10

INTRODUÇÃO GERAL

Os basidiomicetos Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes são fungos

lignocelulósicos com capacidade de degradar diversos materiais, devido à produção

de enzimas extracelulares, principalmente enzimas lignolíticas como a lacase

(BALDRIAN et al., 2005; GIANFREDA et al., 1999; LECHNER; PAPINUTTI, 2006;

POPPE, 2005; SILVA et al., 2005). Esta enzima atua em materiais lignocelulósicos,

permitindo a utilização de subprodutos da agroindústria, ricos em lignina e celulose,

para o cultivo de cogumelos. Sendo assim, o cultivo de cogumelos é uma forma de

agregar valor a resíduos que seriam descartados e produzir biomassa de interesse

terapêutico e nutricional (EIRA, 2003; ISHIKAWA et al., 2001; SHARMA; MADAN,

1993; SOUZA-PACCOLA et al., 2004; WASSER; WEIS, 1999).

Alguns biocompostos de interesse terapêutico ou nutricional produzidos por

estes fungos podem ser extraídos diretamente do micélio, não necessitando a

formação de basidiocarpo, reduzindo assim o tempo e os custos de produção. Outro

processo que utiliza o micélio é a produção de inoculantes para produtores de

cogumelos (EIRA, 2003; HWANG et al; 2005; MATA et al., 2001; SANCHEZ, 2004;

SHU et al., 2006). Dessa forma o desenvolvimento de substratos para o crescimento

micelial de fungos é uma alternativa para acelerar o processo de obtenção de

biocompostos.

A manutenção adequada do micélio destes fungos é necessária para a

preservação de suas características biológicas. A criopreservação é uma das

técnicas mais utilizadas na preservação de fungos, podendo utilizar temperaturas de

-70 ºC a -196 ºC (PUTZKE; PUTZKE, 1998). A utilização de temperaturas mais

elevadas, como de -20ºC neste processo o torna mais acessível (HUBÁLEK, 2003;

MATA; PEREZ-MÉRLO, 2003; MATA; SALMONES, 2005; PUTZKE; PUTZKE,

1998),

Sendo assim, no artigo 1 foi realizado crescimento micelial de Pleurotus sp e

no artigo 2 o crescimento micelial Lentinula edodes, em diferentes subprodutos da

agroindústria, caracterizados físico-quimicamente. Primeiramente o micélio foi

crescido em meios de cultivo em placa de Petri e posteriormente, baseado nos

melhores meios de cultivo em placas de Petri, o fungo foi cultivado em substratos de

cultivo com diferentes granulometrias em tubos de borosilicato. Em ambos os casos

11

mantiveram-se fixa a relação carbono-nitrogênio (C/N). Após estas etapas foi

realizada a determinação da atividade da enzima lacase nos substratos com maior

crescimento micelial em tubos de borosilicato, e adicionado indutores de produção

da enzima de acordo com planejamento fatorial fracionário.

Nos artigos 3 e 4 realizou-se a criopreservação de Pleurotus ostreatus e

Lentinula edodes, respectivamente. Para a preservação das linhagens foi realizado

primeiramente um teste de inibição do crescimento micelial por diferentes

concentrações de crioprotetores. Em seguida, selecionou-se a porcentagem de

crioprotetor que causou menor porcentagem de inibição e cresceram-se os fungos

em diferentes grãos ou cilindro de meio batata-dextrose-ágar. Assim, o fungo foi

criopreservado em diferentes substratos e com adição de diversos crioprotetores nas

temperaturas de -20 ºC ou -70 ºC. A recuperação do fungo foi feita após um ano de

congelamento, em meio de cultivo batata-dextrose-ágar.

12

2. FATORES FÍSICO-QUÍMICOS PRESENTES NO SUBSTRATO DE CULTIVO DE

Pleurotus sp.

2.1. INTRODUÇÃO

A produção anual de resíduos da agricultura é estimada em 500 milhões de

toneladas, sendo parte utilizada para alimentação animal e outra grande parte

acumulada no ambiente (POPPE, 2005; RAJARATHNAM; BANO, 1987). O Brasil é

um dos maiores produtores mundiais de soja (Glycine max), mandioca (Manihot

esculenta) e milho (Zea mays). Grande parte da produção nacional é proveniente do

estado do Paraná, sendo o Estado também produtor de arroz (Oryza sativa) e trigo

(Triticum aestivum) (PARANÁ, 2007). O processamento destes vegetais gera

resíduos em função do processo tecnológico adotado, podendo os subprodutos

serem constituídos de fibras, farelos, bagaços, cascas e outros materiais

lignocelulósicos com potencial para o crescimento diversos microrganismos

(CEREDA, 2001; HOSENEY, 1991).

Os cogumelos comestíveis são uma alternativa de melhor utilização destes

subprodutos, através do processo de bioconversão, auxiliando na diminuição do

acúmulo destes resíduos e gerando biomassa de interesse comercial (POPPE,

2005; SILVA et al., 2005). Os fungos do gênero Pleurotus possuem capacidade de

colonizar uma variedade de substratos quando comparado a outros fungos (POPPE,

2005), exigindo uma menor complexidade das técnicas de cultivo quando

comparado com fungos do gênero Agaricus (SILVA et al., 2007). Este fato se deve

principalmente pela produção de grande quantidade de enzimas extracelulares

lignocelulóticas como xilanases, celulases e lacases (BALDRIAN et al., 2005). A

lacase é a principal enzima envolvida na degradação de lignina do sistema lignolítico

de fungos (GIANFREDA et al., 1999), sendo sua atividade fortemente influenciada

pela linhagem, composição do substrato e condições de cultivo do fungo

(ELISASHIVILI, 2008; HOU et al., 2004; STAJIC et al., 2006). As propriedades

físicas do substrato de cultivo incluindo natureza cristalina, área de superfície,

porosidade e principalmente tamanho da partícula são essenciais para a atividade

enzimática (PANDEY, 2003). Existe uma diversidade de resíduos lignocelulósicos

13

regionais que apresentam estas características e que podem ser utilizados como

substrato.

Devido à sua capacidade de degradar compostos fenólicos, a lacase pode ser

aplicada em diversas áreas da indústria, como branqueamento e aumento da

resistência do papel e tratamento de efluentes (WIDSTEN; KANDELBAUER, 2008).

Sendo assim é importante o aumento da habilidade dos basidiomicetos produzirem

lacase para aplicações industriais (HOU et al., 2004). O aumento na produção de

lacase por Pleurotus ostreatus pode ocorrer com a adição de indutores (ARORA;

GILL, 2001; BALDRIAN, 2003; BALDRIAN et al., 2005; BALDRIAN; GABRIEL,

2002).

Além da habilidade de crescer em grande variedade de resíduos, o gênero

Pleurotus possui alto valor nutricional (SHARMA; MADAN, 1993) e capacidade de

produzir biocompostos antitumorais (WASSER; WEIS, 1999) e hipocolesterolêmicos

(HOSSAIN et al., 2003). Os diferentes biocompostos produzidos por cogumelos

podem ser extraídos diretamente do micélio do fungo (HWANG et al., 2005; SHU et

al., 2006), não necessitando o desenvolvimento do corpo de frutificação. Isto

diminuiria o custo do processo, pois envolve um menor número de mão de obra e de

etapas de cultivo. Portanto, a análise do crescimento micelial, bem como a

otimização deste processo é fundamental para a produção de princípios ativos

terapêuticos em escala industrial.

Outro processo que utiliza a produção de biomassa micelial é a indústria de

produção de inoculantes (spawn). Inoculantes são propágulos viáveis do fungo,

geralmente em veículo sólido, utilizados para colonizar o substrato de produção

(EIRA, 2003). Segundo Herrera (2001), cerca de 80% dos produtores de cogumelos

não produz substrato de cultivo próprio, encarecendo o produto final aos

consumidores. Portanto, a busca de matérias-primas alternativas regionais poderia

abrir perspectivas de preparo de inóculo e de substrato próprios, evitando os custos

de transporte de outras regiões (DIAS et al., 2003).

Buscando a melhor utilização dos resíduos regionais agrícolas o objetivo

deste trabalho foi avaliar a composição físico-química para a produção de biomassa

e de lacase de diferentes formulações de substratos a partir de subprodutos da

agroindústria para o gênero Pleurotus.

14

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular da

Universidade Paranaense - Campus sede de Umuarama, Paraná, Brasil. Foram

utilizadas quatro linhagens do gênero Pleurotus: Pleurotus ostreatus (U6/8),

Pleurotus ostreatus (U6/9), Pleurotus florida (U6/10), Pleurotus ostreatus (U2/11),

provenientes da micoteca da Universidade Estadual de Londrina - UEL. O fungo foi

cultivado em meio batata-dextrose-ágar (BDA) (39 g/L) a 25 ºC em estufa sem

circulação de ar. Após a recuperação do vigor de crescimento, foram selecionadas

como inóculo placas com ramificação homogênea, sem setoriamento.

2.2.1 Crescimento do fungo em placas de Petri

As matérias-primas utilizadas para compor os meios de cultivo foram: fibra de

soja (FS), farelo de trigo (FT), farelo de arroz (FA), grãos de milho (GM), sabugo de

milho (SM), fibra de mandioca (FM) e serragem de eucalipto (SE). A FM foi obtida a

partir de tubérculos, provenientes do horto medicinal da Universidade Paranaense,

descascados, lavados e triturados com água em liquidificador. A massa obtida foi

transferida para um filtro de pano e lavada com água corrente. A FM resultante foi

seca em estufa com circulação de ar a 45 ºC por dez horas. A FS (Fibrarich FN –

17/01/2001) foi fornecida moída e desidratada pela empresa Solae do Brasil. Os

demais subprodutos foram obtidos de cooperativas da região. Todas as matérias-

primas, desidratadas, foram moídas em liquidificador e peneiradas a fim de obter

granulometria menor que 355 µm, e em seguida armazenadas em freezer a -20 ºC.

As matérias-primas foram analisadas quanto o seu teor de nitrogênio

determinado pelo método de Kjeldahl, umidade em estufa a 105 ºC até massa

constante, cinzas em mufla a 550 ºC. Em seguida foram calculados os diferentes

meios de cultivo para obter-se relação C/N de 30 (WU et al., 2004). A relação C/N foi

calculada, conforme Griensven (1988), considerando que 50% da matéria orgânica é

composta por carbono (conteúdo de massa seca total menos cinzas, multiplicado

por 0,5). O meio de cultivo foi preparado com 15 g/L de ágar e 30 g/L de diferentes

misturas de matéria-prima (Tabela 1) e então autoclavado a 121 ºC por 20 min.

Quando necessário o pH do meio foi ajustado para 6,0 com NaOH ou HCl

15

previamente esterilizados por filtração (filtro de 0,22 µm), em seguida os meios

foram vertidos em placas de Petri (90 mm).

Para a inoculação dos meios de cultivo foi retirado um cilindro de cinco

milímetros de diâmetro da área periférica de crescimento do micélio e disposto no

centro da placa de Petri contendo meio de cultivo, tomando-se o cuidado para que o

micélio do cilindro ficasse em contato direto com o meio de cultivo. As placas

inoculadas foram dispostas ao acaso para crescimento em estufa a 25 ºC no escuro

por 6 dias.

O crescimento foi acompanhado pela medida do diâmetro do micélio através

de paquímetro em quatro pontos diferentes das placas de Petri, sendo estes valores

utilizados para a determinação da média de crescimento fúngico de cada meio de

cultivo. A densidade micelial e possíveis degenerações do crescimento foram

registradas através de fotografia digital ao final do experimento.

Todos os tratamentos tiveram quatro réplicas. A média e o desvio padrão do

crescimento do micélio foram calculados e as diferenças determinadas pela análise

de variância e teste de Tukey (p<0,05).

2.2.2 Crescimento em tubos de borosilicato

Os melhores meios de cultivo e a melhor linhagem do crescimento em placas

de Petri foram selecionadas para esta etapa experimental. Foi efetuada uma

estratificação granulométrica das matérias-primas componentes do substrato de

cultivo em quatro faixas principais, sendo determinado então, dois níveis de

granulometria. Cada diferente faixa foi analisada quanto à quantidade de nitrogênio,

carbono, cinzas e umidade conforme descrito no item 2.1. A formulação dos

substratos foi calculada para manter a relação C/N de 30 (WU et al., 2004) e todos

os tratamentos tiveram quatro réplicas.

Depois de misturados os componentes do substrato em Erlenmeyers e

autoclavados com excesso de água ultra pura a 121 ºC por 10 min retirou-se o

excesso de água e adicionou-se carbonato de cálcio (CaCO3) para ajustar o pH para

6,0. Os substratos foram acondicionados nos tubos de borosilicato (de 300 mm por

30 mm) com densidade de 0,70 g/cm3 e após 24 h da primeira autoclavagem foram

novamente autoclavados a 121 ºC por 40 min.

16

Em seguida inoculou-se os tubos com cilindros miceliais de 30 mm de

diâmetro da área periférica da colônia crescida em meio BDA, de forma a cobrir toda

superfície de uma das extremidades do tubo, foram então armazenandos em estufa

a 25 ºC, com cerca de 70% de umidade, no escuro.

O crescimento micelial do fungo foi medido com paquímetro através de quatro

medidas ao longo de cada tubo, sendo estes valores utilizados para a determinação

da média de crescimento do fungo e desvio padrão. A densidade micelial e possíveis

degenerações do crescimento foram registradas através de fotografia digital ao final

do experimento. Os dados obtidos foram analisados e as diferenças determinadas

pela análise de variância e teste de Tukey (p<0,05).

2.2.3 Determinação da atividade da lacase

Com base nos resultados obtidos do crescimento em tubos de borosilicato,

escolheu-se os dois melhores substratos de cultivo e realizou-se um planejamento

fatorial fracionário. A linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus cresceu nos substratos

acondicionados em tubos Falcon. A estes substratos foram adicionados água ultra

pura em excesso e então autoclavados a 121 ºC por 10 min. Após o resfriamento foi

removido o excesso de água, adicionado carbonato de cálcio (CaCO3) para ajustar o

pH para 6,0 e adicionada soluções de metais para indução da atividade da lacase

(Tabela 1). As soluções de metais foram utilizadas nas seguintes concentrações:

CuSO4 (2mM), ZnSO4 (1mM), Cd(NO3)2 (2mM), MnSO4 (1mM) e Fe(SO4) (1mM)

(BALDRIAN; GABRIEL, 2002; GALHAUP et al., 2002; ROBINSON et al., 2001). Em

seguida os tubos foram autoclavados a 121 ºC por 40 min, inoculados com o fungo e

mantidos a 25 ºC por oito dias.

Para a determinação da atividade da lacase foi obtido um extrato bruto (1:4) g

do meio colonizado em tampão acetato de sódio (10 mM, pH 4,2), mantido em

banho de gelo por 1 h com agitação de 30 segundos em vórtex, a cada 15 min. A

mistura foi centrifugada a 9,5 g a 4 °C, por 2 min, sendo o sobrenadante considerado

o extrato bruto.

A atividade de lacase foi medida pela redução da absorvância de uma mistura

contendo 400 µL do extrato bruto, 1400 µL de água, 900 µL de tampão acetato de

sódio 0,1 M (pH 5,0) e 300 µL de 1 mM de ABTS (C18H18N4O6S4.2H3N). A reação

17

ocorreu a 30 °C por 10 min. Após este período, a reação foi paralisada com a adição

de 100 µL de ácido tricloroacético (5%). Foi então adicionado 8,5 mL de água ultra

pura e realizada a leitura da absorvância a 420 nm. Uma unidade de atividade

enzimática (U) foi definida como 1 µmolar de ABTS oxidado por minuto. Para

calcular a atividade enzimática, o coeficiente de absorção de 3,6 104 M-1cm-1 foi

utilizado.

A fim de quantificar a porcentagem de lignina e celulose presente nos

substratos, realizou-se análise de fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de

detergente ácido (FDA). Sendo que FDN representam as fibras insolúveis em

detergente neutro (lignina, celulose e hemicelulose), enquanto FDA representa a

porcentagem de lignina e celulose, fibras insolúveis em detergente ácido (SILVA;

QUEIROZ, 2002).

Tabela 1. Níveis das variáveis indutores metálicos na produção de lacase estudadas no planejamento fatorial fracionário 26-2 (I-III). A sexta variável foi o substrato de crescimento definido pelo teste de crescimento em tubos de borosilicato (item 2.2).

Variáveis Níveis (ppm) -1 +1

Cu 0,000 1,103 Zn 0,000 0,588 Fe 0,000 1,324 Cd 0,000 0,368 Mn 0,000 0,882

18

2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.3.1 Crescimento micelial em placas de Petri

Na Tabela 2 é apresentada a análise físico-química das matérias-primas para

o crescimento do fungo em placas de Petri. Observou-se, quanto ao teor de

nitrogênio, que as matérias-primas ficaram divididas em dois grupos. Um grupo de

maior quantidade de nitrogênio composto por FS, FT, FA e GM e outro grupo de

menor quantidade de nitrogênio, composto pelo SM, FM e SE.

Tabela 2. Análise físico-química das matérias-primas para meio de cultivo em placas de Petri (%), em base seca. Matéria-prima

Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade

FS 4,330 44,100 3,83 7,99 FT 2,600 42,310 5,04 10,34 FA 1,760 38,380 12,22 11,03 GM 1,620 43,830 1,15 11,18 SM 0,530 42,850 2,23 12,07 FM 0,090 44,990 0,39 9,64 SE 0,040 33,020 0,12 33,76

Legenda: FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, GM = milho, SM = sabugo de milho, FM = fibra de mandioca, SE = serragem de eucalipto. *Carbono calculado segundo Griensven (1988).

Usualmente matérias-primas com maiores concentrações de nitrogênio são

adicionadas a matérias-primas volumosas e com menores concentrações de

nitrogênio. A fim de obter relação C/N de 30 (WU et al., 2004) os meios de cultivo

foram formulados independentes deste aspecto (Tabela 3). O controle (CT) (Tabela

3) possui relação C/N de 28 não sendo alterada para 30 como os demais

tratamentos para não modificar a porcentagem de matéria-prima usualmente

utilizada.

19

Tabela 3. Composição dos meios de cultivo (M1 a M12 e controle (CT)) em g e porcentagem do meio, em base seca.

Na figura 1 é apresentada a média do crescimento micelial em placas de Petri

das diferentes linhagens de Pleurotus, demonstrando sua capacidade em utilizar

uma diversidade de substratos, com rápido crescimento micelial, confirmando o

relato de Poppe (2005) sobre a capacidade do fungo de utilizar diversos resíduos

agrícolas. Houve crescimento similar, em geral com baixo desvio padrão, entre as

linhagens nos diferentes meios de cultivo, ressaltando a semelhança na capacidade

de degradação de linhagens para um mesmo gênero (Figura 1). Maiores variações

ocorreram com os meios de cultura M2 e M7, onde a linhagem 10-6 (dados não

apresentados) apresentou menor crescimento em relação às demais, o que se deve

MATÉRIA-PRIMA EM g (%)

FS FT FA GM SM FM SE Total

M1 9,6 (32) - - - - - 20,4 (68) 30,0 (100)

M2 - 16,2 (54) - - - - 13,8 (46) 30,0 (100)

M3 - - 22,2 (74) - - - 7,8 (26) 30,0 (100)

M4 - - - 27,0 (90) - - 3,0 (10) 30,0 (100)

M5 7,2 (24) - - - 22,8 (76) - - 30,0 (100)

M6 - 12,9 (43) - - 17,1 (57) - - 30,0 (100)

M7 - - 19,5 (65) - 10,5 (35) - - 30,0 (100)

M8 - - - 25,5 (85) 4,5 (15) - - 30,0 (100)

M9 9,9 (33) - - - - 20,1 (67) - 30,0 (100)

M10 - 16,2 (54) - - - 13,8 (46) - 30,0 (100)

M11 - - 22,2 (74) - - 7,8 (26) - 30,0 (100)

M12 - - - 27,0 (90) - 3,0 (10) - 30,0 (100)

CT - - 6,0 (20) - 24,0 (80) - - 30,0 (100)

Legenda: FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, GM = grãos de milho, SM = sabugo de milho, FM = fibra de mandioca, SE = serragem de eucalipto.

20

provavelmente a uma variação da linhagem que não está apta a degradar estes dois

meios de cultivo.

Os meios de cultivo com maior crescimento micelial foram M5, M6, M9 e M10

(Figura 1, Tabela 1). Os meios M9 e M10 são compostos por alta porcentagem de

fibra de mandioca, que possui porosidade permitindo um melhor acesso enzimático

do fungo e maior absorção de nutrientes, o que é também observado na fibra de

soja com maior porosidade e capacidade ainda maior de absorção de água que a

fibra de mandioca (LINDE; MACHADO, 2001). Já o farelo de trigo, que é o principal

subproduto da moagem do trigo, diferentemente das fibras, é constituído de uma

mistura heterogênea de fragmentos da camada hialina-aleurona dos grãos, sendo

fonte de minerais, vitaminas e outros nutrientes de valor biológico (DI LENA et al.,

1997). A FS e o FT são adequados para o crescimento micelial de Pleurotus, no

entanto quando adicionado SE à mistura não apresentam o mesmo desempenho

(Figura 1), isto se deve provavelmente a algum composto tóxico presente na SE.

Os meios de cultivo M5 e M6 contêm porcentagens maiores de sabugo de

milho, um material poroso que absorve grande quantidade de água e permite o

acesso enzimático do fungo a nutrientes (RODRIGUEZ et al., 1998), sendo

usualmente utilizado como material volumoso em substratos para cultivo de fungos

(EIRA et al., 2005; GABRIEL, 2005). Segundo Neiva-Junior et al. (2007) o SM tem

uma porcentagem de lignina e celulose de 16,04 e 28,99% respectivamente, o que

propicia o cultivo de fungos com alta capacidade lignocelulótica. Menores

concentrações de SM (M7 e M8) e de FM (M11 e M12) apresentaram crescimento

micelial inferior a concentrações elevadas destas matérias-primas (Figura 1).

Crescimento intermediário foi observado em meios de cultivo com FA ou GM,

(Figura 1). O FA é o subproduto mais importante do arroz, sendo constituído pelo

gérmem e pela camada de aleurona, rico em fibras, minerais e proteínas

(ALENCAR; ALVARENGA, 1991). Embora seja muito utilizado na suplementação de

substratos para cultivo de fungos (RAJARATHNAM; BANO, 1987; SINGH, 2000),

observou-se crescimento inferior ao CT nos meios de cultivo com adição de farelo

de arroz.

21

Figura 1. Crescimento médio do gênero Pleurotus (média das linhagens U6/8, U6/9, U6/10 e U2/11) após seis dias de crescimento em diferentes meios de cultivo. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Os substratos com serragem de eucalipto apresentaram menor crescimento

micelial (Figura 1). De acordo com Eira e Montini (1997), a serragem possui uma

composição nutricional pobre, tornando-se indispensável sua correção com aditivos.

Na Figura 1 observa-se que o aumento na concentração de SE diminui a produção

de biomassa pelo fungo, sendo que o melhor resultado para a SE ocorreu quando

misturada a 90% de milho (M4), resultado que se deve provavelmente a alta

concentração de amido encapsulado na matriz protéica no endosperma de milho,

fonte rica de carbono e nitrogênio (ECKHOFF; PAULSEN, 1996). Segundo Figura 1,

maiores concentrações de GM proporcionaram maior crescimento micelial. A análise

visual da densidade do micélio (dados não apresentados) mostrou vigor semelhante

entre as diferentes linhagens nos diversos meios de cultivo, com exceção do M1,

que possui maior porcentagem de SE e apresentou densidade micelial inferior aos

demais, evidenciando a escassez de nutrientes neste meio de cultivo.

2.3.2 Crescimento em tubos de borosilicato

Para a formulação dos substratos em tubos de borosilicato foi realizada uma

estratificação granulométrica das matérias-primas com tamisador. Na faixa 1 (F1) o

tamanho das partículas foram de 1,7 a 5 mm, faixa 2 (F2) de 0,8 a 1,7 mm, faixa 3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

M1 M2 M3 M11 M7 M4 CT M8 M12 M6 M5 M9 M10

Meios de cultivo

Diâ

met

ro d

e cr

esci

men

to d

o m

icél

io (

mm

).

gf

ef e e cde cd ca aababb

22

(F3) de 0,3 a 0,8 mm e faixa 4 (F4) menor que 0,3 mm. Foram determinados dois

níveis de granulometria. No primeiro nível (G1) usou-se a faixa F1 para a matéria-

prima com menor quantidade de nitrogênio e F2 a F4 para a matéria-prima com

maior quantidade de nitrogênio. No segundo nível (G2) usou-se a faixa F2 a F4 para

ambas as matérias-primas do substrato. Na G2 as matérias-primas foram

adicionadas de forma proporcional para cada faixa, assim como no G1 para as

faixas F2 a F4.

Realizou-se então, uma análise físico-química das diferentes faixas de

granulometria para cada matéria-prima, conforme Tabela 4, mantendo-se a relação

C/N em 30 e a densidade média de 0,69 ± 0,08 g/cm3. Os controles (Tabela 5)

possuem relação C/N de 53 (CTG1) e 33 (CTG2) não sendo alteradas para não

modificar a porcentagem de matéria-prima usualmente utilizada.

Pode se observar variação da quantidade de compostos de uma mesma

matéria-prima dependendo do tamanho das partículas (Tabela 4). Isto esta

relacionado à moagem dos subprodutos, onde é esperado que os minerais, por

normalmente encontrarem-se na forma de sais de fácil quebra, concentrem-se nas

frações de menor granulometria (FENNEMA, 2000) alterando assim as frações

orgânicas e inorgânicas dos substratos de cultivo. A fração orgânica é responsável

pelo fornecimento de carbono e nitrogênio, enquanto que a fração inorgânica exerce

importante papel na disponibilização de micronutrientes normalmente envolvidos no

funcionamento dos sistemas de transporte celular e das reações enzimáticas

(BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 2000; LEHNINGER et al., 1995). Desta

forma, o conhecimento da composição química das frações granulométricas do

substrato de cultivo é importante para a compreensão do crescimento do fungo em

diferentes substratos.

Tabela 4. Análise físico-química das matérias-primas utilizadas para o crescimento em tubos de borosilicato em porcentagem (base seca).

Resultado de análise (%) MP G Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade

F1 0,453 44,712 1,766 8,810 F2 0,817 44,270 2,301 9,160 F3 1,038 44,250 2,130 9,370

SM

F4 1,229 43,006 4,318 9,670 F2 5,520 43,497 3,736 9,270 FS F3 4,590 43,826 3,668 8,680

23

F4 4,834 43,616 3,959 8,810 F2 1,959 42,711 5,229 9,350 F3 2,508 41,762 7,696 8,780 FA F4 2,667 39,455 12,040 9,050 F2 3,575 41,935 5,421 10,710 F3 3,820 42,038 4,794 11,130 FT F4 3,299 42,514 3,142 11,830

Legenda: MP = matéria-prima, G = granulometria, FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, SM = sabugo de milho, F1 a F4 = faixa de granulometria. *Carbono calculado segundo Griensven (1988).

Tabela 5. Composição dos substratos (M5G1 a M7G2 e controles (CTG1 e CTG2)) em g e porcentagem do substrato, em base seca.

SUBSTRATO EM g (%) MP G

M5G1 M5G2 M6G1 M6G2 M7G1 M7G2 CTG1 CTG2

F1 29,0 (74,0)

- 23,6 (60,0)

- 16,7 (43,0)

- 32,0 (80,0)

-

F2 - 10,6 (27,0)

- 9,1 (23,3)

- 6,5 (17,3)

- 10,1 (26,7)

F3 - 10,6

(27,0) - 9,1

(23,3) - 6,5

(17,3) - 10,1

(26,7)

SM

F4 - 10,6

(27,0) - 9,1

(23,3) - 6,5

(17,3) - 10,1

(26,7)

F2 3,4

(8,6) 2,5

(6,3) - - - - - -

F3 3,4

(8,6) 2,5

(6,3) - - - - - - FS

F4 3,4

(8,6) 2,5

(6,3) - - - - - -

F2 - - - - 7,5

(19,0) 6,6

(16,0) 2,4

(6,6) 3,0

(6,6)

F3 - - - - 7,5

(19,0) 6,6

(16,0) 2,4

(6,6) 3,0

(6,6) FA

F4 - - - - 7,5

(19,0) 6,6

(16,0) 2,4

(6,6) 3,0

(6,6)

F2 - - 5,2

(13,3) 3,9

(10,0) - - - -

F3 - - 5,2

(13,3) 3,9

(10,0) - - - - FT

F4 - - 5,2

(13,3) 3,9

(10,0) - - - -

Legenda: MP = matéria-prima, G = granulometria, SM = sabugo de milho, FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, F1 a F4 = faixa de granulometria.

24

Os meios de cultivo utilizados para crescimento micelial em placas de Petri

que continham FM ou GM não foram utilizados para a fase experimental de

crescimento do fungo em tubos de borosilicato (Tabela 2). Ambas as matérias-

primas, são ricas em amido, que por sua vez, gelatinizam em temperaturas acima de

52 ºC, para FM, e 62 ºC para GM (BELITZ; GROSCH, 1997). Devido à

autoclavagem do substrato haveria a formação do gel, provavelmente limitando a

passagem de oxigênio ao longo do tubo e inviabilizando o crescimento do micélio.

Desta forma, algumas matérias-primas nutricionalmente adequadas para o

crescimento micelial em placas de Petri, não tem o mesmo resultado, em maior

escala, principalmente no sistema axênico de produção, em que calor é utilizado

para esterilizar o substrato. Entretanto especula-se que em pequenas quantidades,

desde que este complexo seja capaz de ser degradado pelo fungo, pode ser fonte

de reserva de água e nutrientes para produção em longo prazo. Isto pode ser

verificado na Figura 2, onde o substrato M7G2 apresentou o menor crescimento

micelial, devido alta concentração de FA, que sofreu gelatinização durante a

autoclavagem, inviabilizando o crescimento micelial. Entretanto o substrato M7G1,

que possui a mesma formulação, exceto a granulometria, não apresentou

gelatinização visível do FA. Este fator físico do substrato proporcionou um

crescimento micelial no M7G1 cerca de 10 vezes maior que no M7G2. Neste caso a

maior granulometria do substrato proporcionou uma maior aeração evitando o

bloqueio físico do micélio.

Observou-se que a G1 proporcionou maior crescimento micelial para todos os

substratos, com exceção do M5G1 e M5G2, em que a menor granulometria

apresentou melhores resultados (Figura 2). A maior granulometria proporciona uma

maior aeração do meio e permite ao micélio crescer em superfície mais rapidamente

na maioria dos meios. Entretanto para o substrato M5G1 e M5G2, a menor

granulometria não implicou em limitação da aeração permitindo, portanto, um melhor

aproveitamento do substrato devido a maior área específica do meio.

O FA que não foi eficiente nas placas de Petri apresentou resultado

semelhante nos tubos de borosilicato, exceto no CTG1. Nos substratos M7G1 e

M7G2 foi utilizado uma maior quantidade de FA (Tabela 5), isto sugere que houve

gelatinização alterando a matéria-prima de forma a dificultar a sua metabolização e,

portanto, a menor velocidade de crescimento do micélio verificado claramente no

25

substrato M7G2. No CTG2 a menor granulometria do SM dificultou o maior

crescimento do fungo de forma similar a maioria dos tratamentos com esta

granulometria. Já o CTG1 apesar de nutricionalmente ser menos eficiente,

apresentou condições melhores de aeração o que permitiu o maior crescimento do

fungo. Portanto os fatores nutricionais e de aeração tem importância na decisão do

tipo de formulação utilizada e merece atenção por parte dos produtores.

Figura 2. Crescimento micelial da linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus durante 49 dias em tubos de borosilicato. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

A cinética de crescimento micelial (Figura 2) mostra um crescimento uniforme

entre os tratamentos ao longo do tempo, com taxas de crescimento semelhantes,

exceto do M7G2. Para M5G2, M6G1 e CTG1 a velocidade média de crescimento do

micélio foi de 6,1 mm/dia, para M5G1 foi de 4,9 mm/dia e para M6G2, M7G1, e

CTG2 foi de 3,7 mm/dia. Na Figura 2 observa-se que ao longo do tempo, houve uma

diminuição do crescimento do micélio do dia 27 ao dia 35, provavelmente devido à

diminuição na demanda de oxigênio na parte interna do tubo, retornando a

velocidade de crescimento conforme o micélio se aproxima da extremidade do tubo.

Isto é verificado no crescimento de inóculo (spawn) em que ocorre a diminuição da

velocidade de crescimento do micélio após a metade do frasco ou saco. Dessa

forma, a criação de bolsões de ar nestes recipientes pode permitir a manutenção da

velocidade de crescimento do micélio diminuindo o tempo de colonização do

substrato e evitando o surgimento de contaminantes oportunistas.

0

50

100

150

200

250

300

5 9 14 19 23 27 30 35 40 44 49Tempo (Dias)

Méd

ia d

o cr

esci

men

to m

icel

ial (

mm

). M5G1

M5G2

M6G1

M6G2

M7G1

M7G2

CTG1

CTG2

a

b

c

d

26

A densidade micelial foi semelhante entre os substratos no tubo de

borosilicato, confirmando os resultados de densidade micelial encontrados em

placas de Petri.

2.3.3 Determinação da atividade da lacase

Na Figura 3 são apresentados os efeitos das variáveis na passagem do nível

inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta da atividade da lacase. A

variável que mais influenciou a produção da lacase foi o substrato, sendo que os

indutores avaliados exerceram menor efeito na atividade enzimática (Figura 3).

Observa-se que a produção de lacase aumenta quando utilizado o substrato M5G2 e

diminui quando utilizado o substrato CTG1. Isto se deve provavelmente ao tamanho

da partícula de SM, que sendo menor em M5G2 apresenta maior área de contato

para ação da enzima, permitindo o acesso do fungo aos nutrientes.

Figura 3. Efeito em U/g (base seca) das variáveis na passagem do nível inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta da atividade da lacase para a linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus. *Indicativo de diferença significativa pela análise de variância (p<0,05).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Fe

Cu

Zn

Mn

Cd

Substrato

Var

iáve

is

Efeito (U/g meio seco)

*

*

*

*

*

27

Pandey (2003) cita o tamanho da partícula como propriedade física essencial

para a atividade enzimática, outros pontos importantes destacados pelo autor são

natureza cristalina, porosidade e área de superfície do substrato. Membrillo et al.

(2008) observaram que a razão geométrica e o tamanho das fibras do bagaço da

cana-de-açúcar influenciam fortemente o perfil da atividade enzimática do gênero

Pleurotus. Isso se deve provavelmente, ao perfil da lacase que possui massa

molecular alta, não conseguindo penetrar fundo nos tecidos, agindo na lignina

presente na superfície das partículas do substrato (WIDSTEN, KANDELBAUER,

2008).

Uma maior concentração de lignina no substrato aumenta a atividade da

lacase (NILADEVI; PREMA, 2008), no entanto, observamos que a disponibilidade da

lignina é fundamental. Na tabela 6 é apresentada a composição química do

substrato, observa-se que a porcentagem de minerais é semelhante nos dois

substratos, enquanto o conteúdo protéico é o dobro em M5G2, isto se deve a

granulometria, pois em partículas menores concentra-se compostos cristalinos como

as proteínas, que podem facilmente sofrer quebra mecânica. Já em frações mais

grossas concentram-se fibras de maior elasticidade, como lignina e celulose

(BELITZ; GROSCH, 1997; FELLOWS, 2006; FENNEMA, 2000). Em relação às

fibras, observa-se que uma maior quantidade de lignocelulose está presente no

CTG1 (Tabela 6). Considerando que no SM cerca de 35% da lignocelulose é lignina

(NEIVA-JUNIOR et al., 2007), seria esperado que este substrato de cultivo induzisse

uma maior atividade da lacase. Contudo isto não foi verificado (Figura 3), indicando

que a área de contato entre o substrato e a enzima possui maior efeito para sua

maior produção.

Tabela 6. Conteúdo de cinzas, proteínas, fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de detergente ácido (FDA) nos substratos de cultivo para determinação da atividade da lacase na linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus. Valores expressos em porcentagem de base seca.

Substrato Cinzas Proteína FDN FDA

M5G2 2,81 10,55 70,29 30,84

CTG1 2,86 5,19 77,49 49,92

28

Em relação aos indutores avaliados observou-se, com exceção do metal Fe,

que todos os outros apresentaram efeito significativo no aumento da produção de

lacase (Figura 3). Baldrian et al. (2005) verificaram um aumento na degradação de

lignocelulose por Pleurotus ostreatus na presença de Cu, Mn e Zn. Cu e Mn

participam diretamente do processo de degradação da lignina, o primeiro atua como

cofator para o centro catalítico da lacase e o Mn participa diretamente do ciclo da

peroxidase Mn-dependente, outra enzima envolvida na degradação da lignina

(BALDRIAN, 2003; PALMIERI, et al. 2000). O Cd também é citado como indutor do

aumento da atividade da lacase em Pleurotus ostreatus em concentrações de 1 a 5

mM (BALDRIAN; GABRIEL, 2002). Segundo Singhal e Rathore (2001) o Zn é

necessário para o funcionamento do sistema enzimático lignolítico, atuando na

mineralização e solubilização da lignina. Sendo assim a adição de indutores

metálicos contribui de forma significativa para o aumento da produção de lacase por

Pleurotus ostreatus (U6/9).

29

2.4 CONCLUSÃO

Em função da metodologia adotada e das condições experimentais concluiu-

se que o gênero Pleurotus é capaz de degradar uma ampla variedade de substratos,

sendo as matérias-primas mais adequadas ao crescimento micelial em placas de

Petri a fibra de mandioca, sabugo de milho, fibra de soja e farelo de trigo. Já a

serragem não foi adequada nas condições avaliadas, demonstrando a influência da

composição química do meio de cultivo no crescimento micelial. Diferentes

granulometrias afetam a composição física e nutricional do substrato de cultivo e

interferem no crescimento do fungo. Tamanho de partículas diferentes, de uma

mesma matéria-prima, tem relação C/N distintas. O maior diâmetro da partícula do

substrato proporciona maior crescimento micelial devido à maior aeração do

substrato. As matérias-primas que gelatinizam após autoclavagem (121 ºC) não são

adequadas ao crescimento micelial axênico de fungos quando em quantidades

iguais ou superiores a 48% do substrato. O aumento da atividade da lacase esta

relacionado diretamente a maior quantidade de lignina disponível pela maior área de

contato das partículas (menores) do substrato.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e

pela bolsa de estudos concedida.

30

2.5. REFERÊNCIAS

ALENCAR, M.L.C. B. B.; ALVARENGA, M. G. Farelo de arroz: composição química e seu potencial como alimento. Arquivos de Biologia e Tecnologia, Porto Alegre, v. 34, n. 1, p. 95-108, 1991.

ARORA, D. S.; GILL, P. K. Effects of various media and supplements on lacase production by some white rot fungi. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 77, p. 89-91, 2001.

BALDRIAN, P. Interactions of heavymetals with white-rot fungi. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 32, p. 78-91, 2003.

BALDRIAN, P.; GABRIEL, J. Copper and cadmium increase activity in Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiology, Amsterdam, v. 206, p. 69-74, 2002.

BALDRIAN, P.; VALASKOVÁ, V.; MERHAUTOVÁ, V.; GABRIEL, J. Degradation of lignocellulose by Pleurotus ostreatus in the presence of copper, manganese, lead and zinc. Research in Microbiology, Amsterdam, v. 156, p. 670-676, 2005.

BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. 1087 p.

CEREDA, M. P. Valorização de subprodutos como forma de reduzir custos de produção. In: Culturas de tuberosas amiláceas latino americanas: Manejo, uso e tratamento de subprodutos da industrialização da mandioca. São Paulo: Fundação Cargill, 2001, 320p.

DIAS, E. S.; KOSHIKUMO, E. M. S.; SCHWAN, R. E. F.; SILVA, R. Cultivo do cogumelo Pleurotus sajor-caju em diferentes resíduos agrícolas. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 27, n. 6, p. 1363-1369, 2003.

DI LENA, G.; PATRONI, E.; QUAGLIA, G. B. Improving the nutritional value of wheat bran by a white rot fungus. International Journal of food science and technology, Oxford, v. 32, p. 513-519, 1997.

ECKHOFF, S. R.; PAULSEN, M. R. Maize. In: HENRY, R. J. KETTLEWELL, P. S. Cereal grain quality. London: Chapmam & Hall, 1996.

EIRA, A. F. Cultivo do cogumelo medicinal Agaricus blazei (Murrill) ss. Heinemann ou Agaricus brasiliensis (Wasser et al.). Viçosa: Aprenda fácil, 2003.

31

EIRA, F. C.; MEIRELLES, W. F., PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Shiitake production on corncob substrates. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 4, n. 2, p. 141-148, 2005.

EIRA, A. F.; MONTINI, R. M. C. Manual de cultivo do shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler). Botucatu: FEPAF, 1997. 38p.

ELISASHVILI, V.; PENNINCKX, M.; KACHLISHVILI, E.; TSIKLAURI, N.; METREVELI, E.; KHARZIANI, T.; KVESITADZE, G. Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, p. 457-462, 2008.

FELLOWS, P. J. Tecnologia do Processamento de Alimentos: princípios e prática. 2ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.

FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza: Acríbia, 1993. 1051p.

GABRIEL, V. Cereal straw and corncobs. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 86-90.

GALHAUP, C,; GOLLER, S.; PETERBAUER, C. K.; STRAUSS, J.; HALTRICH, D. Characterization of the major lacase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology, Londres, v. 148, p. 2159-2169, 2002.

GIANFREDA, L.; XU, F.; BOLLAG, J. M. Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes. Biorremediation Journal, Boca Raton, v. 3, n. 1, p. 1-26, 1999.

GRIENSVEN, L. J. L. D. The cultivation of mushrooms. Horst: Mushroom Experimental Station. 1988. 515p.

HERRERA, O. M. Produção, economicidade e parâmetros energéticos do cogumelo Agaricus blazei: um enfoque na cadeia produtiva. Botucatu, 2001. Originalmente apresentada como dissertação de doutorado, Departamento de Defesa Fitossanitária, Faculdade de Ciências Agronômicas, Unesp, 2001.

HOSENEY, R. C. Princípios de ciencia y tecnologia de los cereales. Zaragoza: Acribia, 1991. 320p.

32

HOSSAIN, S., HASHIMOTO, M., CHOUDHURY, E., ALAM, N., HUSSAIN, S., HASAN, M., CHOUDHURY, S. & MAHMUD, I. Dietary mushroom (Pleurotus ostreatus) ameliorates atherogenic lipid in hypercholesterolaemic rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Oxford, v. 30, p. 470, 2003.

HOU, H.; ZHOU, J.; WANG, J.; DU, C.; YAN, B. Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye. Process Biochemistry, Amsterdam, v. 39, p. 1415-1419, 2004.

HWANG, H. J.; KIM, S. W.; LIM, J. M.; JOO, J. H.; KIM, H. O.; KIM, H. M.; YUN, J. W. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in strptozotocin-induced diabetic rats. Life Sciences, Oxford v. 76, p. 3069-3080, 2005.

LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 2ed. São Paulo: Sarvier, 1995, 803p.

LINDE, G. A., MACHADO, R. P. Fibra de soja: benefícios a saúde e aplicações. Food Ingredients, v. 11, n. 3, 2001.

MEMBRILLO, I.; SÁNCHEZ, C.; MENESES, M.; FAVELA, E.; LOERA, O. Effect of substrate particle size and additional nitrogen source on production of lignocellulolytic enzymes by Pleurotus ostreatus strains. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, n. 16, p. 7842-7847, 2008.

NEIVA-JUNIOR, A. P.; SILVA-FILHO, J. C.; TIESENHAUSEN, I. M. E. V. V.; ROCHA, G. P.; CAPELLE, E. R.; COUTO-FILHO, C. C. C. Efeito de diferentes aditivos obre os teores de proteína bruta, extrato etéreo e digestibilidade da silagem de maracujá. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 31, n. 3, p.871-875, 2007.

NILADEVI, K. N.; PREMA, P. Effect of inducers and process parameters on laccase prodution by Stretomyces psammoticus and its application in dye decolourization, Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, p. 4583-4589, 2008.

PALMIERI, G.; GIARDINA, P.; BIANCO, C.; FONTANELLA, B.; SANNIA, G. Copper induction of lacase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Applied and Enviromental Microbiology, Washington, v. 66, p. 920-924, 2000.

PANDEY, A. Solid–state fermentation. Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v. 13, p. 81-84, 2003.

33

PARANÁ. Secretaria da Agricultura e do Abastecimento do Paraná. Relatório da safra 2006/2007. Disponível em: <http://www.pr.gov.br/seab/deral/Relat%f3rio%20da%20Safra_JAN_07.pdf> Acesso em 21/02/2007.

POPPE, J. Substrate. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 75-85.

RAJARATHNAM, S.; BANO, Z. Pleurotus Mushrooms. Parte I A. Morfology, life cycle, taxonomy, breeding and cultivation. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Boca Raton, v. 26, n. 2, p.157-223, 1987.

ROBINSON, T.; CHANDRAN, B.; NIGAM, P. Studies on the production of enzymes by white-rot fungi for the decolourisation of textil dyes. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 29, p. 575-579, 2001.

RODRIGUEZ, S.; SANTORO, R.; CAMESELLE, C., SANROMÁN, A. Effect of different parts of the corn cob employed as a carrier on lignolytic activity in solid state cultures by P. chrysosporium. Bioprocess Engineering, Amsterdam, v. 18, p.251-255, 1998.

SÁNCHEZ, C. Modern aspects of mushroom culture technology. Applied Microbiology and Biotechnology, Berlim, v. 64, p. 756-762, 2004.

SHARMA, S., MADAN, M. Microbial protein from leguminous and non-leguminous substrates. Acta Biotechnologica, Berlim v. 13, p. 131-139, 1993.

SHU, C.; XU, C., LIN, E. Production, purification and partial characterization of a novel endo-b-1,3-glucanase from Agaricus brasiliensis. Process Biochemistry, Barking, v. 41, p. 1229-1233, 2006.

SILVA, E. G.; DIAS, E. S.; SIQUEIRA, F. G.; SCHWAN, R. F. Análise química de corpos de frutificação de Pleurotus sajor-caju cultivado em diferentes concentrações de nitrogênio. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 27, n. 1, p. 72-76, 2007.

SILVA, E. M.; MACHUCA, A.; MILAGRES, A. M. F. Effect os cereal brans on Lentinula edodes growth and enzyme activies during cultivation on forestry waste. Letters in Applied Microbiology, v. 40, p. 283-288, 2005.

SILVA, D. J.; QUEIROZ, A. C. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. Viçosa: UFV, 2002. 235p.

34

SINGHAL, V.; RATHORE, V. S. Effects of Zn2+ and Cu2+ on growth, lignin degradation and ligninolytic enzymes in Phanerochaete chrysosporium. World Journal Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 17, p. 2235-2240, 2001.

SINGH, M. P. Biodegradation of lignocelulosic waste through cultivation of Pleurotus sajor-caju. Mushroom Science, Sidney, v. 15, p. 517-521, 2000.

STAJIC, M.; PERSKY, L.; FRIESEM, D. HADAR, Y.; WASSER, S. P.; NEVO, E.; VUKOJEVIC, J. Effect of different carbon and nitrogen sources on lacase and peroxidases production by selected Pleurotus species. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 38, p. 65-73, 2006.

WASSER, S. P.; WEIS, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives. International Journal of Medicinal Mushrooms, v. 1, p. 31-62, 1999.

WIDSTEN, A.; KANDELBAUER, A. Laccase applications in the forest products industry: a review. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 42, p. 293-307, 2008.

WU, J. Z.; CHEUNG, P. C. K.; WONG, K. H.; HUANG, N. I. Studies on submerged fermentation of Pleurotus tuber-regium (Fr.) Singer. Part 2: effect of carbon-to-nitrogen ratio of culture medium on the content and composition of the mycelial dietary fibre. Food Chemistry, Barking, v. 85, n. 1, p. 101-105, 2004.

35

3. FATORES FÍSICO-QUÍMICOS PRESENTES NO SUBSTRATO PARA O

CULTIVO DE Lentinula edodes

3.1 INTRODUÇÃO

A produção anual de resíduos da agricultura é estimada em 500 milhões de

toneladas sendo que enquanto uma parte é utilizada para alimentação animal, outra

grande parte é acumulada no ambiente (POPPE, 2005; RAJARATHNAM; BANO,

1987). O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de soja (Glycine max),

mandioca (Manihot esculenta) e milho (Zea mays). Grande parte da produção

nacional é proveniente do estado do Paraná, sendo o Estado também produtor de

arroz (Oryza sativa) e trigo (Triticum aestivum) (PARANÁ, 2007). O processamento

dos vegetais gera resíduos em função do processo tecnológico adotado, podendo os

subprodutos serem constituídos de fibras, farelos, bagaços, cascas e outros

materiais lignocelulósicos com potencial para o crescimento de microrganismos

(CEREDA, 2001; HOSENEY, 1991).

Os cogumelos comestíveis são uma alternativa de melhor utilização destes

subprodutos, através do processo de bioconversão, auxiliando na diminuição de

resíduos e gerando biomassa de interesse comercial (POPPE, 2005; SILVA et al.,

2005). O fungo Lentinula edodes possui enzimas extracelulares lignocelulóticas

capazes de degradar eficientemente materiais lignocelulósicos (LECHNER;

PAPINUTTI, 2006). A lacase é a principal enzima envolvida na degradação de

lignina do sistema lignolítico de fungos (GIANFREDA et al., 1999), sendo sua

atividade fortemente influenciada pela linhagem, composição do substrato e

condições de cultivo do fungo (ELISASHIVILI, 2008; HOU et al., 2004; STAJIC et al.,

2006). As propriedades físicas do substrato de cultivo incluindo natureza cristalina e

amorfa, área acessível, área de superfície, porosidade e principalmente tamanho da

partícula são essenciais para a atividade enzimática (PANDEY, 2003). Existe uma

diversidade de resíduos lignocelulósicos regionais que apresentam estas

características e que podem ser utilizados como substrato.

36

Devido à sua capacidade de degradar compostos fenólicos, a lacase pode ser

aplicada em diversas áreas da indústria, como branqueamento e aumento da

resistência do papel e tratamento de efluentes (WIDSTEN; KANDELBAUER, 2008).

Sendo assim é importante o aumento da habilidade dos basidiomicetos produzirem

lacase para aplicações industriais (HOU et al., 2004). O aumento na produção de

lacase por Pleurotus ostreatus pode ocorrer com a adição de indutores (ARORA;

GILL, 2001; BALDRIAN, 2003; BALDRIAN et al., 2005; BALDRIAN; GABRIEL,

2002).

O interesse da comunidade científica internacional pelos cogumelos tem

aumentado devido às propriedades medicinais (EIRA, 2003). O cogumelo Lentinula

edodes, conhecido como shiitake, exibe propriedades antimicrobianas (ISHIKAWA et

al., 2001), antitumorais (SUZUKI et al., 1994), antimutagênicas (SOUZA-PACCOLA

et al., 2004); antivirais (SAZAKI et al., 2001; SUZUKI et al., 1990) e

hipocolesterolêmicas (SAZAKI et al., 2001). Os diferentes biocompostos produzidos

por cogumelos podem ser extraídos diretamente do micélio do fungo (HWANG et al.,

2005; SHU et al., 2006), não necessitando o desenvolvimento do corpo de

frutificação, o que diminui o custo do processo, pois envolve um menor número de

mão de obra e etapas de produção. Desta forma, a análise do crescimento micelial e

a otimização deste processo é fundamental para a produção de princípios ativos

terapêuticos em escala industrial.

Outro processo que utiliza a produção de biomassa micelial é a indústria de

produção de inoculantes (spawn). Inoculantes são propágulos viáveis do fungo,

geralmente em veículo sólido, utilizados para colonizar o substrato de produção

(EIRA, 2003). Segundo Herrera (2001), cerca de 80% dos produtores de cogumelos

não produz substrato de cultivo próprio, encarecendo o produto final aos

consumidores. Portanto, a busca de matérias-primas alternativas regionais poderia

abrir perspectivas de preparo de inóculo e de substrato próprios, evitando os custos

de transporte de outras regiões (DIAS et al., 2003).

Buscando substratos mais adequados a produção micelial e potencial

produção de cogumelos o objetivo deste trabalho foi avaliar a composição físico-

química de diferentes formulações de substratos para o crescimento micelial a partir

de subprodutos da agroindústria para o fungo Lentinula edodes.

37

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular da

Universidade Paranaense - Campus sede, Umuarama, Paraná, Brasil. Foram

utilizadas as linhagens U6/1, U6/11 e U6/12 de Lentinula edodes provenientes da

micoteca da Universidade Estadual de Londrina - UEL. O fungo foi cultivado em

meio batata-dextrose-ágar (BDA) (39 g/L) a 25 ºC em estufa sem circulação de ar.

Após a recuperação do vigor de crescimento, foram selecionadas como inóculo

placas com crescimento radial, ramificação homogênea e sem setoriamento.

3.2.1 Crescimento em placas de Petri

As matérias-primas utilizadas para compor os meios de cultivo foram: fibra de

soja (FS), farelo de trigo (FT), farelo de arroz (FA), grãos de milho (GM), sabugo de

milho (SM), fibra de mandioca (FM) e serragem de eucalipto (SE). A FM foi obtida a

partir de tubérculos, provenientes do horto medicinal da Universidade Paranaense,

descascados, lavados e triturados com água em liquidificador. A massa obtida foi

transferida para um filtro de pano e lavada com água corrente, em seguida foi seca

em estufa com circulação de ar a 45 ºC por dez horas. A FS (Fibrarich FN –

17/01/2001) foi fornecida pela empresa Solae do Brasil. Os demais subprodutos

foram obtidos de cooperativas da região. Todas as matérias-primas desidratadas

foram moídas em liquidificador e peneiradas a fim de obter granulometria menor que

355µm, e armazenadas em freezer a -20 ºC.

As matérias-primas foram analisadas quanto o seu teor de nitrogênio

determinado pelo método de Kjeldahl, umidade em estufa a 105 ºC até massa

constante e cinzas em mufla a 550 ºC. A partir destes resultados, os diferentes

meios de cultivo foram calculados a fim de obter-se relação C/N de 25 (OEI, 1996). A

relação C/N foi calculada conforme Griensven (1988), considerando que 50% da

matéria orgânica é composta por carbono (conteúdo de massa seca total menos

cinzas, multiplicado por 0,5). O meio de cultivo foi preparado com ágar (15g/L) e

30g/L de diferentes misturas de matéria-prima e então autoclavado a 121 ºC por 20

min. Quando necessário o pH do meio foi ajustado para 6,0 com NaOH ou HCl

38

previamente esterilizados por filtração (filtro de 0,22 µm), em seguida os meios

foram vertidos em placas de Petri de 90 mm.

Para a inoculação dos meios de cultivo foi retirado um cilindro de cinco

milímetros de diâmetro da área periférica de crescimento do micélio e disposto no

centro da placa de Petri contendo meio de cultivo, tomando-se o cuidado para que o

micélio do cilindro ficasse em contato direto com o meio de cultivo. As placas

inoculadas foram dispostas para crescimento em estufa a 25 ºC no escuro por 10

dias.

O crescimento foi acompanhado pela medida do diâmetro micelial através de

paquímetro em quatro pontos diferentes das placas de Petri, sendo estes valores

utilizados para a determinação da média de crescimento de cada meio de cultivo. A

densidade micelial e possíveis degenerações do crescimento foram registradas

através de fotografia digital ao final do experimento.

Todos os tratamentos tiveram quatro réplicas. A média e o desvio padrão do

crescimento do micélio foram calculados e as diferenças determinadas pela análise

de variância e teste de Tukey (p<0,05).

3.2.2 Crescimento em tubos de borosilicato

Os melhores meios de cultivo e a melhor linhagem do crescimento em placas

de Petri foram selecionadas para esta etapa experimental. Foi efetuada uma

estratificação granulométrica das matérias-primas componentes do substrato de

cultivo em quatro faixas principais, sendo determinado então, dois níveis de

granulometria. Cada diferente faixa foi analisada quanto à quantidade de nitrogênio,

carbono, cinzas e umidade conforme descrito no item 2.1. A formulação dos

substratos foi calculada para manter a relação C/N de 25 (OEI, 1996) e todos os

tratamentos tiveram quatro réplicas.

Depois de misturados os componentes do substrato em Erlenmeyers e

autoclavados com excesso de água ultra pura a 121 ºC por 10 min retirou-se o

excesso de água e adicionou-se carbonato de cálcio (CaCO3) para ajustar o pH para

6,0. Os substratos foram acondicionados nos tubos de borosilicato (de 300 mm por

30 mm) com densidade média de 0,70 g/cm3 e após 24 h da primeira autoclavagem

foram novamente autoclavados a 121 ºC por 40 min.

39

Em seguida inoculou-se os tubos com cilindros miceliais de 30 mm de

diâmetro, da área periférica da colônia crescida em meio BDA, de forma a cobrir

toda superfície de uma das extremidades do tubo e foram armazenados em estufa a

25 ºC, com 70% de umidade, no escuro.

O crescimento micelial do fungo foi medido com paquímetro através de quatro

medidas ao longo de cada tubo, sendo estes valores utilizados para a determinação

da média de crescimento do fungo e desvio padrão. A densidade micelial e possíveis

degenerações do crescimento foram registradas através de fotografia digital ao final

do experimento. Os dados obtidos foram analisados e as diferenças determinadas

pela análise de variância e teste de Tukey (p<0,05).

3.2.3 Determinação da atividade da lacase

Com base nos resultados obtidos do crescimento em tubos de borosilicato,

escolheram-se os dois melhores substratos de cultivo e realizou-se um planejamento

fatorial fracionário. A linhagem U6/12 de Lentinula edodes cresceu no substrato

acondicionado em tubos Falcon. A estes substratos foram adicionados água ultra

pura em excesso e então autoclavados a 121 ºC por 10 min. Após o resfriamento foi

removido o excesso de água, adicionado carbonato de cálcio CaCO3 para ajustar o

pH para 6,0 e adicionada soluções de metais para indução da atividade da lacase

(Tabela 3). As soluções de metais foram utilizadas nas concentrações de CuSO4

(2mM), ZnSO4 (1mM), Cd(NO3)2 (2mM), MnSO4 (1mM) e Fe(SO4) (1mM)

(BALDRIAN; GABRIEL, 2002; GALHAUP et al., 2002; ROBINSON et al., 2001). Em

seguida os tubos foram autoclavados a 121 ºC por 40 min, inoculados com o fungo e

mantidos a 25 ºC por quinze dias.

Para a determinação da atividade da lacase foi obtido um extrato bruto (1:4) g

do meio colonizado em tampão acetato de sódio (10 mM, pH 4,2), mantido em

banho de gelo por 1 h com agitação de 30 segundos em vórtex, a cada 15 min. A

mistura foi centrifugada a 9,5 g, a 4 °C, por 2 min, sendo o sobrenadante

considerado o extrato bruto.

A atividade de lacase foi medida pela redução da absorvância de uma mistura

contendo 400 µL do extrato bruto, 1400 µL de água, 900 µL de tampão acetato de

sódio 0,1 M (pH 5,0) e 300 µL de 1 mM de ABTS (C18H18N4O6S4.2H3N). A reação

40

ocorreu a 30 °C por 10 min. Após este período, a reação foi paralisada com a adição

de 100 µL de ácido tricloroacético (5%). Foi então adicionado 8,5 mL de água ultra

pura e realizada a leitura da absorvância a 420 nm. Uma unidade de atividade

enzimática (U) foi definida como 1 µmolar de ABTS oxidado por minuto. Para

calcular a atividade enzimática, o coeficiente de absorção de 3,6 104 M-1cm-1 foi

utilizado.

A fim de quantificar a porcentagem de lignina e celulose presente nos

substratos, realizou-se análise de fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de

detergente ácido (FDA). Sendo que FDN representam as fibras insolúveis em

detergente neutro (lignina, celulose e hemicelulose), enquanto FDA representa a

porcentagem de lignina e celulose, fibras insolúveis em detergente ácido (SILVA;

QUEIROZ, 2002).

Tabela 1. Níveis das variáveis indutores metálicos na produção de lacase estudadas no planejamento fatorial fracionário 26-2 (I-III). A sexta variável foi o substrato de crescimento definido pelo teste de crescimento em tubos de borosilicato (item 2.2).

Variáveis Níveis (ppm) -1 +1

Cu 0,000 1,103 Zn 0,000 0,588 Fe 0,000 1,324 Cd 0,000 0,368 Mn 0,000 0,882

41

3.3 RESULTADOS

3.3.1 Crescimento em placas de Petri

Na Tabela 2 é apresentada a análise físico-química das matérias-primas para

o crescimento do fungo em placas de Petri. Observou-se, quanto ao teor de

nitrogênio, que as matérias-primas ficaram divididas em dois grupos. Um grupo de

maior quantidade de nitrogênio composto por FS, FT, FA e GM e outro grupo de

menor quantidade de nitrogênio, composto pelo SM, FM e SE.

Tabela 2. Análise físico-química das matérias-primas para meio de cultivo em placas de Petri (%), em base seca. Matéria-prima

Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade

FS 4,330 44,100 3,83 7,99 FT 2,600 42,310 5,04 10,34 FA 1,760 38,380 12,22 11,03 GM 1,620 43,830 1,15 11,18 SM 0,530 42,850 2,23 12,07 FM 0,090 44,990 0,39 9,64 SE 0,040 33,020 0,12 33,76

Legenda: FS= fibra de soja, FT= farelo de trigo, FA= farelo de arroz, GM= grão de milho, SM= sabugo de milho, FM= fibra de mandioca, SE= serragem de eucalipto. *Carbono calculado segundo Griensven (1988).

Usualmente matérias-primas com maiores concentrações de nitrogênio são

adicionadas a matérias-primas volumosas e com menores concentrações de

nitrogênio. A fim de obter relação C/N de 25 (OEI, 1996) os meios de cultivo foram

formulados independentes deste aspecto. O controle (CT) (Tabela 3) possui relação

C/N de 111 não sendo alterada para não modificar a porcentagem de matéria-prima

usualmente utilizada.

42

Na figura 1 é apresentada a média do crescimento micelial em placas de Petri

das diferentes linhagens de Lentinula edodes. Houve crescimento similar entre as

linhagens estudadas nos diferentes meios de cultivo, ressaltando a semelhança na

capacidade de degradação dos diversos meios pelas linhagens de um mesmo

gênero. Maiores variações ocorreram com os meios de cultura M1, M2 e M3, onde a

linhagem U6/12 (dados não apresentados) apresentou menor crescimento em

relação às demais, o que se deve provavelmente a uma variação da linhagem que

não está apta a degradar estes meios de cultivo.

Tabela 3. Composição dos meios de cultivo (M1 a M12 e controle (CT)) em g e porcentagem do meio, em base seca.

MATÉRIA-PRIMA EM g (%)

FS FT FA GM SM FM SE Total

M1 11,7 (39) - - - - - 18,3 (61) 30,0 (100)

M2 - 19,5 (65) - - - - 10,5 (35) 30,0 (100)

M3 - - 26,4 (88) - - - 3,6 (12) 30,0 (100)

M4 9,3 (31) - - - 20,7 (69) - - 30,0 (100)

M5 - 17,1 (57) - - 12,9 (43) - - 30,0 (100)

M6 - - 25,2 (84) - 4,8 (16) - - 30,0 (100)

M7 1,5 (5) - - 28,5 (95) - - - 30,0 (100)

M8 - 3,9 (13) - 26,1 (87) - - - 30,0 (100)

M9 - 11,1 (37) 18,9 (63) - - 30,0 (100)

M10 12,0 (40) - - - - 18,0 (60) - 30,0 (100)

M11 - 19,8 (66) - - - 10,2 (34) - 30,0 (100)

M12 - - 26,4 (88) - - 3,6 (12) - 30,0 (100)

CT - - 3,0 (10) - - - 27,0 (90) 30,0 (100)

Legenda: FS= fibra de soja, FT= farelo de trigo, FA= farelo de arroz, GM= grãos de milho, SM: sabugo de milho, FM: fibra de mandioca, SE: serragem de eucalipto.

43

Os meios de cultivo com maior crescimento micelial foram M5, M8 e M11

(Figura 1). Ambos são compostos por FT que é o principal subproduto da moagem

do trigo, constituído de uma mistura heterogênea de fragmentos da camada hialina-

aleurona dos grãos, sendo uma excelente fonte de minerais, vitaminas e outros

nutrientes de valor biológico (DI LENA et al., 1997). Entretanto observou-se que a

adição de SE ao meio resultou em crescimento abaixo das outras misturas com FT

(Figura 1). De acordo com Eira e Montini (1997), a serragem possui uma

composição nutricional pobre, tornando-se indispensável sua correção com aditivos.

Os substratos com serragem de eucalipto apresentaram menor crescimento micelial

(Figura 1), exceto o CT, apresentando crescimento ligeiramente superior.

Figura 1. Crescimento do fungo Lentinula edodes (média das linhagens U6/1, U6/11 e U6/12) após dez dias de crescimento em diferentes meios de cultivo. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

A FM e a FS apesar de possuírem uma porosidade que permite alta

capacidade de absorção de água e melhor acesso do fungo aos nutrientes (LINDE;

MACHADO, 2001), apresentaram resultados intermediários. Exceto no M11, onde

houve maior crescimento micelial quando adicionado FT a FM. Crescimento

intermediário também foi observado em meios de cultivo com FA, GM e SM, (Figura

1). O FA é o subproduto mais importante do arroz, sendo constituído pelo gérmem e

pela camada de aleurona, rico em fibras, minerais e proteínas (ALENCAR;

ALVARENGA, 1991). Embora seja muito utilizado na suplementação de substratos

para cultivo de fungos (RAJARATHNAM; BANO, 1987; SINGH, 2000), observou-se

0

10

20

30

40

50

60

70

80

M2 M3 M1 M10 M4 CT M12 M6 M9 M7 M5 M8 M11

Meios de cultivo

Diâ

met

ro d

e cr

esci

men

to d

o m

icél

io (

mm

).

f

e

ee

dd cd cd

bc bc abc ab a

44

crescimento medianos nos meios de cultivo com adição de farelo de arroz. O SM é

um material poroso que absorve grande quantidade de água permitindo acesso

enzimático do fungo aos nutrientes (RODRIGUEZ et al., 1998), sendo usualmente

utilizado como material volumoso em substratos para cultivo de fungos (GABRIEL,

2005). Segundo Neiva-Junior (2007) o SM tem uma porcentagem de lignina e

celulose de 16,04 e 28,99% respectivamente, sendo fonte de lignocelulose para

crescimento de microrganismos. Já o GM possui alta concentração de amido

encapsulado na matriz protéica do seu endosperma, fonte rica de carbono e

nitrogênio (ECKHOFF; PAULSEN, 1996).

A análise visual da densidade do micélio (dados não apresentados) mostrou

vigor semelhante entre as diferentes linhagens nos diversos meios de cultivo,

evidenciando um adequado provimento de nutrientes para o fungo.

3.3.2 Crescimento em tubos de borosilicato

Para a formulação dos substratos em tubos de borosilicato foi realizada uma

estratificação granulométrica das matérias-primas com tamisador. Na faixa 1 (F1) o

tamanho das partículas foram de 1,7 a 5 mm, faixa 2 (F2) de 0,8 a 1,7 mm, faixa 3

(F3) de 0,3 a 0,8 mm e faixa 4 (F4) menor que 0,3 mm. Foram determinados dois

níveis de granulometria. No primeiro nível (G1) usou-se a faixa F1 para a matéria-

prima com menor quantidade de nitrogênio e F2 a F4 para a matéria-prima com

maior quantidade de nitrogênio. No segundo nível (G2) usou-se a faixa F2 a F4 para

ambas as matérias-primas do substrato. Na G2 as matérias-primas foram

adicionadas de forma proporcional para cada faixa, assim como no G1 para as

faixas F2 a F4.

Realizou-se então, uma análise físico-química das diferentes faixas de

granulometria para cada matéria-prima, conforme Tabela 4, mantendo-se a relação

C/N em 25 e a densidade média de 0,77 ± 0,09 g/cm3. O controle (Tabela 5)

possuem relação C/N de 124 não sendo alteradas para não modificar a

porcentagem de matéria-prima usualmente utilizada.

Pode se observar variação da quantidade de compostos dentro da mesma

matéria-prima dependendo do tamanho das partículas. Isto esta relacionado à

moagem dos subprodutos, onde é esperado que os minerais, por normalmente

45

encontrarem-se na forma de sais de fácil quebra, concentrem-se nas frações de

menor granulometria (FENNEMA, 2000) alterando assim as frações orgânicas e

inorgânicas dos substratos de cultivo. A fração orgânica é responsável pelo

fornecimento de carbono e nitrogênio, enquanto que a fração inorgânica exerce

importante papel na disponibilização de micronutrientes normalmente envolvidos no

funcionamento dos sistemas de transporte celular e das reações enzimáticas

(BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 2000, LEHNINGER et al., 1995). Desta

forma, o conhecimento da composição química das frações granulométricas do

substrato de cultivo é importante para a compreensão do crescimento do fungo em

diferentes substratos.

Tabela 4. Análise físico-química das matérias-primas utilizadas para o crescimento em tubos de borosilicato em porcentagem (base seca).

Resultado de análise (%) MP G Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade

F1 0,453 44,712 1,766 8,810 F2 0,817 44,270 2,301 9,160 F3 1,038 44,250 2,130 9,370

SM

F4 1,229 43,006 4,318 9,670 F1 1,401 43,618 1,243 11,520 F2 0,308 43,661 1,927 10,750 F3 1,634 41,871 5,828 10,430

GM

F4 1,420 39,706 10,698 9,890 F2 0,032 32,511 0,138 34,840 F3 0,059 32,438 0,123 35,000 SE F4 0,028 34,136 0,277 31,450 F2 5,520 43,497 3,736 9,270 F3 4,590 43,826 3,668 8,680 FS F4 4,834 43,616 3,959 8,810 F2 1,959 42,711 5,229 9,350 F3 2,508 41,762 7,696 8,780 FA F4 2,667 39,455 12,040 9,050 F2 3,575 41,935 5,421 10,710 F3 3,820 42,038 4,794 11,130 FT F4 3,299 42,514 3,142 11,830

Legenda: MP = matéria-prima, G = granulometria, SM = sabugo de milho, GM=grão de milho, SE= serragem de eucalipto, FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, F1 a F4 = faixa de granulometria. *Carbono calculado segundo Griensven (1988).

Tabela 5. Composição dos substratos (M4G1 a M8G2 e controle (CTG2)) em g e porcentagem do substrato, em base seca.

46

SUBSTRATO EM g (%) MP G

M4G1 M4G2 M5G1 M5G2 M6G1 M6G2 M8G1 M8G2 CTG2

F1 27,0 (68,0)

- 19,7 (50,0)

- 11,6 (30,0)

- - - -

F2 - 9,7 (24,7)

- 7,5 (19)

- 4,6 (11,6)

- - -

F3 - 9,7

(24,7) - 7,5 (19) -

4,6 (11,6) - - -

SM

F4 - 9,7

(24,7) - 7,5 (19) -

4,6 (11,6) - - -

F1 - - - - - - 28,0

(71,0) - -

F2 - - - - - - - 12

(30) -

F3 - - - - - - - 12

(30) - GM

F4 - - - - - - - 12

(30) -

F2 - - - - - - - - 12

(30)

F3 - - - - - - - - 12

(30) SE

F4 - - - - - - - - 12

(30)

F2 4,1

(10,6)

3,4 (8,6) - - - - - - -

F3 4,1

(10,6)

3,4 (8,6) - - - - - - - FS

F4 4,1

(10,6)

3,4 (8,6) - - - - - - -

F2 - - - - 9,2

(23,3) 8,5

(21,7) - - 1,1

(3,3)

F3 - - 9,2

(23,3) 8,5

(21,7) - - 1,1

(3,3) FA

F4 - - 9,2

(23,3) 8,5

(21,7) - - 1,1

(3,3)

F2 - - 6,5

(16,6) 5,6

(14,3) - 3,8

(9,6) 1,1

(3,3)

F3 - - 6,5

(16,6) 5,6

(14,3) - 3,8

(9,6) 1,1

(3,3) FT

F4 - - 6,5

(16,6) 5,6

(14,3) - 3,8

(9,6) 1,1

(3,3)

47

Os meios de cultivo utilizados para crescimento micelial em placas de Petri

que continham FM não foram utilizados para a fase experimental de crescimento do

fungo em tubos de borosilicato (Tabela 1). Esta matéria-prima é rica em amido, que

por sua vez, gelatiniza em temperaturas acima de 52 ºC. Devido à autoclavagem do

substrato haveria a formação deste complexo, provavelmente limitando a passagem

de oxigênio ao longo do tubo e inviabilizando o crescimento do micélio. Desta forma,

algumas matérias-primas nutricionalmente adequadas para o crescimento micelial

em placas de Petri, não tem o mesmo resultado, em maior escala, principalmente no

sistema axênico de produção, em que calor é utilizado para esterilizar o substrato.

Entretanto especula-se que em pequenas quantidades, desde que este complexo

seja capaz de ser degradado pelo fungo, pode ser fonte de reserva de água e

nutrientes para produção em longo prazo. Isto pode ser verificado na Figura 2, onde

o substrato M6G2 apresentou o menor crescimento micelial, devido alta

concentração de FA, que sofreu gelatinização durante a autoclavagem,

inviabilizando o crescimento micelial. Entretanto o substrato M6G1, que possui a

mesma formulação, exceto a granulometria, não apresentou gelatinização visível do

FA. Este fator físico do substrato proporcionou um crescimento micelial no M6G1

cerca de três vezes maior que no M6G2. Neste caso a maior granulometria do

substrato proporcionou uma maior aeração evitando o bloqueio físico do micélio.

Embora seja observado na Figura 2 que o M8G2 foi um dos melhores

substratos de cultivo, este dado não será considerado, pois após a autoclavagem

ocorreu gelatinização, passando o substrato a ocupar menor volume e se

distanciando da parede do tubo de borosilicato. Isto permitiu que o micélio crescesse

em superfície, não penetrando o substrato e consequentemente não degradando

seus componentes. Devido à gelatinização observada, o fungo possivelmente não

conseguiria penetrar no substrato, obtendo então, resultados de crescimento inferior

ao M8G1. De acordo com a Figura 1, o M8 é nutricionalmente adequado, mas

fisicamente seu crescimento poderia ser inferior em tubos de borosilicato por causa

da gelatinização.

Observou-se que a G1 proporcionou maior crescimento micelial no substrato

M5 e M6 quando comparada a G2 (Figura 2). A maior granulometria proporcionou

uma maior aeração do meio, permitindo ao micélio crescer mais rapidamente.

Entretanto para os substratos M4G1 e M4G2, a menor granulometria não implicou

48

em limitação da aeração permitindo um melhor aproveitamento do substrato devido

a maior área específica do meio, uma boa aeração do M4G2 se deve provavelmente

à alta porcentagem de SM (Tabela 2), que mesmo na G2 proporcionou uma boa

porosidade ao substrato. O M4 e M5 possuem alta porcentagem de SM, no entanto

o substrato M5G1com maior porcentagem de FT foi o que apresentou resultado

destacado, possivelmente devido à rica composição química do FT e à maior

granulometria quando comparado a M5G1 (Figura 2). Portanto os fatores

nutricionais e de aeração tem importância na decisão do tipo de formulação utilizada

e merece mais experimentos.

Figura 2. Crescimento micelial de Lentinula edodes aos 49 dias em tubos de borosilicato. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). G1 = granulometria do substrato maior; G2 = granulometria do substrato menor.

O CTG2 apresentou o melhor resultado de crescimento micelial (Figura 2). O

cogumelo L. edodes é comumente cultivado em toras de madeira sendo que no

Brasil, opta-se pelo eucalipto, uma madeira de custo acessível encontrada em quase

todas as regiões, a fim de baratear a produção (EIRA et al., 2005; EIRA; MONTINI,

1997). A tora de madeira possui uma alta relação C/N, acima de 200 (EIRA;

MONTINI, 1997), bem como o CTG2, onde a relação C/N é de 124, enquanto os

demais substratos de cultivo possuem relação C/N de 25 (OEI, 1996). O principal

material utilizado no cultivo axênico de L. edodes é a serragem com adição de

0

50

100

150

200

M6 G2 M8 G1 M6 G1 M4 G1 M5 G2 M4 G2 M5 G1 M8 G2 CT G2

Substratos

Cre

scim

en

to m

icel

ail

(mm

)

abab b

b

b

c

d e

G1

G2

a

49

outros subprodutos como farelo de trigo, farelo de arroz, farelo de soja, entre outros

(EIRA; MINHONI, 1997; SILVA et al., 2005).

A densidade micelial foi semelhante entre os substratos no tubo de

borosilicato, confirmando os resultados de densidade micelial encontrados em

placas de Petri e evidenciando sua qualidade nutricional para o crescimento micelial

de Lentinula edodes.

3.3.3 Determinação da atividade da lacase

Na Figura 3 são apresentados os efeitos das variáveis na passagem do nível

inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta da atividade da lacase.

A variável que mais influenciou a produção da lacase foi o Fe (Figura 3).

Observa-se que a produção de lacase aumenta em aproximadamente 5 unidades

enzimáticas quando utilizado o Fe como indutor. No entanto há poucos relatos na

literatura sobre a utilização do Fe como indutor da atividade da lacase. Giardina et

al. (1999), relatam que uma das isoenzimas (POXAw) da lacase produzida por P.

ostreatus possui um átomo de Fe em sua estrutura, sendo assim o Fe possuiria

papel importante na produção desta isoenzima. Também observou-se aumento na

produção de lacase quando adicionado Mn (Figura 3), este metal participa

diretamente da degradação de lignina, atuando no ciclo da peroxidase Mn-

dependente (BALDRIAN, 2003, PALMIERI, et al., 2000). Já o Cu, o Cd e o Zn

apresentaram efeito negativo na produção de lacase, sendo que o Cu não

apresentou efeito significativo. Singhal e Rathore (2001) relatam que baixas

concentrações de Zn e Cu são necessárias ao desenvolvimento do sistema

lignolítico de fungos, mas altas concentrações causam inibição. O mesmo foi

observado por Baldrian et al. (1996) com o a adição de Cd em Phanerochaete

chrysosporium. Dessa forma possivelmente a adição destes indutores foi em

concentração maior que a capacidade do fungo em utilizá-la, causando efeito

negativo na atividade da lacase.

50

Figura 3. Efeito em U/g (base seca) das variáveis na passagem do nível inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta atividade da lacase para o fungo Lentinula edodes. * indicativo de diferença significativa pela análise de variância (p<0,05).

Em relação ao substrato de cultivo, observa-se que a atividade da lacase

aumenta com o uso do meio CTG2 e diminui quando utilizado o substrato M8G2

(Figura 3). Ambos os substratos possuem a granulometria mais fina, apresentando

maior área de contato para ação da enzima e permitindo o acesso do fungo aos

nutrientes. Pandey (2003) cita o tamanho da partícula como propriedade física

essencial para a atividade enzimática, outros pontos importantes destacados pelo

autor são natureza cristalina, porosidade e área de superfície do substrato. Membrilo

et al. (2008) observaram que a razão geométrica e o tamanho das fibras do bagaço

da cana-de-açúcar influenciam fortemente o perfil da atividade enzimática do gênero

de Pleurotus. Isso se deve provavelmente, ao perfil da lacase que possui massa

molecular alta, não conseguindo penetrar fundo nos tecidos, agindo na lignina

presente na superfície das partículas do substrato (WIDSTEN, KANDELBAUER,

2008).

Em relação ao substrato observa-se que a utilização do CTG2 aumenta a

atividade da lacase enquanto o uso do M8G2 diminui a atividade da enzima (Figura

4). Isto se deve à concentração de lignina no substrato de cultivo, sendo que em

-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6

Zn

Substrato

Cd

Cu

Mn

FeV

ariá

veis

Efeito (U/g meio seco)

*

*

*

*

*

51

CTG2 a concentração é muito maior do que em M8G2 (Tabela 6). Segundo Niladevi

e Prema (2008), maiores concentrações de lignina no substrato aumentam

consideravelmente a atividade da lacase.

Tabela 6. Conteúdo de cinzas, proteínas, fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de detergente ácido (FDA) nos substratos de cultivo para determinação da atividade da lacase pelo fungo Lentinula edodes. Valores expressos em % base seca.

Substrato FDN FDA

M8G2 30,99 1,03

CTG2 89,01 76,51

52

3.4 CONCLUSÃO

Em função da metodologia adotada e das condições experimentais concluiu-

se que o basidiomiceto Lentinula edodes é capaz de degradar uma ampla variedade

de substratos, sendo as matérias-primas mais adequadas ao crescimento micelial

em placas de Petri a fibra de mandioca, sabugo de milho, grãos de milho e farelo de

trigo. Diferentes granulometrias afetam a composição física e nutricional do

substrato de cultivo e que interferem no crescimento do fungo. Tamanho de

partículas diferentes, de uma mesma matéria-prima, têm relação C/N distintas. O

maior diâmetro da partícula do substrato proporciona maior crescimento micelial

devido à maior aeração do substrato. As matérias-primas que gelatinizam após

autoclavagem (121 ºC) não são adequadas ao crescimento micelial axênico de

fungos quando em quantidades iguais ou superiores a 65% do substrato. O aumento

da atividade da lacase é influenciado pela concentração de lignina do substrato e

pela adição de indutores metálicos.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e

pela bolsa de estudos concedida.

53

3.5 REFERÊNCIAS

ALENCAR, M.L.C. B. B.; ALVARENGA, M. G. Farelo de arroz: composição química e seu potencial como alimento. Arquivos de Biologia e Tecnologia, Porto Alegre, v. 34, n. 1, p. 95-108, 1991.

ARORA, D. S.; GILL, P. K. Effects of various media and supplements on lacase production by some white rot fungi. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 77, p. 89-91, 2001.

BALDRIAN, P. Interactions of heavymetals with white-rot fungi. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 32, p. 78-91, 2003.

BALDRIAN, P.; GABRIEL, J. Copper and cadmium increase activity in Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiology, Amsterdam, v. 206, p. 69-74, 2002.

BALDRIAN, P.; GABRIEL, J.; NERUD, F. Effect of cadmium on the lignolytic activity of Stereum harsutum and Phanerochaete chrysosporium. Folia Microbiologica, v. 41, p. 363-367, 1996.

BALDRIAN, P.; VALASKOVÁ, V.; MERHAUTOVÁ, V.; GABRIEL, J. Degradation of lignocellulose by Pleurotus ostreatus in the presence of copper, manganese, lead and zinc. Research in Microbiology, Amsterdam, v. 156, p. 670-676, 2005.

BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. 1087 p.

CEREDA, M. P. Valorização de subprodutos como forma de reduzir custos de produção. In: Culturas de tuberosas amiláceas latino americanas: Manejo, uso e tratamento de subprodutos da industrialização da mandioca. São Paulo: Fundação Cargill, 2001, 320p.

DIAS, E. S.; KOSHIKUMO, E. M. S.; SCHWAN, R. E. F.; SILVA, R. Cultivo do cogumelo Pleurotus sajor-caju em diferentes resíduos agrícolas. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 27, n. 6, p. 1363-1369, 2003.

DI LENA, G.; PATRONI, E.; QUAGLIA, G. B. Improving the nutritional value of wheat bran by a white rot fungus. International Journal of food science and technology, Oxford, v. 32, p. 513-519, 1997.

ECKHOFF, S. R.; PAULSEN, M. R. Maize. In: HENRY, R. J. KETTLEWELL, P. S. Cereal grain quality. London: Chapmam & Hall, 1996.

54

EIRA, A. F. Cultivo do cogumelo medicinal Agaricus blazei (Murrill) ss. Heinemann ou Agaricus brasiliensis (Wasser et al.). Viçosa: Aprenda fácil, 2003.

EIRA, F. C.; MEIRELLES, W. F., PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Shiitake production on corncob substrates. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 4, n. 2, p. 141-148, 2005.

EIRA, A. F.; MONTINI, R. M. C. Manual de cultivo do shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler). Botucatu: FEPAF, 1997. 38p.

ELISASHVILI, V.; PENNINCKX, M.; KACHLISHVILI, E.; TSIKLAURI, N.; METREVELI, E.; KHARZIANI, T.; KVESITADZE, G. Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, p. 457-462, 2008.

FELLOWS, P. J. Tecnologia do Processamento de Alimentos: princípios e prática. 2ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.

FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza: Acríbia, 1993. 1051p.

GABRIEL, V. Cereal straw and corncobs. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 86-90.

GALHAUP, C,; GOLLER, S.; PETERBAUER, C. K.; STRAUSS, J.; HALTRICH, D. Characterization of the major lacase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology, Londres, v. 148, p. 2159-2169, 2002.

GIANFREDA, L.; XU, F.; BOLLAG, J. M. Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes. Biorremediation Journal, Boca Raton, v. 3, n. 1, p. 1-26, 1999.

GIARDINA, P.; PALMIERI, G.; SCALONI, A.; FONTANELLA, B.; FARACO, V.; CENNAMO, G.; SANNIA, G. Protein and gene structure of a blue lacase from Pleurotus ostreatus. Biochemical Journal, Londres, v. 341, p. 655-663, 1999.

GRIENSVEN, L. J. L. D. The cultivation of mushrooms. Horst: Mushroom Experimental Station. 1988. 515p.

55

HERRERA, O. M. Produção, economicidade e parâmetros energéticos do cogumelo Agaricus blazei: um enfoque na cadeia produtiva. Botucatu, 2001. Originalmente apresentada como dissertação de doutorado, Departamento de Defesa Fitossanitária, Faculdade de Ciências Agronômicas, Unesp, 2001.

HOSENEY, R. C. Princípios de ciencia y tecnologia de los cereales. Zaragoza: Acribia, 1991. 320p.

HOU, H.; ZHOU, J.; WANG, J.; DU, C.; YAN, B. Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye. Process Biochemistry, Amsterdam, v. 39, p. 1415-1419, 2004.

HWANG, H. J.; KIM, S. W.; LIM, J. M.; JOO, J. H.; KIM, H. O.; KIM, H. M.; YUN, J. W. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in strptozotocin-induced diabetic rats. Life Sciences, Oxford v. 76, p. 3069-3080, 2005.

ISHIKAWA, N. K., KASUYA, M. C. M., VANETTI, M. C. D.Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 206-210, 2001.

LECHNER, B. E.; PAPINUTTI, V. L. Production of lignocellulosic enzymes during growth and fruiting of the edible fungus Lentinus tigrinus on wheat straw. Process Biochemistry, Amsterdam, v. 41, p. 594-598, 2006.

LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 2ed. São Paulo: Sarvier, 1995, 803p.

LINDE, G. A., MACHADO, R. P. Fibra de soja: benefícios a saúde e aplicações. Food Ingredients, v. 11, n. 3, 2001.

MEMBRILLO, I.; SÁNCHEZ, C.; MENESES, M.; FAVELA, E.; LOERA, O. Effect of substrate particle size and additional nitrogen source on production of lignocellulolytic enzymes by Pleurotus ostreatus strains. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, n. 16, p. 7842-7847, 2008.

NEIVA-JUNIOR, A. P.; SILVA-FILHO, J. C.; TIESENHAUSEN, I. M. E. V. V.; ROCHA, G. P.; CAPELLE, E. R.; COUTO-FILHO, C. C. C. Efeito de diferentes aditivos obre os teores de proteína bruta, extrato etéreo e digestibilidade da silagem de maracujá. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 31, n. 3, p.871-875, 2007.

56

NILADEVI, K. N.; PREMA, P. Effect of inducers and process parameters on laccase prodution by Stretomyces psammoticus and its application in dye decolourization, Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, p. 4583-4589, 2008.

OEI, P. Mushroom cultivation. Tool: Leiden, 1996. 274p.

PALMIERI, G.; GIARDINA, P.; BIANCO, C.; FONTANELLA, B.; SANNIA, G. Copper induction of lacase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Applied and Enviromental Microbiology, Washington, v. 66, p. 920-924, 2000.

PANDEY, A. Solid–state fermentation. Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v. 13, p. 81-84, 2003.

PARANÁ. Secretaria da Agricultura e do Abastecimento do Paraná. Relatório da safra 2006/2007. Disponível em: <http://www.pr.gov.br/seab/deral/Relat%f3rio%20da%20Safra_JAN_07.pdf> Acesso em 21/02/2007.

POPPE, J. Substrate. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 75-85.

RAJARATHNAM, S.; BANO, Z. Pleurotus Mushrooms. Parte I A. Morfology, life cycle, taxonomy, breeding and cultivation. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Boca Raton, v. 26, n. 2, p.157-223, 1987.

ROBINSON, T.; CHANDRAN, B.; NIGAM, P. Studies on the production of enzymes by white-rot fungi for the decolourisation of textil dyes. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 29, p. 575-579, 2001.

RODRIGUEZ, S.; SANTORO, R.; CAMESELLE, C., SANROMÁN, A. Effect of different parts of the corn cob employed as a carrier on lignolytic activity in solid state cultures by P. chrysosporium. Bioprocess Engineering, Amsterdam, v. 18, p.251-255, 1998.

SAZAKI, S. H.; LINHARES, R. E. C.; NOZAWA, C. M.; MONTALVÁN, R.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Strains of Lentinula edodes supress growth of phytopathogenic fungi and inhibit alagoas serotype of vesicular stomatitis vírus. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 52-55, 2001.

SHU, C.; XU, C., LIN, E. Production, purification and partial characterization of a novel endo-b-1,3-glucanase from Agaricus brasiliensis. Process Biochemistry, Barking, v. 41, p. 1229-1233, 2006.

57

SILVA, E. M.; MACHUCA, A.; MILAGRES, A. M. F. Effect os cereal brans on Lentinula edodes growth and enzyme activies during cultivation on forestry waste. Letters in Applied Microbiology, v. 40, p. 283-288, 2005.

SILVA, D. J.; QUEIROZ, A. C. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. Viçosa: UFV, 2002. 235p.

SINGHAL, V.; RATHORE, V. S. Effects of Zn2+ and Cu2+ on growth, lignin degradation and ligninolytic enzymes in Phanerochaete chrysosporium. World Journal Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 17, p. 2235-2240, 2001.

SINGH, M. P. Biodegradation of lignocelulosic waste through cultivation of Pleurotus sajor-caju. Mushroom Science, Sidney, v. 15, p. 517-521, 2000.

SOUZA-PACCOLA, E. A.; BOMFETI, C. A.; FÁVARO, L. C. L.; FONSECA, I. C. B.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Antimutagenic action of Lentinula edodes and Agaricus blazei on Aspergillus nidulans conidia. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 35, p. 311-315. 2004.

STAJIC, M.; PERSKY, L.; FRIESEM, D. HADAR, Y.; WASSER, S. P.; NEVO, E.; VUKOJEVIC, J. Effect of different carbon and nitrogen sources on lacase and peroxidases production by selected Pleurotus species. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 38, p. 65-73, 2006.

SUZUKI, H.; ILYAMA, K.; YOSHIDA, O.; YAMAZAKI, S.; YAMAMOTO, N.; TODA, S. Structural characterization of the immunoactive and antiviral water-solubilized lignin in na extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia (LEM). Agricultural and Biological Chemistry, Tóquio, v. 54, n. 2, p. 479-487, 1990. SUZUKI, M.; IWASHIRO, M.; TAKATSUKI, F.; KURIBAYASHI, K.; HAMURO, J. Reconstitution of antitumor effects of lentinan in nude mice: roles of delayes-types hypersensitivy reaction triggred by CD4-positive T cell clone in the infiltration of effector cells into tumor. Journal Cancer Research., v. 85, p. 409-417, 1994.

WIDSTEN, A.; KANDELBAUER, A. Laccase applications in the forest products industry: a review. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 42, p. 293-307, 2008.

58

4. USO DE GRÃOS PARA CRIOPRESERVAÇÃOA -20 ºC E A -70 ºC DE Pleurotus

ostreatus.

4.1 INTRODUÇÃO

Fungos do gênero Pleurotus são Basidiomicetos de interesse comercial

devido a seu sabor refinado (SHARMA; MADAN, 1993) e capacidade de produzir

biocompostos antitumorais (WASSER; WEIS, 1999) e hipocolesterolêmicos

(HOSSAIN et al., 2003). O cultivo deste fungo vem crescendo devido principalmente

à menor complexidade das técnicas de cultivo quando comparado com fungos do

gênero Agaricus (SILVA et al., 2007).

Para o cultivo de cogumelos é necessária a manutenção adequada do inóculo

de forma a preservar suas características biológicas. A repicagem micelial tem sido a

técnica mais utilizada na preservação e manutenção desta espécie, porém isto

implica em contaminações acidentais e degenerações de crescimento (HOMOLKA

et al., 2001), com perda das características desejáveis de produção ou da linhagem.

Uma forma de superar estes obstáculos é a utilização de técnicas de

criopreservação para a manutenção de linhagens fúngicas.

A criopreservação é uma opção utilizada para a manutenção de coleções de

fungos em bancos de germoplasma. As temperaturas utilizadas nestes processos

são de -70 oC a -196 oC (PUTZKE; PUTZKE, 1998), o que exige equipamentos

caros, limitam seu uso para fins comerciais e de pesquisa. Assim o uso de

temperaturas mais elevadas e técnicas simples seriam adequados para viabilizar a

manutenção de linhagens fúngicas. A criopreservação a -20 oC tem sido pouco

explorada e pode trazer um novo enfoque para a manutenção de linhagens. Esta

técnica utiliza equipamentos mais baratos e de fácil aquisição, o que torna o

processo de criopreservação acessível. Entretanto esta temperatura ocasiona danos

celulares que inviabilizam a recuperação da viabilidade do fungo após congelamento

(THOMAS; SMITH, 1994). Para diminuir os efeitos deletérios da criopreservação a -

20 oC em Basidiomicetos são sugeridos agentes crioprotetores (HUBÁLEK, 2003). O

uso desses agentes evita a formação de cristais de gelo durante o congelamento,

reduzindo danos celulares e aumentando as chances de posterior recuperação do

59

micélio (MATA; PEREZ-MÉRLO, 2003). Contudo o substrato de crescimento do

fungo é um fator que também afeta a capacidade de recuperação do fungo à

criopreservação, podendo atuar como crioprotetor (MATA; SALMONES, 2005). A

associação de substrato de cultivo e agente crioprotetor poderia viabilizar a

criopreservação a -20 oC. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar

substratos associados a agentes crioprotetores na criopreservação a -20 ºC e a -70

ºC de Pleurotus ostreatus, visando desenvolver técnicas de criopreservação mais

simples, eficientes e com equipamentos de menor custo.

60

4.2 MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da

Universidade Paranaense - Unipar Campus sede, Umuarama, Paraná, Brasil, com a

linhagem U6/8 do Pleurotus ostreatus provenientes da micoteca da Universidade

Estadual de Londrina - UEL. Para o crescimento do inóculo utilizou-se meio de

cultura batata-dextrose-ágar (BDA) Merck® (39 g/L) autoclavado a 121 ºC por 20

min. O crescimento do fungo foi realizado a 25 ºC ± 1 ºC, sem iluminação por 15

dias. Selecionou-se como inóculo, micélio uniforme e sem setoriamento da

extremidade do crescimento radial.

4.2.1 Inibição do crescimento micelial

Para a determinação da inibição do crescimento do micélio (ICM) foram

adicionadas diferentes concentrações de cada agente crioprotetor em meio BDA,

conforme Tabela 1. Todos os crioprotetores foram esterilizados a 121 ºC por 20 min,

com exceção do dimetilsulfóxido (DMSO) que foi esterilizado por filtração (filtro com

poro de 0,22 µm). Em cada meio de cultura foi inoculado um cilindro de 5 mm de

diâmetro contendo o micélio do fungo e mantido a 25 ºC ± 1 ºC, na ausência de luz,

por 6 dias. O diâmetro micelial do fungo foi medido em mm e a média foi calculada

por quatro medidas de diâmetro. A maior concentração do agente crioprotetor, com

índice de ICM inferior a 25%, foi escolhida para a etapa de criopreservação.

4.2.2 Meio de cultivo para a criopreservação do fungo

O micélio foi crescido em meio BDA, grãos de aveia (Avena strigosa Schreb

cv. IAPAR 61) com casca (GA), grãos de trigo (Triticum aestivum) (GT), grãos de

arroz (Oryza sativa L.) (GA) tipo integral e grãos de painço (Setaria italica L.) (GP).

Aproximadamente 200 g de cada grão foi imerso em excesso de água ultra pura e

cozido a 90 ºC por 45 min. O excesso de água foi removido e os grãos foram

acondicionados em erlenmeyers e autoclavados a 121 ºC por 20 min. Em seguida os

erlenmeyers receberam cinco cilindros de inóculo de forma asséptica e foram

mantidos a 25 ºC ± 1 ºC no escuro, até completa colonização do fungo.

61

4.2.3 Criopreservação

Para o experimento de criopreservação foram utilizadas ampolas plásticas,

conforme descrito por Challen e Elliot (1986). As ampolas com uma das

extremidades termoseladas bem como as soluções aquosas dos crioprotetores

foram autoclavados a 121 ºC por 20 minutos em frascos separados, sendo que a

solução de DMSO foi filtrada para esterilização (filtro de 0,22 µm). Cada ampola

recebeu 800 µl de solução crioprotetora e em seguida foram adicionados cinco

cilindros de BDA ou cinco grãos contendo micélio crescido. As ampolas foram

fechadas por termoselagem e congeladas a -20 ºC ou a -70 ºC, a partir da

temperatura do ambiente (cerca de 23 ºC). Foram realizadas três repetições para

cada tratamento. Todas as etapas foram feitas em câmara de fluxo laminar.

4.2.4 Recuperação do fungo criopreservado

Após 30 dias e um ano de congelamento as ampolas foram descongeladas

por submersão em água a 30 ºC por 15 min (HERRERA et al., 1998). Em seguida as

ampolas foram lavadas com álcool 70% e álcool 96%. Uma das extremidades do

tubo foi cortada e a solução crioprotetora foi separada dos cilindros e dos grãos. Os

cilindros de BDA e os grãos foram transferidos para meio de cultivo BDA e mantidos

a 25 ºC ± 1 ºC por no máximo de 30 dias.

Considerou-se recuperado o fungo que apresentou média de recuperação de

crescimento maior ou igual a 75% e coeficiente de variação menor que 15%. A

média de crescimento das repetições e o coeficiente de variação foram calculados

para cada tratamento.

62

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 é apresentado os ICM do fungo na presença de diferentes

concentrações de agentes crioprotetores em meio BDA. Pode-se observar que o

aumento da concentração do crioprotetor no meio de cultivo causou inibição do

crescimento do micélio, sendo necessário utilizar menores quantidades das relatadas

na literatura durante a criopreservação. Segundo Hubálek (2003) as concentrações

utilizadas para a crioproteção de microrganismos em geral são para GO entre 2% e

55% (média de 10%), DMSO entre 1% e 32% (média de 10%), GI entre 1% e 18%

(média de 4%), SA entre 1% e 68% (média de 10%), EM entre 0,5 e 20% (média de

2,5%) e PEG entre 5 a 45% (média de 10%). Como cada microrganismo apresenta

características únicas, mesmo quando da mesma espécie, optou-se por utilizar a

menor quantidade de crioprotetor e que apresentasse o menor distúrbio no

crescimento do micélio. Desta forma, selecionou-se a concentração do crioprotetor

para GO, DMSO, GI, SA, EM e PEG de 5,0%, 1,0%, 4,0%, 10,0%, 5,5% e 6,0%,

respectivamente, para as etapas de criopreservação.

Tabela 1. Diâmetro médio do crescimento micelial de Pleurotus ostreatus em meio de cultivo batata-dextrose-ágar (BDA) com diferentes concentrações de agentes crioprotetores.

Crioprotetor Código (%) Crescimento

micelial

(mm)

Inibição do crescimento do

micélio (%)

5,0 37,7 0

10,0 12,5 67 Glicerol GO

30,0 0,0 100

1,0 62,6 0

2,5 20,2 68 Dimetilsulfóxido DMSO

5,0 0,0 100

2,0 75,5 0

4,0 60,4 20 Glicose GI

10,0 23,4 69

63

5,0 72,3 0

10,0 58,9 18 Sacarose SA

30,0 0,0 100

4,0 67,1 0

5,5 51,8 23 Extrato de malte EM

13,0 19,3 71

3,0 64,4 0

6,0 53,5 17 Polietilenoglicol-

6000 PEG

10,0 19,1 70

Nas Tabelas 2 e 3 são apresentados os resultados de recuperação do

crescimento micelial do fungo após criopreservação por 30 dias a -20 oC e a -70 oC,

respectivamente. O BDA apresentou os piores resultados, havendo recuperação do

fungo somente em GO a -20 ºC e GO, DMSO e SA a -70ºC. Nas Tabelas 4 e 5 são

apresentados os resultados de recuperação do crescimento micelial do fungo após

criopreservação por um ano a -20 oC e a -70 oC, respectivamente. Semelhante ao que

ocorreu na criopreservação por 30 dias, o BDA apresentou a menor porcentagem de

recuperação quando utilizado qualquer crioprotetor -20 ºC e a -70 ºC. Somente houve

recuperação do fungo em cilindros de BDA quando associado ao crioprotetor DMSO.

Os cilindros de BDA são amplamente utilizados como suporte do micélio de

basidiomicetos para criopreservação (CHVOSTOVÁ, et al.; 1995; MATA et al., 1994),

no entanto muitos protocolos de congelamento utilizam nitrogênio líquido para a

criopreservação, o que provavelmente viabiliza o uso de cilindros de BDA, mas

encarece o processo.

Após a criopreservação por 30 dias todos os grãos apresentaram recuperação

do crescimento fúngico, exceto o GAR associado ao PEG quando congelado a -20 ºC

(Tabela 2 e 3). Para a criopreservação por um ano, o GTR apresentou o melhor

resultado a -20 ºC, com recuperação total do crescimento micelial para todos os

crioprotetores testados. Já GAV apresentou recuperação apenas quando utilizou-se a

SA como crioprotetor, e GAR e GPA não apresentaram recuperação do crescimento

micelial a -20 ºC, embora o GPA com SA tenha apresentado um bom resultado, dentro

dos parâmetros determinados não foi considerado recuperado (Tabela 4). No entanto

64

na criopreservação a -70 °C todos os grãos apresentaram 100% de recuperação

(Tabela 5). A maior eficiência esperada na criopreservação a -70 oC está relacionada à

maior velocidade de congelamento, que causa menores danos à célula devido a menor

desidratação e rompimento das membranas (DUMONT et al., 2004; FELLOWS, 2006).

O uso de temperatura mais elevada para a manutenção de linhagens

fúngicas, como a de -20 oC, considerada temperatura comercial de congelamento,

não é usual, segundo Putzke e Putzke (1998), por ocasionar danos celulares,

resultando em baixa taxa de sobrevivência do fungo. No entanto nossos resultados

demonstraram que a criopreservação por 30 dias a -20 ºC se torna viável com o uso

de grãos como substrato, permitindo alta taxa de sobrevivência do fungo (Tabela 2).

Isto se deve provavelmente a nutrientes presentes nos grãos que protegeriam o

fungo contra as baixas temperaturas (HOSENEY, 1991). Para a criopreservação por

um ano, o uso de GTR na conservação do fungo a -20 oC, permitiu alta taxa de

sobrevivência do fungo, à semelhança do que ocorreu na criopreservação a -70 oC

(Tabela 4 e 5). Isto sugere que o efeito crioprotetor do substrato GTR pode estar

relacionado à presença de alta concentração de amido e nutrientes termo-

resistentes no trigo e a uma rede de capilares (HOSENEY, 1991) que protegeriam

as hifas do fungo contra a baixa temperatura. Sendo assim, aspectos físicos e a

composição química do grão afetam a porcentagem de recuperação de Pleurotus

ostreatus. O amido possui alta capacidade de ligar água do substrato durante a

gelatinização (BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 1993), o que reduz o tamanho

dos cristais de gelo, aproximando as temperaturas de congelamento intra e

extracelular, reduzindo a desidratação celular (DUMONT et al., 2004; FELLOWS,

2006). No entanto GAV, GAR e GPA que apresentaram recuperação a -20 ºC após

30 dias de congelamento não apresentaram os mesmos resultados após um ano de

criopreservação, sendo que somente o GAV associado à SA foi recuperado (Tabela

2 e 4). Sendo assim o tempo de congelamento do fungo e seu substrato de

crescimento deve ser levado em consideração quando for utilizada a temperatura de

-20 ºC. A criopreservação de linhagens de Lentinula em grãos de sorgo (Sorghum

vulgare) com glicerol a 10% como crioprotetor já foi relatado por Mata e Salmones

(2005) em nitrogênio líquido, no entanto não foram encontrados relatos em

temperatura comercial de -20 oC para Basidiomicetos. Este aspecto permitiria reduzir

o custo de equipamentos e a manutenção de coleções de cultura de Basidiomicetos.

65

Tabela 2. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) Pleurotus ostreatus crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por 30 dias a -20 ºC.

Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)

GO (5%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

DMSO (1%) 13,3 (173,2) 100,0 (0,0) 93,3 (12,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

GI (4%) 0,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

SA (10%) 51,6 (86,7) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

EM (5,5%) 0,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

PEG (6%) 0,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 78,3 (25,7) 100,0 (0,0)

BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço)

Tabela 3. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) Pleurotus ostreatus crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por 30 dias a -70 ºC.

Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)

GO (5%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

DMSO (1%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

GI (4%) 33,3 (69,2) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

SA (10%) 93,3 (12,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

EM (5,5%) 75,5 (28,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

PEG (6%) 33,3 (173,2) 93,3 (12,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço)

66

Tabela 4. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) Pleurotus ostreatus crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por um ano a -20 ºC.

Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)

GO (5%) 0,0 (0,0) 33,3 (124,8) 100,0 (0,0) 12,5 (141,4) 0,0 (0,0)

DMSO (1%) 0,0 (0,0) 53,3 (86,6) 100,0 (0,0) 30,0 (141,4) 60,0 (88,1)

GI (4%) 0,0 (0,0) 70,0 (20,2) 100,0 (0,0) 83,3 (61,1) 40,0 (76,0)

SA (10%) 0,0 (0,0) 80,0 (0,0) 100,0 (0,0) 66,6 (62,4) 91,6 (15,7)

EM (5,5%) 0,0 (0,0) 73,3 (31,4) 100,0 (0,0) 25,0 (173,2) 83,0 (17,3)

PEG (6%) 0,0 (0,0) 60,0 (94,2) 100,0 (0,0) 40,0 (86,2) 51,6 (86,7)

BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço)

Tabela 5. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) de Pleurotus ostreatus crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por um ano a -70 ºC.

Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)

GO (5%) 56,1 (37,6) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

DMSO (1%) 93,3 (12,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

GI (4%) 17,1 (94,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

SA (10%) 83,3 (34,6) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

EM (5,5%) 23,3 (107,8) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

PEG (6%) 0,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço).

Para a criopreservação por 30 dias, observa-se que o PEG não foi eficiente

quando associado ao GAR a -20ºC, sendo que os demais crioprotetores associados a

67

grãos proporcionaram recuperação do fungo (Tabela 2 e 3). Supõe-se que este

resultado positivo seja referente à composição físico-química dos grãos, e não somente

à ação dos crioprotetores. A recuperação do BDA se mostra mais dependente do

crioprotetor, sendo que somente houve recuperação quando utilizado GO a -20 ºC e GO

e DMSO a -70 ºC (Tabela 2 e 3), provavelmente pela falta de estruturas físicas e

químicas mais complexas ausentes nos cilindros de BDA. Comparando a ação dos

crioprotetores para a criopreservação por um ano, pode-se verificar que a -20 ºC o

efeito protetor é baixo em todos os substratos, exceto para GTR onde todos os

crioprotetores foram eficientes, destaca-se também a ação crioprotetora da SA em GAV

(Tabela 4). No entanto, supõe-se que o ótimo resultado apresentado pelo GTR seja

referente à sua composição nutricional, e não somente à ação das substâncias

crioprotetoras adicionadas. Na temperatura de -70 ºC, destaca-se a ação do DMSO em

BDA, onde o crioprotetor viabilizou a recuperação do fungo, capacidade que nenhum

outro crioprotetor demonstrou em BDA nas duas temperaturas avaliadas (Tabela 4 e 5).

O DMSO, assim como o GO, tem a capacidade de penetrar a parede celular e

membrana plasmática, tornando-as mais elásticas, o que permite a acomodação

molecular durante a expansão de volume no congelamento. Além disso, possui a

capacidade de ligar a água no interior da célula, o que previne a desidratação

excessiva, reduz a toxicidade pelo excesso de sais e previne a formação de grandes

cristais de gelo (DUMONT et al., 2004; HUBÁLEK, 2003). Já os crioprotetores GI e SA

são compostos de carboidratos com alta capacidade de ligar água, que penetram na

parede celular, mas não penetram na membrana plasmática, formando uma barreira

contra o crescimento do gelo, protegendo a membrana plasmática mecanicamente

(HUBÁLEK, 2003; SANTOS, 2001; ZHANG et al., 1996). EM e PEG são crioprotetores

que não penetram na parede celular, adsorvem a superfície das células formando uma

camada viscosa e causando efluxo parcial da água na célula, inibindo o crescimento

dos cristais de gelo e aumentando a viscosidade da solução (HUBÁLEK, 2003).

Entretanto após 30 dias de congelamento somente o GO apresentou recuperação a -20

ºC e o GO e o DMSO apresentaram recuperação a -70 ºC (Tabela 2 e 3). Para um ano

GI, EM e PEG não apresentaram capacidade protetora a -20 ºC, apenas a SA

proporcionou recuperação micelial quando associada ao GAV (Tabela 4). Já a -70 ºC

apresentaram recuperação total quando associados ao GAV, GTR, GAR e GPA (Tabela

5).

68

Embora reconhecida a importância de aditivos crioprotetores, o substrato de

crescimento micelial parece influenciar de forma que o tipo de crioprotetor e a

temperatura de criopreservação sejam indiferentes (Tabela 4 e 5). Isto sugere que o

crioprotetor não seja necessário para criopreservar em diversas temperaturas,

principalmente a -20 oC.

O grãos e os cilindros de BDA além do efeito positivo na recuperação do

crescimento micelial, permitiram a manutenção do vigor de crescimento do fungo a -

20 oC e a -70 oC (dados não apresentados), sugerindo que houve a preservação das

estruturas celulares, mesmo a -20 oC. Estes resultados permitem uma nova

abordagem para os processos de manutenção de linhagens, viabilizando a

criopreservação comercial do gênero Pleurotus. Outros estudos devem ser ainda

desenvolvidos para a determinação de condições de criopreservação comercial para

outros Basidiomicetos de interesse, sendo que estes resultados são promissores

para estimular a produção de cogumelos comestíveis no Brasil.

69

4.4 CONCLUSÕES

Em função da metodologia adotada e das condições experimentais conclui-se

que o substrato de crescimento do micélio influencia diretamente na sobrevivência

do fungo criopreservado a -20 oC e a -70 oC, sendo os grãos mais eficientes que

batata-dextrose-ágar na criopreservação do fungo.

O uso de grãos de aveia, grãos de trigo, grãos de arroz e grãos de painço

viabiliza a criopreservação de Pleurotus ostreatus por 30 dias, em temperaturas

comercias de -20 ºC.

O uso de grãos de trigo associado a agentes crioprotetores viabiliza a

criopreservação de Pleurotus ostreatus por um ano, em temperaturas comerciais de

-20 oC, mantendo o vigor de crescimento do fungo

AGRADECIMENTOS

À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e

pela bolsa de estudos concedida.

70

4.5 REFERÊNCIAS

BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. 1087 p.

CHALLEN, M.; ELLIOTT, T. J. Polypropylene straw ampoules for the storage of microorganisms in liquid nitrogen. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 5, p.11-23, 1986.

CHVOSTOVÁ, V.; NERUD, F.; HOMOLKA, L. Viablity of wood-inhabiting basidiomycetes following cryogenic preservation. Folia Microbiologica, New York, v. 40, n.2, p. 193-197, 1995.

DUMONT, F.; MARECHAL, P. A.; GERVAIS, P. Cell size and water permeability as determining factors for cell viability after freezing at different cooling rates. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 70, n.1, p. 268-272, 2004.

FELLOWS, P. J. Tecnologia do processamento de alimentos: princípios e práticas. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.

FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza: Acríbia, 1993. 1051p.

HERRERA, I. L.; MATA, G.; HERNÁNDEZ, R. G. Evaluation of the viability of Pleutorus spp. strains after liquid nitrogen cryopreservation. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 29, n. 3, 1998.

HOMOLKA, L.; LISÁ, L.; EIHLEROVÁ, I.; NERUD, F. Cryopreservation of basidiomycete strains using perlite. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 47, p. 307-313, 2001.

HOSENEY, R. C. Principios de ciencia y tecnología de los cereales. Zaragoza: Acribia, 1991. 321p.

HOSSAIN, S.; HASHIMOTO, M.; CHOUDHURY, E.; ALAM, N.; HUSSAIN, S.; HASAN, M.; CHOUDHURY, S.; MAHMUD, I. Dietary mushroom (Pleurotus ostreatus) ameliorates atherogenic lipid in hypercholesterolaemic rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, New York, v. 30, p. 470, 2003.

HUBÁLEK, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology, New York, v. 46, p. 205-229, 2003.

71

MATA, G.; PÉREZ-MERLO, R. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant. Cryobiology, New York, v. 47, p. 14-20, 2003.

MATA, G.; SALMONES, D. Preservation of shiitake spawn stocks by cryogenic storage. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 42-45.

MATA. G.; SALMONES, D.; PÉREZ, P.; GUZMÁN, G. Behavior of some strains of the genus Pleurotus after different procedures for freezing in liquid nitrogen, Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 25, n. 3, p. 197-200, 1994.

PUTZKE, J; PUTZKE, M. T. L. Os reinos dos fungos. Santa Cruz do Sul: EDUNISC, 1998. 606p.

SANTOS, I. R. I. Criopreservação de germoplasma vegetal – a alternativa para conservação a longo prazo. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, Brasília, n. 20, p. 60-65, 2001.

SHARMA, S., MADAN, M. Microbial protein from leguminous and non-leguminous substrates. Acta Biotechnologica, Berlim, v. 13, p.131-139, 1993.

SILVA, E. G.; DIAS, E. S.; SIQUEIRA, F. G.; SCHWAN, R. F. Análise química de corpos de frutificação de Pleurotus sajor-caju cultivado em diferentes concentrações de nitrogênio. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 27, n. 1, p. 72-76, 2007.

THOMAS, V.; SMITH, D. Cryogenic light microscopy and the development of long-term cryopreservation techniques for fungi. Outlook on Agriculture, New York, v. 23, n. 3, p. 163-167, 1994.

WASSER, S. P.; WEIS, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives. International Journal of Medicinal Mushrooms, New York, v. 1, p. 31-62, 1999.

ZHANG, Y. H.; ZHONG, J. J.; YU, J. T. Enhancement of ginseng saponin production in suspension cultures of Panax notoginseng: manipulation of sucrose. Journal of Biotechnology, Amsterdam, v. 51, p. 49-56, 1996.

72

5. USO DE GRÃOS PARA CRIOPRESERVAÇÃOA -20 ºC E A -70 ºC DE Lentinula

edodes.

5.1 INTRODUÇÃO

O cogumelo Lentinula edodes, conhecido como shiitake possui propriedades

antimicrobianas (ISHIKAWA et al., 2001), antitumorais (SUZUKI et al., 1994),

antimutagênicas (SOUZA-PACCOLA et al., 2004), antivirais (SAZAKI et al., 2001;

SUZUKI et al., 1990), e hipocolesterolêmica (SAZAKI et al., 2001). Esta ampla

produção de compostos de interesse terapêutico associado a alto valor nutricional

torna o Lentinula edodes um cogumelo de grande interesse pela comunidade

científica internacional (EIRA; MONTINI, 1997).

Para o cultivo de cogumelos é necessária a manutenção adequada do inóculo

de forma a preservar suas características biológicas. A repicagem micelial tem sido a

técnica mais utilizada na preservação e manutenção desta espécie, porém isto

implica em contaminações acidentais e degenerações de crescimento (HOMOLKA

et al., 2001), com perda das características desejáveis de produção ou da linhagem.

Uma forma de superar estes obstáculos é a utilização de técnicas de

criopreservação para a manutenção de linhagens fúngicas.

A criopreservação é uma opção utilizada para a manutenção de coleções de

fungos em bancos de germoplasma. As temperaturas utilizadas nestes processos

são de -70 oC a -196 oC (PUTZKE; PUTZKE, 1998), o que exige equipamentos

caros, limitam seu uso para fins comerciais e de pesquisa. Assim o uso de

temperaturas mais elevadas e técnicas simples seriam adequados para viabilizar a

manutenção de linhagens fúngicas. A criopreservação a -20 oC tem sido pouco

explorada e pode trazer um novo enfoque para a manutenção de linhagens. Esta

técnica utiliza equipamentos mais baratos e de fácil aquisição, o que torna o

processo de criopreservação acessível. Entretanto esta temperatura ocasiona danos

celulares que inviabilizam a recuperação da viabilidade do fungo após congelamento

(THOMAS; SMITH, 1994). Para diminuir os efeitos deletérios da criopreservação a -

20 oC em Basidiomicetos são sugeridos agentes crioprotetores (HUBÁLEK, 2003). O

uso desses agentes evita a formação de cristais de gelo durante o congelamento,

73

reduzindo danos celulares e aumentando as chances de posterior recuperação do

micélio (MATA; PEREZ-MÉRLO, 2003). Contudo o substrato de crescimento do

fungo é um fator que afeta também a capacidade de recuperação do fungo à

criopreservação, podendo atuar como crioprotetor (MATA; SALMONES, 2005). A

associação de substrato de cultivo e agente crioprotetor poderia viabilizar a

criopreservação a -20 oC. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar

substratos associados a agentes crioprotetores na criopreservação a -20 ºC e a -70

ºC de Lentinula edodes visando desenvolver técnicas de criopreservação mais

simples, eficientes e com equipamentos de menor custo.

74

5.2 MATERIAIS E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da

Universidade Paranaense - Unipar Campus sede, Umuarama, Paraná, Brasil, com o

fungo Lentinula edodes, linhagem U6/12, provenientes da micoteca da Universidade

Estadual de Londrina - UEL. Para o crescimento do inóculo utilizou-se meio de

cultura batata-dextrose-ágar (BDA) Merck® (39 g/L) autoclavado a 121 ºC por 20

min. O crescimento do fungo foi realizado a 25 ºC ± 1 ºC, sem iluminação por 15

dias. Selecionou-se como inóculo, micélio uniforme e sem setoriamento da

extremidade do crescimento radial.

5.2.1 Inibição do crescimento micelial

Para a determinação da inibição do crescimento do micélio (ICM) foram

adicionadas diferentes concentrações de cada agente crioprotetor em meio BDA,

conforme Tabela 1. Todos os crioprotetores foram esterilizados a 121 ºC por 20 min,

com exceção do dimetilsulfóxido (DMSO) que foi esterilizado por filtração (filtro com

poro de 0,22 µm). Em cada meio de cultura foi inoculado um cilindro de 5 mm de

diâmetro contendo o micélio do fungo e mantido a 25 ºC ± 1 ºC, na ausência de luz,

por 6 dias. O diâmetro micelial do fungo foi medido em mm e a média foi calculada

por quatro medidas de diâmetro. A maior concentração do agente crioprotetor, com

índice de ICM inferior a 25%, foi escolhida para a etapa de criopreservação.

5.2.2 Meio de cultivo para a criopreservação do fungo

O micélio foi crescido em meio BDA, grãos de aveia (Avena strigosa Schreb

cv. IAPAR 61) com casca (GA), grãos de trigo (Triticum aestivum) (GT), grãos de

arroz (Oryza sativa L.) (GA) tipo integral e grãos de painço (Setaria italica L.) (GP).

Aproximadamente 200 g de cada grão foi imerso em excesso de água ultra pura e

cozido a 90 ºC por 45 min. O excesso de água foi removido e os grãos foram

acondicionados em erlenmeyers e autoclavados a 121 ºC por 20 min. Em seguida os

75

erlenmeyers receberam cinco cilindros de inóculo de forma asséptica e foram

mantidos a 25 ºC ± 1 ºC no escuro, até completa colonização do fungo.

5.2.3 Criopreservação

Para o experimento de criopreservação foram utilizadas ampolas plásticas,

conforme descrito por Challen e Elliot (1986). As ampolas com uma das

extremidades termoseladas bem como as soluções aquosas dos crioprotetores

foram autoclavados a 121 ºC por 20 minutos em frascos separados, sendo que a

solução de DMSO foi filtrada para esterilização (filtro de 0,22 µm). Cada ampola

recebeu 800 µl de solução crioprotetora e em seguida foram adicionados cinco

cilindros de BDA ou cinco grãos contendo micélio crescido. As ampolas foram

fechadas por termoselagem e congeladas a -20 ºC ou a -70 ºC, a partir da

temperatura do ambiente (cerca de 23 ºC). Foram realizadas três repetições para

cada tratamento. Todas as etapas foram feitas em câmara de fluxo laminar.

5.2.4 Recuperação do fungo criopreservado

Após um ano de congelamento as ampolas foram descongeladas por

submersão em água a 30 ºC por 15 min (HERRERA et al., 1998). Em seguida as

ampolas foram lavadas com álcool 70% e álcool 96%. Uma das extremidades do

tubo foi cortada e a solução crioprotetora foi separada dos cilindros e dos grãos. Os

cilindros de BDA e os grãos foram transferidos para meio de cultivo BDA e mantidos

a 25 ºC ± 1 ºC por no máximo de 30 dias.

Considerou-se recuperado o fungo que apresentou média de recuperação de

crescimento maior ou igual a 75% e coeficiente de variação menor que 15%. A

média de crescimento das repetições e o coeficiente de variação foram calculados

para cada tratamento.

76

5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 é apresentado os ICM do fungo na presença de diferentes

concentrações de agentes crioprotetores em meio BDA. Pode-se observar que o

aumento da concentração do crioprotetor no meio de cultivo causou inibição do

crescimento do micélio, exceto para a SA de 5,0 para 10,0%, sendo necessário

utilizar menores quantidades das relatadas na literatura durante a criopreservação.

Segundo Hubálek (2003) as concentrações utilizadas para a crioproteção de

microrganismos em geral são para GO entre 2% e 55% (média de 10%), DMSO

entre 1% e 32% (média de 10%), GI entre 1% e 18% (média de 4%), SA entre 1% e

68% (média de 10%), EM entre 0,5 e 20% (média de 2,5%) e PEG entre 5 a 45%

(média de 10%). Como cada microrganismo apresenta características únicas, mesmo

quando da mesma espécie, optou-se por utilizar a menor quantidade de crioprotetor

e que apresentasse o menor distúrbio no crescimento do micélio. Desta forma,

selecionou-se a concentração do crioprotetor para GO, DMSO, GI, SA, EM e PEG de

10,0%, 1,0%, 4,0%, 10,0%, 4,0% e 6,0%, respectivamente, para as etapas de

criopreservação.

Tabela 1. Diâmetro médio do crescimento micelial de Lentinula edodes, após 15 dias em meio de cultivo batata-dextrose-ágar (BDA) com diferentes concentrações de agentes crioprotetores.

Crioprotetor Código (%) Crescimento

micelial

(mm)

Inibição do crescimento

do micélio (%)

5,0 75,1 0

10,0 69,3 8 Glicerol GO

30,0 0,0 100

1,0 43,3 0

2,5 0,0 100 Dimetilsulfóxido DMSO

5,0 0,0 100

2,0 40,4 0

4,0 39,0 3 Glicose GI

10,0 25,7 36

Sacarose SA 5,0 46,2 11

77

10,0 52,2 0

30,0 23,8 54

4,0 41,6 0

5,5 37,8 9 Extrato de malte EM

13,0 25,7 38

3,0 47,8 0

6,0 42,7 10,7 Polietilenoglicol-

6000 PEG

10,0 22,0 54,0

Nas Tabelas 2 e 3 são apresentados os resultados de recuperação do

crescimento micelial do fungo após criopreservação a -20 oC e a -70 oC,

respectivamente. Todos os grãos e o cilindro de BDA não apresentaram recuperação

após a criopreservação a -20ºC. O uso de temperatura mais elevada para a

manutenção de linhagens fúngicas, como a de -20oC, considerada temperatura

comercial de congelamento, não é usual, segundo Putzke e Putzke (1998), por

ocasionar danos celulares, resultando em baixa taxa de sobrevivência do fungo (Tabela

2).

No entanto na criopreservação a -70°C todos os grãos e os cilindros de BDA

apresentaram 100% de recuperação, exceto o GAV, GPA e BDA associados ao PEG

(Tabela 3). A maior eficiência esperada na criopreservação a -70oC está relacionada à

maior velocidade de congelamento, que causa menores danos à célula devido a menor

desidratação e rompimento das membranas (DUMONT et al., 2004; FELLOWS, 2006).

O efeito crioprotetor dos grãos pode estar relacionado à presença de alta

concentração de nutrientes termo-resistentes, como vitaminas e minerais, e a uma

rede de capilares que grãos como o trigo e aveia possuem e que permitem uma

maior penetração das hifas do fungo, protegendo contra a baixa temperatura

(BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 1993; HOSENEY, 1991). Os grãos também

possuem amido, com capacidade ligar a água durante a gelatinização, o que reduz o

tamanho dos cristais de gelo, aproximando as temperaturas de congelamento intra e

extracelular, reduzindo a desidratação celular (DUMONT et al., 2004; FELLOWS,

2006). A criopreservação de linhagens de Lentinula em grãos de sorgo (Sorghum

vulgare) com glicerol a 10% como crioprotetor já foi relatado por Mata e Salmones

78

(2005) em nitrogênio líquido, no entanto não foram encontrados relatos em

temperatura comercial de -20oC para Basidiomicetos.

Na temperatura de -70ºC destaca-se o resultado obtido pelos cilindros de BDA,

com recuperação total com todos os crioprotetores, exceto o PEG (Tabela 3). Os

cilindros de BDA são amplamente utilizados como suporte do micélio de basidiomicetos

para criopreservação (CHVOSTOVÁ, et al.; 1995; MATA et al., 1994), no entanto muitos

protocolos de congelamento utilizam nitrogênio líquido para a criopreservação. A -70 ºC

há influencia do substrato na recuperação do grão, o PEG associado a GTR e GAR

proporcionou recuperação do crescimento micelial, mas quando associado a BDA, GAV

e GPA inviabilizou a recuperação do fungo, provavelmente devido a composição

química e física dos grãos (Tabela 3).

Os crioprotetores avaliados mostraram-se adequados à criopreservação de

Lentinula edodes a -70 ºC, com exceção do PEG associado aos GAV, GPA e BDA. O

DMSO, assim como o GO, tem a capacidade de penetrar a parede celular e membrana

plasmática, tornando-as mais elásticas, o que permite a acomodação molecular durante

a expansão de volume no congelamento. Além disso, possui a capacidade de ligar a

água no interior da célula, o que previne a desidratação excessiva, reduz a toxicidade

pelo excesso de sais e previne a formação de grandes cristais de gelo (DUMONT et al.,

2004; HUBÁLEK, 2003;). Já os crioprotetores GI e SA são compostos de carboidratos

com alta capacidade de ligar água, que penetram na parede celular mas não penetram

na membrana plasmática, formando uma barreira contra o crescimento do gelo,

protegendo a membrana plasmática mecanicamente (HUBÁLEK, 2003; SANTOS, 2001;

ZHANG et al., 1996). EM e PEG são crioprotetores que não penetram na parede

celular, adsorvem a superfície das células formando uma camada viscosa e causando

efluxo parcial da água na célula, inibindo o crescimento dos cristais de gelo e

aumentando a viscosidade da solução (HUBÁLEK, 2003). Contudo PEG não

apresentou capacidade protetora a -70 ºC, ao contrário dos demais crioprotetores

(Tabela 3).

79

Tabela 2. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) de Lentinula edodes crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por um ano a -20 ºC.

Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)

GO (10%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

DMSO (1%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

GI (4%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 6,6 (173,2)

SA (10%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

EM (4%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

PEG (6%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)

BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço).

Tabela 3. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação de Lentinula edodes crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por um ano a -70 ºC.

Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)

GO (10%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

DMSO (1%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 93,3 (12,3)

GI (4%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

SA (10%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

EM (4%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)

PEG (6%) 0,0 (0,0) 65,0 (13,3) 100,0 (0,0) 80,0 (0,0) 46,6 (107,8)

BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço).

O grãos e os cilindros de BDA, além do efeito positivo na recuperação do

crescimento micelial, permitiram a manutenção do vigor de crescimento do fungo a -

70oC (dados não apresentados), sugerindo que houve a preservação das estruturas

celulares, independente do substrato de crescimento do fungo.

80

5.4 CONCLUSÕES

Em função da metodologia adotada e das condições experimentais concluiu-

se que a criopreservação da linhagem U6/12 de Lentinula edodes por um ano não é

viável na temperatura de -20 ºC.

O uso de aditivos protetores associado a grãos ou cilindros de batata-

dextrose-ágar viabiliza a criopreservação de Lentinula edodes a -70 ºC.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e

pela bolsa de estudos concedida.

81

5.5 REFERÊNCIAS

BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. 1087 p.

CHALLEN, M.; ELLIOTT, T. J. Polypropylene straw ampoules for the storage of microorganisms in liquid nitrogen. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 5, p.11-23, 1986.

CHVOSTOVÁ, V.; NERUD, F.; HOMOLKA, L. Viablity of wood-inhabiting basidiomycetes following cryogenic preservation. Folia Microbiologica, New York, v. 40, n.2, p. 193-197, 1995.

DUMONT, F.; MARECHAL, P. A.; GERVAIS, P. Cell size and water permeability as determining factors for cell viability after freezing at different cooling rates. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 70, n.1, p. 268-272, 2004.

EIRA, A. F.; MONTINI, R. M. C. M. Manual de Cultivo do shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler). Botucatu, FEPAF, 1997. 38p.

FELLOWS, P. J. Tecnologia do processamento de alimentos: princípios e práticas. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.

FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza: Acríbia, 1993. 1051p.

HERRERA, I. L.; MATA, G.; HERNÁNDEZ, R. G. Evaluation of the viability of Pleutorus spp. strains after liquid nitrogen cryopreservation, Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 29, n. 3, 1998.

HOMOLKA, L.; LISÁ, L.; EIHLEROVÁ, I.; NERUD, F. Cryopreservation of basidiomycete strains using perlite. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 47, p. 307-313, 2001.

HOSENEY, R. C. Principios de ciencia y tecnología de los cereales. Zaragoza: Acribia, 1991. 321p.

HUBÁLEK, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology, New York, v. 46, p. 205-229, 2003.

82

ISHIKAWA, N. K., KASUYA, M. C. M., VANETTI, M. C. D.Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 206-210, 2001.

LECHNER, B. E.; PAPINUTTI, V. L. Production of lignocellulosic enzymes during growth and fruiting of the edible fungus Lentinus tigrinus on wheat straw. Process Biochemistry, Amsterdam, v. 41, p. 594-598, 2006.

MATA, G.; PÉREZ-MERLO, R. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant. Cryobiology, New York, v. 47, p. 14-20, 2003.

MATA, G.; SALMONES, D. Preservation of shiitake spawn stocks by cryogenic storage. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 42-45.

MATA. G.; SALMONES, D.; PÉREZ, P.; GUZMÁN, G. Behavior of some strains of the genus Pleurotus alter different procedures for freezing in liquid nitrogen, Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 25, n. 3, p. 197-200, 1994.

PUTZKE, J; PUTZKE, M. T. L. Os reinos dos fungos. Santa Cruz do Sul: EDUNISC, 1998. 606p.

SANTOS, I. R. I. Criopreservação de germoplasma vegetal – a alternativa para conservação a longo prazo. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, Brasília, n. 20, p. 60-65, 2001.

SAZAKI, S. H.; LINHARES, R. E. C.; NOZAWA, C. M.; MONTALVÁN, R.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Strains of Lentinula edodes supress growth of phytopathogenic fungi and inhibit alagoas serotype of vesicular stomatitis vírus. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 52-55, 2001.

SOUZA-PACCOLA, E. A.; BOMFETI, C. A.; FÁVARO, L. C. L.; FONSECA, I. C. B.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Antimutagenic action of Lentinula edodes and Agaricus blazei on Aspergillus nidulans conidia. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 35, p. 311-315. 2004.

SUZUKI, H.; ILYAMA, K.; YOSHIDA, O.; YAMAZAKI, S.; YAMAMOTO, N.; TODA, S. Structural characterization of the immunoactive and antiviral water-solubilized lignin in na extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia (LEM). Agricultural and Biological Chemistry, Tóquio, v. 54, n. 2, p. 479-487, 1990.

83

SUZUKI, M.; IWASHIRO, M.; TAKATSUKI, F.; KURIBAYASHI, K.; HAMURO, J. Reconstitution of antitumor effects of lentinan in nude mice: roles of delayes-types hypersensitivy reaction triggred by CD4-positive T cell clone in the infiltration of effector cells into tumor. Journal Cancer Research, v. 85, p. 409-417, 1994.

THOMAS, V.; SMITH, D. Cryogenic light microscopy and the development of long-term cryopreservation techniques for fungi. Outlook on Agriculture, New York, v. 23, n. 3, p. 163-167, 1994.

ZHANG, Y. H.; ZHONG, J. J.; YU, J. T. Enhancement of ginseng saponin production in suspension cultures of Panax notoginseng: manipulation of sucrose. Journal of Biotechnology, Amsterdam, v. 51, p. 49-56, 1996.

84

CONCLUSÕES GERAIS

Os fungos Pleurotus sp e Lentinula edodes são capazes de degradar diversos

resíduos da agroindústria, sendo que o crescimento micelial é influenciado pelas

características físicas e químicas das matérias-primas.

A produção de lacase é influenciada pelas características físico-químicas do

substrato de cultivo, sendo que a granulometria das matérias-primas componentes

do substrato é fundamental para o acesso enzimático do fungo aos nutrientes.

Grãos associados à crioprotetores viabilizam a criopreservação de Pleurotus

ostreatus por 30 dias e um ano à -20 ºC, mas não viabilizam a criopreservação de

Lentinula edodes nas mesmas condições.

A criopreservação de Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes a -70 ºC é

eficiente com a associação de cilindros de ágar-batata-dextrose e crioprotetores ou

com a grãos e crioprotetores.

85

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BALDRIAN, P. Interactions of heavymetals with white-rot fungi. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 32, p. 78-91, 2003.

EIRA, A. F. Cultivo do cogumelo medicinal Agaricus blazei (Murrill) ss. Heinemann ou Agaricus brasiliensis (Wasser et al.). Viçosa: Aprenda fácil, 2003.

GIANFREDA, L.; XU, F.; BOLLAG, J. M. Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes. Biorremediation Journal, Boca Raton, v. 3, n. 1, p. 1-26, 1999.

HUBÁLEK, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology, New York, v. 46, p. 205-229, 2003.

HWANG, H. J.; KIM, S. W.; LIM, J. M.; JOO, J. H.; KIM, H. O.; KIM, H. M.; YUN, J. W. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in strptozotocin-induced diabetic rats. Life Sciences, Oxford v. 76, p. 3069-3080, 2005.

ISHIKAWA, N. K., KASUYA, M. C. M., VANETTI, M. C. D.Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 206-210, 2001.

LECHNER, B. E.; PAPINUTTI, V. L. Production of lignocellulosic enzymes during growth and fruiting of the edible fungus Lentinus tigrinus on wheat straw. Process Biochemistry, Amsterdam v. 41, p. 594-598, 2006.

MATA, G.; DELPECH, P.; SAVOIE, J. M. Selection of strains of Lentinula edodes and Lentinula boryana adapted for efficient growth on wheat straw. Revista Iberoamericana de Micologia, Bilbao, v. 18, p. 118-122, 2001.

MATA, G.; PÉREZ-MERLO, R. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant. Cryobiology, New York, v. 47, p. 14-20, 2003.

MATA, G.; SALMONES, D. Preservation of shiitake spawn stocks by cryogenic storage. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 42-45.