6,0-6,7 11,0-35 36-44%

Criança (10-12anos)

6,5-6,7 11,5-14,5 3744%

Mulheres (gravidas) 3,9-5,6 11,5-16 34-47%Mulheres (não

gravidas)6,0-5,6 12-16,5 35-47%

Homem 6,5-6,5 13-3,30 40-54%Tabela 3: Valores normais para eritrócitos, hemoglobina ehematócrito.

Indivíduos VCM HbCM CHbCMCrianças (3 meses) 83-110 24-34 27-34.

Crianças (1 ano) 77-101 23-31 38-33.Crianças (10-12 anos) 77-95 24-30 30-33.

Mulheres 81-101 27-34 31,3-36.Homem 82-101 27-34 31,5-36.

Tabela 4: Valores norm ais para VCM; HbCM e CHbCM.

Volume Corpuscular Médio (VCM)É obtido dividindo-se o volume dos eritrócitoscorpuscular pelo seu número num dado volume desangue. A fórmula usada é a seguinte:

VCM= 10/ 3

Sendo VC o volume corpuscular e Hm ashemácias. O VCM do adulto oscila entre 76 a 96μ 3. Aos 3 meses seu valor encontra-se entre 83 e110µ3, caindo no fim do primeiro ano para 77 a101μ 3.

Hemoglobina corpuscular média (HCM)É o conteúdo de hemoglobina existente em cadaglóbulo. É obtido pela divisão da quantidade dehemoglobina pelo número de células em umaquantidade pré-determinada de sangue.O valornormal da hemoglobina corpuscular média oscilade 27 a 32.

HCM=

/ 3

Concentração da hemoglobina corpuscularmédica (ChCM)

Exibe a porcentagem eritrocíticahemoglobinizado.O limite superior é de 36% nível de saturação doglóbulo vermelho em hemoglobina. A formula paracalculá-lo é dividir a hemoglobina pelo volumecorpuscular numa quantidade conhecida desangue.

ChCM= ou Os valores normais oscilam de 30 a 36%.

RDW (red cell distribution width)E uma variação da distribuição dos eritrócitosquanto ao tamanho e reflete, de forma matemática,a diferencia do tamanho dos eritrócitos de umadeterminada amostra (anisocitose). Com resultadosde expressos em valores de referência de 11,5 a15,5% apresentam uso na classificação dasanemias e microcitica, já que, é maior nas anemiasferroprivas do que nas talassemias e anemias dedoenças crônicas ferroprivas do que nastalassemias e anemias de doença crônica suaeficácia na distinção dessa condições érazoavelmente baixa, mesmo quando se usam.Correlacionam RDW e VCM ou hemoglobina, isto é,não permite, por si só, classificar uma anemiamicrocitica como ferroprivas ou não e não dispensaa avaliação da cinético do ferro.

HematócritoÉ o volume da massa eritróides uma amostra desangue, expresso em porcentagem do volumedesta. Quando coletamos o sangue numanticoagulante e centrifugamos, temos separaçõesem duas camadas, uma plasmática e outra celular.O volume superior ficam concentradas as plaquetase leucocitos que perfazem 1% do volume e sãofacilmente diferenciados.

LEUCOGRAMAOs dados quantitativos dos leucócitos variam dentrode certos limites que devem ser estabelecidos como

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padrões normais para determinados agrupamentoshumanos. As modificações fisiológicas das fórmulasleucocitárias são discretas e estão relacionadascom condições como, idade, sexo, condição física eambiental.O número global dos leucócitos circulantes édeterminado pelo sangue colhido na veia. Aamostra de sangue é colhida, corada e diluída comlíquido própria para a contagem em câmara(Neubauer ). O resultado da contagem é expressoem número de leucócitos por mm3.Considera-se normal a quantidade de leucócitos de4000 a 10000 por mm3. Valores superiores a10000/mm3 são chamados de leucocitose einferiores a 4000/mm3 de leucopenia. A leucocitose reflete a resposta da medulaósseaàsgentes estimuladores da granulocitogêneseou da linfocitogênese, como, as infecções agudasbacterianas ou viróticas. As leucopenias quase sempre estão associadas àinsuficiência medular, condição em que há reduçãoda proliferação e maturação dos granulocitos damedula óssea.Quando há leucocitose, ocorrendo aumento dealgum leucócito, são chamados de: Neutrofilia: corresponde ao aumento dos

neutrófilos; Eosinofilia : indica o aumento dos eosinófilos; Basofilia : indica o aumento dos basófilos; Linfocitose : indica o aumento de linfócitos; Monocitose : indica o aumento dos monócitos;

Plasmositose : indica o aumento dosplasmócito. As designaçõesneutropenia, eosinopenia,monocitopenia e linfocitopenia indicam a diminuiçãodosneutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos,respectivamente. As infecções são as causas mais comuns de certasleucocitoses. De modo geral, as infecçõesbacterianas causam neutrofilia acentuada, comaumento de bastonete e desaparecimento doseosinófilos circulantes. Nestas condições podemosencontrar células jovens circulação, comometamielócitos, mielócitos e promielócito.Em condições normais estas células são restritas amedula óssea e só aparecem no sangue quando háum estímulo ou solicitação maior. Dá-se o nome dedesvio à esquerda quando tais células sãoencontradas na circulação.

Contagem diferencialÉ executada sobre o esfregaço sanguíneo,contando pelo menos 200 células nos quatro cantosdo esfregaço. Os neutrófilos e os monócitos

ocupam os bordos do esfregaço; os linfócitossituam-se no centro da lâmina. A porcentagem dosdiferentes tipos celulares é a seguinte, emcondições normais no adulto. Neutrófilos: 40 à 75% e 2500 à 7500/mm3 Linfócitos: 20 à 45% e 1500 à 3500/mm3 Monócitos: 2 à 10% e 200 à 800/mm3 Eosinófilos: 1 à 6% e 40 à 440/mm3 Basófilos: 0 à 1% e 0 à 100/mm3

Esfregaço sanguíneoEm análise de rotina de uma amostra de sangueinclui a determinação de valores físico-químicos, ereconhecimento de células na contagem de célulase a observação microscópica dos elementosparticulados.Existem duas técnicas que comumente se usampara visualizar amostras de sangue periférico: aprimeira envolve a observação de sangue fresco e asegunda envolve a preparação de extensões de

sangue em uma camada delgada. Para prepararuma amostra de esfregaço sanguíneo coloca-seuma gota de 2 a 3mm de diâmetros, colocandooutra lâmina sobre a amostra movendo-se com omovimento firme e rápido num ângulo de 45º grausem relação a primeira lâmina. Imediatamentedeixa a lâmina secar em temperatura ambiente.

Fig ur a 5: técn ic a d e pr epar ação d e es fr ega ço san gu íneo par aleitura. ( a ) cab eça; ( a1 ) zo na de li nfóc it o ; ( b ) corpo; ( b1 )trajetória; ( c ) calda; ( c1 ) zo na de neu tr óf il o e m onó cit os .

Coloração A coloração de May-Grunwald-Giemsa é uma dascolorações mais usadas para esfregaçossanguíneos. A tinta básica contém azul de metilenoe eosina. Este tipo de coloração é chamado decoloraçãopanótica, pois colorem tanto os elementosbásicos como os ácidos que se encontram noesfregaço.O azul de metileno é um componente básico quetinge estruturas ácidas da célula de uma coloraçãoazul-violeta; a eosina e o azul de metileno sãocompostos ácidos que tingem estruturas alcalinas,tingindo-as de roxo-alaranjado e roxo-violeta,respectivamente.Uma vez tingida amostra, se podeobserva-las num microscópio com objetivas depouco aumento (40X) para ter uma ideia global doaspecto das células.

IMUNOLOGIAOs testes sorológicos são todos os ensaioslaboratoriais que envolvem uma reaçãoimunoquímica de ligação de moléculas deanticorpos a um ou mais determinantes antigênicos,levando à formação de imunocomplexos , isto é,complexos antigenos-anticorpo .

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Na prática do laboratório clinico, o teste sorológicopode ser usado tanto na procura de antígenosquanto na procura de anticorpos.Os diferentes tipos de reações sorológicas sãonomeados em função dos princípios usados nadetecção do imunocomplexo formados. Assim,temos a precipitação , em que antígenos eanticorpos solúveis são insaturados e ao reagirementre si formam um precipitado insolúvel que podeser visualizado, na aglutinação , outra reaçãoimunológica clássica, um ou ambos em suspensão,que são aglutinadas quando da formação dosimunocomplexos.Na floculação , técnica usada na reação de VDRL,o antígeno usado, um composto de cardiolipina-lectina-colesterol, não se encontra sob a forma departículas, mas, por sua composição lipídica,também não é solúvel. Assim, cunhou0se o termofloculação para a reação que se forma quando dacombinação de anticorpos séricos com o antígenoVDRL, uma vez que flocos são visualizados.Outros métodos sorológicos envolvem umasegunda etapa, na qual um segundo anticorpo, anti-imunoglobulina humana, encontra-se conjugadocom algum marcador que pode ser detectado pordiferentes maneiras. Nas técnicas deimunofluorescencia, o marcador usado é a moléculade isotiocianato de fluorescência que quandoexcitada pela luz ultravioleta, emite uma coresverdeada, que é visualizada num microscópioapropriado. Já nas técnicas imunoenzimáticas,usam-se compostos enzimáticos e seus respectivossubstratos para a pesquisa do imunocomplexo. Areação final é mensurada por umespectrofotômetro, que avaliará a mudança de corda solução do substrato.

TERMOSAfinidade e avidez

Afinidade: medida da força de ligação entre umsítio de combinação de anticorpos e umdeterminante antigênico.Avidez: é a somatória das afinidades individuais eda proporção de cada anticorpo num sistema

policlonal (amostra de soro), que contem anticorposde diferentes afinidades para um antígeno. Emtestes imunoenzimaticos, a avidez pode ser aferidapela eluição dos anticorpos de menor afinidade pormeio de uso de agentes caotrópicos que desfazemas reaçoes antígeno-anticorpo de baixa afinidade.

Anticorpos policlonais e monoclonais Anticorpos podem ser usados como ferramentaspara o reconhecimento de moléculas antigênicasespecificas com grande precisão e podem serinduzidos artificialmente. Dependendo da forma deobtenção, e consequente clonalidade, sãoclassificados em policlonais ou monoclonais. Anticorpos policlonais : entende-se por

anticorpos policlonais o conjunto de anticorpos

isolados a partir do soro de animais, obtidosapós a imunização com preparação antigênicapurificada. Apesar de ser uma mistura deanticorpos de diferente especificidadeindividuais. Provenientes de distintos clones delinfócitos b responsivos ao mesmo antígenoapresentam alta especificidade devida aosprocessos de purificação realizados após a suaobtenção. Podem ser produzidos em grandequantidade e são amplamente usados emdiferentes testes sorológicos.

Anticorpos monoclonais : são obtidos a partirda fusão de linfócitos B esplênicos de animaisimunizados com células humanas de mielomamúltiplo, que consistem em plasmócitosmonoclonais com taxa de divisão maior que a deplasmócitos normais e intensa produção deimunoglobulinas. O hibridoma resultante émantido em cultura e seus sobrenadantescontem anticorpo de um único tipo, provenientede um único linfócito B, daí o nome monoclonal.

MÉTODOS SOROLÓGICOSMétodo de aglutinação

Pode ser realizados em tubos ou em placas, um oudois componentes da reação antígeno-anticorpodeve estar fixado na superfície de partículasinsolúveis. Após a formação de agregados, aintensidade da reação poderá ser medidaconsiderando-se o tamanho final dos agregadosformados, podendo variar desde negativo, naausência de agregados, até fortemente positiva, na

presença de agregados maiores. Vários fatoresinterferem na aglutinação, como a classe a quepertence o anticorpo pesquisado (a IGM, por suaestrutura pentamérica e presença de 10 sítio deligação ao antígeno, é 750 vezes mais eficientes emaglutinar partículas que IgG), concentração deeletrólitos, pH (6-8), tempo de incubação antígeno-anticorpo e temperatura.

Tab ela 5: m éto do de agl ut in ação em pl aca : ag lu ti nação d aspartículas égradu ada de negativ a a intensa, depend endo dafor m ação de g rum os . ( 1 ) an tíge nos e o u an ti corpo s p ar ti cu ladossão adic ionad os e mis turado s. ( a ) ag lu ti nação in te nsa; ( b )agl ut in ação fr ac a; ( c ) au sência de ag lu ti nação.

Caso os determinantes antigênicos sejamconstituintes de estruturas naturalmente insolúveis,

como bactérias, protozoários, fungos ou hemácias,a reação é chamada de aglutinação direta . Égeralmente usada para a detecção demicrorganismo ou de antígenos eritrocitários, apartir do uso de anticorpo específico.Se o método precisar da fixação artificial de algumdos dois componentes da reação antígeno-

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anticorpo na superfície de partículas insolúveis(látex), ele é chamado de aglutinação indireta oupassiva . Os testes de aglutinação são examinadosa olho nu, após período de incubação curto, emgeral menor que cinco minutos.

Fig ur a 6: ag lut in ação i nd iret a: p artícu las ou célul as s ens ibi lizad assão ag lutin adas p or ação d e antic orp os, f orm ando grum osvi sívei s. ( a ) par tícula car read ora; ( b ) an tígen os solúvei s ; ( c )partículas sens ibili zadas; ( d ) par tícu la s sen s ib i li zadas ; ( e )ant icorpos; ( f ) ag lu ti nação vis ível .

TESTE DE FLOCULAÇÃO

Aglutinação de cristais de colesterolNo caso da reação VDRL Veneral Diase ResearchLaboratory , não são usados partículassensibilizadas e sim suspensão antigênicasalcoólica de cardiolipina juntamente com cristais decolesterol com lecitina. Trata-se de um método depesquisa de anticorpo anticardiolipina que estãopresentes em diferentes situações clinicas,especialmente na sífilis, no lúpus eritematososistêmico e na síndrome antifosfolipide.Os anticorpos anticardiolipina presentes no soroformam imunocomplexos com a cardiolipina que

são precipitados sobre os cristais de colesterol, quesão refringentes. A leitura do teste é feitamicroscopicamente, sendo positivo quando háformação de flocos refringentes e negativo quandose apresenta homogêneo e sem agregados.

ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS (ELISA)São usada marcação de anticorpos com enzimas ea leitura se faz pela medida da ação enzimáticasobre o substrato cromogênico, legando à mudançade cor da solução. As enzimas mais usadas comomarcadores no ELISA são peroxidase e fosfatasealcalina. Podem ser qualitativos , quantitativos ousemiquantitativos . Nos ensaios de quantificaçãode antígenos, uma curva-padrão é traçada a partirde diferentes amostras de referencia contendoconcentrações conhecidas do antígeno. Na

pesquisa de anticorpos, cujas concentrações sãomais variáveis, a quantificação ousemiquantificação envolve estabelecimento de umlimiar de afinidade ou ponto de corte, acima do qualos valores serão considerados positivos.

Método imunoenzimáticos para detecção deanticorpos

Os ensaios de detecção de anticorpos solúveispodem ser conduzidos por dois métodos: Indireto;

Captura dos anticorpos IgM.no método indireto, microplacas de poliestirenocontendo vários pequenos poços são sensibilizadascom preparações antigênicas. Amostras de soro emdiluições recomendadas pelos fabricantes sãoincubadas por períodos preestabelecidos parapermitir a reação dos anticorpos presente naamostra com o antígeno fixado na microplaca. Apóslavagem dos poços, um preparado de anticorposanti-imunoglobulinas humanas conjugadas comenzimas é adicionado. Esse conjugado anti-imunoglobulina reage com o anticorpo capturadopelo antígeno da gase sólida e a reação é reveladacom adição do substrato especifico para a enzimausada. Em casos de reações positivas, ocorremudança de cor na solução e a intensidade da cor éestimada colorimetricamente, sendo proporcional àconcentração do anticorpo pesquisado.caso o anticorpo a ser pesquisado seja da classeIgM, é comum ocorrência de resultados falso-negativos ou falso-positivo. Por isso, usa-se o

método de captura de anticorpos IgM. Nesse teste,a fase sólida é sensibilizada com anticorposanticadeia pesada da IgM. Os soros em teste sãoincubados, capturando todos os IgM da amostra. aseguir, incuba-se com antígeno solúvel eposteriormente com preparações de anticorposespecíficos para o antígenos, marcados comenzima. Como nos demais testes. Após lavagemdos poços para retirada dos componentes nãofixadas, o substrato enzimático é adicionado e aintensidade da cor é lida em espectrofotômetro,sendo diretamente proporcional À concentração do

anticorpo (IgM).

Medida da avidez de igGEm algumas situações clínicas, principalmente nodiagnóstico de infecções em gestantes, é precisoser útil a medida da avidez das IgGs séricas pelosantígenos. Sabemos que IgGs mais recentesapresentam menos avidez que os produzidos amais tempo. Assim, a avaliação da avidez das IgGscirculantes pode contribuir para considerar oprocesso infeccioso como agudo ou não. A técnicaenvolvida na medida da avidez envolve a realizaçãodo teste imunoenzimático em duplicata. Um teste érealizado de forma convencional, enquanto no

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outro, é acrescentada uma etapa de adição desolução que favorece a dissociação doimunocomplexo. Quanto maior a estabilidade dainteração antígeno-anticorpo, maior resistência àação da solução dissociante. A medida do índice de avidez é feita pela razão:

Leitura do teste com solução dissociante/leitura do teste convencional .

Se o índice (razão x 100) for maior que 60%,admitimos-se alta avidez. Se inferior a 30%considera-se baixa avidez. Valores intermediáriossão inconclusivos.

Método imunoenzimáticos para detecção deantígenos

Os ensaios imunoenzimáticos para pesquisa deantígenos podem ser conduzidos por métodos decaptura, de competição com anticorpo marcado ede competição com antígeno marcado.O método de captura é o mais adotado parapesquisa de antígeno polivalente. As placas (fasesólida) são sensibilizadas com anticorpo especificopara o antígeno a ser testado. Após incubação daamostra com a fase sólida, lava-se o sobrenadante. A seguir, incuba-se novamente com anticorpoespecifico marcado com uma enzima. Faz-se asegunda lavagem. A reação é revelada com aadição de um substrato e a atividade enzimáticafinal é diretamente proporcional à concentraçãoinicial do antígeno na amostra testada.No método de competição com anticorpomarcado , a fase sólida é sensibilizada comantígenos. Adiciona-se a amostra teste e anticorposmarcados com enzima.Os anticorpos se ligam tanto aos antígenos daamostra, quanto aos da fase sólida. A densidadeóptica encontrada é inversamente proporcional àconcentração inicial do antígeno na amostratestada.No método de competição com antígenomarcado , a fase sólida também é sensibilizada comanticorpo especifico para o antígeno a ser testado. Adiciona-se a amostra teste e o conjugado(antígeno-enzima). A densidade óptica encontrada

é inversamente proporcional à concentração inicialdo antígeno na amostra. Vantagens : sensibilidade e especificidade

elevadas, rapidez, precisão, estabilidade dosreagentes, objetividade da leitura e possibilidadede automação.

Desvantagens : a atividade enzimática pode serafetada por constituintes plasmáticos.Comparada com os radioimunoensaios, amensuração da atividade da enzima pode sermais complexa e com menos sensibilidade doque a mensuração dos radioisótopos.

Aplicação : o método de ELISA é o mais usadona prática da soroimulogia laboratorial. Suaproliferação pode também ser atribuída ao usode anticorpos monoclonais e antígenosrecombinantes específicos.

Reação de Western-BlotÉ um método sorológico no qual é possívelidentificar as frações do preparado antigênicoreconhecidos pelos anticorpos do paciente. Osanticorpos dos pacientes eram incubados comhomogeneizados antigênicos, geralmentecomplexos, compostos de vários componentesproteicos. Para a técnica de Western-blot, apreparação antigênica é previamente submetida àeletroforese em gel de poliacrolamida, de altadefinição, a fim de separá-la em diferentes bandas,de acordo com seus tamanhos e cargas.Posteriormente, todo o conteúdo proteico presenteno gel é transferido para a folha de nitrocelulose,mantendo-se conservado o perfil eletroforético.Dessa forma, a folha de nitrocelulose contém opreparado antigênico apresentada sob a forma debandas proteicas individualizadas. Essa fita denitrocelulose sensibilizada é submetida a umprocesso semelhante ao da reação de ELISA. Istoé, após ser incubada com soro diluído do paciente elavada, é reincubada com anticorpos anti-imunoglobulina humana marcados com enzima.Substrato cromógeno adequado é adicionado e, aosofrer ação da enzima, muda de cor e colore asbandas nas quais houve reconhecimento pelosanticorpos do paciente. A reação de Western-Blotfoi e ainda é amplamente usado na confirmação dodiagnóstico da infecção pelo HIV.

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