(3 op) Staff Scientist, FT Jari Koivisto€¦ · 4 1. Johdanto 1.1 NMR-Laboratorion yleiset säännöt •Vain valtuutetut käyttäjät voivat operoida spektrometria •Valtuutettuja

1

KE-4.5510Käytännön NMR-spektroskopia(3 op)

Staff Scientist, FTJari Koivisto

Huone: C308bPuhelin: 050 343 8574Sähköposti: [email protected]

2

Käytännön NMR-spektroskopia

Yleistä

LuennotTiistaisin klo 12:15 – 14:00 salissa B202b (23.2. – 29.3.).

HarjoituksetNMR-huoneessa C121. Aika sovitaan ensimmäisellä luennolla.

Kirjallisuus• Jari Koivisto: Bruker Avance DPX400 User Manual (Version 1/2010)• Luentomoniste ja lisämateriaali

Muuta luettavaa• Bruker-manuaalit (https://www.bruker.com/products/mr/nmr.html)• Berger, S.; Braun, S. 200 and More NMR Experiments,

A Practical Course; Wiley-VHC: Weinheim, 2004.

Kurssin suoritusKäytännön koe. Aika sovitaan myöhemmin.

3

Käytännön NMR-spektroskopia

Sisältö, tavoitteet ja esitiedot

SisältöKurssilla perehdytään Bruker Avance DPX400 NMR-spektrometrin operointiin käytännön harjoitusten avulla. Pääpaino on kehittyneemmilläNMR-tekniikoilla (selektiiviset 1D-mittaukset, erilaiset 2D-mittaukset, pure shift-mittaukset, ja mittaukset eri lämpötiloissa). Mittausten teoreettinen tausta ja spektrien tulkinta käydään lyhyesti läpi. Lisäksi tutustutaan laitteistoon ja sen ylläpitoon.

TavoitteetKurssin ensisijaisena tavoitteena on oppia itsenäisesti operoimaanBruker Avance DPX400 NMR-spektrometria. Lisäksi tavoitteena on hallita TopSpin-ohjelmisto sekä oppia selviytymään erilaisista ongelmatilanteista ilman NMR-vastaavan apua.

EsitiedotCHEM-E8100 Organic Structural Analysis tai KE-4.4100 Orgaaninen rakenneanalytiikka.

4

1. Johdanto

1.1 NMR-Laboratorion yleiset säännöt

•Vain valtuutetut käyttäjät voivat operoida spektrometria

•Valtuutettuja käyttäjiä ovat henkilöt, jotka ovat saaneet koulutuksen NMR-laboratorion vastaavalta(JK) ja ovat osoittaneet pystyvänsä operoimaan spektrometria itsenäisesti

•Käytä ainoastaan AN-alkuisia parametreja!

•Älä tee muutoksia ohjelmistoihin äläkä laitteistoon ilman JK:n opastusta

•Täytä lokikirja ennen kuin poistut NMR-laboratoriosta. Merkitse mahdolliset epämääräisyydet lokikirjaan jakerro niistä välittömästi JK:lle

•Älä vie mitään mukanasi NMR-laboratoriosta (manuaalit, työkalut jne...)

•Kopioi vanhat/turhat tiedostot ja poista alkuperäiset tiedostot kovalevyltä

•Älä tuo ruokaa äläkä juomaa NMR-laboratorioon

•Älä operoi spektrometria suojakäsineet kädessä

•Älä käytä NMR-tietokonetta nettisurffailuun tai s-postin lukemiseen (virusvaara)

•Sulje (ja lukitse) ovi lähtiessäsi

5

1. Johdanto

1.2 NMR-Laboratorion varaussäännöt

•Varauslista löytyy osoitteesta \\work\T102\T10203\NMR-booking\NMR BOOKING.xls

•Varauksen saa tehdä aikaisintaan edellisenä päivänä

•Varattavissa on sekä 10 min että 15 min aikoja. Varaa vain yksi 10 min aika / pariton tunti

•Maksimivaraus on arkisin päivällä (8.00 – 18.00) 2h; pitkät mittaukset tehdään yöllä tai viikonloppuisin

•Yömittaukset alkavat aikaisintaan 18.00 ja päättyvät viimeistään 8.00

•Jos teet mittauksia muussa kuin normaalilämpötilassa (25 °C, 298 K), ota huomioon probenjäähtymiseen/lämpenemiseen tarvitsema aika

•Jos et käytä kaikkea varaamaasi aikaa, ilmoita siitä varauslistassa seuraavana olevalle

•Älä kajoa toisten varauksiin; jos on jotain valittamista, kerro siitä JK:lle

•JK varaa oikeuden tehdä mitä huvittaa ja milloin huvittaa!

6

1. Johdanto

1.3 Magneetti ja turvallisuus

Lyhyesti ja ytimekkäästi:

Älä tuo mitään magneettisia esineitä magneetin lähelle!

Tyhjennä taskusi ja ota kello ranteestasi ennen kuin lähestyt magneettia!

Sydämentahdistin / metalli-implantti VAARA!

7

Shimmauskelat

N2

He

N2

Näytteenvaihdin

Probe

Magneetinkelat Näyte

Lähetin Vahvistin/vastaanotin

Tietokone Tulostin

Probe

Näytteenvaihdin

Magneetti

Shimmauskelat

Elektroniikka(mm. lähetin ja vastaanotin)

N2 täyttöHe täyttö

2. NMR-Spektrometri

He

Esivahvistin

Esivahvistin

8

2. NMR-Spektrometri

MagneettiSuprajohtava magneetti kehittää magneettikentän, jota tarvitaan indusoimaan NMR-siirtymät. Jottamagneetti pysyisi suprajohtavassa tilassa, sitä jäähdytetään nestemäisellä heliumilla (4 K, -269 °C), jotapuolestaan jäähdytetään nestemäisella typellä (77 K, -196 °C). Bruker Avance DPX400 NMR-spektrometrissa on 9.40 Teslan magneetti.

ShimmausysteemiHuoneenlämpötilassa olevat shimmauskelat sijaitsevat magneetin pohjaosassa. Niiden avulla pyritäänmaksimoimaan magneettikentän homogeenisuus näytteen ympäristössä. Shimmaussysteemiä ohjataantietokoneelta tai BSMS-näppäimistön (Bruker Smart Magnet System) kautta. BSMS-näppäimistö onpöydällä tietokoneen vieressä.

ProbeProbe sijaitsee magneetin pohjassa. Shimmauskelat ovat proben ympärillä. Probessa sijaitsevatnäytteeseen suunnattujen radiotaajuussignaalien lähettämiseen ja näytteestä emittoituvien signaalienvastaanottamiseen tarkoitetut kelat. Probe hoitaa myöskin lukkosignaalin lähettämisen javastaanottamisen. Lisäksi probessa sijaitsee näytteenlämmitysyksikkö. Mittauksen aikana näyteputki onproben sisällä. Orgaanisen kemian laboratorion spektrometri on varustettu 5 mm BBFO-probella (BroadBand Observe), jolla voidaan mitata protonin (1H) lisäksi hiiltä (13C), fosforia (31P), fluoria (19F), typpeä(15N), sekä useita muita NMR-aktiivisia ytimiä. Tämä probe on varustettu Z-gradienttikeloilla sekäautomaattisella virityksellä/sovituksella (ATM). BBFO-proben lisäksi NMR-laboratoriosta löytyy vanha QNP-probe (Quattro Nucleus Probe).

9

2. NMR-Spektrometri

EsivahvistinEsivahvistinyksikkö (HPPR, High Performance PreamplifieR) välittää lähetetyn signaalin näytteeseen javahvistaa näytteestä tulevan erittäin heikon signaalin ennen sen syöttämistä vahvistimelle meneväänkaapeliin. HPPR myös lähettää ja vastaanottaa lukon deuteriumsignaalia (tai fluorisignaalia). Lisäksi sitäkäytetään wobble-rutiinissa (tuning ja matching) sekä kontrolloimaan QNP-proben pneumaattista kytkintä.HPPR sijaitsee lattialla magneetin vieressä.

KonsoliSuurin osa spektrometrin elektroniikasta sijaitsee konsolissa. Tärkeimmät elektroniikkayksiköt ovat AQS(AcQuisition control System), BSMS ja VTU (Variable Temperature Unit). AQS hoitaa näytteenvirittämiseen tarkoitettujen radiotaajuuspulssien kehittämisen sekä näytteestä emittoituvien signaalienvastaanottamisen, vahvistamisen ja digitoinnin. AQS:stä data siirretään PC:lle prosessointia ja varastointiavarten. AQS kontrolloi täydellisesti spektrometria NMR-mittauksen aikana. BSMS-yksikköä ohjataan BSMS-näppäimistön tai tietokoneen kautta ja sitä käytetään kontrolloimaan lukkoa, shimmaussysteemiä sekänäytteen nostoa/laskua ja pyöritystä. Orgaanisen kemian laboratorion spektrometrissa VTU on osa BSMS-yksikköä. VTU:n tarkoituksena on pitää näytteen lämpötila tasaisena ja tarvittaessa muuttaa sitäkontrolloidusti. VTU:ta ohjataan tietokoneelta.

TietokoneWindows XP Pro työasema, joka sisältää TopSpin 2.1 ohjelmistopaketin.

MuutaOrgaanisen kemian laboratorion spektrometri on varustettu automaattisella 24:n näytteen vaihtimella(NMR Case), jota ohjataan tietokoneelta käsin.

10

3. Ennen mittausta

3.1 Näytteen valmistus

•Käytä aina deuteroituja liuottimia

•Huomioi liukoisuus, jäännösliuotinsignaalin paikka, lämpötilariippuvuus, viskositeetti, vesipitoisuus, hinta

•Tavalliseen 1H NMR-mittaukseen riittää 1 – 5 mg näytettä; 13C NMR n. 5 × määrä

•25 mg riittää lähes kaikkiin 2D-mittauksiin; 1H,1H-mittaukset (esim. COSY) 1 – 5 mg on riittävä määrä

•Pyri käyttämään aina samaa liuoskorkeutta NMR-putkessa. Suositus (vähintään) 0.6 ml tai 4 cm liuostaø 5 mm putkessa

•Käytä aina korkeatasoisia NMR-putkia (esim. Wilmad 527-PP tai 528-PP), jotka ovat puhtaita ja kuivia.Huom! Suoraan pakkauksesta käyttöön otetut putket eivät ole puhtaita!

•Suodata näyte (varmista, ettei näytteessä ole magneettisia epäpuhtauksia)

11

3. Ennen mittausta

3.2 NMR-Putken asettaminen spinneriin

•Käytä aina syvyysmittaa kun laitat NMR-putken spinneriin

•Ole varovainen syvyysmitan kanssa: älä muuta syvyyttä! (pohjalevyn pitää olla kohdassa 5 – 15 mm)

•Pyyhi NMR-putki ennen kuin laitat sen spinneriin. Pyyhi putki toistamiseen spinneriin asettamisen jälkeen

•Älä koske spinneriin paljain käsin!

•NMR-Putken asettaminen spinneriin: laita spinneri syvyysmitan suulle ja työnnä NMR-putkea varovasti spinnerin läpi, kunnes putken pohja osuu syvyysmitan pohjalevyyn

•Poista syvyysmitta ennen kuin laitat NMR-putken ja spinnerin magneettiin

•Tarkista, että NMR-putki istuu tiukasti spinnerissä

12

4. Normaalin 1D NMR-mittauksen kulku

1. Laita näyte magneettiin ja tarkista, että spinneri on päällä (gradientteja hyödyntävissä mittauksissa spinneri pois päältä)

2. Avaa oma kansiosi ja luo uusi tiedosto. Tässä yhteydessä valitaan liuotin ja mittausparametrit sekä annetaan mittaukselle otsikko

3. Lukitse spektrometri deuteroidun liuottimen 2H-signaaliin

4. (Tarvittaessa tuning ja matching)

5. Optimoi Z-shimmit (tarvittaessa myös XY-shimmit)

6. Käynnistä mittaus. Vastaanottimen tason säätö, mittauksen käynnistäminen, Fourier-muunnos, faasikorjaus ja pohjaviivan korjaus tapahtuvat automaattisesti (kaikki nämä voidaan tehdä myös manuaalisesti)

7. Kalibroi

8. Määritä piikkien huippujen ppm/Hz-arvot

9. Integroi 1H-spektri

10. (Tulosta)

13

Operaattori ohjaa spektrometria PC:llä olevan TopSpin-ohjelmiston ja BSMS-näppäimistön avulla. TopSpinhoitaa tiedon varastoinnin ja analysoinnin. Kaikki keräämiseen liittyvät toiminnot hoitaa kuitenkinkonsolissa sijaitseva AQS-yksikkö. BSMS-näppäimistöllä kontrolloidaan lukkoa, shimmaussysteemiä(manuaalinen shimmaus) sekä näytteen nostoa/laskua ja pyöritystä.

Näytteen nostaminen ja laskeminen tehdään paineilman avulla. Tätä toimintaa ohjataan BSMS-näppäimistöllä. Varmista, että näytteen vaihdin on ylhäällä ja paineilma virtaa (kuuluu selvä kohina) ennenkuin laitat spinnerissä olevan NMR-putken magneetin aukon suulle. Laske näyte alas ja tarkista, ettäspinneri on päällä (ei kuitenkaan ole katastrofi, vaikka näytettä ei pyöritetä).

Jos TopSpin-ohjelma on suljettu, avataan se kaksoisklikkaamalla TopSpin 2.1 ikonia. Uusi mittaustiedostoluodaan klikkaamalla kuvaketta ja antamalla uusi tiedostonimi tai eksperimenttinumero. Uusillekäyttäjille luodaan kansio kirjoittamalla kohtaan USER käyttäjän sukunimi. Tässä yhteydessä valitaan myösliuotin ja sopiva AN-alkuinen parametrisetti sekä kirjoitetaan mittauksen otsikko. Mittausparametritsisältävät pulssisarjan, keräys- ja prosessointiparametrit, kuten myös kaikki muut tarvittavat parametrit,mukaan lukien pulssien kestot ja tehot.

5. Toimenpiteet ennen lukitsemista

14

6. Lukko ja shimmaus

Lukitseminen ja shimmaaminen tehdään aina ennen NMR-mittauksen aloittamista. Nämätoimenpiteet pitää tehdä uudelleen vain siinä tapauksessa, että näyte vaihdetaan mittaustenvälillä!

LukkoSignaali-kohinasuhteen parantamiseksi kerätään yleensä useita FID-signaaleja (Free Induction Decay)ennen Fourier-muunnosta, jolloin keräysajat saattavat muodostua pitkiksi. Muutokset magneettikentässä jaradiotaajuudessa mittauksen aikana aiheuttavat signaalien levenemistä (2D-mittauksissa t1-kohinaa).Kentän ja taajuuden stabiloimiseen käytetään kenttä/taajuuslukkoa. Lukko pitää yllä resonanssiehtoaerillisessä NMR-kokeessa, joka on käynnissä rinnakkain ”oikean” mittauksen kanssa (lukko pitää itseasiassa kentän ja taajuuden suhdetta vakiona). Yleensä lukkosignaalina käytetään deuteroidun liuottimen2H-resonanssia. Niin kauan kun lukkosignaali pidetään resonanssissa, on kentän ja taajuuden suhdemääritelty myös havaitsemiskanavalla. Lukkosignaali näkyy erillisessä lukkoikkunassa. Lukkoikkunaavataan klikkaamalla kuvaketta. Lukitseminen tehdään klikkaamalla kuvaketta, jonka jälkeen valitaanoikea liuotin listasta.

ShimmausMittauksen aikana kaikilla tutkittavilla spineillä pitää olla sama Larmor-taajuus, eli kentän tulee ollahomogeeninen. Epähomogeeninen kenttä heikentää resoluutiota ja signaalien viivanmuotoa.Magneettikentän homogeenisuutta näytteen ympäristössä säädetään ns. shimmauskelojen avulla.Rutiinityöskentelyssä optimoidaan Z-shimmit automaattisesti käyttäen topshim-rutiinia. Shimmaus voidaanmyös tehdä manuaalisesti BSMS-näppäimistön avulla. Homogeenisuutta voidaan lisätä pyörittämällänäytettä 20 Hz nopeudella.

15

6. Lukko ja shimmaus

OK shimmiKapea symmetrinen

signaali

Huono Z1

Symmetrisesti leventynyt signaali

Huono Z2

Leventymä tai olkapää jommallakummalla puolella signaalia

16

7. Tuning ja matching

Tuning ja matching eivät ole tarpeellisia toimenpiteitä normaalissa rutiinityöskentelyssä!

Tuning (virittäminen)Probeen lähetetyn signaalin taajuus vaikuttaa proben herkkyyteen. On olemassa tietty taajuus, jolla probeon kaikkein herkimmillään. Tätä taajuutta voidaan säätää proben resonanssipiireissä sijaitsevienkondensaattorien avulla. Virittämisessä proben resonanssipiiriä säädetään siten että taajuus, jolla probe onherkimmillään on relevantti lähetystaajuus. Kaikki proben kelat viritetään (ja sovitetaan) erikseen.

Matching (sovittaminen)Jos probe viritetään, pitää se myös sovittaa. Sovittamisessa säädetään proben resonanssipiirienimpedanssia siten, että se vastaa siihen kytketyn kaapelilinjan impedanssia. Tämä impedanssi on 50 .Sovittamisessa pyritään varmistamaan, että maksimimäärä tehoa siirtyy proben kelaan, eikä heijastutakaisin vahvistimiin (ja mene hukkaan).

Hyvä viritys ja sovitus

ViritysSo

vitu

s

BBFO-proben viritys ja sovitus tehdään automaattisestikomennolla atma. Tällöin saadaan PC:n näytölle oheisennäköinen wobble-käyrä. QNP-proben säätötoimenpiteettehdään probessa olevilla ruuveilla.

17

8. Vastaanottimen tason säätäminen

Vastaanottimen taso (receiver gain) on tärkeä parametri, jota käytetään sovittamaan FID:n amplitudiADC:n (Analog/Digital Converter) dynaamiseen alueeseen. Oikea taso voidaan määrittää tarkastelemallaFID-signaalia. Jos FID leikkautuu ensimmäisten pulssien aikana näytön ylä- ja alalaidassa, pitää tasoapienentää. Liian suuri taso johtaa Fourier-muunnoksen jälkeen spektrin pohjaviivan vääristymiseen.Toisaalta jos taso on liian pieni, ei pystytä hyödyntämään ADC:n täyttä dynaamista aluetta. Siinätapauksessa tasoa pitää nostaa. Taso voidaan säätää automaattisesti komennolla rga. Joissaintapauksissa taso annetaan komennolla rg.

t [s]

Liian suuri taso

18

9. Keräyksen aloittaminen ja Fourier-muunnos

6,50 6,00 5,50 5,00 4,50 4,00 3,50 3,00 2,50

FT

Prosessia, jossa NMR-signaalia vastaanotetaan, kutsutaan keräämiseksi (acquisition). Ts. mittauksenaikana dataa kerätään. Keräys aloitetaan komennolla zg. Tämä komento tuhoaa kaiken aiemman datan(Zero) ja aloittaa mittauksen (Go). Mittauksen aikana kerättävä signaali on muodoltaan aikaspektri, elins. FID (Free Induction Decay). FID sisältää koko spektriä varten tarvittavan informaation ja se vaimeneeajan funktiona. FID muutetaan taajuusspektriksi matemaattisella operaatiolla, jota kutsutaan Fourier-muunnokseksi (FT). Fourier-muunnos tehdään yleensä komennolla ef. Tällä komennolla FID:iämuokataan eksponentiaalisella funktiolla ennen Fourier-muunnosta, jotta saavutettaisiin parempisignaali/kohinasuhde (resoluution kustannuksella). Komento ft tekee pelkän Fourier-muunnoksen.

t [s]

FID Taajuusspektri

[Hz]

19

10. Faasikorjaus ja pohjaviivan korjaus

Detektiomenetelmästä johtuen signaalit yleensä sisältävät Fourier-muunnoksen jälkeen sekä absorptio-että dispersiokomponentteja. Normaalisti 1D NMR-spektrit esitetään absoptiomuodossa. Tämän vuoksidispersiokomponentit poistetaan ns. faasikorjauksen avulla. Tämä tehdään yleensä automaattisestikomennolla apk. Faasikorjaus voidaan tehdä myös käsin. Yleensä faasikorjauksen jälkeen tehdäänautomaattinen pohjaviivan korjaus komennolla abs. Tällä komennolla poistetaan pohjaviivanvääristymät vähentämällä siitä joku sopiva polynomi.

Faasikorjaus

Dispersiosignaali Absorptiosignaali

20

11. Kalibrointi, integrointi ja tulostaminen

KalibrointiNMR-spektroskopiassa ei ole absoluuttista mitta-asteikkoa, koska resonanssiehdon seurauksenaresonanssitaajuus riippuu magneettivuon tiheydestä. Tämän vuoksi käytetään ns. sisäistä standardia,joka on 1H ja 13C NMR:ssä yleensä tetrametyylisilaani (TMS, (CH3)4Si). TMS:n resonanssitaajuuttamerkitään sopimuksen mukaan arvolla = 0. Jos ei käytetä TMS:ää, voidaan spektri kalibroida liuottimenjäännösprotonien signaaliin. Kalibrointi aloitetaan klikkaamalla kuvaketta.

Piikkien huippujen määrittäminenPiikkien huippujen ppm/Hz-arvojen määrittäminen voidaan tehdä automaattisesti tai manuaalisesti(suositeltavampi). Manuaalinen huippujen määrittäminen aloitetaan klikkaamalla kuvaketta.

Integrointi1H NMR-spektroskopiassa signaalin pinta-ala (integraali) on suoraan verrannollinen signaalinaiheuttaneiden protonien lukumäärään. Tämän johdosta integroimalla voidaan määrittää protoniensuhteelliset lukumäärät molekyylissä. Se mahdollistaa seosten kvantitatiivisen analyysin ja auttaarakennemäärityksessä. Integrointi aloitetaan klikkaamalla kuvaketta.

TulostaminenTulostaminen aloitetaan klikkaamalla kuvaketta. Tämän jälkeen valitaan kohta Print with layout – plotdirectly sekä sopiva AN-alkuinen layout.

HUOM!Kaikki prosessoiminen ja tulostaminen tehdään omalla koneella. Suurin osa orgaanisen kemianlaboratorion tietokoneista sisältää TopSpin-ohjelmiston. Tiedostot ovat siirrettävissä koneelle verkonkautta.

21

12. Mittauksen jälkeen

Spektrometri pitää palauttaa normaalitilaan ennen poistumista NMR-laboratoriosta. Mikäli mittauksia ontehty jossain muussa kuin normaalilämpötilassa (25 °C, 298 K), pitää probe palauttaa tähän lämpötilaanennen standardinäytteen asettamista magneettiin.

1. Vaihda standardinäyte magneettiin (liuottimena CDCl3)

2. Lukitse spektrometri kloroformiin

3. Optimoi Z-shimmit (topshim) jos olet käyttänyt muuta liuotinta kuin kloroformia

4. Sulje keräysikkuna

5. Avaa guest -kansiossa oleva EB-tiedosto

6. Merkitse lokikirjaan oikeaan ajankohtaan nimikirjaimesi, suoritetut mittaukset ja käytetty liuotin

7. Merkitse mahdolliset epämääräisyydet lokikirjaan ja kerro niistä mahdollisimman nopeasti JK:lle

8. Sulje (ja lukitse) ovi poistuessasi NMR-laboratoriosta

22

1H NMR-mittauksen pulssisarja koostuu relaksaatioviiveestä d1 ja radiotaajuuspulssista p1 sekäkeräysajasta aq, jonka aikana FID tallennetaan. Kuvassa pulssikulma on 90°. Todellisuudessa tässäpulssisarjassa käytetään 30° kulmaa. d1 on tyypillisesti muutaman sekunnin luokkaa, kun taas p1 ontyypillisesti pituudeltaan joitain mikrosekunteja.

1H NMR-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_1H_routine, jossa:Pulssisarja (pulprog): zg30Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 kProsessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 kSkannausten lukumäärä (ns): 16Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 2Spektrin leveys (sw): 15 ppmSpektrin keskikohta (o1p): 6.5 ppmMittausaika (expt): n. 1 min 15 s

90°x’ FID

d1 p1

1H

aq

13.1 1H NMR

13. Normaalit 1D-mittaukset

23

1. ;zg30

2. ;avance-version (00/02/07)

3. ;1D sequence

4. ;using 30 degree flip angle

5. #include <Avance.incl>

6. 1 ze

7. 2 d1

8. p1*0.33 ph1

9. go=2 ph31

10. wr #0

11. exit

12. ph1=0 2 2 0 1 3 3 1

13. ph31=0 2 2 0 1 3 3 1

14. ;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default)

15. ;p1 : f1 channel - 90 degree high power pulse

16. ;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1

13.2 Esimerkki pulssisarjasta: 1H NMR


Varsinainen pulssisarja

Rivit 1-4: Kommentteja (alkavat puolipisteellä)

Rivi 5: Avance.incl tiedosto sisältyy zg30-pulssisarjaan

Rivit 6-13: Varsinainen pulssisarjaze - Muistissa oleva data korvautuu ensimmäisenskannauksen datalla. Tämän jälkeen tulevat skannauksettallentuvat muistiind1 - Viivep1*0.33 ph1 - Pulssi p1 * 0.33 = 30° pulssi. Pulssinfaasi ph1 asetetaango=2 ph31 - Käynnistää useita prosesseja (mm.vastaanotin aukeaa, NMR-signaalien digitointi alkaa). Kunkeräys loppuu ohjelma palaa riville 7. ja prosessi toistuu nskertaa. Vastaanottimen faasi ph31 asetetaanwr #0 - Tietokone tallentaa kerätyn datan kovalevylleExit - Pulssisarja päättyyph1=0 2 2 0 1 3 3 1 - Lähettimen faasikiertoph31=0 2 2 0 1 3 3 1 - Vastaanottimen faasikierto

Rivit 14-16: Kommentteja

24

13.2 Esimerkki pulssisarjasta: 1H NMR


Pulssisarja zg, jossa ns = 4 ja ds = 0

90°x’ FID

d1 p1

1H

aq

FT

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

d1

p1

aqze

d1

p1

aq

d1

p1

aq

d1

p1

aq wr#0

exit

Aika

25

UDEFT (Uniform Driven Equilibrium Fourier Transform) on 13C NMR-mittaus, jossa havaitaan hiiltä (kanava1) ja samalla irrotetaan kytkennät protoneihin (kanava 2) hyödyntäen CPD-sekvenssiä (Composite PulseDecoupling). UDEFT on korvannut perinteisen 13C-mittauksen, koska se on selvästi jälkimmäistä herkempimenetelmä.

UDEFT-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_UDEFT, jossa:Pulssisarja (pulprog): udeft_an_shitKerättyjen datapisteiden määrä (td): 18 kProsessoidun reaalisen spektrin koko (si): 64 kSkannausten lukumäärä (ns): 130Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 0Spektrin leveys (sw): 250 ppmSpektrin keskikohta (o1p): 120 ppmIrroituksen keskikohta (o2p): 4 ppmMittausaika (expt): n. 13 min

CPD1H

13.3 UDEFT (13C NMR)


90° FID

d1 p1 aq p33 p1

90°180° 180°

p34TAU=aq

13C

26

DEPT-eksperimentissä (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) polarisaatiota(magnetisaatiota) siirretään herkemmiltä (suoraan hiileen kytkeytyneiltä) 1H-ytimiltä epäherkille 13C-ytimille. Tästä seuraa, että protoneihin suoraan kytkeytyneiden hiilien signaalien intensiteetit kasvavat.Pulssissarjassa °y’:lle voidaan antaa arvot: 1 = 45°, 2 = 90° ja 3 = 135°, eli on mahdollista tehdäkolme erilaista eksperimenttiä, jotka ovat DEPT 45, DEPT 90 ja DEPT 135. DEPT 45 antaa positiivisetCH-, CH2- ja CH3-signaalit, DEPT 90 antaa pelkät positiiviset CH-signaalit ja DEPT 135 antaa positiivisetCH- ja CH3-signaalit sekä negatiiviset CH2-signaalit.

DEPT-mittauksissa käytetyt parametrisetit ovatAN_DEPT45, AN_DEPT90 ja AN_DEPT135 , joissa:Pulssisarja (pulprog): dept45, dept90 ja

dept135Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 64 kProsessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 kSkannausten lukumäärä (ns): 220Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 8Spektrin leveys (sw): 250 ppmSpektrin keskikohta (o1p): 120 ppmMittausaika (expt): n. 13 min

90°x’ FID

d1p3

13C

aq

CPD1H

90°x’

d2

180°x’°y’

p4

180°x’

p2p1

d2 d2p0

13.4 DEPT 45, DEPT 90 ja DEPT 135


27

13.4 DEPT 45, DEPT 90 ja DEPT 135


45°(1)

90°(2)

135°(3)

y’

180°

1.0

1.0

00°

(1H)/(13C)

CH

CH2

CH3

CH-Alispektri:2 = 90° DEPT 90

CH2-Alispektri: DEPT 45 - DEPT 135

CH3-Alispektri: DEPT 45 + DEPT 135 - 0.707DEPT 90

DEPT 45: 1 = 45° CH-, CH2- ja CH3-piikit ylöspäin

DEPT 90: 2 = 90° CH-piikit ylöspäin

DEPT 135: 3 = 135° CH- ja CH3-piikit ylöspäin,CH2-piikit alaspäin

Kvaternaariset hiilet eivät anna signaalia.

CH-, CH2- ja CH3-signaalien intensiteetitriippuvat kulmasta :

CH: I = [(1H)/((13C)]sinCH2: I = [(1H)/((13C)]sin2CH3: I = [3(1H)/(4(13C)](sin + sin3)

28

M0

y’

x’

z

A

B1

M-y’

B DC

M0

M-y’

M0

B1M-z

M0

”Vajaa” 180°x 90°x

14. Esimerkki faasikierrosta: inversion recovery experiment (180°x – – 90°x)

M0

y’

x’

z

E

B1

My’

F HG

M0

My’

M0

B1

Mz M0

”Vajaa” 180°-x 90°x

D+H

M0

29

15. Pulssitetut kenttägradientit

1. Tarvitaan vähemmän faasikiertoja erilaisten virheiden eliminoimiseksi

2. Vahvoilla näytteillä selvästi lyhyemmät mittausajat

3. 2D-Mittauksissa vähemmän t1-kohinaa

4. Spektrien prosessointi ja analyysi helpompaa

5. Tehokas ei-haluttujen signaalien eliminointi (esim. intensiivinen liuotinpiikki H2O-näytteissä)

6. Dynaaminen alue pienempi

15.1 Yleistä

Jos koherenssien valinnassa hyödynnetään PFG-(pulsed field gradient)tekniikaa, voidaan saavuttaaseuraavia etuja:

30

Havaittavatilavuus

5

4

3

2

1

5 = 0 + ( / 2)g5(B0 + g5)

4 = 0 + ( / 2)g4(B0 + g4)

3 = 0

2 = 0 - ( / 2)g2(B0 - g2)

1 = 0 - ( / 2)g1(B0 - g1)

B0

n = ( / 2)(B0 + gn)

B0 + gn

-g1

-g2

g4

g5

g3 = 0


PFG-tekniikassa käytetään erityisiä gradienttikeloja tuottamaan lineaarinen magneettikenttäulkoisen kentän B0 (Z-akselin) suunnassa. Tästä seuraa, että ytimet kokevat erilaisen magneettikentänniiden paikasta riippuen. Gradienttikenttää pidetään päällä tietty aika , jonka jälkeen se sammutetaanja ytimet kokevat jälleen pelkän B0:n ja prekessoivat samalla taajuudella 0.

15.2 PFG:n vaikutus transversaaliseen magnetisaatioon

31

Z

y’

x’

M5

M4

M3

M2

M1

A Z

y’

x’

BGradienttipulssin vaikutustransversaaliseen magnetisaatioon

A ja C: Tilanne 90°-x’-pulssin jälkeen.Viipaleiden 1 - 5 magnetisaatiovektoreidensumma muodostaa y’-suuntaisenkokonaismagnetisaatiota kuvaavanvektorin Mn, joka pyörii z-akselin ympärinopeudella0 (ytimien prekessiotaajuus).Pyörivä koordinaatisto pyörii samallanopeudella Mn:n kanssa.

B ja D: Tilanne gradienttipulssin aikana.Vektorit, jotka muodostavat Mn:n, alkavatpyöriä eri taajuuksilla n. Koordinaatisto(x’ ja y’) pyörii edelleen taajuudella 0, kutenmyös M3. Vektoreiden M1 - M5 erilaisetprekessionopeudet 1 - 5 johtuvat erilaisistagradienttikontribuutioista g1 - g5.

Gradienttipulssin aikana vektorienfaasikoherenssi katoaa. Jos on riittävänpitkä (~1 ms), transversaalisen magnetisaationkomponentti tuhoutuu täydellisesti, eikävastaanottimen kelalle indusoidu signaalia.

y’

x’

y’

x’M5

M1M2

M3

M4

C

D

Mn(z)= My’


15.2 PFG:n vaikutus transversaaliseen magnetisaatioon

32

90°-x’

FID

A

G

-G

a b

c

y’

x’

B = 0

a

= 2(n - 0)

b

y’

x’

= 2(0 - n)

c

y’

x’

”Kaiku””Gradienttikaiku”-eksperimentti

A: Pulssisarja.B: Viipaleen n transversaalisen magnetisaationkäyttäytyminen.

Jos spinsysteemiin kohdistetaan gradienttipulssinjälkeen toinen samanlainen, mutta vastakkaismerkkinengradienttipulssi, saadaan spinit jälleen refokusoitua transversaalisen magnetisaation vektorit Mn osoittavaty’-suuntaan, kuten ensimmäisen 90°-x’-pulssin jälkeen ”gradienttikaiku” indusoituu vastaanottimen kelalle.


15.3 Gradienttikaiku Gradienttipulssi ei tuhoa transversaalistamagnetisaatiota peruuttamattomasti, päinvastoin kuinepähomogeenisen magneettikentän aiheuttamatsatunnaiset kenttägradientit.

33

90°-x’

FID

A

G1

a c

b

FID

y’

x’

B

c d

y’

x’

e

y’

x’

f

y’

x’

a

y’

x’

b

y’

x’

180°-y’

G2

d

e

f

M5

M5

t t

”Spinkaiku”-eksperimentti

A: Spinkaikueksperimentin pulssisarja, jossa käytetäängradienttipulsseja (gs = gradient selected).

B: Viipaleen 5 transversaalisen magnetisaation M5käyttäytymistä kuvaavat vektoridiagrammit.


15.4 Spinkaiku gradienteilla

34

16. Selektiivinen eksitaatio: Double-Pulsed-Field-Gradient Spin-Echo (DPFGSE)

G1

Grad.

90°

G2G1 G2

1H

Selektiivinen180°

Selektiivinen180°

DPFGSE-sekvenssin avulla voidaan valita selektiivisesti vain yksi resonanssi useiden signaalienjoukosta.

90°-Pulssi kääntää kaikki magnetisaatiot transversaaliselle x’,y’-tasolle. Ensimmäinen gradientti G1 tuhoaakaikkien magnetisaatioiden faasikoherenssin. Jatkossa selektiivinen pulssi kääntää vain valitunmagnetisaation. Tästä seuraa, että toisen gradientin G1 jälkeen vain valittu magnetisaatio refokusoituu.Kaikkien muiden magnetisaatioiden faasit puolestaan menevät vielä enemmän sekaisin. Ensimmäistägradienttispinkaikua (G1 – selektiivinen 180° – G1) seuraa toinen (G2 – selektiivinen 180° – G2), jossagradienttien G2 voimakkuus on eri kuin gradienttien G1. Kahden peräkkäisen gradienttispinkaiun ansiostasaavutetaan halutun signaalin faasivirheistä vapaa selektiivinen eksitaatio.

DPFGSE-sekvenssi sopii erinomaisesti selektiivisten 1D-pulssisarjojen ensimmäiseksielementiksi.

35

17.1 Yleistä

17. Selektiiviset 1D-mittaukset

Selektiivinen 1D-mittaus on usein parempi valinta kuin vastaava 2D-mittaus:

1. 1D-spektrien analyysi antaa usein luotettavampia tuloksia

2. Korkeampi digitaalinen resoluutio

3. Lyhyemmät keräys- ja prosessointiajat

4. Pienemmät tiedostokoot

5. Joissain tapauksissa gradientteja voidaan käyttää menettämättä mittausherkkyyttä

6. 1D-mittaukset erittäin käyttökelpoisia kun halutaan vain rajoitettu määrä informaatiota

36

17.2 1D COSY


1D COSY (COrrelation SpectroscopY) on vastaavan 2D-mittauksen selektiivinen 1D-versio. Tässämittauksessa 2D-version ensimmäinen 90°-pulssi on korvattu DPFGSE-sekvenssillä, jolloin mitataantäyden 2D-matriisin sijaan vain yksi ”rivi”. Näin ollen spektrissä nähdään vain ne signaalit, joihinselektiivisesti valittu signaali on spin-spin-kytkeytynyt.

Viive d2 määrittää säteilytettyyn signaaliin kytkeytyneiden signaalien intensiteetin. Saattaa ollatarpeellista tehdä mittaus kahdesti eri d2-arvoilla (30 – 60 ms), jotta voitaisiin tunnistaa sekä pienen ettäsuuren kytkeytymisvakion omaavat kytkeytymiskumppanit.

G1

Grad.

90°

G3G2 G4

1H

Selektiivinen180°

Selektiivinen180° 90°

d1 d2p12 p12p1 p1

G5

G6

FID

aq

1/(2J HH)

37

17.2 1D COSY


1D COSY-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_1D_COSY, jossa:

Pulssisarja (pulprog): dpfgse-cosyKerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 kProsessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 kSkannausten lukumäärä (ns): 32Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 4Spektrin leveys (sw): 10 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta (o1p): 5 ppm (optimoidaan; viritettävän signaalin keskikohta)Selektiivinen 180°-pulssi (p12): 80 ms (viritettävän alueen leveys n. 12.5 Hz)Selektiivisen pulssin vaimennus (sp2): 65 dBViive 1/(2J HH) (d2): 50 ms (vastaa 10 Hz-kytkeytymisvakiota)Mittausaika (expt): n. 4 min

Selektiivisen 180°-pulssin (p12) kestoa voidaan vaihdella halutun selektiivisyyden mukaan. Tällöin myösvaimennus (sp2) muuttuu.

1D COSY-spektrissä säteilytetty protoni antaa normaalinabsorptiosignaalin. COSY-Signaaleissa aktiivinenkytkeytyminen näkyy antifaasirakenteena.Gradienttien aiheuttamasta lineaarisestafaasisiirtymästä johtuen faasikorjaus on tehtävä kaikillesignaaleille erikseen.

Normaalisignaali

Signaaliantifaasissa

38

17.3 1D TOCSY


1D TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) on vastaavan 2D-mittauksen selektiivinen 1D-versio.Tässä mittauksessa 2D-version ensimmäinen 90°-pulssi on korvattu DPFGSE-sekvenssillä, jolloin mitataantäyden 2D-matriisin sijaan vain yksi ”rivi”. Näin ollen spektrissä nähdään vain ne signaalit, joihinselektiivisesti valittu signaali on spin-spin-kytkeytynyt. 1D TOCSY-mittaus sisältää kaksi ZQF-sekvenssiä(Zero-Quantum Filter), joiden avulla spektristä voidaan suodattaa dispersiivisiä antifaasikomponentteja(vääristyneitä signaaleja).

1D TOCSY-spektristä saadaan sama informaatio kuin 1D COSY-spektristä. Lisäksi korrelaatioita havaitaansellaisten protonien välillä, jotka eivät ole kytkeytyneet suoraan toisiinsa, mutta sijaitsevat samassaspinsysteemissä. TOCSY-Spinlukon kestoaika d9 määrittää kuinka pitkälle spin-spin-kytkeytynyttäverkostoa tutkitaan. Lyhyillä d9:n arvoilla (20 – 40 ms) mittaus antaa saman informaation kuin 1D COSY.Pidemmillä arvoilla (60 – 100 ms) voidaan havaita kytkeytymisiä saman spinsysteemin kaukaisempiinprotoneihin.

G1

90°

G2G1 G2

1H

Selektiivinen180°

Selektiivinen180°

d1 p12 p12p1

90°

p1

SpinlukkoDIPSI-2

G0 G3 G0

p32 p34

90°

p1

FID

aq

Grad.

SmoothedChirp(ZQF)

SmoothedChirp(ZQF)

39

17.3 1D TOCSY


1D TOCSY-spektrissä sekä säteilytetyn signaalin että TOCSY-signaaleiden faasit korjataan positiivisiksi.

1D TOCSY-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_1D_TOCSY, jossa:

Pulssisarja (pulprog): dpfgse-zqf-tocsy_dipsi2Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 kProsessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 kSkannausten lukumäärä (ns): 128Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 4Spektrin leveys (sw): 10 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta (o1p): 5 ppm (optimoidaan; viritettävän signaalin keskikohta)Selektiivinen 180°-pulssi (p12): 80 ms (viritettävän alueen leveys n. 12.5 Hz)Selektiivisen pulssin vaimennus (sp2): 65 dBSekoitusaika (d9): 80 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan)Mittausaika (expt): n. 14 min

Selektiivisen 180°-pulssin (p12) kestoa voidaan vaihdella halutun selektiivisyyden mukaan. Tällöinmyös vaimennus (sp2) muuttuu.

40

17.4 1D NOESY, 1D ROESY ja 1D off-resonance ROESY


1D NOESY/ROESY/off-resonance ROESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY/Rotating-frameOverhauser Effect SpectroscopY) mittauksissa yhden protonin/protoniryhmän selektiivinen säteilyttäminenaiheuttaa intensiteetin muutoksen muissa signaaleissa. Tämä intensiteetinmuutos on verrannollinenspinien välisen avaruudellisen etäisyyden käänteiseen kuudenteen eksponenttiin (1/r 6). Ts. 1DNOESY/ROESY/off-res-ROESY-spektrissä säteilytettyä signaalia avaruudellisesti lähellä sijaitsevatprotonit antavat NOE/ROE-signaalin.

1D NOESY-mittauksessa parametri d8 määrittää sekoitusajan pituuden, jonka aikana NOE:n kehittyminentapahtuu. 1D ROESY/off-res-ROESY-mittauksissa vastaava parametri on p15, joka määrittää spinlukonkestoajan. 1D NOESY-mittaus sisältää ZQF-sekvenssin, joka suodattaa spektristä dispersiivisiäantifaasikomponentteja (vääristyneitä signaaleja).

Off-resonance ROESY-mittauksessa spinlukkoon käytetään trapetsoidin muotoista pulssia, joka onkohdistettu kauas sivuun spektrin keskikohdasta. Off-resonance ROESY on tavallaan NOESY- ja ROESY-mittausten kombinaatio, jossa normaalissa ROESY-mittauksessa esiintyvät HOHAHA(HOmonuclearHArtmann-HAhn)-tyyppiset ja off-resonance-virheet ovat tehokkaasti eliminoitu.

41


FID

aq

CW-Spinlukko

p15

G1

Grad.

90°

G3G2 G4

1H

Selektiivinen180°

Selektiivinen180°

d1 p12 p12p1

1D NOESY

1D ROESY

FID

aq

CW-Spinlukko90°

p1 p1

1D off-resonance

ROESY

90°

p15


G1

90°

G2G1 G2

1H

Selektiivinen180°

Selektiivinen180°

d1 p12 p12p1

90°

p1

G0 G3

p32

90°

p1

FID

aq

Grad.

SmoothedChirp(ZQF)

d8

42


1D NOESY/ROESY-spektrissä säteilytetyn signaalin faasi korjataan negatiiviseksi, jolloin todelliset NOE/ROE-piikit ovat positiivisia. 1D NOESY/ROESY-mittauksissa käytettävät parametrisetit ovat AN_1D_NOESY,AN_1D_ROESY ja AN_1D_off-res-ROESY, joissa:

Pulssisarja (pulprog): dpfgse-zqf-noe_jk (NOESY), selrogp.5 (ROESY) jadpfgse-troesy (off-res-ROESY)

Kerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 kProsessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 kSkannausten lukumäärä (ns): 128Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 4Spektrin leveys (sw): 10 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta (o1p): 5 ppm (optimoidaan; viritettävän signaalin keskikohta)Selektiivinen 180°-pulssi (p12): 80 ms (viritettävän alueen leveys n. 12.5 Hz)Selektiivisen pulssin vaimennus (sp2): 65 dBNOE-Sekoitusaika (d8): 500 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan)ROE-Spinlukko (p15): 500 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan)Mittausaika (expt): Kaikki n. 15 min

Selektiivisen 180°-pulssin (p12) kestoa voidaan vaihdella halutun selektiivisyyden mukaan. Tällöin myösvaimennus (sp2) muuttuu. Off-resonance ROESY-mittausta varten lasketaan spinlukon siirtymä [Hz] kaavalla

SL = (B1/tan ) + O1jossa B1 = herätekentän taajuus [5107 Hz], tan = 45 = 1 ja O1 = spektrin keskikohta [Hz]. SL ja O1kirjataan taajuuslistaan, jota pulssisarja lukee mittauksen aikana.


43


17.5 SELINCOR

SELINCOR(SELective INverse H,C CORrelation)-mittaus tuottaa 1D-protonispektrin, jossa näkyvätainoastaan ne protonit, jotka ovat kytkeytyneet suoraan (1JCH) selektiivisesti säteilytettyyn 13C-ytimeen.

90°

1H

G3

G1

180°

Grad.

180° 90°

13C

1/(41J CH)

G2

p1 p2

p4 p3

FID

aqp28

90°

p1

G4

p14

Spinlukko 90° 180°

180°

p1 p2

p4

90°

p3

Selektiivinen180°

CPD

G5

d4d1 d4 d4 d4

1/(41J CH) 1/(41J CH)1/(41J CH)

44


17.5 SELINCOR

SELINCOR-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_SELINCOR, jossa:

Pulssisarja (pulprog): selincorgpKerättyjen datapisteiden määrä (td): 32 kProsessoidun reaalisen spektrin koko (si): 32 kSkannausten lukumäärä (ns): 256Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16Spektrin leveys (sw): 15 ppmSpektrin keskikohta 1H (o1p): 6.5 ppmSpektrin keskikohta 13C (o2p): 50 ppm (optimoidaan, viritettävän signaalin keskikohta)Mittausaika (expt): n. 22 min

45

18. Erittäin selektiiviset pseudo-2D-mittaukset

Erittäin selektiiviset pseudo-2D-mittaukset hyödyntävät CSSF(Chemical Shift Selective Filter)-sekvenssiä.CSSF:n avulla voidaan selektiivisesti valita yksi signaali useiden päällekkäisten signaalien joukosta, vaikkavalitun signaalin ja muiden signaalien välisen kemiallisen siirtymän ero on vain muutaman Hertsin (Hz)luokkaa. Normaaleissa selektiivisissä 1D-mittauksissa tämän eron pitää olla vähintään noin 30 Hz, eivätkäsignaalit saa olla päällekkäin.

Onnistuneella CSSF-mittauksella on kaksi edellytystä: (1) Valitulla signaalilla tulee olla erillinen kemiallinensiirtymä, sillä CSSF ei pysty erottelemaan kahta saman siirtymän omaavaa signaalia. (2) Valitun signaalinkemiallinen siirtymä on tunnettava tarkasti. Vaikka edellämainut edellytykset toteutuvatkin, saattaa CSSF-mittaus silti antaa valitun signaalin naapuripiikeistä johtuvia heikkoja signaaleja.

NMR-manuaalista löytyy kolme CSSF-mittausta: CSSF-TOCSY, CSSF-NOESY ja CSSF-off-res-ROESY. Nämämittaukset ovat CSSF-sekvenssiä lukuunottamatta identtisiä vastaavien selektiivisten 1D-mittausten kanssa(antavat saman informaation).

46


G1

90°

G2G1 G2

1H

Selektiivinen180°

Selektiivinen180°

d1 p12 p12p1

Grad.

180°

p2 d212

d212

DPFGSE-CSSF-sekvenssi

47

CSSF-mittauksissa käytettävät parametrisetit ovat AN_CSSF-TOCSY, AN_CSSF-NOESY ja AN_CSSF-off-res-ROESY. CSSF-mittausten parametrit ovat lähes identtisiä vastaavien selektiivisten 1D-mittausten parametrien kanssa. Suurin ero on CSSF-mittausten F1-dimensio, jonka ansiosta CSSF-mittausantaa samanlaisen korrelaatiokartan kuin 2D-mittaukset. CSSF-spektri kuitenkin prosessoidaan 1D-spektriksi. Tästä nimitys ”pseudo-2D-mittaus”.

CSSF-sekvenssin optimaalinen kesto, tmax, voidaan laskea yhtälöllä

tmax = 0.5/

jossa = valitun signaalin ja lähimmän naapurisignaalin välinen ero Hertseinä (Hz). Yleensä tmaxasetetaan pidemmäksi kuin laskettu arvo. Näin huomioidaan relaksaation vaikutukset. CSSF:n kestoavoidaan pidentää/lyhentää muuttamalla CSSF-inkrementtien määrää, eli muuttamalla kerättyjendatapisteiden määrää (td) F1-suunnassa (oletusarvo 8). Myös viiveellä d21 (oletusarvo 1 ms) sekäkyseisen viiveen inkrementillä in21 (oletusarvo 10 ms) voidaan vaikuttaa CSSF-sekvenssin kestoaikaan.


48

1D NMR-spektroskopiassa taajuudet (kemialliset siirtymät) ovat x-akselilla ja intensiteetit y-akselilla. 2DNMR:ssä molemmilla taajuusakseleilla voi olla kemialliset siirtymät, jolloin puhutaan(siirtymä)korrelaatiospektristä. 2D-spektriä, jossa toisella taajuusakselilla on kemialliset siirtymät jatoisella kytkentävakiot, kutsutaan J -resolvoiduksi 2D spektriksi. Intensiteetit ovat z-akselilla (tavallaankolmas ulottuvuus). Kahdesta em. spektristä korrelaatiospektrit ovat tärkeämpiä.

2D-menetelmät voivat perustua ydindipolien välisiin skalaarisiin (esim. COSY) tai dipolaarisiin (esim.NOESY) kytkentöihin. Magnetisaation siirto voi tapahtua myös kemiallisen vaihdon kautta (esim. EXSY),jolloin kyseessä on dynaaminen 2D NMR-spektroskopia.

2D NMR-spektri saadaan, kun mitataan sarja 1D NMR-spektrejä. Nämä yksittäiset 1D-spektrit eroavattoisistaan vain pulssisarjaan sisälletyn aikainkrementin verran. 2D-mittauksen pulssisarjoista voidaanlöytää neljä erilaista aikajaksoa: valmistelu, evoluutio, sekoitus ja havaitseminen.

19. 2D NMR

19.1 Yleistä

49

Valmistelu:Spinsysteemi relaksoituu, jonka jälkeen sitä häiritään ainakin yhdellä radiotaajuuspulssilla.

Evoluutio (t1)Spinsysteemi kehittyy vapaasti eri vuorovaikutusten alaisena, joita ovat esim. Larmor-prekessio tai spin-spinkytkeytyminen. t1-jakson pituutta muutetaan systemaattisesti (inkrementoidaan) 2D NMR-kokeenaikana.

Sekoitus ()Sisältää pulsseja ja viiveitä. Sekoitusajan pituus pidetään vakiona.

Havaitseminen (t2)FID-signaali havaitaan. 1D-NMR:ssä tätä jaksoa kutsutaan keräämiseksi.

FID

t1

Valmistelu Evoluutio

t2

Havaitseminen

Sekoitus

19. 2D NMR

19.1 Yleistä

50

Esimerkkinä kloroformin (13CHCl3) kuvitteellisen J -resolvoidun 2D NMR-eksperimentin tuottama spektri. F2-akselilla hiilen kemiallinen siirtymä (13C) = 77.7 ja F2-akselilla kytkentävakio 1J (C,H) = 206 Hz. 2D-spektritvoidaan esittää joko contour plot-tyylillä (A, spektri suoraan ylhäältäpäin katsottuna) tai stacked plot-tyylillä (B, sarja F2-spektrejä erilaisilla F1-arvoilla päällekkäin pinottuna), joista ensin mainittu on selvästiinformatiivisempi.

(13C) F277.7

F1

[Hz]-100

+100

0...

1.

2.

3.

n.

t1

t2

.

.

.

S (t1, t2) S (t1, F2) S (F1, F2) t1

F2

1. FT 2. FT

A

-100

+100

0

77.7 F2

F1

(13C)

[Hz]

B

19. 2D NMR

19.1 YleistäPrimaarinen 2D-matriisi muodostuu sarjasta FID-signaaleja.Ensimmäinen Fourier-muunnos t2:n suhteen tuottaa sarjan 1D-spektrejä, joiden signaaleilla voi olla erilainen amplitudi ja/tai faasi.Toinen Fourier-muunnos t1:n suhteen antaa lopullisen 2D-matriisin,jossa on taajuusakselit F1 ja F2.

51

S (t1, F2) t1

S (F1, F2)

19. 2D NMR

19.1 Yleistä

52

FT

FT

+

2D NMR-spektroskopiassa ei ole detektoria F1-suunnassa. Tämän vuoksi F1-suunnassa taajuuksienetumerkit määritetään etukäteen F2-suunnassa tapahtuvan keräyksen aikana. Signaalin etumerkinmäärittäminen F1-suunnassa perustuu yksittäisten F2-suunnassa saatujen FID:ien faasikierrätykseen(phase cycling) jokaisen t1-inkrementin aikana. Koherenssipolut voidaan valita myös pulssitettujenkenttägradienttien (PFG) avulla. Tällöin faasikiertoa ei tarvita.

1D NMR:ssä käytetään normaalisti quadrature-detektiota. Siinä kantoaaltoon asetettu spektrin keskelle. Alkuperäinen NMR-signaali on jakautunutkahteen osaan ja sitä havaitaan kahdella detektorilla, joiden faasiero on 90°.Nämä detektorit tuottavat NMR-signaalin sini- ja kosinikomponentit. NMR-signaalin taajuus eroaa kantoaallon taajuudesta jonkin tietyn taajuudenverran. Tämän taajuuseron etumerkki kantoaallon suhteen voidaan määrittääyhtäaikaisella tai perättäisellä sini- ja kosinikomponenttien keräämisellä.

Sini

Kosini

19. 2D NMR

19.1 Yleistä

53

On tärkeää tietää, onko 2D NMR-spektri faasisensitiivinen vai ei. Faasisensitiiviselle spektrille pitäätehdä faasikorjaus, kun taas ei-faasisensitiiviselle spektrille (eli ns. magnitude-spektrille) sitä ei tehdä.Faasisensitiivisyys riippuu siitä, miten faasikierron tuottamia sini- ja kosinikomponentteja käsitelläänmittauksen aikana. Faasisensitiivisessä menetelmässä faasikierto tuottaa evoluutioajan t1 suhteen sini- jakosinikomponentit, jotka talletetaan erikseen. Tämän jälkeen tehtävä reaalinen Fourier-muunnos havaitseetaajuuksien etumerkit ja signaalien faasit. Tämä on lähes samanlainen menetelmä kuin 1D-NMR:ssä javoidaan tehdä yhtäaikaa (RSH, Ruben-States-Haberkorn) tai perättäisesti (TPPI, Time ProportionalPhase Increment). Ei-faasisensitiivisessä menetelmässä faasikierron tuottamia sini- jakosinikomponentteja ei talleteta erikseen. Kompleksinen Fourier-muunnos havaitsee tälläkin kertaataajuuksien etumerkit. Tuloksena on kuitenkin vääristyneitä signaaleja, jotka sisältävät sini- jakosinikomponentteja molemmissa dimensioissa. Sen vuoksi nämä spektrit prosessoidaan yleensämagnitude-menetelmällä. Gradienttivalittu 2D-spektri ei ole faasisensitiivinen, jos gradienttipulsseja onkäytetty evoluutioajan t1 aikana.

Faasisensitiivisen spektrin etuna on, että siinä korrelaatiopiikkien viivanmuoto voidaan esittää puhtaallaabsorptiolla sekä F1- että F2-suunnassa. Tästä seuraa, että faasisensitiivisellä spektrillä onkorkeampi resoluutio kuin muuten ulkomuodoltaan samanlaisella magnitude-spektrillä. Magnitude-signaalin viivanmuoto on leveämpi kuin puhtaan absorptiopiikin viivanmuoto. Faasisensitiivisen spektrinhaittana puolestaan on faasikorjaukseen kuluva aika.

Kurssin perustana olevassa Bruker Avance DPX400-spektrometrin manuaalissa DQF-COSY, TOCSY,NOESY/gs-NOESY, ROESY/T-ROESY/off-res-ROESY, HSQC ja G-BIRD-HSQMBC ovat faasisensitiivisiä 2D-mittauksia.

19. 2D NMR

19.1 Yleistä

54

1. Mittaa tarvittava(t) 1D spektri(t) ja määritä optimaalinen mittausalue, spektrin keskikohta, kalibrointiparametri(t) ja tarvittaessa kirjoita ylös 1D-mittauksen antama vastaanottimen taso

2. Luo uusi tiedosto ja valitse oikea 2D-parametrisetti3. (Tarvittaessa tuning ja matching)4. Jos olet mitannut 1D spektri(t) ennen tätä NMR-sessiota, lukitse ja shimmaa Z-shimmit (topshim, ilman

näytteen pyöritystä). Tarvittaessa XY-shimmit manuaalisesti5. Aseta oikeat keräysparametrit AcquPars-valikossa ja prosessointiparametrit ProcPars-valikossa6. Pysäytä spinneri (jos ei pysäytetty kohdassa 4.)7. Tee automaattinen vastaanottimen tason säätö (mikäli tasoa ei asetettu kohdassa 5.)8. Käynnistä mittaus9. Tee Fourier-muunnos ja automaattinen pohjaviivan korjaus10. Aseta 1D-projektiot11. Tee faasikorjaus, jos kyseessä on faasisensitiivinen 2D-spektri (pohjaviivan korjaus faasikorjauksen

jälkeen)12. Tee manuaalinen kalibrointi, mikäli tarpeellista13. (Tulosta spektri)

19. 2D NMR

19.2 Normaalin 2D-mittauksen kulku

55

1H,1H COSY on homonukleaarinen 2D-menetelmä, jossa spin-spinkytkeytyneet protonit antavatkorrelaatiopiikin. 1D NMR-spektri (yhdisteen normaali 1H spektri) esiintyy 2D-spektrin diagonaalilla jakorrelaatiopiikit symmetrisesti diagonaalin molemmilla puolilla

Diagonaali

Korrelaatiopiikki

F2

F1

a

b

c

a b c1D-spektrinprojektiot

19. 2D NMR

19.3 COSY ja DQF-COSY

56

COSY:ssä käytetään gradienttivalintaa halutun koherenssipolun valitsemiseen (korvaa faasikierron), jollointarvitaan periaatteessa vain yksi skannaus yhtä t1-inkrementtiä kohden. Tästä on seurauksena lyhyempimittausaika kuin ei-gradienttivalitulla eksperimentillä. DQF(Double Quantum Filtered)-COSY:ssägradienttipulssit toimivat kaksoiskvanttisuodattimina. Edelleen tarvitaan vain yksi skannaus per t1-inkrementti. Alla on esitetty COSY:n (A) ja DQF-COSY:n (B) pulssisarjat.

90°

t1

90°

t2

A

d1

1H

d0p1 p0

Grad.G1 G2

90°

t1

90°

t2

B

d1

1H

d0p1 p1

Grad.G1

180°

p2

90°

p1

180°

p2

G2

aq

aq

19. 2D NMR


57

19. 2D NMR


DQF-COSY:llä on joitain etuja ”normaaliin” COSY:yn verrattuna:

1. DQF-eksperimentti on faasisensitiivinen, ja sillä on siten korkeampi resoluutio kuin muutensaman informaation antavalla magnitude-spektrillä (COSY)

2. DQF-spektrissä diagonaalipiikit ovat pienempiä kuin normaalissa COSY-spektrissä

3. Kaksoiskvanttisuodatin eliminoi voimakkaat signaalit. Vain kaksoiskvanttisiirtymistä (doublequantum transfer) johtuvat piikit näkyvät selkeästi. Yksikvanttisiirtymistä (single quantum tranfer)aiheutuvat signaalit eivät pääse suodattimen läpi. Spinsysteemin täytyy sisältää vähintään kaksikytkeytynyttä spiniä (esim. AX, AB, ...), jotta piikit saataisiin näkyviin. Tämä tarkoittaa sitä, ettäesim. liuottimen 1H-jäännöspiikit, jotka eivät ole homonukleaarisesti J -kytkeytyneet, eivät näyspektrissä (mm. veden häiritsevä signaali saattaa kadota)

DQF-COSY:n haittana on sen epäherkkyys normaaliin COSY-mittaukseen verrattuna (pidempi mittausaika).Myös prosessointiin (faasikorjaus) kuluvaa aikaa voidaan pitää haittana.

58

19. 2D NMR


COSY-spektrille ei tehdä faasikorjausta. DQF-COSY-spektrin faasikorjauksessa tarkastellaankorrelaatiopiikkejä (ei diagonaalipiikkejä), jotka korjataan puhtaiksi absorptiosignaaleiksi. Aktiivinenkytkeytyminen näkyy antifaasirakenteena, joten multipletteja ei voi korjata siten, että kaikki piikit olisivatpositiivisia.

COSY-mittauksissa käytetyt parametrisetit ovat AN_COSY ja AN_DQF-COSY, joissa:

Pulssisarja (pulprog): cosygpqf (COSY) ja cosygpmfph (DQF-COSY)Kerättyjen datapisteiden määrä F2 (td): 2 kKerättyjen datapisteiden määrä F1 (td): 256 (COSY) ja 512 (DQF-COSY)Prosessoidun reaalisen spektrinkoko F1 + F2 (si): 1 k (COSY) ja 2 k (DQF-COSY)Skannausten lukumäärä (ns): 2Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16Spektrin leveys F1 + F2 (sw): 8 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan)Mittausaika (expt): n. 17 min (COSY) ja n. 1 h (DQF-COSY)

59

19. 2D NMR

19.4 TOCSY

1H,1H TOCSY-spektri antaa saman informaation kuin COSY. Lisäksi korrelaatioita havaitaan sellaistenprotonien välillä, jotka eivät ole kytkeytyneet suoraan toisiinsa, mutta sijaitsevat samassaspinsysteemissä. TOCSY-spinlukon kestoaika d9 määrittää kuinka pitkälle spin-spin-kytkeytynyttäverkostoa tutkitaan. Lyhyillä d9:n arvoilla (20 – 40 ms) mittaus antaa saman informaation kuin COSY.Pidemmillä arvoilla (60 – 100 ms) voidaan havaita kytkeytymisiä saman spinsysteemin kaukaisempiinprotoneihin. Kuten 1D TOCSY, 2D TOCSY-mittaus sisältää kaksi ZQF-sekvenssiä (Zero-Quantum Filter),joiden avulla spektristä voidaan suodattaa dispersiivisiä antifaasikomponentteja (vääristyneitä signaaleja).

TOCSY:ssä 1D NMR-spektri esiintyy 2D-spektrin diagonaalilla ja korrelaatiopiikit symmetrisestidiagonaalin molemmilla puolilla.

1H

d1 p1

90°

p1

SpinlukkoDIPSI-2

G0 G1 G0

p32 p34

90°

p1 aq

Grad.

SmoothedChirp(ZQF)

SmoothedChirp(ZQF)

90°

t1 t2

d0

60

TOCSY-spektrissä diagonaalipiikit korjataan positiivisiksi. Tällöin myös todelliset TOCSY-signaalit ovatpositiivisia.

TOCSY-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_TOCSY, jossa:

Pulssisarja (pulprog): zqf-tocsy_dipsi2Kerättyjen datapisteiden määrä F2 (td): 2 kKerättyjen datapisteiden määrä F1 (td): 256Prosessoidun reaalisen spektrinkoko F1 + F2 (si): 1 kSkannausten lukumäärä (ns): 8Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16Spektrin leveys F1 + F2 (sw): 8 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan)Sekoitusaika (d9): 80 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan)Mittausaika (expt): n. 1h 25 min

19. 2D NMR

19.4 TOCSY

61

19. 2D NMR

19.5 NOESY ja gs-NOESY

NOESY(Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY)-mittauksessa avaruudellisesti lähellä toisiaanolevat (dipoli-dipolikytkeytyneet) ytimet antavat spektrissä korrelaatiopiikin. NOEn etumerkki riippuumolekyylin korrelaatioajasta C. Seurauksena on, että NOESY-mittauksessa molekyylien, joidenmolekyylipaino on luokkaa 600 - 1500, korrelaatiopiikit saattavat kadota. Tällöin voi vaihtoehtoisestikokeilla ROESY-mittausta.

NMR-manuaalista löytyy kaksi NOESY-mittausta: standardi NOESY ja gradienttivalittu gs-NOESY, joistasaadaan sama informaatio. Kuten 1D NOESY, standardi 2D-NOESY-mittaus sisältää ZQF-sekvenssin, jokasuodattaa spektristä dispersiivisiä antifaasikomponentteja (vääristyneitä signaaleja). Tämän vuoksistandardi NOESY on parempi valinta, vaikka gs-NOESY:llä onkin selvästi lyhyempi mittausaika.

NOESY:ssä 1D NMR-spektri esiintyy 2D-spektrin diagonaalilla ja korrelaatiopiikit sijaitsevatsymmetrisesti diagonaalin molemmilla puolilla.

62

19. 2D NMR


t1

sekoitus

90°

1H

d1 p1 p1 aqp1

t1 t2

d0

sekoitus

90° 90°

G1

G2

p2

180°

Grad.

d8

A

B

Alla on esitetty standardi NOESY:n (A) ja gradienttivalitun gs-NOESY:n (B) pulssisarjat.

90°

1H

d1 p1

90°

p1

G0 G1

p32

90°

p1 aq

Grad.

SmoothedChirp(ZQF)

d8

d0

t2

63

19. 2D NMR


MA

MX

b

y’

x’

za

y’

x’

zc

y’

x’

z

d

y’

x’

ze

y’

x’

zf

y’

x’

z

NOESY-mittaus voidaan esittäävektorimallien avulla:

90°-x’ - t1 - 90°-x’ - - 90°-x’ - FID

Protonit A ja B kuuluvat samaan molekyyliinja ovat avaruudellisesti lähellä toisiaan, muttaeivät spin-spinkytkeytyneitä.

a: Alkutilanteessa makrokooppiset magnetisaatio-vektorit MA ja MX ovat orientoituneet z-akselinsuuntaisesti (B0:n suunta).b: 90°-x’-pulssi kääntää vektorit y’-akselin suuntaisiksi.c: Evoluution t1 aikana MA ja MX prekessoivat erinopeuksilla z-akselin ympäri.d: Toinen 90°-x’-pulssi kääntää vektoreiden y’-komponentit z-akselin suuntaisiksi (vektorit ovatkemiallisten siirtymien leimaamia). Suunta voi olla+z tai -z (tässä +z).e: Sekoitusaikana systeemi relaksoituu ja samallapolarisaatiota siirtyy MA:lta ja MX:lle ja päinvastoin ristirelaksaatio (cross-relaxation).f: Viimeinen 90°-x’-pulssi kääntää saadutmagnetisaatiovektorit y’-suuntaisiksi voidaanmitata FID.

64

19. 2D NMR


NOESY-spektrissä diagonaalipiikit korjataan negatiivisiksi, jolloin todellisilla NOESY-piikeillä on positiivinenfaasi. Mahdollisilla COSY-tyyppisillä signaaleilla on sama faasi kuin diagonaalilla.

NOESY-mittauksessa käytetyt parametrisetit ovat AN_NOESY ja AN_NOESYgs, joissa:

Pulssisarja (pulprog): noesygpphzs (NOESY) ja noesygpph (gs-NOESY)Kerättyjen datapisteiden määrä F2 (td): 2 kKerättyjen datapisteiden määrä F1 (td): 256Prosessoidun reaalisen spektrinkoko F1 + F2 (si): 1 kSkannausten lukumäärä (ns): 8 (NOESY) ja 4 (gs-NOESY)Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16Spektrin leveys F1 + F2 (sw): 8 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan)Sekoitusaika (d8): 500 ms (voidaan optimoida)Mittausaika (expt): n. 1 h 40 min (NOESY) ja n. 50 min (gs-NOESY)

65

19. 2D NMR

19.6 ROESY, T-ROESY ja off-resonance ROESY

ROESY(Rotating-frame Overhauser Effect SpectroscopY)-mittaus antaa saman informaation kuin NOESY,eli avaruudellisesti lähellä toisiaan olevat ytimet antavat spektrissä korrelaatiopiikin. ROESY:ssäsekoitus tapahtuu spinlukon aikana. Tästä seuraa, että ROE on aina positiivinen riippumatta molekyylinkorrelaatioajasta C. Eräs ROESY:n huono puoli on, että spektrissä saattaa esiintyä myös HOHAHA-tyyppisiä korrelaatioita. Tämä voidaan välttää käyttämällä ROESY:n sijasta T-ROESY-mittausta (Transverse-ROESY), jossa spinlukko muodostuu peräkkäisistä 180x 180-x pulsseista. T-ROESY saattaa joissaintapauksissa antaa heikompia korrelaatiosignaaleja kuin ROESY. Off-resonance ROESY-mittauksessaspinlukkoon käytetään trapetsoidin muotoista pulssia, joka on kohdistettu kauas sivuun spektrinkeskikohdasta. Off-resonance ROESY on tavallaan NOESY- ja ROESY-mittausten kombinaatio, jossanormaalissa ROESY-mittauksessa esiintyvät HOHAHA-tyyppiset ja off-resonance-virheet ovat tehokkaastieliminoitu.

ROESY:ssä 1D NMR-spektri esiintyy 2D-spektrin diagonaalilla ja korrelaatiopiikit sijaitsevatsymmetrisesti diagonaalin molemmilla puolilla.

90°

1H

d1 p1 aq

Spinlukko

p15

t1 t2

d0 aq

Spinlukko90°

p1 p1

90°

t2

90°

1H

d1 p1

t1

d0

ROESYT-ROESY

Off-resonance ROESY

p15

66

ROESY-spektrissä diagonaalipiikit korjataan negatiivisiksi, jolloin todellisilla ROESY-piikeillä onpositiivinen faasi.

ROESY-mittauksessa käytetyt parametrisetit ovat AN_ROESY ja AN_T-ROESY ja AN_off-res-ROESY, joissa:

Pulssisarja (pulprog): roesyph (ROESY), roesyph.2 (T-ROESY) ja troesyph(off-res-ROESY)

Kerättyjen datapisteiden määrä F2 (td): 2 kKerättyjen datapisteiden määrä F1 (td): 256Prosessoidun reaalisen spektrinkoko F1 + F2 (si): 1 kSkannausten lukumäärä (ns): 8Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16Spektrin leveys F1 + F2 (sw): 8 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan)Sekoitusaika (p15): 500 ms (vaihdettavissa tarpeen mukaan)Mittausaika (expt): Kaikki n. 1 h 40 min

Off-resonance ROESY-mittausta varten lasketaan spinlukon siirtymä ja laaditaan taajuuslista kutenkohdassa 17.4.

19. 2D NMR

19.6 ROESY, T-ROESY ja off-resonance ROESY

67

HMQC-(Heteronuclear Multible-Quantum Coherence) ja HSQC-(Heteronuclear Single-QuantumCoherence)spektreissä suoraan toisiinsa kytkeytyneiden 1H- ja 13C-ytimien välillä havaitaankorrelaatiopiikki.

Korrelaatiopiikki

F2 (1H)

F 1(

13C

)

1H NMR1D-spektrin

projektio

13C NMR1D-spektrin

projektio

Kvaternaarinenhiili ei suoraa H,C-korrelaatiota

19. 2D NMR

19.7 HMQC ja HSQC

68

HMQC ja HSQC ovat ns. käänteisiä mittauksia (inverse experiments), eli niissä havaitaan sitä ydintä, jollaon suurempi gyromagneettinen suhde (eli tässä tapauksessa protonia). Näin saavutetaan suurempiherkkyys kuin suorassa mittauksessa, jossa havaitaan epäherkkää 13C-ydintä (esim. 13C,1H HETCOR; Huom!ensiksi mainittu ydin on se, jota havaitaan).

Käänteisten mittausten ongelmana on ei-toivottujen, 12C-ytimeen sitoutuneiden protonien signaalienpoistaminen. Nykyaikaisessa NMR-spektroskopiassa tällaiset signaalit voidaan poistaa lähes täydellisestihyödyntäen PFG-tekniikkaa. Tällöin ei tarvita ylimääräisiä faasikiertoja ja mittausaika lyhenee.

HMQC-mittauksessa korrelaatiopiikit ovat leventyneet F1-suunnassa homonukleaarisen 1H,1H-kytkeytymisenvuoksi. Seurauksena on heikompi resoluutio tässä suunnassa. HSQC-mittauksessa ei tapahdu resoluutionpienenemistä F1-suunnassa, koska evoluutioaikana t1 esiintyy ainoastaan 13C single-quantum (yksikvantti)magnetisaatiota.

HMQC- ja HSQC-mittausten periaate:Ensin tehdään n kappaletta mittauksia eri t1-arvoilla (inkrementit muutaman s:n luokkaa) alkaen nollasta ainamuutamaan millisekuntiin asti. FIDien Fourier-muunnokset t2:n suhteen antavat taajuusspektrejä F2, jotkasisältävät tietoa 1H kemiallisista siirtymistä ja kytkentävakioista. Toinen Fourier-muunnos t1:n suhteen antaa2D-spektrin, jossa on korrelaatiopiikkejä (C,H)-asemissa.

19. 2D NMR

19.7 HMQC ja HSQC

69

Alla on esitetty HMQC:n pulssisarja. Tässä esitetty versio ei ole faasisensitiivinen (gradienttipulssejaevoluution t1 aikana). Brukerin vastaava HSQC on faasisensitiivinen. HMQC:ssa gradientteja käytetäänkoherenssien valintaan ja quadrature-detektioon F1-suunnassa. Brukerin HSQC:ssa gradientteja käytetäänpelkästään koherenssien valintaan.

90°

1H

G3G1

180°t2

Grad.

90° 90°

t1/2

13C

1/(21J CH) t1/2

G2

d1

p1 p2aq

d2 d0 d0

p3 p3

19. 2D NMR

19.7 HMQC ja HSQC

70

HMQC- ja HSQC-mittauksissa käytetyt parametrisetit ovat AN_HMQC ja AN_HSQC, joissa:

Pulssisarja (pulprog): hmqcgpqf (HMQC) ja hsqcetgpsi (HSQC)Kerättyjen datapisteiden määrä F2 (td): 2 kKerättyjen datapisteiden määrä F1 (td): 256Prosessoidun reaalisen spektrinkoko F1 + F2 (si): 1 kSkannausten lukumäärä (ns): 2Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16Spektrin leveys F2 (sw): 8 ppm (optimoidaan)Spektrin leveys F1 (sw): 250 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta F2 (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta F1 (o2p): 120 ppm (optimoidaan)Mittausaika (expt): Molemmat n. 21 min

19. 2D NMR

19.7 HMQC ja HSQC

71

HMBC:llä on seuraavia heikkouksia:

1. F1-suunnassa esiintyy multiplettirakennetta 13C-resoluutio heikompi

2. Vain yksi kiinteä polarisaatioviive, jonka aikana pitkän matkan 1H,13C-kytkentöjen evoluutiotapahtuu selvästi polarisaatioviiveen määrittämästä nJCH-arvosta poikkeavat kytkennät antavatheikommat signaalit/katoavat kokonaan

3. Kytkentävakiosta riippuen spektrissä saattaa esiintyä suoria 1H,13C-kytkeytymisiä (1JCH), jotkanäkyvät dupletteina F2-suunnassa ei voida hyödyntää 1H,13C-kytkentöjen irrottamista (dupletitsulautuisivat singletiksi ei voida erottaa 1JCH- ja nJCH-kytkeytymisiä), jolloin saavutettaisiinterävämmät signaalit F2-suunnassa. Lisäksi ylimääräiset signaalit vaikeuttavat spektrin tulkitsemista

19. 2D NMR

19.8 HMBC ja CIGAR-HMBCHMBC (Heteronuclear Multible Bond Correlation) on HMQC:n modifioitu versio, jonka avulla voidaanselvittää kahden tai useamman sidoksen yli tapahtuvat 1H,13C-kytkennät. HMBC, kuten HMQC jaHSQC, on käänteinen mittaus (herkempi kuin vastaava 13C-havaittu COLOC).

Manuaalissa on esitetty kaksi HMBC-mittausta: HMBC ja CIGAR-HMBC (Constant time Inverse-detectedGradient Accordion Rescaled long-range HMBC), joista jälkimmäinen on suositeltavampi.

CIGAR-HMBC-mittauksessa F1-dimension multiplettirakenne voidaan poistaa kokonaan, jolloin tässäsuunnassa saavutetaan HMBC-mittausta parempi resoluutio. CIGAR-HMBC käy läpi käyttäjänmäärittelemän alueen nJCH-arvoja, jolloin on mahdollista nähdä enemmän korrelaatiosignaaleja. LisäksiCIGAR-HMBC:ssä suorat 1H,13C-kytkeytymiset on minimoitu, joten 1H,13C-kytkentöjen irrottaminen onmahdollista. Tästä seuraa, että signaalit ovat terävämpiä F2-suunnassa.

72

90°

1H

G3G1

180°t2

Grad.

90° 90°

t1/2

13C

1/(2nJ CH) t1/2

G2

90°

1/(21J CH)d1

p1 p2aq

d2 d0 d0

p3 p3

d6

p3

19. 2D NMR

19.8 HMBC ja CIGAR-HMBC

Alla on esitetty HMBC:n pulssisarja. Tässä esitetty versio ei ole faasisensitiivinen (gradienttipulssejaevoluution t1 aikana). Myöskään CIGAR-HMBC ei ole faasisensitiivinen. Viive 1/(2nJCH) on AN-parametrisetissä 50 ms, joka vastaa kytkentävakion arvoa 10 Hz (pitkän matkan 1H,13C-kytkentöjenevoluutio). CIGAR-HMBC käy läpi nJCH-arvot 6 – 10 Hz.

73

HMBC-mittauksissa käytetyt parametrisetit ovat AN_HMBC ja AN_CIGAR-HMBC, joissa:

Pulssisarja (pulprog): hmbcgplpndqf (HMBC) ja hmbcacgplpqf (CIGAR-HMBC)Kerättyjen datapisteiden määrä F2 (td): 2 kKerättyjen datapisteiden määrä F1 (td): 256Prosessoidun reaalisen spektrinkoko F1 + F2 (si): 1 kSkannausten lukumäärä (ns): 8Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16Spektrin leveys F2 (sw): 8 ppm (optimoidaan)Spektrin leveys F1 (sw): 250 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta F2 (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta F1 (o2p): 120 ppm (optimoidaan)nJCH-Kytkentöjen evoluutiogs-HMBC (cnst13): 10 HzCIGAR-HMBC (cnst14 ja cnst15): 6 Hz (min.) ja 10 Hz (max.)Mittausaika (expt): n. 1 h 25 min (HMBC) ja n. 1 h 30 min (CIGAR-HMBC)

19. 2D NMR

19.8 HMBC ja CIGAR-HMBC

74

19. 2D NMR

19.9 G-BIRD-HSQMBC

G-BIRD-HSQMBC(Heteronuclear Single Quantum Multiple Bond Correlation)-mittauksen avulla voidaanmäärittää kahden tai useamman sidoksen yli tapahtuvien 1H,13C-kytkentöjen kytkentävakioidenarvot (nJCH).

90°

1H

G3

180°t2

Grad.

90°

t1/2

13C

t1/2

G1

p1 p2aq

d2 d0 d0

p3

d6/2

180°90°

p2p1

90°

p1Tr

imm

ip28 p1

90° 180°

p2p1

90°

p14

90°

p3

G3

d2 d6/2

G4 G2

p24

75

G-BIRD-HSQMBC-mittauksessa käytetty parametrisetti on AN_G-BIRD-HSQMBC, jossa:

Pulssisarja (pulprog): hsqcetgpjclrndKerättyjen datapisteiden määrä F2 (td): 4 kKerättyjen datapisteiden määrä F1 (td): 512Prosessoidun reaalisen spektrinkoko (si): 8 k (F2), 1 k (F1)Skannausten lukumäärä (ns): 8Skannausten lkm. ilman keräystä (ds): 16Spektrin leveys F2 (sw): 8 ppm (optimoidaan)Spektrin leveys F1 (sw): 250 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta F2 (o1p): 3.5 ppm (optimoidaan)Spektrin keskikohta F1 (o2p): 120 ppm (optimoidaan)Mittausaika (expt): n. 3 h 10 min

19. 2D NMR

19.9 G-BIRD-HSQMBC

G-BIRD-HSQMBC-spektrille tehdään faasikorjaus.Korrelaatiopiikit korjataan puhtaiksi absorptiosignaaleiksi.Kytkeytyminen näkyy antifaasirakenteena, jotenmultipletteja ei voi korjata siten, että kaikki piikit olisivatpositiivisia. G-BIRD-HSQMBC-spektristä eristetään 1D-spektrejä kytkentävakioiden määrittämistä varten.

2D HSQMBC-korrelaatio

ja vastaava 1D-spektri

76

20. Pure shift-mittaukset

Pure shift-mittauksissa poistetaan protonien väliset kytkeytymiset. Tuloksena on spektri, jossa näkyvät vainprotonien kemialliset siirtymät. Tällä tavoin on mahdollista saavuttaa jopa monikymmenkertainen resoluutionlisäys normaaliin mittaukseen verrattuna. Tällä hetkellä orgaanisen kemian NMR:llä on mahdollista mitata 1D1H ja 2D TOCSY pure shift-spektrit. 1D 1H pure shift-mittaus on itse asiassa 2D-mittaus, joka prosessoidaan1D-spektriksi. 2D pure shift-spektriin päädytään vastaavasti 3D-mittauksen kautta. Pure shift-mittaustenongelmana on usein niiden epäherkkyys (pitkät mittausajat) verrattuna normaaliin mittaukseen. Alla onesitetty 1D 1H pure shift-mittauksen pulssisarja.

90°

1H

G1

Grad.

p1

180°

p2

G2

p12

G4

G3

t1 t1

1/SW1

Rsnob180°

77

20. Pure shift-mittaukset1D 1H pure shift-spektri (sininen)Normaali 1D 1H-spektri (punainen)

78

20. Pure shift-mittaukset1D 1H pure shift-spektri (sininen)Normaali 1D 1H-spektri (punainen)

79

20. Pure shift-mittauksetNormaali TOCSY (vas.)Pure shift TOCSY (oik.)

80

20. Pure shift-mittauksetNormaali TOCSY (v.pun.)Pure shift TOCSY (musta)

81

21. NOE-Mittauksista

Orgaanisen kemian laboratorion NMR-spektrometrilla on tällä hetkellä mahdollista tehdä seuraavanlaisia NOE-mittauksia: selektiivinen 1D NOESY/ROESY/off-resonance ROESY, 2D NOESY (standardi ja gradienttivalittu) ja2D ROESY/T-ROESY/off-resonance ROESY. Lisäksi käytettävissä on kaksi erittäin selektiivistä pseudo-2D-mittausta: CSSF-NOESY ja CSSF-off-res-ROESY.

NOE-mittauksen valintaan vaikuttavat:

1. Molekyylipaino

2. Näytteen määrä

3. Halutun NOE-informaation määrä

On myös huomioitava, että sekoitusajalla (mixing time) ja näytteen valmistuksella on suuri vaikutus NOE-spektriin.

82


MolekyylipainoNOE:n suuruus riippuu molekyylin pyörimisnopeudesta akselinsa ympäri (tumbling rate), joka puolestaanon suuresti riippuvainen molekyylipainosta. Muita tärkeitä tekijöitä ovat liuottimen viskositeetti jalämpötila. NOE on positiivinen pienillä molekyyleillä (MW < 600), käy nollan kautta keskikokoisillamolekyyleillä (MW 600 – 1500) ja on negatiivinen suurilla molekyyleillä (MW > 1500). Keskikokoisillamolekyyleillä NOE voi olla teoreettisesti nolla, jolloin on syytä käyttää ROESY-eksperimenttiä (ROE on ainapositiivinen). On kuitenkin muistettava, että normaalilla ROESY:llä on omat huonot puolensa. Off-resonance ROESY:ssä nämä heikkoudet on tehokkaasti minimoitu.

Näytteen määrä ja halutun NOE-informaation määräValinta 1D- ja 2D-mittausten välillä riippuu näytteen määrästä ja halutun NOE-informaation määrästä. 1D-mittaukset antavat informaatiota vain säteilytetyn signaalin NOE-korrelaatioista, kun taas 2D-mittauksetantavat koko molekyylin NOE-informaation yhdellä mittauskerralla. Yleisesti ottaen 1D-mittaukset ovatselvästi nopeampia kuin 2D-mittaukset. 1D-mittausten etuna on myös helpompi ja nopeampi prosessointi.

Jos näyte on kohtuullisen konsentroitu ( 10 mg 0.6 ml:ssa liuotinta) ja kiinnostuksen kohteena on 5NOE:a, on 1D-mittaus hyvä valinta. Jos näytemäärä on pieni (< 1 – 2 mg 0.6 ml:ssa liuotinta) ja lukuisatNOE:t kiinnostavat, on 2D-mittaus parempi valinta.

Mikäli selektiivisessä 1D-mittauksessa säteilytettävä signaali on liian lähellä (< 30 Hz tai 0.075 ppm 400MHz laitteella) muita signaaleja, ei 1D-mittauksen selektiivisyys välttämättä riitä. Tällöin on syytä tehdä2D-mittaus tai erittäin selektiivinen pseudo-2D-mittaus, joka hyödyntää CSSF-sekvenssiä.

83


SekoitusaikaSekoitusaika on tärkeä parametri, koska NOE:n kehittyminen vie aikaa. Kehittymisen nopeus riippuumolekyylipainosta ja ytimien välisistä avaruudellisista etäisyyksistä.

•Pienet molekyylit (MW < 600) 0.5 – 2 s•Keskikokoiset molekyylit (MW 600 – 1500) 0.1 – 0.8 s•Suuret molekyylit (MW > 1500) 0.05 – 0.2 s

Kaikissa AN-alkuisissa NOE-parametriseteissä sekoitusajalle on annettu arvoksi 500 ms. Tämä aika onkuitenkin helposti optimoitavissa.

Näytteen valmistusLiuennut happi saattaa vähentää havaittavan NOE:n intensiteettiä. Tämän vuoksi näytteelle tulisi tehdäkaasun poisto. Paras menetelmä tähän on ns. freeze-pump-thaw-sykli, jossa NMR-putkessa oleva näyteensin jäädytetään, sitten putkeen imetään vakuumi ja vakuumilinjan sulkemisen jälkeen annetaannäytteen hitaasti lämmetä huoneenlämpöön. Tätä sykliä toistetaan 3 – 5 kertaa. Toinen (huonompi)menetelmä on näytteen kuplittaminen inertillä kaasulla (esim. N2 tai Ar). Hapen lisäksi paramagneettisetmetalli-ionit (esim. Cr ja Mn) vaikuttavat NOE:a heikentävästi.

84

22. Lineaarinen ennustaminen (linear prediction)Lineaarisen ennustamisen avulla voidaan parantaa 2D-spektrien resoluutiota lisäämällä mitattuun dataandatapisteitä. Yleensä FID on typistetty F1-suunnassa mittausajan lyhentämiseksi. Jos halutaan lisää datapisteitäF1-suuntaan, pitää TD-parametrin arvoa kasvattaa tässä suunnassa. Tämä johtaa mittausaikojenpidentymiseen. Esimerkiksi TD:n kaksinkertaistaminen F1-suunnassa kaksinkertaistaa FIDien määrän tässäsuunnassa ja johtaa kaksi kertaa pidempään mittausaikaan. Lineaarinen ennustaminen onprosessointimenetelmä, jonka avulla resoluutiota voidaan parantaa F1-suunnassa ilman mittausajanpidentymistä. Lineaarista ennustamista voidaan käyttää myös F2-suunnassa. Parempi on kuitenkin säätääennen mittausta suhde SW(F2)/TD(F2) sellaiseksi, että digitaalinen resoluutio (FIDRES) saa F2-suunnassahalutun arvon. Mitä pienempi FIDRES, sitä parempi resoluutio.

Lineaarisessa ennustamisessa käytettävien kertoimien lukumäärä määritetään parametrin NCOEF avulla. Tätäparametria optimoimalla pyritään mahdollisimman hyvään lopputulokseen. Oletusarvo NCOEF=100 TD(F1)-arvolla 256 on hyvä lähtökohta. Normaalisti lineaarista ennustamista ei tehdä. Tällöin prosessointiparametriME_mod saa arvon NO. Kun ME_mod-parametrille on annettu jokin muu arvo kuin NO, tapahtuu lineaarinenennustaminen 2D Fourier-muunnoksen yhteydessä. Normaalisti lineaarinen ennustaminen tehdään ME_modarvolla LPfr. Alla esimerkki lineaarisesta ennustamisesta sovellettuna G-BIRD-HSQMBC-mittaukseen.

Ei LP

LPF1-suunnassa

85

23. VT-MittauksetProben lämpötila on normaalisti 25 °C (298 K). On kuitenkin mahdollista tehdä mittauksia sekäkorkeammissa että matalammissa lämpötiloissa. Käytettävissä oleva lämpötila-alue on rajoitettu -80 °C ja+100 °C välille. Näiden rajojen ylitys on mahdollista kysymällä ensin lupa allekirjoittaneelta. Ennen VT-mittauksia on syytä varmistaa, että näyte kestää kohdelämpötilan jäätymättä tai kiehumatta. Tarkistakäytetyn liuottimen jäätymis- tai kiehumispiste äläkä mene 10 °C lähemmäksi tätä lämpötilaa. VT-työskentelyssä pitää käyttää ehjiä ja korkealaatuisia NMR-putkia (esim. Wilmad 528-PP). Spinnerinäkäytetään valkoista keraamista spinneriä, joka kestää sekä korkeita että matalia lämpötiloja. Sinisienmuovisten spinnerien lämpötila-alue on vain +10 – +50 °C.

VT-mittauksia varten on varattava riittävästi spektrometriaikaa. Uuden lämpötilan stabiloitumiseenkannattaa varata ainakin 10 min. Tämän jälkeen pitää shimmata ja tarpeen mukaan tehdä myös viritys jasovitus. Huomioi, että riippuen VT-mittauksessa käytetystä lämpötilasta, proben tuominen takaisinhuoneenlämpötilaan voi kestää jopa 30 min. Muista myöskin merkitä normaalista poikkeavat lämpötilat NMR-lokikirjaan.

VT-mittauksia kontrolloidaan edte-ikkunasta käsin (aukeaa komennolla edte).

KylmämittauksetNestetypellä täytettyyn Dewar-astiaan sijoitetulla evaporaattorilla tuotetaan kylmää typpikaasua, jokajohdetaan probeen. Kylmä kaasu lämmitetään haluttuun lämpötilaan probessa olevalla lämmittimellä.Näytteen lähellä sijaitseva anturi tarkkailee lämpötilaa ja lähettää signaalin kontrolliyksikköön, jokapuolestaan korottaa tai laskee evaporaattorin lämpötilaa.

Alin mahdollinen stabiili lämpötila ilman jäähdytystä on (valitettavasti) n. 24 °C. Tätä alempia lämpötilojavarten täytyy rakentaa nestetyppijäähdytyslaitteisto.

Mittaukset korotetussa lämpötilassaProbessa oleva lämmitin lämmittää sisään tulevan paineilman haluttuun lämpötilaan.

86

24. Liuotinsignaalien suppressointi

Voimakas liuotinsignaali saattaa dominoida NMR-spektriä ja peittää alleen tutkittavan yhdisteen signaalit.Tällöin voidaan hyödyntää erilaisia liuotinsignaalien suppressointiin tarkoitettuja menetelmiä. Liuotinsignaalinsuppressointi on välttämätöntä, jos liuottimena käytetään vaikkapa 10% D2O / 90% H2O-seosta. Signaalinsuppressointiin voidaan käyttää esimerkiksi:

•Säteilytystä

•Säteilytystä komposiittipulssien avulla

•WATERGATE-pulssisarjaa

•Excitation sculpting-menetelmää

•WET-menetelmää (useiden signaalien suppressointi)

87

25. Muutamia hyödyllisiä komentoja

multizgKomennon multizg avulla voidaan mitata useita NMR-spektrejä yhdellä käskyllä. Jos eri mittaustenparametrit ovat valmiina, kaikki mittaukset tehdään niiden mukaisesti. Mikäli uusia mittauksia ei ole luotu,kopioituu sen hetkinen parametrisetti. Multizg:n päätyttyä spektrit prosessoidaan manuaalin ohjeidenmukaisesti. Multizg voidaan pysäyttää antamalla komento kill ja valitsemalla exec. Tämä päättää kokomultizg-mittauksen. Mikäli halutaan lopettaa vain kyseisellä hetkellä käynnissä oleva mittaus, valitaan kill-komennon jälkeen zg.

multi_zgvdKomennon multi_zgvd avulla voidaan toistaa useita kertoja jokin tietty NMR-mittaus joko samanapysyvän viiveen ja vaihtelevan viiveen jälkeen. Muutoin tämä komento toimii kuten multizg.

multi_procKomennon multi_proc avulla voidaan prosessoida useita 1D-spektrejä yhdellä komennolla. Tämäkomento tekee Fourier-muunnoksen (ef), faasikorjauksen (apk) ja pohjaviivan korjauksen (abs).

88

26. NMR-Putkien puhdistaminen

YleistäSuoraan paketista otetut NMR-putket eivät ole välttämättä puhtaita. Valmistusmenetelmästä johtuen nesaattavat sisältää orgaanisia ja/tai epäorgaanisia epäpuhtauksia.

Älä käytä harjaa tai hankaavia pesuaineita, kun peset NMR-putkia!

Yksinkertainen puhdistusJos NMR-putki ei ole kovin likainen, pelkkä huuhteleminen vedellä tai orgaanisella liuottimella on riittäväpuhdistustoimenpide. Lopullinen huuhtelu kannattaa tehdä asetonilla tai tislatulla vedellä (jos näyte aiotaanliuottaa D2O:n).

Vaikeammat puhdistusongelmatJos näyte on ollut NMR-putkessa pitkiä aikoja, saattaa edessä olla vaikea puhdistusprosessi. Älä siissäilytä näytteitä NMR-putkissa pitkään! Mikäli lika ei lähde huuhtelemalla, useamman päivän liuotusväkevässä typpihapossa todennäköisesti auttaa. Happoliuotuksen jälkeen putki on huuhdeltava huolellisestivedellä ja lopuksi asetonilla tai tislatulla vedellä.

Polymeeriset näytteet saattavat aiheuttaa vielä vaikeampia puhdistusongelmia. Proteiineille japolysakkarideille riittää yleensä pelkkä happoliuotus. Happoja kestäviä synteettisiä polymeerejä voi ensinyrittää turvottaa jossain sopivassa liuottimessa. Tämän voi jälkeen yrittää onkia pehmennyt materiaali poisputkesta. Kannattaa myös kokeilla ultraäänipuhdistusta. Tällöin on syytä varoa, etteivät hauraat NMR-putketkosketa toisiaan ultraäänihauteessa.

89

26. NMR-Putkien puhdistaminen

Veden poistaminen NMR-putkistaVältä mahdollisuuksien mukaan NMR-putkien kuivausta uunissa! Jos uunikuivaus onvälttämätöntä, sijoita putket lappeelleen täysin tasaiselle alustalle vain 30 – 45 min ajaksi uuninlämpötilan ollessa korkeintaan 125 °C. Vakuumiuuni on tavallista uunia parempi vaihtoehto.

Kemisorptioitunut vesi ei lähde putken pinnalta edes korkeassa lämpötilassa. Tämän vuoksi vesi kannattaapoistaa kemiallisesti. Eräs tapa on vaihtaa kemisorptioitunut vesi deuteriumiin (esim. D2O) ennen lyhyttäuunikuivausta.

Jos vesi hajottaa näytteen, on veden poistaminen välttämätöntä. Tällöin voi kokeilla reaktiotahydridiliuoksen kanssa. Hydridihuuhtelun jälkeen viimeinen huuhtelu ennen uunia kannattaa tehdäkuivatulla asetonilla. Uunikuivauksen jälkeen putki pitää siirtää heti eksikaattoriin jäähtymään. Sulje putkethuolellisesti kuivauksen jälkeen.

Documents

(3 op) Staff Scientist, FT Jari Koivisto€¦ · 4 1. Johdanto 1.1 NMR-Laboratorion yleiset säännöt •Vain valtuutetut käyttäjät voivat operoida spektrometria •Valtuutettuja