7
13 PENDAHULUAN Embryonic stem cells (ESC) adalah sel yang belum berdiferensiasi yang dapat diarahkan untuk membentuk berbagai tipe sel. Dibandingkan dengan jenis stem cell yang lain, ESC memiliki karakteristik yang unik yaitu dapat memperbanyak diri selama periode yang panjang dan pada kondisi kultur tertentu dapat diinduksi untuk berdiferensiasi menjadi semua tipe sel tubuh (Czyz et al. 2003), seperti sel syaraf (Bouhon et al. 2005, Zhang et al. 2006), sel pankreas (Roche et al. 2005), sel jantung (Kanno et al. 2004, Guo et al. 2006, Hong et al. 2007), sel ginjal (Kim & Dressler 2005), otot, sel darah, sel tulang dan sebagainya (Boheler et al. 2002). Berdasarkan sifat tersebut, ESC dapat digunakan untuk terapi regeneratif melalui Produksi Embryonic Stem Cells dari Inner Cell Mass Blastosis yang Diisolasi dengan Metode Enzimatik dan Immunosurgery (PRODUCTION OF EMBBRYONIC STEM CELLS FROM INNER CELL MASS OF BLASTOCYST ISOLATED BY ENZYMATIC AND IMMUNOSURGERY METHODS) Thomas MataHine 1 , Iman Supriatna 2 , Dondin Sajuthi 2 , Arief Boediono 3 1 Laboratorium Reproduksi dan Kesehatan Hewan, Jurusan Produksi Ternak, Fakultas Peternakan, Universitas Nusa Cendana, Kupang Telp. 08219296248. E-mail: [email protected] 2 Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor 3 Laboratorium Embriologi, Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor ABSTRAK Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan metode isolasi inner cell mass (ICM) yang lebih efektif dalam memproduksi embryonic stem cells (ESC). Penelitian ini menggunakan embrio yang berada pada stadium blastosis yang dipanen dari mencit DDy. Zona pelusida blastosis dilisiskan dengan 0,25% pronase, isolasi ICM dengan metode enzimatik atau immunosurgery, dan kultur dalam Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) yang disuplementasi dengan mercaptoethanol, gentamycin, fetal bovine serum (FBS), dan sel kumulus digunakan sebagai feeder layer. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode immunosurgery menghasilkan attachment rate dan tingkat pembentukan koloni primer ESC yang lebih tinggi (P<0,05) yaitu 93,85% dan 43,08%, daripada metode enzimatik yaitu 79,63% dan 18,52%, tetapi viabilitas ICM pada kedua metode isolasi tidak berbeda (P>0.05) yaitu 93,59% pada metode enzimatik dan 98,56% pada metode immunosurgery. Dari hasil penelitian tersebut dapat disimpulkan bahwa metode immunosurgery lebih efektif untuk isolasi ICM dan produksi ESC daripada metode enzimatik. Kata kunci: Embryonic stem cells, inner cell mass, enzimatik, immunosurgery ABSTRACT The objective of the research is determining the ICM isolation method to produce ESC. Blastocyst stage of DDy mice embryos were used in this study. Zona pellucida of blastocysts were removed by 0.25% pronase, the ICM isolation were done by enzimatic or immunosurgery method, and then they were cultured in DMEM-high glucose supplemented with mercaptoethanol, gentamycin, fetal bovine serum, and cumulus cells as feeder layer. The result of the research indicated that immunosurgery method yielding attachment rate and number ESC colony 93.85% and 43.08%, respectively, higher (P<0.05) than enzimatic method that weree 79.63% and 18.52%, respectively, but the viability of ICM cells were equal (P >0.05) that are 93.59% in enzymatic method and 98.56% in immunosurgery method. This research concluded that immunosurgery more effective method for isolation of ICM and ESC production than enzymatic method. Key word: Embryonic stem cells, inner cell mass, enzimatic, immunosurgery Jurnal Veteriner Maret 2008 Vol. 9 No. 1 : 13-19 ISSN : 1411 - 8327

3. Mata Hine et al

  • Upload
    vannhu

  • View
    222

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: 3. Mata Hine et al

��

�����������

���������� � ������������������ ������������������������ ������������������������ ���������� ��������� ����� ������������������������������� � ��� �������������������� �������������� ��������� ������������������� ���������������������� ������������������������������������������������

������������������������������������������������������������� �� ������ !��������������� �����"����� � ���� � #�� $���� � ���� � %��� ������������&�'�� ������ #���������������(���� ������ )��*��� ������ %��+���� ������ ,������������(���-���������� #�������������������������������������� ���"����� ������ ���"����������� ������ ���������� ���� ��������������������� ������� �����������������

�������������������� �� ���������� �� ������� ���� �������������

�������� �������� ����� ���������� ��

�.&/�0�12/3�/4��5""&6/32���1�5���77��4&/5�233�&���77�58���/4"78�1/�6�1�2�/781���"6��3$65812��83��25503/�0&*�&6�5�1+/���

�� ��� � ��������� ������� �� ����������� ����������������������

�7������������&��������������(��������+�9����:�������.��������1�������4�������.�����������0��;��������3�������������(�����1���� <�=>�>%�)<���?���@�������������A ����'����

������������(������&��������������.�������4�������(����������+�9�����2��������.���������"����

�7����������������������������������8��������4������������4����������4�������(����������+�9����2��������.���������"����

�������

��������������� �������������� �������� ������� ������������������������� ���������������� ���������������������������������������� �������� ��������������������������������������� ��������� ����������������������� ���������������������� ����������������������� ��������������!"#���������� ������$�� ��� ������������������������ ���������������������������������������%�#&#'�������������� ��������������� �� ���������� �����������������������%()*'���������������������������������� ������� ������+�������� ������������������,���� ��������������������������������������������� ���� ������ ����������������&*"���������� ���� %�-����'��� ��./�0� �����1/��0 ����������� ������$�� ���� ��2.�3/ �����40��� �� � �5��� ���!"#������������� ���������� ������������%�6����'��� ��./��. ������� ������$�� �����.0��3 ������� ������������������������������� ��� ������ ���� �������������,���� ������������������������� ���� ���������!"#������������&*"���������� ������$�� ��

������ ��������������������������������������$�� ���������������

��������

��������� 5����� ���������������� ������� ���!"#����� ����� ���� ���������&*"��)��� ���� � �����������������������,����������� ���� ������������������������� ���� ��,��������5���������� �������� ���!"#����� ���,��������������$�� �������������������� ��������� ���� ����,������� �������#&#7������������������� ���, ������� �� ���������� ��������� �����5����������������������������������������������������� ���� ���������������� ��� �� ���������������� ������������ ������ �� �������������&*"��������./�0� �����1/��0 ������� 5�����������%�-����'� ������$�� ���� ��� �� �,������2.�3/ �����40��� ������� 5�������� � ���5��� �����!"#�������,�����8����%��6����'� �� ����./��. � �� ��$��� ���� ���� ���� .0��3 � �� ��������������� ����� ���� ��������� ���������� �� ����������������������� 5���� ������������ ������!"#�����&*"������ ��� ������$��� ���� ����

9���,���:�&��������� ����������������������������$�� ���������������

����������������� ��� ������������������������������������� �

Page 2: 3. Mata Hine et al

��

������������������������������������������������� ������������������������.���� ����� )��� ���� ����� ��� ����� ����� �9�����'������ ���� ���� ������ ����������������� ������������� ���� ����� ���������������� ������ %������������������������������������������������������������������������������������������B�����-�"������ #�7�� ������ %��

��������������������� � ��������2�5� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ���� ������������� 2�5� ������������ ����� ��������� ��������� ����������������������������������������1�������������� ���� ���� ��������� ��� ���������������� ����������������������������� ������������������+��������������5�������� %����������������9�������)%�����������������������������2�5���������������� ������������� ��>�����������=>�#,C��� �����������������������������������������������&����� �� ������������������ ���� ����������������������������� �������������������������� ����������������������2�5���������2�5�������������������������������������������������������������������

0����������9������������������������������������� ���� �������������������������������������������2�5��������������� ����� ������� ���������� ���� ���������������� ���� .���� ������� ������������������� �������� ���� ���������� ������������������� ������� ������ ���� �������������������������� �����������������������������������������������������������2�5������������������������������ ����������������������������2�5� ���������������������������� ����� �������� � ��� ������=>,#���.������������������������������������������������������'����������� �������?����������� ������������������������������������������������������������������� ������������ �����'������������� � ��������������2�5 ��������������������� ������������������������� �������� ����� (����� ������� ������������������������������� ��������������������������� 2�5������ ��?��� �������� ������������ ���������������������������������������

������������ ������������

������!�" ���� ��#�"�$�����%���&����� ���! ���������'�������������������

����� %?<�������� ���������� ������� ������������� ����� ��� #� 20��� �������� ��� ���������������� �.5�*D� 4������� 2����;���+��������������)<����������������������������#� 20��������������������������� ��*D��������2����;����+�������7��� ������ !��.������������������*����'����������������������9����������������'��������������������� ���������������������������������������������� ������� ����� =@=�� .���� ����� ����������� �� ��������� ����������� ������;������ �������� ������ ����������������������� �������� �����9������ .����� ������������������������������������������������*���������������������������� �� ������ �."�D� *��'��� �������� ����������������

���" ����'������� ���=#>� ������� ���������������

���������������������������������������� ��#C�������#��������������������������������������2������2�5��������������������������� ������������ ������������������������� ���������� ��&� 5������ ��������������������������������������������������������������������������� ��#C��� �����E � )C���18���������0�8��������= ����������� �������� �� ������������� ����� ���������������2�5��������?�������������5��������������� ��� ������������ ����������������� ��������� ������ ����� ��������������������������� �����������������0�8�������% ��������������� � �����������0�8�������! ����������������!,����'�'�������5�5�����= C�4"�������������� �������������� ���������������������2�5��������?�����������

#�"�����'��(����� 2�5���������������!��� ��

���� � ����� ��� �������5�5�?��������� ��������0�8��� �������������������������=C��� �� ���������������3�88D�*��'����� C����� ��;���� ������ �4"���*��'��� # � ����F�����'����� # � G�F�� �������� '���� �=��5���'������������������0�8������� � ���� � ������������������������������5������ ������ ,��

�;������;���������2�5���������������������� ��������� 2�5������ ���������� 2�5

��������� �������������

Page 3: 3. Mata Hine et al

��

��9������ ������� ������� �� ���� !!�#<?��������� ����� �+��'��?.2��� ������ = ������� �������������������� ��������������9������������ ���� � ���� 2���� ��� ������9����� ����� ������������ ��� ������������ ������ ���������� ���� ���9������������������������ ����������"����� ����� � �������������������� ����� 2�5� ��������������� � ���� �������������������������������� ������ ������� ���� ������������������� ����� 2�5� ���� ��������������������������������� ��������������� ���������� ���������� ������� �������������

��������������������

(������ ������� ��������� ����� ���������������������������������������9������ ����� ��������� ������� �������'����������������������B������������������������ ������ �������������� ��9�� ���������������������� ���������������������� �������������������� ���������������+�� �����������������9����'����������������������;������������������;������������������� ���������� ����� �������������� ��������� ������ �� �������� ������� ��� ���� ������������� ���� ����� �������� ������������������������������������������������������������������������������ ��������������9������������������������������# C�;��������������������������������������# �E�< C;������������������������������������������������������� ���������� ����������> C;����� �������� �*������ =���������?������ �������������������������������������������������������������������'��������������������� ���� �������� �� �������������������������

���������������������������������������������� ��#C�������!�������#������������������������������������������������������������ ��������� �������@� ��� ������� 2�5��������� ����������������������������������� �*������ �8?����� ��� ������� 2�5���������������������������� ����������� ����*��������?�*���������;��������������������������������������������������;����������� 2�5�� ������ �� ��� � ���� ��������������������������������

(� %�"�� ���'��;������;���������2�5����������������

������ ��������� 2�5������ ���������� 2�5��9������ ������� ������� �� ��� ##$%&��������������� �������= �������� ������������������� ���������������9����������� ���� � ���� 2���� ��� ���� ���9����� ���������������� ��� ����� �������� �����*�������+������������� �������9������������������������ ���������

H��������� 2�5� ���������� ��������� ��������� ���� ��������� ������� ���������������� ��� �><�#%C�� ���������� ����������� ���������������>!�#>C��B������������������'���������������;���������2�5���������������������������������������� ���������� �����.I � #���1����=��

B������� ;��������� 2�5�������� ����������������������������������������������������������� �������� ������������ ����������������������������������������������� ����������������������������������������������������������������+������������������������������ ����;���� ����������������� ��������������;����� ���� �������� �������� ��������������������������������9�������������� ���� ������� ����������������� 2�5�� :���9������������������������������������������ ����?������������ ����������'���������������������� �������������������������������������2�5����������������������������?���2�5�������� ����� �������� 2�5� �������� ����������������������������������?������������������ ����� 9����� ���������� ���� �������������������������� ������������� ��2�5�������������������?�������������������� �������9��������������� ���������������������������������������������������������������?��� ��������� ���������������� ��������������������2�5�������������� �����������������������������������������������2�5����������������������������������������������������� ��������� ��� ��9����������������������������������������� ���� ���������������������������

2������2�5������������������������� ��������������������9����������������������� ���������������������������������� � ������������������������������������������9��������2�5������������������'������������������������������������������������������% ������� ���� ����� ���� � ��� ������! �������:��������������������������������������� ����� % ������� �������� �������

����������������� ��� ���������������������

Page 4: 3. Mata Hine et al

��

��������� �������������

������� ������������������������������������������������������������������������������������������ ����!������������"�����������������������������������������������#!$���������������%����&���������'��(�)�

�����*� +�������������#!$�����������������,�������-��.�"/�������������� ����- �.��/����� �������������0,������������������������������������������������������������������!�"��#!$�������������������������&������1�������������������������������������2��������������#!$��������������������������0������&������3��#!$����������� ����������������2���0�������������������������������#!$���������������%����&���������'��(�)��

������� +�&���#!$����� 4!��������������������������#!$����������������������0*���������������������� 4!�������������������������0���������!��������� 4!������������0�������

Page 5: 3. Mata Hine et al

�5

��� ����������?������������ �������������������������������� � ������?��� ��������������� ���������� ��� ���� � ��� ������������������������?�����������������������������������������'���������������������������� ���������������������������+������������������������������������������������������������������ �� �����! ������������������������� ! ������� ����� ���� � �� �������-(��9��� =>,#���8��� �� ���������� ��������������������������������������������������������� � ��� ������������������������(��9��� ������������ ���������� ������� � ��������������������������������������������������������������������������� ���������������������������

"���������� ����������������������������� ���������� ��� ����@� =�� 9�������������� ��������������������������������������� � �� ����������������������������������;���������2�5������������(��9���=>,#���������� ��������������������� ���������'����������������������0�������������������������������������������������������)��= ��=%�������)������������������ ������������������������ � ���������! ����������?���������������� ��������������������� ������'���� ���������� ���������� 2�5� ������������������ ����� �������� ������ ���

�������������������������������������+��������������������� ��9�� ��������� �������������� �������� ����������9������������������������)������.�������������9����� ���� ���� ���� ����� �)� ���� �������������������������� 2�5� ������������������������������������������������'�9���������� 2�5� ������ ����������� ��'���������������������������� ���������������������� ������������������� ���� � ���������������������'�����������!�����������������������������2�5��������?�������������������� ������� ������ ��� ��������� ����������������������������������� �������������������� � ������������������������������ ������ )�� 2�5� ������ ������������������������������#���������������������������������� 2�5������ ����� ������ ����9����� ������������������

B�������������������������������� ������������������������������������������� ������������������������������������ ��������������������� ����������������"�������?��������� ������������������� ������������������'�� ���������� ���������������������� �� ����������� ���� ��� ���� ����� ��������� �������������������������������������������������������������������������������������������������'�'�������������

Metode Isolasi Jumlah embrio Attachment rate (%) Tingkat Pembentukan Koloni Primer ESC (%)

Enzimatik 54 43 (79.63 %)b 10 (18.52 %)b

Immunosurgery 65 61 (93.85 %)a 28 (43.08 %)a

�������� ������������������ ������������������������������������������������ ����������������������� �����

������������������������������������������������6�������������������������-+7(�(�/��������������

Metode Isolasi Jumlah ICM Total sel ICM Profil sel ICM

Hidup Mati Viabilitas (%)

Enzimatik 20 468 438 30 93,59a

Immunosurgery 20 487 480 7 98,56a

�����������������������������������������������6�������������������������-+7(�(�/��������������

%������ 8���������#!$���������������������������������,������������������� ���

����������������� ��� ���������������������

Page 6: 3. Mata Hine et al

�9

��������������� ����)$ ����%����$ ��#�"����������

B�������;���������2�5�������������������������������������������� ���������� ����� ���� �������� ������������ ������ �������*������ !�� � ����� 2�5� ������������ ����������������������� ����������������.J � #����������������������������"����� ����� �������������������������������������2�5� ������������������������������������ ����'�����������?�����������>!�<#C�����)!� <C����������� �.J � #������������� ���������� ����,>�%!C� ���� =<�#�C� �1���� ���� +�� ������������������� ��9�� ��������� ��������������������������2�5�������������������������������������������������������������� � ���� �������������� ���������������������� ���������������������������������������������������

������������ ����������� �������� ����� ������������������������������������������ ������� ���� ��������� ������������������������������������������������ ������ ������������������������������������2�5��������?�������������.�������������������� ������� ����������� �������� �������������������������������������������������������������������������������������������������'�����2�5������������������ ��2�5�������������������� �����������������������?���������������������������������������������������������;����������������������+����� ������� ����� ;��������� ������ �������9�����������������������'������������������������� ��'���������� ��������� ������������������������������2�5� ��������������������� �� ���� ��������� ������ �������� ������������� ���������� ������?��� 2�5������������������������ ��������������������������������������������� ����?���������������� ���������������� � ��������������������������������� ���

.�������������2�5�������������������������������������������������������������������������'�����������������������2�5�������?��� ��������� �*������ ����� .��������������� ����� ������� �������� �� ���� ������������������������������������?������������������������������������������������������ ��� ��������� ��'���� ���������.���������������������������������� ��������������� ������������ ��� ����� ������� ������ ���������������� ������������������������������?���2�5����������2�5��������������

������������������������ ������������������������ �������� ������ ���������������� 2�5�������?������������

��'���������������� ����� ������������������������������ ������� �����������������������������������������7�� ������� !������������������������������������������������������ ����������� �� ��� ����'����= C������������������������������������������%<C��+����������������������������������������������������������������������� ��������������

#���������

��������� ����������������������������9��������� ���������� ��� ���� �����������������������2�5��������?������������������������������� ��������������������������������������

�'����������#����K

.��������� ��������� ������"..���������2(12�KK����������������������������������������� ��� ������� ���������� ����� ��������� ��������� �������!� ��������� ��� 2�������.��������� "������ � 0����� ���� �����������'������ ������������ ������� ����������������� ��� ������ 7������������� 4(+� 2."��������������������������������������� �����������������������������

��*�������#�

"�����(&��:��� �����19�������+?1�6������H8������;�� ���� 85� B������ � ���������������������.�������������� ���'���������2����������� �' ���������' ��>=@=<>?� =�

"�����28��+�(����������������3��8����� #�3���������������������������������� ���'�����'������'���'� ���������������������' � ������� ���%<@�%�E,#�

�� ��:����B������8�&����'����.�" ��'�����5�����������85�B������� !��.�������������� ���'���������������'������;������������� ���!<)@=!>=?=) >�

*���L?5��6?��$����+?L��������?6�B������7���?7����� L?8� $����� �?5������� 7?$������+�:������:�7���6�����������L�6����� %�������������������������'�����'����������;�������������������� ���'������'��������������==!@���>?��!,�

+�������:(�(������:�"�������& ����+�7���

��������� �������������

Page 7: 3. Mata Hine et al

�:

:+�7���� � ,����;�������� ��� ����'����'�����'� ���������������������� ������������ ���'� ����� '����( � ����� ������� ������!)�@��#?�<�

(��������.(5�(����(�������:�7����1&�"�����77��������� )��3����'� �M���� ��'�������'������ ���������������������� ���'�����'��������)���"�������0�8�= =@=��,,E=��<=�

(������*&����������� #��3��������'���'����������������������������������������� ���'�����'����������������������*�"�����) ������=%@�!#�,E!#!)�

7��5����$�����6�+����7�:�����L�$���������B?+�B����� � !�� 2�������� ���� '������ ������ ���'� ����� '��� ����� ���'��������' ���������' �����! ���%#@)�>?)!)�

7���+�� :N�7������B���������5?1�3�� ����&(��������+���������B7�6�������+������ !��5�������������������������� ���������'�������;�����������������22���' ������ �� �����=@=#�?=%=�

7��:��&+�����:�"������?+�6�����5��� ����� %����������'������'��������������������� ���'������'��������)���"������0�8�= !@#%<<?#%>!�

5�������1��� %��.����������������������������� ��� � �� ����� ���� ����������������������������������������������������� ���� ���'� ����� '�����'���7�������.���������������5�����4������.�����������0��;��������3������������

5�������1��8�"��������� ����(�0 �� � ,�.���������������������������� ��������� � ���� � ����� ��� � ������� ���������������� ��� �� ��� ������� ��� ����������������������������7�������.��������+����"��������� 4������� .����������0��;��������3������������

.����885���5���������88�.�������������5������������� )���40?*5�����'��������������� ���'������'���'����������������������9��������'����+������� ��*��<@=?#�

&�'�����.�����'����:8�&�����8����������"������� � #���'�������� '���������� ��������?�����'����'�������;����������������� ���'������'����,� -"���*������=>@=!)=?=!)!�

�������5��5�"���������� ����H�5����� %�� ����� '��� ���� �������������� ���� � >=@==#<?==%#�

���������""�(��9����=>,#��2����������� ��������������' ����.��'��)���"�������0�8,�@# >>?#= ��

B�����85���(&�"������� #������ ���'�����'��@�������'���������;�������������� ����'������� ����������' ��<#@%!#?%,<�

$����:?N��L?"�6���"?4�5���B�+��6���8?L$�����*�+������44�5����L?5�$�����$?�B������?3�7���"1�7����8.�L������� %�3����� ��O������������ ��� ���� ���'� ����'�������'���� �'���������������������������� ����� '��� ! � ���� ����) ����� � �=,@><=?><%�

����������������� ��� ���������������������