343o Giuliana De Gregoris 11.03.doc)€¦ · Ao laboratório de Farmacologia, na pessoa do prof. Guilherme Suarez-Kurtz, ... Análise da atividade de transativação transcricional

INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ONCOLOGIA

AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE VARIANTES MISSENSE DE BRCA1: ESTUDO PARA O

APERFEIÇOAMENTO DO ENSAIO DE TRANSATIVAÇÃO TRANSCRICIONAL

GIULIANA DE GREGORIS

RIO DE JANEIRO

MARÇO – 2012

ii




Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Oncologia do Instituto

Nacional de Câncer, como requisito parcial

para obtenção do título de Mestre em

Oncologia.

Orientador: Marcelo Alex de Carvalho.

RIO DE JANEIRO

MARÇO - 2012

iii




Data da aprovação:____________.

BANCA EXAMINADORA:

Turán P. Urmenyi – IBCCF/UFRJ

____________________________

Miguel Ângelo. M. Moreira – Genética/INCA

____________________________

Fernando Regla Vargas – Genética/INCA

____________________________

Claudio Gustavo Stefanoff – BNT/INCA (Suplente)

____________________________

Robson Queiroz Monteiro – IbqM/UFRJ (Suplente)

____________________________

RIO DE JANEIRO

MARÇO - 2012

iv

AGRADECIMENTOS

Ao orientador Marcelo Alex de Carvalho, pela oportunidade de poder desenvolver este

trabalho junto ao seu grupo. A cobrança, a paciência e a dedicação desprendidas foram

muito importantes para que eu pudesse concluir este trabalho, e, principalmente,

compreender o que de fato é necessário para se “fazer ciência”!

Aos companheiros e amigos do grupo de pesquisa, Renata, Vanessa, Thales, Amanda,

João e Renato, por toda a ajuda, todo o aprendizado, e companhia.

Ao laboratório de Farmacologia, na pessoa do prof. Guilherme Suarez-Kurtz, e à todos

os amigos e companheiros do 3º andar do CPq/INCA: Vera, Mateus, Cíntia, Cyntia,

Diogo, Marcelo Sobral, Fernanda, Ivone. Todos me ajudaram direta ou indiretamente

para que eu pudesse concluir este trabalho.

Aos colegas da Pesquisa Clínica, pela companhia agradável e suporte quando

necessário.

À minha família, especialmente meus pais, os quais devo tudo o que sou e tenho.

Ao Erik Guarisco e sua família, por todo apoio e por me acolherem como membro de

sua própria família.

v

RESUMO

Estima-se que 5 a 10% dos casos de câncer de mama sejam de origem hereditária. BRCA1 foi o primeiro gene de susceptibilidade ao câncer de mama identificado e grande parte dos casos da doença pode ser atribuída a mutações nesse gene. O aconselhamento genético baseado na análise compreensiva de alterações em BRCA1 pode auxiliar indivíduos afetados a adotarem procedimentos preventivos. Porém, muitas das mutações detectadas não possuem classificação quanto sua associação ou não ao câncer, se enquadrando no status de variante não classificado (VNC). Os ensaios funcionais constituem uma estratégia que permite, em parte, contornar essa situação. BRCA1 quando fusionado a um domínio heterólogo de ligação ao DNA pode induzir a transcrição de um gene repórter. A avaliação da capacidade de ativação transcricional (AT) de BRCA1 já foi validada por nosso grupo como um sistema confiável para classificação de variantes. O ensaio correlaciona a capacidade AT e a integridade estrutural da região C-terminal da proteína, essencial para sua função supressora de tumor, podendo se estabelecer uma relação com a funcionalidade da proteína. Atualmente o ensaio AT é restrito à região dos exons 13 a 24 de BRCA1 (aminoácidos 1395 a 1863 da proteína) – BRCA1 13/24. O presente trabalho conduziu um estudo para aperfeiçoar o modelo de ensaio funcional AT a um contexto maior da proteína, compreendendo o final do exon 11 ao exon 24 (aminoácidos 1315 a 1863) - BRCA1 11/24. Os variantes a serem analisados foram gerados por mutagênese sítio-dirigida e clonados em vetores para expressão em leveduras (S. cerevisiae) e células humanas (HEK293T). A avaliação do método no novo contexto (BRCA1 11/24) foi realizada com variantes de comportamento conhecido (neutros e deletérios) já descritos na literatura (controles positivos e negativos). Quando comparada a atividade dos controles em ambos os contextos (11/24 e 13/24) os resultados foram equivalentes. A capacidade TA de variantes não naturais de comportamento preditivo (putativamente neutros e deletérios) situados na região de extensão do modelo (aminoácidos 1315-1395), bem como a de variantes naturais não classificados, foi avaliada. Segundo os critérios de classificação definidos para o ensaio TA no contexto 13/24, todos os variantes analisados no contexto 11/24 apresentam perfil neutro. Porém, a inexistência de variantes controle na região de extensão do estudo impede, por ora, o uso do ensaio AT como ferramenta confiável de classificação de variantes na região analisada. O ensaio TA de BRCA1 tem se mostrado um importante modelo de predição do comportamento de VNC na sua porção C-terminal, mas este possui limitações e carece de estudos que possam melhor contribuir com informações sobre o modelo. Palavras-chave: BRCA1; ativação transcricional; variantes não classificados; ensaio funcional.

vi

ABSTRACT

Germline mutations in the breast and ovarian cancer predisposing gene (BRCA1) are responsible for the majority of cases involving hereditary breast and ovarian cancer. Genetic counseling based on comprehensive analysis of alterations in BRCA1 may assist affected individuals to adopt preventive procedures. However, many of the mutations found in patients do not have a clear designation as either cancer-associated or not, remaining as unclassified variants (UCV). Functional assays provide an approach which allows circumventing this problem, at least in part. The Transcriptional Activation (TA) assay was derived from the observation that the C-terminal region of BRCA1 (BRCT domains) functions as a transcriptional transactivation domain when expressed as a fusion to a heterologous DNA binding domain (DBD). In this model, the expression of a reporter gene can be correlated with the integrity of the BRCT domains and its vicinity. Previously, our group, validated this assay as a reliable model to classify missense variants within the region limited by exons 13-24 of BRCA1 (amino acids 1396-1863). In this work, we conducted a study to improve the TA assay for functional evaluation of UCV located on BRCA1 exon 12 and part of exon 11, extending the TA assay model to a larger context of the protein (amino acids 1315-1863). BRCA1 variants were generated by site-directed PCR mutagenesis and then cloned into yeast and mammalian expression vectors to be functionally evaluated. Constructs enclosing the BRCA1 wild-type sequence and variants of known classification (neutral or deleterious controls) were evaluated in both contexts (1396-1863 and 1315-1863) showing similar results. UCV of natural and non-natural (synthetic) occurrence located in the extended region (1315-1395) were also evaluated. According to previously determined classification criteria for the TA assay, a neutral behavior was observed for all investigated variants. However, the lack of proper control variants in the extended context limits the TA assay as a reliable tool for variants classification. The BRCA1 TA assay is an important method for predicting the behavior of UCV in its C-terminal portion, but it has limitations and there is still the need for studies that contribute with information about the model. Key words: BRCA1; transcription activation; unclassified variants; functional assay.

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1: Distribuição dos dez tipos de câncer mais incidentes no Brasil estimados

para o ano de 2012 por sexo, exceto câncer de pele não melanoma............................18

Figura 1.2: Diagrama da estrutura proteica de BRCA1 e seus domínios.......................23

Figura 1.3: Estrutura dos domínios BRCT em tandem de BRCA1 representados

tridimensionalmente pelo modelo de fitas.......................................................................25

Figura 1.4: Freqüência de variantes de BRCA1 depositados no banco de dados do

BIC...................................................................................................................................32

Figura 1.5: Representação esquemática do comportamento de transativação

transcricional da região C-terminal de BRCA1 em função da expressão de um gene

repórter............................................................................................................................39

Figura 3.1: Diagrama esquemático da rotina de mutagênese sítio-dirigida por

sobreposição de fragmentos...........................................................................................49

Figura 3.2: Representação da construção de pLex9-BRCA1 11/24..............................53

Figura 3.3: Representação da construção de pGBT9-BRCA1 11/24.............................54

Figura 3.4: Representação da construção de pCDNA3-BRCA1 11/24..........................55

Figura 3.5: Fluxograma de rotinas realizadas para geração e clonagem das

construções utilizadas neste estudo................................................................................56

Figura 3.6: Representação do plasmídeo pRB1840 (Invitrogen)...................................59

viii

Figura 3.7: Representação dos vetores pG5luc e pGR-TK............................................63

Figura 4.1: Representação esquemática da região codificante de BRCA1 com seus

éxons identificados..........................................................................................................69

Figura 4.2: Representação esquemática de BRCA1aa1315-1863 (11/24) e BRCA1aa1396-1863

(13/24) fusionados a um domínio heterólogo de ligação ao DNA (DBD) e a localização

dos variantes controle analisados no estudo..................................................................69

Figura 4.3: Análise da atividade de transativação transcricional em levedura de

controles de BRCA1. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de

levedura S. cerevisiae EGY48.........................................................................................70

Figura 4.4: Análise da atividade de transativação transcricional em levedura de

controles de BRCA1. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de

levedura S. cerevisiae EGY48.........................................................................................73

Figura 4.5: Análise da atividade de transativação transcricional em célula de mamífero

de controles de BRCA1. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células

de mamífero HEK293T....................................................................................................74

Figura 4.6: Análise da atividade de transativação transcricional em células humanas de

controles de BRCA1. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células

humanas HEK293T.........................................................................................................75

Figura 4.7: Alinhamento de ortólogos de BRCA1, resíduos 1315-1395.........................78

Figura 4.8: Representação esquemática de BRCA1aa1315-1863 fusionado a um domínio

heterólogo de ligação ao DNA (DBD) e a localização dos variantes analisados no

estudo..............................................................................................................................82

ix

Figura 4.9: Análise da atividade de transativação transcricional em célula de levedura

de variantes sintéticos de BRCA1 no contexto 11/24. Ensaio de transativação

transcricional quantitativo em células de levedura S. cerevisiae EGY 48.......................83

Figura 4.10: Análise da atividade de transativação transcricional em célula de levedura

de variantes naturais de BRCA1 no contexto 11/24. Ensaio de transativação

transcricional quantitativo em células de levedura S. cerevisiae EGY 48.......................84


de variantes sintéticos de BRCA1 no contexto 11/24. Ensaio de transativação

transcricional quantitativo em células de levedura HEK293T.........................................86


de variantes naturais de BRCA1 no contexto 11/24. Ensaio de transativação

transcricional quantitativo em células de levedura HEK293T.........................................87

Figura 4.13: Análise da expressão de proteínas de fusão LexA:BRCA1 no modelo de

levedura por immunoblotting...........................................................................................88

Figura 4.14: Análise da expressão de proteínas de fusão GAL4:BRCA1 no modelo de

células HEK293T por immunoblotting.............................................................................89

x

LISTA DE QUADROS

Quadro 3.1: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na geração de variantes para o

estudo............................................................................................................................50

Quadro 4.1: Variantes sintéticos selecionados para o estudo. ....................................77

Quadro 4.2: Variantes naturais de BRCA1 identificados na região limitada pelos

aminoácidos 1315-1395................................................................................................80

xi

LISTA DE ABREVIATURAS

°C – graus Celsius

aa – aminoácido (s)

ADP – adenosine difosfato

ATM- Ataxia Telangiectasia Mutated

BACH1 – BTB and CNC homology 1

BARD1 – BRCA1-associated RING Domain Protein 1

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool

BRCA2 – Breast Cancer Susceptibility Gene 2

BRCT – BRCA1 C-terminal

CDK2 – cyclin-dependent kinase 2

cDNA – ácido desoxirribonucléico complementar

CHEK2 – Chekpoint Kinase 2

CK2 – casein kinase II

CtIP – C-terminal Binding Protein (CtBP) Interacting Protein

DNA – ácido desoxirribonucleico

DO – densidade óptica

EDTA - ácido etilenodiamina tetraacético

g – gravidade (g = 9,8 cm/s2)

H2O - água

HCl – ácido clorídrico

HPRT1 – hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1

IgG – imunoglobilina G

kb - quilobases

xii

KCl- cloreto de potássio

KOH – hidróxido de potássio

kV - quilovolts

loxp – locus of X-over P1

M - molar

MgSO4 – sulfato de magnésio

min – minuto (s)

mL - mililitro

mM - milimolar

Na2H2PO4 – di-hidrogenofosfato de sódio

Na2PO4 – fostato dissódico

NaCl – cloreto de sódio

NaOH – hidróxido de sódio

NCBI – National Center for Biotechnology Information

nm - nanômetros

p/v – peso por volume

PBS – tampão fosfato-salino

PEG – polietilenoglicol

pH – potencial hidrogeniônico

Phe – fenilalanina

pSer – serina fosforilada

PTEN – Phosphatase and Tensin Homolog

RING – Real Interesting New Gene (domínio protéico)

RNA – ácido ribonucleico

SDS – dodecil sulfato de sódio

xiii

TP53 – Tumor Protein p53

v/v – volume por volume

µmol – micromol

µm - micrômetros

xiv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17

1.1 CÂNCER ............................................................................................................... 17

1.2 CÂNCER DE MAMA ............................................................................................. 18

1.3 CÂNCER DE MAMA HEREDITÁRIO.................................................................... 19

1.4 O GENE DE SUSCEPTIBILIDADE AO CÂNCER DE MAMA BRCA1 .................. 21

1.5 A REGIÃO C-TERMINAL DE BRCA1 ................................................................... 24

1.5.1 Os domínios BRCT ....................................................................................... 24

1.5.2 O domínio coiled-coil de BRCA1 ................................................................ 26

1.6 A ATIVIDADE DE TRANSATIVAÇÃO TRANSCRICIONAL DE BRCA1 ............... 27

1.7 VARIANTES NÃO CLASSIFICADOS DE BRCA1: UM PROBLEMA PARA A

IDENTIFICAÇÃO DE INDIVÍDUOS EM RISCO .......................................................... 28

1.8 ENSAIOS FUNCIONAIS PARA CLASSIFICAÇÃO DE VARIANTES DE BRCA1 31

1.8.1 Ensaio do fenótipo de colônias pequenas ................................................. 34

1.8.2 Resgate de resistência à radiação (RRR) ................................................... 35

1.8.3 Atividade ubiquitina-ligase .......................................................................... 35

1.8.4 Ensaio para identificação de códon de parada prematuro ....................... 36

1.8.5 Ensaio de ligação de fosfo-peptídeos ........................................................ 36

1.8.6 Ensaio funcional baseado em células-tronco embrionárias .................... 37

1.9 O ENSAIO DE TRANSATIVAÇÃO TRANSCRICIONAL COMO MODELO DE

AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE BRCA1 ....................................................................... 38

2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 41

2.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 41

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 41

3 MÉTODOS .................................................................................................................. 43

3.1 ANÁLISE COMPARATIVA DE ORTÓLOGOS DE BRCA1 ................................... 43

3.2 ALIGN GV/GD DE VARIANTES DE BRCA1 ........................................................ 44

3.3 IDENTIFICAÇÃO DE VARIANTES NATURAIS EM BANCO DE DADOS ............ 45

3.4 DESENHO DOS VARIANTES SINTÉTICOS (NÃO-NATURAIS) PARA

ESTRUTURAÇÃO DO PERFIL DE ANÁLISE NO ESTUDO ...................................... 45

3.5 GERAÇÃO DE CONSTRUÇÕES ......................................................................... 47

xv

3.5.1 Construções no contexto 11/24 .................................................................. 47

3.5.1.1 Clonagem no vetor de expressão pLex9 ................................................. 51

3.5.1.2 Sub-clonagem no vetor de expressão pGBT9 ......................................... 53

3.5.1.3 Subclonagem no vetor de expressão pCDNA3 ....................................... 54

3.5.2 Construções no contexto 13/24 .................................................................. 56

3.6 TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA E EXTRAÇÃO PLASMIDIAL ....................... 57

3.7 SEQUENCIAMENTO ............................................................................................ 58

3.8 TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURAS ................................................................ 58

3.9 ENSAIO FUNCIONAL EM LEVEDURA ................................................................ 60

3.10 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE LEVEDURA .................................................. 61

3.11 TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS HUMANAS ....................................................... 62

3.12 ENSAIO FUNCIONAL EM CÉLULAS HUMANAS .............................................. 63

3.13 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS HUMANAS .................................. 65

3.14 IMMUNOBLOTTING ........................................................................................... 65

3.15 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ................................................................................ 66

4 RESULTADOS ............................................................................................................ 67

4.1 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE VARIANTES CONTROLE: COMPARAÇÃO DE

ATIVIDADES EM DOIS CONTEXTOS ....................................................................... 67

4.2 ESTRUTURAÇÃO DA AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE VARIANTES MISSENSE

DE BRCA1 NA REGIÃO DE EXTENSÃO DO ENSAIO (RESÍDUOS 1315-1395):

DESENHO DE VARIANTES CONTROLE .................................................................. 76



SELEÇÃO DE VARIANTES NATURAIS..................................................................... 78



SELEÇÃO DE VARIANTES NATURAIS..................................................................... 79

4.4 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE TRANSATIVAÇÃO TRANSCRICIONAL DOS

VARIANTES SELECIONADOS. ................................................................................. 80

4.6 ANÁLISE DE EXPRESSÃO .................................................................................. 88

5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 90

6 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 100

7 REFERÊNCIAS..........................................................................................................102

xvi

8 ANEXO 1....................................................................................................................115

17

1 INTRODUÇÃO

1.1 CÂNCER

Câncer é o termo utilizado para um conjunto de mais de 100 patologias distintas,

que têm em comum a propriedade de crescimento desordenado de células,

eventualmente capazes de invadirem outros tecidos e órgãos (INCA,

http://www.inca.gov.br).

O câncer é uma doença genética, pode ter origem hereditária ou esporádica,

sendo que 5-10% dos casos são hereditários. Os casos esporádicos podem ser

desencadeados por fatores ambientais, tais como tabagismo, idade, hábitos

alimentares, sedentarismo, obesidade, agentes mutagênicos, doenças infecciosas e

disfunções imunológicas (NCI, http://www.cancer.gov).

De acordo com a International Agency for Research on Cancer (IARC), o câncer

é a maior causa de mortalidade mundial, tendo sido responsável por 7,8 milhões de

mortes no ano de 2008, o que representa cerca de 13% dos casos totais de morte no

mundo previstos para aquele ano (IARC, 2008). Para o Brasil, o Instituto Nacional de

Câncer estima que somente no ano de 2012 cerca de 385 mil novos casos de câncer

surgirão, excluindo os casos de câncer de pele não melanoma (INCA, 2011). Segundo

projeção do INCA, os quatro tumores mais incidentes para o sexo masculino no ano de

2012 serão o câncer de próstata (60 mil), pulmão (17 mil), cólon e reto (14 mil) e

estômago (13 mil). Para o sexo feminino, destacam-se os tumores de mama (53 mil),

18

colo do útero (18 mil), cólon e reto (16 mil) e pulmão (10 mil) como os quatro tipos de

tumor mais incidentes (Fig. 1.1).

Figura 1.1: Distribuição dos dez tipos de câncer mais incidentes no Brasil estimados para o ano de 2012

por sexo, exceto câncer de pele não melanoma*. Adaptado de INCA, 2011.

1.2 CÂNCER DE MAMA

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o câncer de mama é o câncer

mais incidente em mulheres tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento.

De acordo com o National Cancer Institute (NCI), somente para os Estados Unidos são

esperados aproximadamente 226.800 novos casos de câncer de mama em mulheres e

cerca de 39.500 mortes em 2012 (NCI, http://www.cancer.gov). No Brasil são esperados

para 2012 mais de 52.500 novos casos de câncer de mama, com risco estimado de 52

casos a cada 100 mil mulheres. As taxas de mortalidade por câncer de mama no Brasil

continuam elevadas, muito provavelmente porque a doença ainda é diagnosticada em

estádios avançados (INCA, 2011).

19

A prevenção primária para dessa neoplasia ainda não é totalmente possível

devido aos diversos fatores de risco envolvidos em sua etiologia. Os fatores de risco

para o carcinoma de mama compreendem predisposição hereditária, fatores

dependentes da constituição hormonal e fatores ambientais, constituídos por agentes

físicos, químicos e biológicos capazes de causar danos ao genoma (AMENDOLA e

VIEIRA, 2005).

1.3 CÂNCER DE MAMA HEREDITÁRIO

Estima-se que de 5 a 10% dos casos de câncer de mama estejam relacionados à

predisposição hereditária associada a mutações em genes determinantes de

susceptibilidade ao câncer (CLAUS, THOMPSON e RISCH, 1991; EASTON et al, 1993).

Em 1990, Hall e colaboradores mapearam o primeiro gene determinante de

susceptibilidade ao câncer de mama, o BRCA1 (Breast Cancer Susceptibility Gene 1)

(HALL et al, 1990). Quatro anos mais tarde, BRCA1 foi clonado (MIKI et al, 1994) e um

segundo gene de susceptibilidade ao câncer foi mapeado, o BRCA2 (WOOSTER et al,

1994). BRCA1 e BRCA2 não apresentam homologia de seqüência, mas ambos são

genes supressores de tumor e comportam-se como guardiões da integridade genômica

(SHARAN et al, 1997; WELCSH et al, 2002).

Mutações germinativas no gene BRCA1 podem ser encontradas em cerca de

45% das famílias com casos hereditário de câncer de mama, e 80% das famílias com

casos de câncer hereditário de mama e ovários (DAPIC et al, 2005). Mulheres com

predisposição hereditária associada a mutações em BRCA1 têm um risco estimado de

56-80% para o desenvolvimento do câncer de mama (contra 11% na população geral) e

20

de 16-60% para câncer de ovário (contra 1,4 - 2,5% na população geral) (EASTON et al,

1993).

O câncer de mama associado a mutações no gene BRCA1 (hereditário) possui

algumas diferenças biológicas importantes quando comparado ao câncer esporádico.

Em portadoras de mutações em BRCA1, uma importante característica é o

acometimento de mulheres jovens. Uma grande porcentagem dos tumores é de alto

grau histológico (grau 3), tende a ser aneuplóide, apresenta altas taxas de células em

fase S do ciclo celular e em mitose, além de infiltrado linfocitário. As morfologias

principais identificadas são o carcinoma ductal, não específico (75%) e o carcinoma

medular (10%). Frequentemente esse tipo de tumor possui um fenótipo triplo negativo

(triple-negative), isto é, não expressa receptores de estrogênio, receptores de

progesterona e HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). Geralmente, também

se apresenta em tamanho aumentado e não acomete os linfonodos periféricos (NAROD

e OFFIT, 2005; AMENDOLA e VIEIRA, 2005).

Além dos genes BRCA1 e BRCA2, outros genes cuja inativação levam à

predisposição ao câncer de mama foram identificados como ATM, TP53, CHEK2 e

PTEN.

A determinação do risco de câncer de mama hereditário está se tornando cada

vez mais importante devido a existência de um crescente número de opções de ações

preventivas disponíveis para pacientes e familiares como, por exemplo, o tratamento

quimioterápico profilático com tamoxifeno (SIFRI; GANGADHARAPPA e ACHESON,

2004).

21

1.4 O GENE DE SUSCEPTIBILIDADE AO CÂNCER DE MAMA BRCA1

O gene BRCA1 foi inicialmente mapeado no braço longo do cromossomo 17 e,

posteriormente, por meio de estratégias de clonagem posicional foi identificado na

posição 17q21 (17q12-q23) (HALL et al, 1990; MIKI et al, 1994). O gene é composto

por 24 éxons, dos quais 22 são codificantes, distribuídos por aproximadamente 100 Kb.

O gene é expresso na maioria dos tecidos, sendo mais abundante no testículo e no

timo, e codifica uma proteína de 1.863 aminoácidos (Fig. 1.2; MIKI et al, 1994; SMITH et

al, 1996).

O gene foi caracterizado como supressor de tumor, regulando negativamente a

proliferação celular. Dessa maneira, o câncer hereditário ligado à mutação em BRCA1

segue o modelo de inativação bialélica proposto pela “hipótese dos dois eventos” (two-

hit hypothesis, KNUDSON, 1971), onde o gene de predisposição herdado possui um

alelo não-funcional, sendo necessário apenas mais um evento mutacional para a perda

do alelo funcional e para o surgimento da doença.

A análise da estrutura protéica de BRCA1 revela a existências de vários motivos

estruturais conservados entre os diferentes ortólogos da proteína (SZABO, WORLEY e

MONTEIRO, 2004). A região N-terminal encerra um domínio RING-finger (Fig. 1.2; aa

1-101) que possui atividade E3-ubiquitina-ligase (RUFFNER et al, 2001; BAER e

LUDWIG, 2002; WU-BAER et al, 2003). O domínio RING-finger de BRCA1 é

responsável por sua interação com BARD1, esta interação já foi demonstrada por

potencializar a atividade E3-ligase de BRCA1 (WU et al, 1996; BRZOVIC et al, 2001;

XIA et al, 2003). Estima-se que mais de 75% do pool celular de BRCA1 esteja

complexado com BARD1, indicando uma função biológica relevante para o

heterodímero (YU & BAER, 2000). Estudos recentes questionam se a função E3

22

ubiquitina-ligase de BRCA1 (associada à BARD1) é importante para sua função

supressora de tumor, tendo um deles demonstrado que a atividade ubiquitina-ligase de

BRCA1 seria dispensável para o reparo ao DNA e supressão de tumor (SHAKYA et al,

2011) e outro demonstrado que a associação de BRCA1 com BARD1 é importante para

se evitar letalidade embrionária e tumorigênese, porém esta interação não parece ser

fundamental para o reparo do DNA por recombinação homóloga (DROST et al, 2011)

Mutações do tipo missense no domínio RING-finger, que rompem a interação

BRCA1/BARD1, foram identificadas em famílias com histórico de câncer de mama

(MORRIS, 2006).

A porção central de BRCA1 consiste de uma região pouco conservada que

separa o domínio RING-finger e os domínios BRCT (BRCA1 C-terminal). Nela há dois

motivos que correspondem a sinais de localização nuclear (NLS – nuclear localization

signal; aa 500-508 e 609-615) e pelo menos um desses sinais (aa 503-508) é essencial

para a apropriada localização nuclear da proteína (Fig. 1.2; THAKUR, 1997).

A presença de diversos sítios de fosforilação localizados na região central de

BRCA1 corrobora os dados que sustentam o envolvimento da proteína nos

mecanismos de reparo do dano ao DNA (RDD) (Fig. 1.2; OUCHI, 2006). Em resposta à

radiação ionizante (RI), diversos resíduos de serina são rapidamente fosforilados por

ATM (CORTEZ, 1999). Outras quinases fosforilam BRCA1 em resposta a RI (ou outros

agentes), como CHK2 (no resíduo de serina da posição 988) (LEE, 2000; KIM, 2004).

O envolvimento de BRCA1 nos mecanismos de RDD ficou claro quando

demonstrado seu papel central nos mecanismos de resistência à radiação, atuando

mais especificamente no reparo à quebra de dupla fita do DNA (SCULLY, XIE e

NAGARAJU, 2004; YANG e XIA, 2010). Já foi demonstrada a participação de BRCA1

em outros mecanismos de RDD como nos reparos dependentes de transcrição

23

(transcription-coupled repair) e no reparo por recombinação não-homóloga (non-

homologous-end joining) (YANG e XIA, 2010; WEI et al, 2011).

Figura 1.2: Diagrama da estrutura proteica de BRCA1 e seus domínios. As estruturas dos domínios

estão desenhadas na escala. As caixas vermelhas indicam os domínios RING-finger e BRCT. A região

necessária para a ligação não específica com o DNA está representada pelo retângulo rosa. Os sítios de

fosforilação são retratados por círculos cheios de cor vermelha (CHK2), amarela (ATM), azul (CDK2) e

verde (CK2). O painel de baixo mostra os parceiros de BRCA1 separados pelas regiões de interação

(representada pelas barras pretas). Para simplificar, apesar de alguns parceiros estarem denotados por

um único círculo, podem representar um complexo protéico (por exemplo, RNA polimerase II). Para

facilitar a visualização do papel de BRCA1 em diferentes processos, os parceiros de interação estão

representados por cores diferentes dependendo de sua função. Lilás: regulação transcricional e

remodelamento de cromatina; vermelho: controle do ciclo celular; verde: resposta ao dano ao DNA; azul:

outros. Nos casos em que o parceiro possui mais de uma função, este se encontra representado por

duas cores. Adaptado de Dapic & Monteiro, 2006.

24

1.5 A REGIÃO C-TERMINAL DE BRCA1

1.5.1 Os domínios BRCT

A região carboxi-terminal de BRCA1 encerra dois domínios em tandem

chamados de BRCT, característicos de uma superfamília de proteínas envolvida no

RDD e controle de pontos de checagem do ciclo celular (MIKI,1994; FAN, 1999;

VIDARSSON, 2002; MESQUITA et al; 2011). Estes domínios foram identificados

primeiramente em BRCA1, daí seu nome. O domínio BRCT N-terminal (BRCT-N)

compreende a região dos aminoácidos 1649-1735, e o domínio BRCT C-terminal

(BRCT-C), os aminoácidos 1756-1855, estes dois domínios estão ligados por uma

região que encerra 23 resíduos de aminoácido, denominada “linker”, e consiste numa

região flexível (GAYTHER et al, 1996; KOONIN, ALTSCHUL e BORK, 1996). Os

domínio BRCT são regiões globulares de BRCA1, determinantes de interação proteína-

proteína, mediando associação com muitas proteínas envolvidas com a replicação do

DNA, nas vias de RDD, na transcrição, no controle do ciclo celular e em processos de

ubiquitinação (NAROD e FOULKES, 2004).

Estudos cristalográficos dos domínios BRCT de BRCA1 demonstraram que as

repetições de BRCT se enovelam de uma maneira singular (como um único domínio

protéico), definida como essencial à sua atividade supressora de tumor (Fig. 1.3;

WILLIAMS, GREEN e GLOVER, 2001, MIRKOVIC et al, 2004; MESQUITA et al, 2011).

Os domínios BRCT em tandem de BRCA1 interagem de maneira a formarem um

centro hidrofóbico em sua estrutura. Este centro é formado pela interação de três α-

hélices: α-2 da porção N-terminal e α-1 e α-3 da porção C-terminal (Fig. 1.3; WILLIAMS,

25

GREEN e GLOVER, 2001). Esta conformação dos domínios BRCT de BRCA1 faz com

que se forme um sulco em sua estrutura, região importante para o papel de ligação de

fosfo-peptídeos de BRCA1, maneira como é dada, por exemplo, sua interação com as

proteínas CtIP e BACH1 (TISCHKOWITZ et al, 2008). Mutações presentes no centro

hidrofóbico dos domínios BRCT podem comprometer sua estrutura e logo a interação

de BRCA1 com parceiros importantes, porém mutações na superfície dos domínios

BRCT não excluem a possibilidade de interferência na interação da proteína com outros

parceiros (WILLIAMS, GREEN e GLOVER, 2001).

Figura 1.3: Estrutura dos domínios BRCT em tandem de BRCA1 representados tridimensionalmente pelo

modelo de fitas. O estudo cristalográfico foi realizado com a região C-terminal de BRCA1 compreendendo

os aminoácidos 1646-1859. Representação dos domínios BRCT N-terminal e C-terminal de BRCA1. A

região denominada “Linker” consiste na região de aminoácidos que conecta os dois domínios. Adaptado

de Williams, Green & Glover, 2001.

26

Os domínios BRCT de BRCA1 atuam como um módulo de ligação a

fosfopeptídeos, ligando-se seletivamente a parceiros como a DNA helicase BACH1, o

fator de ressecção de DNA CtIP, e a proteína Abraxas, que tem está envolvida no

reparo de quebras de dupla fita de DNA (COQUELLE, GREEN e GLOVER, 2011). A

região C-terminal de BRCA1 é essencial para o exercício da função supressora de

tumor e a deleção de apenas 11 aminoácidos na extremidade final da proteína é

suficiente para conferir predisposição ao câncer (FRIEDMAN et al, 1994).

A concentração de resíduos carregados negativamente sugere a participação

direta da região C-terminal de BRCA1 em processos de transcrição (MIKI et al, 1994).

Com a demonstração da interação entre BRCA1 e a RNA polimerase II, através da

associação com RNA helicase A, bem como sua interação com uma série de fatores de

ativação transcricional, co-ativadores, co-repressores, enzimas de remodelamento de

cromatina e fatores de processamento de RNA, ficou inequívoco o papel de BRCA1 em

processos de transcrição (SCULLY et al, 1997; ANDERSON et al, 1998; OUCHI et al,

1998; WANG et al, 1998; YARDEN et al, 1999; BOCHAR et al, 2000; MONTEIRO,

2000; PAO et al, 2000; HU & LI, 2002).

1.5.2 O domínio coiled-coil de BRCA1

Ainda na porção C-terminal da proteína foi possível a identificação de uma região

coiled-coil bastante conservada entre os ortólogos de BRCA1, encerrada entre os

resíduos 1391 a 1424 (Fig. 1.2; HU et al, 2000). Essa região da proteína é responsável

por sua interação com parceiros como JunB, JunD e PALB2 (HU e LI, 2002; SY, HUEN

& CHEN, 2009). É interessante ressaltar que PALB2 (Partner and Localizer of BRCA2)

é uma proteína cujas mutações também podem levar à predisposição ao câncer de

27

mama, sendo também denominado um gene de susceptibilidade à doença (RAHMAN et

al, 2007). Além disso, foi demonstrado que PALB2 é a proteína que medeia a interação

física direta entre BRCA1 e BRCA2 (SY, HUEN e CHEN, 2009).

O domínio coiled-coil de BRCA1 está encerrado numa região que alguns autores

tem denominado de Activation Domain 1 (AD1), compreendendo os aminoácidos 1293

a 1560. Os domínios BRCTs foram denominados como Activation Domain 2 (AD2) (HU

et al, 2000; HU & LI, 2002). O domínio coiled-coil foi identificado por Hu e colaboradores

como crítico para a atividade transcricional desta região, porém o grupo afirma que a

atividade transcricional deste domínio é dependente do modelo trabalhado (células

utilizadas) e é menos robusta que a atividade transcricional do domínio AD2 (BRCT),

mas pode atuar de forma sinergística quando junto ao domínio AD2 (HU et al, 2000). É

possível que a atividade transcricional de AD1 seja dependente do modelo utilizado

pela existência de possíveis parceiros que regulem sua atividade transcricional,

limitando sua atividade às células que poderiam ter maior expressão destes (HU e LI,

2002).

1.6 A ATIVIDADE DE TRANSATIVAÇÃO TRANSCRICIONAL DE BRCA1

A partir da observação de que BRCA1 possuía um domínio RING-finger,

classicamente um domínio de ligação ao DNA, sinais de localização nuclear e uma

região C-terminal acídica, questionou-se sobre o papel da proteína em mecanismos de

transcrição (MONTEIRO, AUGUST e HANAFUSA, 1996). Em 1996, Monteiro e

colaboradores demonstraram que a porção C-terminal de BRCA1, mais

28

especificamente os domínios BRCT, possuía a capacidade de transativar um gene

repórter quando fusionado a um domínio heterólogo de ligação ao DNA.

Foi observado também que mutações germinativas associadas à predisposição

ao câncer presentes na região dos BRCT aboliam essa capacidade de ativação

transcricional e que polimorfismos de BRCA1 (não associados ao câncer) mantinham a

atividade transcricional semelhante à proteína selvagem (MONTEIRO, AUGUST e

HANAFUSA, 1996). Essa observação levou o grupo a concluir que a capacidade de

transativação transcricional de BRCA1 poderia ser utilizada como uma ferramenta para

predição de mutações presentes na região C-terminal da proteína que conferem

susceptibilidade ao câncer.

1.7 VARIANTES NÃO CLASSIFICADOS DE BRCA1: UM PROBLEMA PARA A

IDENTIFICAÇÃO DE INDIVÍDUOS EM RISCO

A identificação de genes associados a síndromes cancerosas hereditárias

constitui um passo relevante nas rotinas de prevenção, em especial pela possibilidade

de identificação precoce de indivíduos em condição de risco elevado (MARX, 1991).

Isso é particularmente importante na consideração de estratégias de intervenção clínica,

que podem envolver desde mudanças no estilo de vida, passando pelo o aumento na

freqüência das rotinas de monitoramento e chegando à situação extrema das cirurgias

preventivas ou terapias hormonais (NAROD e OFFIT, 2005).

Há grande benefício na realização de testes genéticos para indivíduos que

pertençam a famílias com alto-risco de mutações nos genes BRCA1 ou BRCA2. Nessas

condições particulares, o conhecimento do diagnóstico, tanto para os indivíduos

29

portadores como não-portadores, permite definir condutas clínicas adequadas aos dois

casos. A realização de cirurgias preventivas pode ser sugerida somente quando

necessário, evitando-a quando os indivíduos não tenham o alelo de suscetibilidade

associado ao câncer.

Nos Estados Unidos, os testes genéticos para identificação de mutações em

BRCA1 e BRCA2 consistem basicamente no seqüenciamento direto das regiões

codificantes de ambos os genes (FRANK, 1998; FRANK, 2002). Nos primeiros anos em

que o teste se tornou disponível, este era basicamente direcionado à mulheres com

histórico familiar da doença bastante evidente. Em muitos países esses ainda são os

critérios para a indicação de testes genéticos. Atualmente, nos Estados Unidos, os

testes se tornaram mais difundidos pela maior facilidade de acesso e investimento em

propaganda dos laboratórios responsáveis (SPURDLE et al, 2011). Resumidamente,

esses testes podem conduzir a três tipos principais de resultado:

• Positivo para uma mutação deletéria. Indica que o indivíduo em questão

apresenta risco elevado para o desenvolvimento de câncer. Este resultado leva em

conta que as mutações em BRCA1 e BRCA2 não apresentam penetrância completa,

apesar das chances desses indivíduos desenvolverem câncer serem bastante elevadas,

não são de 100%.

• Nenhuma mutação detectada na região codificante em BRCA1 ou BRCA2.

Esse resultado é bastante informativo no caso de uma mutação específica ter sido

encontrada num outro membro da família e não no paciente testado. Isto indicaria que o

indivíduo em questão não herdou aquele alelo de susceptibilidade responsável pelo

câncer familiar. O risco de desenvolver a doença seria baixo ou comparável à

população em geral. No entanto é importante considerar que uma mutação deletéria em

BRCA1 ou BRCA2 pode estar localizada numa região não-codificante (regulatória) dos

30

genes. Além disso, a inativação do gene pode ser causada por grandes rearranjos que

não são identificados pelos ensaios baseados em sequenciamento direto (PUGET et al,

1999; UNGER et al, 2000; AGATHA, et al, 2005). E, finalmente, podem refletir o fato da

susceptibilidade da família ser a consequência da inativação de um outro gene de

susceptibilidade desconhecida.

• Identificação de alterações em BRCA1 ou BRCA2 para qual o risco de

câncer ainda não foi determinado. Essas alterações são chamadas de variantes não

classificados (VNC). A razão para a incapacidade de classificação desses mutantes

reside na falta de informação genética que permita determinar sua associação ao

câncer ou não.

As limitações dos testes genéticos ainda existem e podem ser de várias e de

diferentes naturezas envolvendo questões como sensibilidade, especificidade,

inabilidade na detecção dentre outras. Uma destas grandes limitações é a falta de

correlação funcional entre mutações detectadas e o desenvolvimento do câncer. Desta

maneira há uma importante lacuna a ser preenchida na capacidade de predição do

risco de doença (CARVALHO et al, 2007)

Apesar disso, alguns fatores podem contribuir para um aumento da demanda de

testes genéticos no futuro. O primeiro fator é o lento porém progressivo

desenvolvimento de opções de estratégias preventivas e condutas clínicas disponíveis

aos portadores de mutações. Os testes genéticos para BRCA devem ser mais

requisitados também para o auxílio de terapias específicas que tem como alvo tumores

com BRCA1 e/ou BRCA2 mutados, como as terapias baseadas em inibidores de Poli-

(ADP-ribose) polimerase (PARP) (TRAINER et al, 2010). E um outro importante fator é

o advento de tecnologias para o sequenciamento de DNA, como os seqüenciadores de

segunda-geração (WALSH et al, 2010).

31

1.8 ENSAIOS FUNCIONAIS PARA CLASSIFICAÇÃO DE VARIANTES DE BRCA1

O gene BRCA1 é bastante polimórfico e estima-se que 70% de seus variantes

identificados afetam a integridade da proteína, através da diminuição/perda de

expressão ou expressão de proteína truncada (CARVALHO, COUCH e MONTEIRO,

2007). Mais de 1700 variantes de BRCA1 já foram identificados e depositados no banco

de dados do BIC (Breast Cancer Information Core; http://research.nhgri.nih.gov/bic), e

essas mutações se encontram distribuídas ao longo de todo o gene (Fig. 1.4).

As mutações missense de BRCA1, assim como deleções e inserções in-frame

são os tipos de mutação mais problemáticos para o acesso ao risco de predisposição

ao câncer, pois o efeito dessas mutações na função da proteína é incerto (SZABO,

WORLEY e MONTEIRO, 2004). De acordo com o BIC, mais de 90% das mutações

missense de BRCA1 registradas neste banco de dados são variantes não classificados

quanto sua importância clínica (VNC).

32

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33

A impossibilidade de se determinar quais mutações podem predispor à doença

gera um problema significativo na avaliação de risco, aconselhamento e cuidados

preventivos. De modo a se determinar a importância clínica de VNC em BRCA1,

diversos ensaios funcionais foram desenvolvidos ou estão sendo desenvolvidos

(CARVALHO, COUCH e MONTEIRO, 2007). Estes ensaios servem como um método

de classificação independente de VNC indicando a influência destes em uma

determinada função da proteína. Os resultados destes ensaios podem agregar

informações juntamente a dados epidemiológicos e modelos de probabilidade in silico

para a predição de associação ao câncer de VNC.

Ensaios funcionais podem se basear em funções biológicas globais de uma

proteína ou então em informações específicas sobre domínios protéicos e suas funções

essenciais, sendo assim uma maneira de se monitorar a integridade desses domínios.

Experimentos que se propõem a fazer uma avaliação funcional de determinada proteína

devem analisar uma série de variantes sistematicamente e comparar os resultados com

controles positivos e negativos bem definidos (CARVALHO, COUCH e MONTEIRO,

2007; PHELAN et al, 2005; VALLON-CHRISTERSSON et al, 2001). Para controles

negativos é recomendada a utilização de pelos menos dois variantes de alta

penetrância associados ao câncer, e como controles positivos, é importante a utilização

de BRCA1 selvagem e um polimorfismo sabidamente benigno. No caso de BRCA1, a

mutação C61G na região N-terminal, e as mutações M1775R, A1708E e Y1853X na

região C-terminal constituem controles negativos apropriados e validados para estudos

funcionais. O polimorfismo benigno S1613G, na porção C-terminal de BRCA1 é

comumente utilizado como controle positivo (CARVALHO, COUCH e MONTEIRO,

2007; GOLDGAR et al, 2004).

34

A disponibilidade de diversos dados funcionais de BRCA1 possibilitou o

desenvolvimento de ensaios funcionais importantes para a discriminação de variantes

quanto sua associação ao câncer e apresentam a possibilidade para a condução

desses ensaios em rotinas clínicas para avaliação de VNC identificados.

1.8.1 Ensaio do fenótipo de colônias pequenas

A expressão de construções contendo a porção C-terminal de BRCA1 em

levedura inibe o seu crescimento, resultando na formação de colônias bem menores

quando comparadas a controles que não apresentam sua expressão, gerando o

denominado “fenótipo de pequenas colônias”. Esse fenótipo é confirmado

qualitativamente e/ou quantitativamente através da contagem do número de células

presente em cada colônia (HUMPHREY et al, 1997; COYNE et al, 2004; MONTEIRO et

al, 1998). A inibição do crescimento pela expressão de BRCA1 selvagem ou de um

variante neutro mas não pela expressão de um variante deletério sugere que a região

C-terminal de BRCA1 inibe o crescimento em levedura por um mecanismo análogo ao

de supressão de tumor mediado por BRCA1 em humanos (HUMPHREY et al, 1997).

De outro modo, este fenótipo pode se dar por um mecanismo genérico de inibição

transcricional, já que mutações de predisposição ao câncer abolem a atividade

transcricional de BRCA1 (GILL, SADOWSKI e PTASHNE, 1990; MONTEIRO et al,

1996).

35

1.8.2 Resgate de resistência à radiação (RRR)

BRCA1 tem papel na manutenção da integridade genômica, principalmente em

resposta à quebra de dupla-fita (double-strand break, DSB) do DNA, decorrentes de

erros na replicação ou insultos externos (CORTEZ et al, 1999; ZHANG & POWELL,

2005, SCULLY et al, 1997b). Logo, o reparo eficiente de DSB de DNA está relacionado

à função supressora de tumor de BRCA1. Corroboram com esses dados o fato de que

células deficientes para BRCA1 são sensíveis à radiação ionizante e agentes químicos

indutores de DSB (SHEN et al, 1998).

O RRR se baseia na capacidade de variantes neutros resgatarem a resistência à

radiação ionizante quando expressos em células HCC1937, as quais não possuem

BRCA1 funcional (SCULLY et al, 1999). Variantes deletérios não são capazes de

resgatar essa função.

1.8.3 Atividade ubiquitina-ligase

BRCA1 possui atividade E3 ubiquitina ligase mediada por seu domínio RING-

finger, na porção N-terminal da proteína, e essa atividade é potencializada por sua

interação com BARD1, também mediada por este domínio (BAER et al, 2002; BZROVIC

et al, 2003; STARITA et al, 2004; WU-BAER et al, 2003; XIA et al, 2003). Variantes de

BRCA1 classificados como deletérios nessa região (por exemplo, C61G) levam à

inativação da atividade ubiquitina ligase (RUFFNER et al, 2001).

A interação de BRCA1 com BARD1 também foi utilizada como uma avaliação

funcional para variantes de BRCA1, através de ensaios de dois-híbridos em levedura

(MORRIS et al, 2006). Com este método foi possível a análise sistemática de variantes

36

localizados na região N-terminal de BRCA1, onde a perda da interação foi observada

na presença de mutações germinativas associadas à predisposição ao câncer.

1.8.4 Ensaio para identificação de códon de parada prematuro

Este método foi desenvolvido para a avaliação de deleções ou inserções, assim

como mutações nonsense em qualquer gene supressor de tumor (ISHIOKA et al, 1997).

Neste ensaio, o cDNA a ser testado é clonado em um vetor e inserido em célula de

levedura. O vetor em questão expressa uma fusão do cDNA em teste no mesmo molde

de leitura que um marcador seletivo, como por exemplo uracila (URA3). Logo, quando

há a ocorrência de alguma mutação que leve à expressão da proteína truncada, no

caso BRCA1, a expressão do marcador seletivo é abolida, levando à diminuição ou ao

não crescimento de colônias de levedura. Este ensaio não detecta deleções e insersões

in-frame, assim como mutações missense (MONTEIRO e HUMPHREY, 1998).

1.8.5 Ensaio de ligação de fosfo-peptídeos

Os domínios BRCT em tandem de BRCA1 funcionam como módulos de ligação

à fosfo-peptídeos. Esta ligação se dá de maneira específica à motivos pSer-X-X-Phe,

por intermédio de sulcos estruturais de ligação (RODRIGUEZ et al, 2003; YU et al,

2003; MANKE et al, 2003). O ensaio de ligação à fosfo-peptídeos utiliza variantes

presentes nos domínios BRCT para avaliar a capacidade de manuntenção ou não dos

sítios de ligação desses domínios, comparando com a capacidade da proteína

selvagem (controle positivo) e de variantes deletérios que corrompem essa capacidade.

Já foi demonstrado que importantes mutações nessa região, associadas à

37

predisposição ao câncer, rompem com essa capacidade de ligação à fosfo-peptídeos,

por modificações estruturais importantes no domínio (WILLIAMS et al, 2004; LEE et al,

2010)

1.8.6 Ensaio funcional baseado em células-tronco embrionárias

BRCA1 é essencial para a manutenção e sobrevivência de células-tronco

embrionárias (GOWEN et al, 1996; HAKEM et al, 1996). Células-tronco embrionárias

deficientes para o gene HPRT1 (que codifica a enzima hipoxantina-guanina

fosforibosiltransferase) e com capacidade de expressão condicionada de BRCA1 são

utilizadas para a condução deste ensaio. Estas células possuem um alelo não funcional

de BRCA1 e o segundo alelo modificado, tendo o lócus dos éxons 3-7 flanqueados por

duas metades do mini-gene humano HPRT1 juntamente com dois sítios loxP, o que

permite o silenciamento condicional de BRCA1 e a expressão do gene HPRT1 para a

seleção das células silenciadas em meio seletivo (CHANG et al, 2009).

A perda condicional do alelo de BRCA1 inviabiliza as células. A expressão

ectópica de BRCA1 resgata a viabilidade dessas células. Baseado nessas observações,

alguns variantes foram testados quanto sua capacidade de resgate de viabilidade

dessas células. Assim, variantes que falharam em resgatar o fenótipo normal dessas

células poderiam ser classificados como deletérios, e o oposto seria observado para

variantes neutros (CHANG et al, 2009).

O ponto positivo deste ensaio é a possibilidade de se avaliar mutações em

qualquer ponto da região codificante de BRCA1 (CHANG et al, 2009).

38

1.9 O ENSAIO DE TRANSATIVAÇÃO TRANSCRICIONAL COMO MODELO DE

AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE BRCA1

A identificação da capacidade de transativação transcricional da região C-

terminal de BRCA1 logo levou à utilização dessa função como forma de avaliação da

integridade dessa região da proteína (MONTEIRO, AUGUST e HANAFUSA, 1996;

HAYES et al, 2000).

Os primeiros ensaios foram realizados com uma região C-terminal de BRCA1

que englobava basicamente os domínios BRCT (aa 1560-1863, éxons 16 a 24)

(MONTEIRO, AUGUST e HANAFUSA, 1996; HAYES et al, 2000; VALLON-

CHRISTERSSON et al, 2001). Em 2005, Phelan e colaboradores adaptaram o ensaio

de transativação transcricional para variantes presentes na região entre os aminoácidos

1396 a 1863 de BRCA1, compreendendo a região dos éxons 13 a 24 (PHELAN et al,

2005). Esse contexto de ensaio foi validado por Carvalho e colaboradores em 2007,

onde estes ensaios demonstraram uma excelente correlação entre os dados funcionais

obtidos e dados clínicos, além disso foram definidos valores limitantes de classificação

quanto a atividade de transativação transcricional (CARVALHO et al, 2007)

No modelo mais usual do ensaio, uma fusão da região C-terminal de BRCA1

com os domínios heterólogos de ligação GAL4 ou LexA é expressa em células de

mamífero ou de levedura, respectivamente. Estas células possuem um gene repórter de

forma intrínseca ou epissomal que são responsivos aos domínios de ligação GAL4 ou

LexA (MONTEIRO, AUGUST e HANAFUSA, 1996; HAYES et al, 2000; VALLON-

CHRISTERSSON et al, 2001, CARVALHO et al, 2002; CARVALHO et al, 2007). A

quantificação do produto do gene repórter ou de sua atividade permite uma avaliação

indireta da atividade transcricional de BRCA1. Dessa maneira, o grau de disfunção

39

causado por um variante pode ser avaliado comparativamente a controles positivos

(proteína selvagem, polimorfismo benigno) e negativos (variante associado à

predisposição ao câncer) (Fig. 1.5; VALLON-CHRISTERSSON et al, 2001,PHELAN et

al, 2005, CARVALHO et al, 2007).

Figura 1.5: Representação esquemática do comportamento de transativação transcricional da região C-

terminal de BRCA1 em função da expressão de um gene repórter. A, representa o comportamento da

proteína selvagem; B, da proteína com um polimorfismo benigno; C, um variante missense associado ao

câncer; D, um variante nonsense também associado ao câncer. Figura adaptada de Monteiro, 2000.

É importante que os ensaios sejam conduzidos em modelos de levedura e

células de mamífero, já que variantes termo-sensíveis já foram descritos (ensaios em

levedura são conduzidos a 30°C e em células de mamífero a 37°C), podendo

apresentar resultados discrepantes nos dois ensaios (CARVALHO et al, 2002,

WORLEY et al, 2002). Além disso, alguns transcritos apresentam menor estabilidade

em células de mamífero, levando à discussões sobre os resultados serem inerentes à

40

um artefato técnico ou se realmente essa instabilidade em células humanas pode ser

um reflexo do papel de predisposição ao câncer do variante em estudo (CARVALHO,

COUCH e MONTEIRO, 2007).

O ensaio de transativação transcricional de BRCA1 pode ser considerado uma

avaliação confiável da integridade da região C-terminal de BRCA1, um domínio que já

foi demonstrado ser essencial para função supressora de tumor de BRCA1

(CARVALHO, COUCH e MONTEIRO, 2007). Este ensaio tem demonstrado uma forte

correlação entre seus resultados e a predisposição ao câncer dos variantes testados.

É importante ressaltar que este ensaio está limitado à região limitada pelos

aminoácidos 1396 a 1863 (éxons 13 a 24), e é questionado se regiões adjacentes

poderiam ser utilizadas para avaliação de variantes por este ensaio.

41

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar um modelo para o aperfeiçoamento do ensaio de transativação

transcricional de variantes missense de BRCA1, estendendo a cobertura de

caracterização funcional de VNC por este método à região do éxon 12 e à porção final

do éxon 11, compreendendo os resíduos de aminoácidos 1315 a 1395 de BRCA1

(contexto 11/24).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

2.2.1 Avaliar a capacidade de transativação transcricional de BRCA1 no contexto 11/24

comparativamente a BRCA1 no contexto previamente validado 13/24 (resíduos 1396-

1863);

2.2.1 Avaliar a capacidade de transativação transcricional de variantes de BRCA1,

previamente validados como controles (positivos e negativos para ativação

transcricional), no contexto 11/24 comparativamente a seus correspondentes no

contexto 13/24;

2.2.3 Identificar variantes missense de BRCA1 descritos na população localizados na

região de extensão do estudo (resíduos 1315-1395);

42

2.2.4 Identificar controles positivos e negativos para a atividade de transativação

transcricional na região de extensão do estudo em banco de dados ou por estratégias in

silico;

2.2.5 Selecionar variantes a serem utilizados no estudo;

2.2.6 Avaliar funcionalmente a capacidade de transativação transcricional dos variantes

identificados e selecionados no estudo.

43

3 MÉTODOS

3.1 ANÁLISE COMPARATIVA DE ORTÓLOGOS DE BRCA1

Foram selecionadas proteínas ortólogas à proteína BRCA1 humana por análises

de similaridade usando a sequência codificante de BRCA1 como referência (número de

acesso no NCBI - National Center for Biotechnology Information: U14680), o programa

BLASTp – Standard Protein BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e o banco de

dados não-redundante de proteínas do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Foram

aceitas e analisadas as seqüências completas e anotadas como BRCA1 nos

organismos seguintes: Pan troglodytes (chimpanzé), Gorilla gorilla (gorila-do-ocidente),

Pongo pygmaeus (orangotango), Macaca mulatta (macaco-rhesus), Equus caballus

(cavalo), Sus scrofa (javali), Bos taurus (boi), Canis lupus (lobo), Mus musculus

(camundongo), Rattus norvegicus (rato-marrom), Monodelphis domestica (catita),

Xenopus laevis (rã-de-unhas africana), Xenopus tropicalis (rã da família Pipidae), Galus

Galus (galo), Tetraodon nigroviridis (baiacu), Strongylocentrotus purpuratus (ouriço-

púrpura), Arabidopsis thaliana (vegetal da família Brassicaceae), Nematostella

vectensis (anêmona-do-mar), Ciona intestinalis (ascídia-solitária), Nasonia vitripennis

(vespa), Dictyostelium discoideum (ameba).

As seqüências protéicas completas selecionadas, incluindo a de BRCA1 humana,

foram alinhadas pelo programa Clustal W v. 2.1 (Thompson et al., 1994, disponível em

http://www.clustal.org). A análise do alinhamento foi feita no programa Sea View v. 4.3.3

(GOUY, GUINDON e GASCUEL, 2010, disponível em http://pbil.univ-

lyon1.fr/software/seaview.html), onde foram identificados os loci conservados e

44

variáveis nos ortólogos de BRCA1 na região do exon 12 e na porção final do exon 11

(resíduos de aminoácido 1315-1395).

Buscou-se com a análise comparativa de ortólogos de BRCA1 uma estratégia

para se identificar regiões mais conservadas e menos conservadas evolutivamente na

seqüência codificante de BRCA1 em estudo.

3.2 ALIGN GV/GD DE VARIANTES DE BRCA1

A avaliação comparativa de ortólogos de BRCA1 por alinhamento de sequências

protéicas foi complementada com a utilização do programa Align GV/GD, disponível na

base de dados da International Agency for Research on Cancer - IARC (BReast CAncer

Genes IARC database – BRCA database; http://brca.iarc.fr). Foi submetido ao Align

GV/GD a região de BRCA1 limitada aos resíduos 1315 a 1395, o alinhamento foi

conduzido usando as sequências protéicas disponíveis, variando de BRCA1 humana a

seu ortólogo em ouriço-do-mar.

O Align GV/GD se baseia num alinhamento múltiplo de sequência de ortólogos e

combina duas variáveis: a Variação de Grantham (Grantham Variation – GV) e Desvio

de Grantham (Grantham Deviation – GD) (TAVTIGIAN, 2006), ambas são baseadas na

Diferença de Grantham (GRANTHAM, 1974). Esta ferramenta computacional é usada

como um método preditivo para o efeito de variantes missense. A Variação de

Grantham (GV) é uma medida quantitativa para o grau de variação entre os

aminoácidos em uma determinada posição de um alinhamento de sequências de

ortólogos. O Desvio de Grantham (GD) corresponde à medida quantitativa da distância

entre uma substituição missense e o grau de variação (GV) observado na sua posição

45

do alinhamento. O Align GV/GD utiliza essas variáveis em um algoritmo e gera como

resultado para a variação em análise uma classe preditiva. As classes preditivas

resultantes deste modelo formam um espectro (C0, C15, C25, C35, C45, C55 e C65),

sendo classificado como C0 o variante com pouca ou nenhuma probabilidade de

interferência na função da proteína (perfil neutro) e C65 o variante com grande

probabilidade para tal interferência (perfil deletério).

3.3 IDENTIFICAÇÃO DE VARIANTES NATURAIS EM BANCO DE DADOS

A identificação e seleção de variantes naturais para o estudo foi realizada na

base de dados do BIC. Consideraram-se somente variantes que apresentaram

mutações de interesse para o estudo conduzido (variantes missense), compreendidos

entre a porção final do exon 11 e o exon 12 (resíduos 1315-1395).

3.4 DESENHO DOS VARIANTES SINTÉTICOS (NÃO-NATURAIS) PARA

ESTRUTURAÇÃO DO PERFIL DE ANÁLISE NO ESTUDO

Já foi demonstrado que mutações missense germinativas em BRCA1 associadas

à predisposição ao câncer de mama e/ou ovário abolem ou reduzem em grande parte a

atividade transcricional de BRCA1 quando comparadas à proteína selvagem

(MONTEIRO et al, 1996, CARVALHO et al, 2007). Essas mutações têm sido utilizadas

como controles negativos da atividade transcricional de BRCA1 em estudos funcionais.

Como controles positivos nesses estudos, além da proteína selvagem, são usados

46

variantes identificados na população e que foram caracterizados como benignos ou

neutros, ou seja, que não estão associados à predisposição ao câncer. Porém, para o

estudo proposto neste trabalho uma abordagem diferente se fez necessária, pois não

havia registros nas bases de dados pesquisadas (literatura e BIC) de variantes

missense presentes na região de estudo (resíduos 1315-1395) caracterizados em

estudos populacionais e/ou funcionais quanto sua associação ou não ao câncer.

Para atender a necessidade de variantes controle presentes na região do estudo,

foi conduzido o desenho de variantes sintéticos (não-naturais) putativamente neutros e

deletérios localizados na região encerrada entre os resíduos 1315 a 1395 de BRCA1.

Nomeamos de variantes sintéticos ou não-naturais aqueles não descritos na população

até o momento deste estudo, segundo dados disponíveis na literatura e no banco de

dados do BIC.

Com base na análise comparativa de ortólogos e no Align GV/GD, identificou-se

loci conservados e variáveis. Foram desenhados variantes putativamente neutros e

deletérios por substituição de um único nucleotídeo (variante missense) em códons

variáveis e conservados, observando a semelhança e dessemelhança estrutural e

evolutiva dos resíduos na construção do novo códon.

47

3.5 GERAÇÃO DE CONSTRUÇÕES

3.5.1 Construções no contexto 11/24

Os variantes de BRCA1 gerados para o estudo que encerram a região restrita

aos nucleotídeos 4062 a 5711, correspondente ao final do éxon 11 até o éxon 24, que

codifica a porção C-terminal de BRCA1 (550 aminoácidos - resíduos 1315 a 1863).

Construções encerrando essa região serão referidas como BRCA1 11/24.

Os variantes selecionados para o estudo foram gerados por rotinas de

mutagênese sítio-dirigida por sobreposição de fragmentos (HO et al, 1989). A

mutagênese por sobreposição de fragmentos emprega a técnica de PCR (Polymerase

Chain Reaction) (SAIKI et al, 1988) para inserir mutações específicas em uma

sequência nucleotídica. Resumidamente, em rotinas de PCR distintas são amplificados

dois fragmentos da seqüência alvo, como mostra a figura 3.1. Cada reação (reação “1”

e reação “2”, Fig. 3.1) utiliza um oligonucleotídeo iniciador (primer) que hibridiza em

uma das extremidades da seqüência alvo (primers “a” ou “d”, Fig. 3.1) e um primer de

mutagênese que hibridiza na região da mutação e contém uma base alterada em

relação à seqüência alvo, correspondente a mutação de interesse (primers “b” ou “c”,

Fig. 3.1). Como os produtos das reações “1” e “2” são parcialmente complementares, é

possível então combinar os fragmentos gerados AB e CD (Fig. 3.1) utilizando-os como

molde para geração e amplificação da sequência mutante (reação “3”, Fig 3.1) em

conjunto com os primers “a” e “d”.

Para as reações de mutagênese foram desenhados dois primers (UEND11 e

24ENDT) para a amplificação da sequência codificante de BRCA1 que encerra a região

48

limitada pelos nucleotídeos 4061 a 5711; além disso, também foram desenhados vinte

e dois primers de mutagênese (Quadro 3.1).

O plasmídio pcBRCA1-385 (MIKI et al, 1994), correspondente à seqüência

codificante completa de BRCA1 clonada no vetor de expressão pCDNA3 (Invitrogen,

Califórnia, Estados Unidos) foi usado como molde para as reações de mutagênese. As

reações de amplificação foram conduzidas utilizando uma DNA polimerase de alta

fidelidade, Pfx50 DNA Polymerase (Invitrogen, Califórnia, Estados Unidos), de acordo

com as especificações do fabricante. O programa de termociclagem utilizado para as

reações foi definido com uma etapa de desnaturação inicial de 3 min a 94°C, seguido

por 35 ciclos de passos de desnaturação (1 min a 94°C), anelamento (1 min a 55°C) e

extensão (1,5 min a 72°C) e por fim, um etapa de extensão de 5 min a 72°C. As

reações de amplificação foram conduzidas em termociclador MJ Research PTC-200

Thermalcycler (MJ Research/BIO-RAD, Califórnia, Estados Unidos). Os primers foram

desenhados e testados de forma a atenderem a temperatura de anelamento utilizada

nas rotinas de PCR. Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforese em

gel de agarose 1% (p/v) em tampão TBE (45mM Tris base, 45mM Ácido Bórico, 1mM

EDTA).

49

Figura 3.1: Diagrama esquemático da rotina de mutagênese sítio-dirigida por sobreposição de

fragmentos. Os DNAs dupla-fita e os primers estão representados por linhas com setas na orientação

5’→3’. O sítio de mutagênese está indicado pelo retângulo vermelho sobre as setas. Os primers estão

denotados por letras minúsculas e os produtos de PCR por pares de letras maiúsculas, correspondentes

aos primers utilizados para gerar cada produto. Os primers de extremidade utilizados na rotina de

mutagênese, “a” e “d”, representados em marrom e laranja, são respectivamente UEND11 e 24ENDT. O

retângulo destaca os passos que ocorrem durante a reação “3”, onde os produtos das reações “1” e “2”

desnaturam, se anelam em sua região complementar e são estendidos no sentido 3’ pela DNA

polimerase (linha pontilhada), formando o produto recombinante mutante. Na presença dos primers “a” e

“d” o produto recombinante mutante é amplificado na rotina de PCR. Adaptado de Ho et al, 1989.

50

Quadro 3.1: Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na geração de variantes para o estudo.

Mutação Primer Sentido Sequência nucleotídica (5'→3')

- UEND11 Senso cggaattccctttcttgattggttcttcc

- 24ENDT Anti-senso gcggatcctcagtagtggctgtgggggat

S1613G S1613G Senso atctgcccagggtccagctgc

S1613G Anti-senso gcagctggaccctgggcagattc

M1775R M1775R Senso ttcaccaacaggcccacagatc

M1775R Anti-senso atctgtgggcctgttggtgaagg

L1317F L1317F Fw Senso cggaattccctttcttcattggttcttcc

K1322E K1322E Fw Senso cggaattccctttcttgattggttcttccgaacaa

E1352K E1352K Fw Senso ggaacgggcttgaaagaaaataatc

E1352K Rv Anti-senso gattattttctttcaagcccgttcc

S1360G S1360G Fw Senso agaagagcaaggcatggattc

S1360G Rv Anti-senso gaatccatgccttgctcttcttg

S1370F S1370F Fw Senso ggtgaagcagcatttgggtgtgagag

S1370F Rv Anti-senso ctctcacacccaaatgctgcttcacc

C1372Y C1372Y Fw Senso gcatctgggtatgagagtgaaacaagc

C1372Y Rv Anti-senso gcttgtttcactctcatacccagatgc

D1381Y D1381Y Fw Senso gcgtctctgaatactgctcaggg

D1381Y Rv Anti-senso ccctgagcagtattcagagacgc

Q1388L Q1388L Fw Senso gctatcctctctgagtgacattttaacc

Q1388L Rv Anti-senso ggttaaaatgtcactcagagaggatagc

T1394I T1394I Fw Senso gacattttaaccattcagcagagggatacc

T1394I Rv Anti-senso ggtatccctctgctgaatggttaaaatgtc

Q1395R Q1395R Fw Senso gacattttaaccactcggcagagggatacc

Q1395R Rv Anti-senso ggtatccctctgccgagtggttaaaatgtc

51

Os produtos de amplificação das rotinas de PCR de mutagênese

(correspondentes às reações “1” e “2”, Fig. 3.1) foram purificados a partir de

eletroforese preparativa em gel de agarose (como anteriormente descrito) a fim de se

evitar contaminação com o molde e com produtos inespecíficos da reação de

amplificação. Os fragmentos foram purificados utilizando kit comercial GFX PCR DNA

and Gel Purification Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) ou kit comercial

QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hiden, Alemanha), de acordo com instruções do

fabricante. Os produtos purificados foram analisados novamente utilizados em

eletroforese em gel de agarose.

Os variantes L1317F (g4070t) e K1322E (a4083g), situados em uma das

extremidades da região de interesse (nucleotídeos 4062 a 5711) foram gerados

diretamente por rotinas de PCR usando um primer de mutagênese senso específico e o

primer anti-senso 24ENDT (Quadro 3.1).

De maneira diferente dos demais variantes do estudo, o variante Y1853X foi

amplificado diretamente do plasmídeo molde pCDNA3-BRCA1 Y1853X FL –(seqüência

codificante cadeia completa do variante Y1853X de BRCA1, clonado em pCDNA3,

gentilmente cedido por Dr. Álvaro Monteiro, H. Lee Moffitt Cancer Center, Flórida)

utilizando os primers UEND11 e 24ENDT.

A seqüência selvagem (wt – wild type) codificante de BRCA1 11/24 foi gerada por

rotina de PCR utilizando o molde pcBRCA1-385 e os primers UEND11 e 24ENDT.

3.5.1.1 Clonagem no vetor de expressão pLex9

Os produtos das rotina de amplificação foram direcionalmente clonados nos

sítios de EcoRI e BamHI no vetor de expressão em levedura pLex9 (GOLEMIS, et al,

52

1994), no mesmo quadro de leitura que o DBD LexA (DBD: DNA binding domain /

domínio de ligação ao DNA) presente neste vetor (Fig. 3.2), codificando a expressão da

proteína quimérica DBD LexA:BRCA1aa1315-1863 Resumidamente, os produtos foram

clonados submetidos à reação de digestão com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI

(New England Biolabs, Massachusetts, Estados Unidos), de acordo com instruções do

fabricante. Os produtos digeridos foram analisados por eletroforese preparativa em gel

de agarose 1% (p/v) em tampão TBE. Os fragmentos de interesse foram purificados e

analisados por eletroforese em gel de agarose, como descrito no item 3.5.1.

Os produtos de digestão purificados (insertos) foram usados em uma reação de

ligação juntamente com o vetor pLex9 (previamente digerido com as enzimas EcoRI e

BamHI e purificado), utilizando T4 DNA ligase (Fisher Scientific, Massachusetts,

Estados Unidos) segundo instruções do fabricante. Os produtos recombinantes gerados

nas reações de ligação foram utilizados em rotina de transformação e seleção de

bactérias Escherichia coli DH5’α que continham os plasmídeos de interesse (processo

descrito no item 3.6).

As construções pLex9-BRCA1 11/24 foram confirmadas por sequenciamento

automático, como descrito no item 3.7, e utilizadas no ensaio de transativação

transcricional em levedura (item 3.9).

53

Figura 3.2: Representação da construção de pLex9-BRCA1 11/24. Os produtos obtidos pelas rotinas de

amplificação (cassete BRCA1aa1315-1863, indicado em vermelho) foram clonados direcionalmente no vetor

pLex9 (sítios de EcoRI e BamHI) no mesmo quadro de leitura que o DBD LexA (indicado em laranja).

3.5.1.2 Sub-clonagem no vetor de expressão pGBT9

Os cassetes encerrando a região codificante de BRCA1 correspondente aos

resíduos de aminoácidos 1315 a 1863 (BRCA1aa1315-1863) selvagem ou variante

clonados no vetor pLex9 foram submetidos a digestão e sub-clonados nos sítios de

EcoRI e BamHI no vetor de expressão em levedura pGBT9 (Clontech, Califórnia,

Estados Unidos) no mesmo quadro de leitura do DBD GAL4 (Fig. 3.3), codificando a

expressão da proteína quimérica DBD GAL4:BRCA1aa1315-1863. Os produtos

recombinantes gerados nas reações de ligação foram utilizados em rotina de

transformação e seleção de bactérias Escherichia coli DH5’α que continham os

plasmídeos de interesse (processo descrito no item 3.6).

As construções pGBT9-BRCA1 11/24 foram confirmadas por sequenciamento

automático, como descrito no item 3.7.

54

Figura 3.3: Representação da construção de pGBT9-BRCA1 11/24. O cassete BRCA1aa1315-1863 (em

vermelho) originalmente clonado em pLex9 foi sub-clonados direcionalmente no vetor pGBT9 (sítios de

EcoRI e BamHI) no mesmo quadro de leitura que o DBD GALA (indicado em verde).

3.5.1.3 Sub-clonagem no vetor de expressão pCDNA3

Os cassetes DBD GAL4:BRCA1aa1315-1863 selvagem ou variante oriundos do vetor

pGBT9 foram submetidos a digestão e sub-clonados nos sítios de HindIII e BamHI no

vetor de expressão em célula de mamífero pcDNA3 (Fig. 3.4), codificando a expressão

da proteína quimérica DBD GAL4:BRCA1aa1315-1863. Os produtos recombinantes gerados

nas reações de ligação foram utilizados em rotina de transformação e seleção de

bactérias Escherichia coli DH5’α que continham os plasmídeos de interesse (processo

descrito no item 3.6).

As construções pCDNA3-BRCA1 11/24 foram confirmadas por sequenciamento

automático, como descrito no item 3.7, e utilizadas no ensaio de transativação

transcricional em células de mamífero (item 3.12).

55

A sequência de eventos das rotinas de clonagem e sub-clonagem está

representada esquematicamente na figura 3.5.

Figura 3.4: Representação da construção de pCDNA3-BRCA1 11/24. O cassete BRCA1aa1315-1863 (em

vermelho) originalmente clonado em pGBT9 foi sub-clonado direcionalmente no vetor pcDNA3 (sítios de

HindIII e BamHI).

56

Figura 3.5: Fluxograma de rotinas realizadas para geração e clonagem das construções utilizadas neste

estudo.

3.5.2 Construções no contexto 13/24

As construções controle utilizadas no estudo que encerram a região codificante

correspondente aos resíduos de aminoácido 1396 a 1863 – 469 aminoácidos

(nucleotídeos 4305 a 5711, início do éxon 13 ao fim do éxon 24) clonada em pLex9 e

pcDNA3 foram previamente geradas por nosso grupo (CARVALHO et al, 2007).

Construções encerrando essa região serão referidas como BRCA1 13/24. São elas

BRCA1 selvagem (wt) 13/24 e os variantes S1613G 13/24, M1775R 13/24 e Y1853X

13/24.

57

3.6 TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA E EXTRAÇÃO PLASMIDIAL

A transformação de bactérias usando as construções plasmidiais foi conduzida

pelo processo de eletroporação (NEUMANN et al, 1982). Bactérias eletrocompetentes

foram obtidas conforme previamente descrito (AUSUBEL et al, 1987; MILLER &

Nickoloff, 1995). Resumidamente, bactérias E. coli da cepa DH5α cultivadas em meio

LB (Luria-Bertani; peptona 1% p/v, extrato de levedura 0,5 % p/v, NaCl 0,5% p/v) até

fase logarítmica de crescimento; as células foram recuperadas e sucessivamente

lavadas com água e glicerol 10% v/v, ambos gelados, as bactérias foram estocadas a -

80°C.

Para a transformação, as bactérias eletrocompetentes foram incubadas com o

DNA plasmidial (previamente dessalinizado) em banho de gelo, transferidas para uma

cubeta própria e submetidas a um pulso elétrico rápido de 1.8 kV em eletroporador

MicroPulser (BIO-RAD Califórnia, Estados Unidos). As bactérias foram, então,

recuperadas em meio LB a 37°C sob agitação; posteriormente, as células foram

plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina (10µg/mL).

A extração do DNAs plasmidial foi conduzida pelo método de lise alcalina,

segundo Ausubel (2002). Resumidamente, as células foram ressuspensas em tampão

GTE (Glicose 50mM, Tris-Cl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM), lisadas em solução de

hidróxido de sódio/SDS (NaOH 0.2M, SDS 1% p/v) e neutralizadas em tampão de

acetato de potássio (ácido acético glacial 29,5 mL, pedras de KOH até pH 4,8, H2O para

100mL). O material foi desproteinizado com tratamento com mistura de fenol-

clorofórmio, e precipitado em isopropanol.

58

Para as rotinas de transformação de leveduras e transfecção de células

humanas os DNAs plasmidiais eram extraídos utilizando o kit QIAprep Spin Miniprep

(QIAGEN, Hiden, Alemanha), de acordo com as recomendações do fabricante.

3.7 SEQUENCIAMENTO

As construções geradas foram confirmadas através de rotina de sequenciamento

automático utilizando o kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Califórnia,

Estados Unidos), segundo instruções do fabricante. A análise dos produtos da rotina de

seqüenciamento foi conduzida em sequenciador Applied Biosystems 3130xl (Applied

Biosystems, Califórnia, Estados Unidos) e foi realizada em colaboração com o

Departamento de Genética do Centro de Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer.

3.8 TRANSFORMAÇÃO DE LEVEDURAS

A transformação de leveduras Saccharomyces cerevisiae (cepa EGY48; MATα,

ura3, trp1, his3, 6 lexA operator-LEU2) com construções pLex9-BRCA1 11/24 e 13/24,

selvagem ou mutante, foi conduzida para a expressão do produto de fusão DBD

LexA:BRCA1. As leveduras foram co-transformadas com o plasmídeo pRB1840, que

encerra o sistema repórter LacZ (codificante da β-galactosidase, sob o controle de um

operador LexA) (Invitrogen, Califórnia, Estados Unidos; Fig. 3.6).

59

Para a transformação de leveduras foi utilizado o kit Yeastmaker Yeast

Transformation System 2 (Clontech, Califórnia, Estados Unidos), de acordo com as

instruções do fabricante. Resumidamente, o protocolo consistiu na indução de

competência das células de levedura em fase logarítmica de crescimento pelo

tratamento com tampão de transformação TE/LiAc (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM,

acetato de lítio 100mM, pH 7,5). Posteriormente, as células foram então incubadas em

solução de PEG/LiAc (PEG 4000 40%, Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, acetato de lítio

100mM, pH 7,5), juntamente com os plasmídeos e o DNA carreador, e, por fim, as

células foram submetidas a choque térmico. As células foram ressuspenssas em TE

(Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, pH 7,5) e plaqueadas em meio seletivo sintético

(suplemento drop-out -Trp, -Ura 0,072% p/v, base nitrogenada de levedura 0,067% p/v,

dextrose 2% p/v).

Figura 3.6: Representação do plasmídeo pRB1840 (Invitrogen). O plasmídeo possui a sequência

codificante para a β-galactosidase (LacZ) regulado por um operador LexA, e a seqüência codificante para

enzima envolvida na síntese de uracila (URA3).

60

3.9 ENSAIO FUNCIONAL EM LEVEDURA

A capacidade de transativação transcricional das construções pLex9-BRCA1

11/24 e 13/24, selvagem e variante, em levedura foi avaliada através de um ensaio

quantitativo de expressão da β-galactosidase em cultura líquida (BRENT e PTASHNE,

1985, VALLON-CHRISTERSSON, 2001).

Resumidamente, células previamente co-transformadas com as construções

pLex9-BRCA1 e pRB1840, cultivadas em meio seletivo sintético a 30°C, foram

recolhidas e lavadas em Z-buffer (Na2HPO4.7H2O 60mM, NaH2PO4.H2O 40mM, KCl

10mM, MgSO4.7H2O 1mM) e lisadas por ciclos de congelamento em nitrogênio líquido e

descongelamento em banho-maria à 37°C. Em seguida, a atividade do produto de

transcrição do gene repórter (β-galactosidase) foi avaliada no extrato lisado. A

quantificação da atividade foi conduzida através da reação de hidrólise do substrato

ONPG (o-nitrofenil-ß-D-galactopiranosídeo, incolor) para o-nitrofenol (amarelo), em

tampão Z-buffer contendo β-mercaptoetanol. A mensuração foi feita por

espectrofotometria no comprimento de onda de 420nm.

Uma unidade de β-galactosidase é definida como a quantidade que hidroliza

1µmol de ONPG para o-nitrofenol e D-galactose por minuto, por célula (MILLER,1972).

Para o cálculo de determinação das unidades de β-galactosidase no ensaio, utiliza-se a

seguinte equação:

61

Unid. β-galactosidase = 1,000 x DO420 / (t x V x DO600)

Onde: t = tempo transcorrido da incubação em minutos

V = 0,1mL x 5 (Fator de diluição)

DO600 = Absorbância a 600nm de 1mL de cultura

3.10 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE LEVEDURA

O extrato protéico total de S. cerevisiae foi obtido por lise física das células.

Resumidamente, as células de levedura transformadas cultivadas em meio seletivo

sintético foram lavadas com PBS (Sigma-Aldrich, Missouri, Estados Unidos) e

ressuspenssas em PBS contendo coquetel de inibidores de protease (Sigma-Aldrich,

Missouri, Estados Unidos); em seguida, as células foram submetidas à agitação

vigorosa na presença de micro-esferas de vidro (425-600 µm). O material foi

centrifugado e o sobrenadante recuperado e armazenado a -80°C, como descrito por

Bhaduri & Demchick (1983). A concentração das proteínas foi determinada segundo o

método de Bradford (BRADFORD, 1976).

62

3.11 TRANSFECÇÃO DE CÉLULAS HUMANAS

A transformação de células humanas (linhagem HEK293T) com construções

pcDNA3-BRCA1 11/24 e 13/24, selvagem ou variante, foi conduzida para a expressão

do produto de fusão DBD GAL4:BRCA1. As células foram co-transformadas com o

plasmídeo pG5luc, que encerra o sistema repórter codificante para luciferase de

Photinus pyralis sob o controle de operadores GAL4 (Fig. 3.7-A) e o plasmídeo pGR-TK,

que encerra a sequência codificante para a luciferase de Renilla reniformis (controle

interno de transfecção), sob o controle de um promotor constitutivo HSV-TK (Fig. 3.7-B).

A rotina de transfecção foi conduzida utilizando o reagente de base lipídica Fugene6®

(Roche, Mannheim, Alemanha) segundo instruções do fabricante.

Resumidamente, células HEK293T foram mantidas em cultura em meio RPMI

(GIBCO/Invitrogen, Califórnia, Estados Unidos) suplementado com soro fetal bovino

(GIBCO/Invitrogen, Califórnia, Estados Unidos) 10% (v/v) a 37°C. Foram inoculadas em

placa de 96 poços (5x104/poço). Após 24 horas do plaqueamento, as células foram

tratadas com uma mistura de transfecção (DNA, Fugene6® e meio de cultura sem soro,

previamente incubada a temperatura ambiente por 15 minutos).

63

Figura 3.7: Representação dos vetores pG5luc e pGR-TK. (A) O vetor pG5luc encerra a sequência

codificante da enzima luciferase de P. pyralis (luc+) regulado por 5 operadores de GAL4 (sítios de ligação

a GAL4). (B) O vetor pGR-TK encerra a sequência codificante da enzima luciferase de R. reniformis

(Rluc) controlado por um promotor constitutivo de células humanas, HSV TK.

3.12 ENSAIO FUNCIONAL EM CÉLULAS HUMANAS

A capacidade de transativação transcricional dos produtos de fusão DBD GAL4-

BRCA1 foi determinada pela razão entre a atividade da luciferase de P. pyralis

(expressa pelo sistema repórter) e luciferase de R. reniformis (expressa pelo controle

A

B

pGR-TK

64

interno de transfecção), como descrito por Vallon-Christersson e colaboradores (2001).

O vetor repórter que encerra o gene codificante da luciferase de P. pyralis contém em

sua região promotora sítios de ligação para GAL4, enquanto a construção pGR-TK, que

encerra o gene codificante da luciferase de R. Reniformis apresenta expressão

constitutiva controlado pelo promotor de timidina quinase (HSV-TK). Enquanto a

expressão da luciferase de P. pyralis é uma consequência da eficiência de transfecção

e da capacidade de ativação transcricional da quimera DBD GAL4:BRCA1, a expressão

da luciferase de R. reniformes é uma consequência apenas da eficiência de transfecção.

O uso da razão entre os valores de expressão da luciferase de P. pyralis e R.

reniformis minimiza flutuações relativas à eficiência de transfecção.

A determinação quantitativa da capacidade de transativação transcricional da

quimera DBD GAL4:BRCA1 foi realizada usando o Dual-Luciferase® Reporter Assay

System (Promega), seguindo as recomendações do fabricante. Resumidamente, 24

horas após a transfecção, células HEK293T foram lisadas com o tampão de lise,

disponibilizado pelo fabricante, e uma alíquota do lisado foi transferida para uma placa

opaca de 96 poços para leitura em luminômetro (Veritas Microplate Luminometer,

Turner Biosystems, Califórnia, Estados Unidos). A cada poço foi adicionado o reagente

LARII®, também disponibilizado pelo fabricante, que contém luciferina-D. Este é

convertido pela luciferase P. pyralis, produzindo oxiluciferina e fótons. A emissão dos

fótons é captada pelo luminômetro medida de forma acumulativa por 10 segundos. Em

seguida é adicionado o reagente Stop and Glo®, também fornecido pelo fabricante, que

interrompe a primeira reação e disponibiliza a coelenterazina, substrato da segunda

reação, catalisada pela luciferase de R. reniformis. A reação forma coelenteramida e

fótons que foram novamente mensurados de forma acumulativa por 10 segundos.

65

3.13 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS HUMANAS

O extrato protéico total de células HEK293T foi obtido 24 horas após a

transfecção com as construções pCDNA3-BRCA1 11/24 e 13/24. As células foram

recolhidas e ressuspensas em tampão RIPA (NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.4,

EDTA 5 mM, dodecil sulfato de sódio 0.1%, Triton X-100 1%, deoxicolato de sódio

0.1%) contendo coquetel de inibidores de protease (Sigma-Aldrich, Missouri, Estados

Unidos). Os lisados foram então incubados em banho de gelo por 30 minutos e

centrifugados por 10 minutos a 4ºC (13000 RPM, microcentrifuga). Os sobrenadantes

foram recuperados e armazenados à – 80ºC. A concentração das proteínas foi

mensurada segundo o método de Bradford (BRADFORD, 1976).

3.14 IMMUNOBLOTTING

A avaliação da expressão das proteínas quiméricas, DBD LexA:BRCA1 e DBD

GAL4:BRCA1, foi conduzida por immunoblotting (BURNETTE, 1981). Os extratos

celulares totais foram resolvidos por rotinas de SDS-PAGE (SDS-polyacrilamide gel

electrophoresis) 8% (p/v) e eletro-transferidos para membranas de difluoreto de

polivinilideno (PVDF) (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido), usando

o sistema Trans-Blot Semidry (BIORAD, Califórnia, Estados Unidos), segundo

recomendações do fabricante. Concluída a transferência as membranas foram

bloqueadas com leite desnatado 5% em TBS-Tween (TBS: Tris base 50mM, NaCl

150mM; Tween: 0,1%), por 16 horas a 4°C. Posteriormente, as membranas foram

incubadas com os anticorpos monoclonais IgG de camundongo anti-DBDLexA ou anti-

66

DBDGAL4 (sc-7544 e sc-46680, respectivamente; Santa Cruz, Califórnia, Estados

Unidos) diluídos em TBS-Tween suplementados com leite desnatado 0,5%. A

membrana foi, em seguida, incubada com os anticorpos policlonais de cabra anti-IgG

de camundongo conjugado à peroxidase (sc-2005; Santa Cruz, Califórnia, Estados

Unidos). O sistema foi revelado com o kit Amersham ECL™ Western Blotting Detection

Reagents (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) e a membrana foi exposta

ao filme radiográfico Amershan Hyperfilm ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino

Unido).

3.15 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Os resultados foram analisados estatisticamente empregando análise de

variância (ANOVA) simples e pós-teste de Bonferroni utilizando o programa GraphPad

Prism v. 5.0 para Windows (GraphPad Software, San Diego California USA;

www.graphpad.com).

67

4 RESULTADOS

4.1 AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE VARIANTES CONTROLE: COMPARAÇÃO DE

ATIVIDADES EM DOIS CONTEXTOS

Para a condução deste estudo se fez necessário, primeiramente, verificar se a

capacidade de transativação transcricional da região C-terminal de BRCA1 observada

em outros contextos (BRCA1AA1560-1863/BRCA1 16/24 – região restrita aos nucleotídeos

4797-5711, início do éxon 16 ao fim do éxon 24-, MONTEIRO et al, 1996; BRCAAA1396-

1863/BRCA1 13/24, PHELAN et al, 2005) seria reproduzida no novo modelo de estudo

(BRCA1AA1315-1863/BRCA1 11/24) (Figura 4.1). Assim, foram realizados ensaios

comparativos, utilizando construções controle no contexto mais recentemente validado,

BRCA1 13/24 (CARVALHO, COUCH e MONTEIRO, 2007; CARVALHO et al, 2007) e

construções controle no contexto proposto neste estudo, BRCA1 11/24. As construções

controle avaliadas nos ensaios comparativos, tanto no contexto BRCA1 13/24 quanto

11/24, são controles comumente usados nos ensaios funcionais de ativação

transcricional situados na porção C-terminal da proteína (MONTEIRO et al, 1996;

PHELAN et al, 2005; CARVALHO et al, 2007). Esses controles correspondem à

proteína selvagem (wt) e ao variante benigno descrito na população S1613G

(DUNNING et al, 1997) (controles positivos de transcrição) e os variantes M1775R

(MIKI et al, 1994) e Y1853X (FRIEDMAN et al, 1994), sabidamente associados à

predisposição ao câncer (controles negativos de transcrição). A figura 4.2 destaca a

localização desses variantes controle na porção C-terminal da proteína. Todas as

68

construções foram analisadas segundo sua capacidade de transativação transcricional

nos sistemas de células de levedura e de células humanas.

No ensaio funcional em levedura, cada variante foi testado em, pelo menos, dois

ensaios funcionais independentes, onde, em cada ensaio, três clones de cada variante

foram testados em triplicata. A atividade de transativação transcricional em levedura

das construções BRCA1 11/24 foi avaliada comparativamente com a atividade das

construções BRCA1 13/24 (Fig. 4.3).

69

Figura 4.1: Representação esquemática da região codificante de BRCA1 com seus éxons identificados

(em azul). Representação dos contextos de BRCA1 analisados e validados quanto sua capacidade de

transativação transcricional (retângulos em cinza), demarcando a região de BRCA1 correspondente.

Representação do contexto BRCA1 11/24 proposto neste estudo, demarcando a região de BRCA1

correspondente (retângulo preto). A localização dos domínios BRCTs está indicada nas representações

dos contextos (retângulos verdes).

Figura 4.2: Representação esquemática de BRCA1aa1315-1863 (11/24) e BRCA1aa1396-1863 (13/24)

fusionados a um domínio heterólogo de ligação ao DNA (DBD) e a localização dos variantes controle

analisados no estudo. No retângulo azul, localização do domínio coiled-coil (CC). Os retângulos em verde

delimitam a região dos domínios BRCTs. A seta em azul indica um variante neutro. As setas em vermelho

indicam variantes deletérios.

AA 1315

AA 1560

AA 1395

11/24

13/24 16/24

AA 1863

1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1

70

Figura 4.3: Análise da atividade de transativação transcricional em levedura de controles de BRCA1.

Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de levedura S. cerevisiae EGY48. O gráfico

apresentado é representativo de um experimento. As células foram co-transformadas com a quimera

DBD LexA:BRCA1 selvagem ou variante e um sistema repórter de β-galactosidase. A atividade de

BRCA1 13/24 – barras pretas - comparativamente a atividade de BRCA1 11/24 – barras cinzas - está

apresentada em relação à atividade da construção BRCA1 wt 13/24, os desvios padrão estão indicados

em cada barra. Todos os variantes analisados diferem significativamente (p<0,05) dos controles positivos

wt 13/24 e S1613G 13/24, com exceção de S1613G 11/24. * p<0,0001.

Ativ

idad

e re

lativ

a da

β-g

alac

tosi

dase

(%

)

71

As construções BRCA1 11/24 apresentaram atividade de transativação

transcricional. A atividade observada nas construções controle selvagem e S1613G

(controles positivos) no contexto 11/24 é significativamente menor (p<0,05) que a de

suas correspondentes no contexto 13/24 (Fig. 4.3). Diferente dos controles positivos as

atividades dos controles negativos foram equivalentes. De forma geral, observa-se uma

menor atividade de transativação transcricional das construções controle BRCA1 11/24

comparativamente ao contexto 13/24. Assim como no contexto 13/24, os controles

positivos (wt e S1613G) no contexto 11/24 são significativamente diferentes dos

controles negativos (M1775R e Y1863X) (p< 0,0001). Os resultados sugerem que o

conjunto dos controles 11/24 apresentam comportamento semelhante ao seus

correspondentes no contexto 13/24.

A semelhança no comportamento dos controles nos diferentes contextos fica

evidente quando os mesmos são normalizados pela atividade de suas respectivas

construções selvagens (Fig. 4.4). A atividade dos controles negativos, em ambos os

contextos, difere dos controles positivos em cerca de 80% para o variante M1775R e

mais de 90% para o variante Y1853X. De forma análoga a atividade observada do

variante S1613G é semelhante à atividade da construção selvagem em ambos

contextos.

A avaliação da capacidade de transativação transcricional nos contextos 13/24 e

11/24 também foi conduzida no modelo em células humanas (linhagem HEK293T). Nos

ensaios de transativação transcricional em células humanas, cada variante foi testado

em, pelo menos, dois ensaios independentes em quadruplicata.

Os resultados observados em células humanas (sistema repórter baseado na

expressão de luciferase) demonstraram, assim como na avaliação em células de

levedura (sistema repórter baseado na expressão de β-galactosidase), que as

72

construções BRCA1 11/24 também apresentam atividade de transativação

transcricional. A figura 4.5 mostra o perfil de atividade de ativação transcricional das

construções BRCA1 13/24 e 11/24 em células de mamífero expressas em relação à

atividade de BRCA1 wt 13/24.

Assim como no modelo em levedura, a atividade observada nas construções

controle selvagem e S1613G (controles positivos) no contexto 11/24 é

significativamente menor (p<0,0001) que a de suas correspondentes no contexto 13/24

(Fig. 4.5). Diferente dos controles positivos as atividades dos controles negativos foram

equivalentes.

Estes resultados mostram que as atividades de ativação transcricional de BRCA1

11/24, assim como no modelo em levedura, são menores que no contexto 13/24 (Figura

4.5). Os controles positivos (wt e S1613G) no contexto 11/24 são significativamente

diferentes dos controles negativos (M1775R e Y1863X) (p< 0,05), assim como no

contexto 13/24 (p<0,0001). Os resultados sugerem que o conjunto dos controles 11/24

apresentam comportamento semelhante aos seus correspondentes no contexto 13/24,

análogo aos resultados no modelo em levedura.

A semelhança no comportamento dos controles nos diferentes contextos no

modelo em células humanas fica evidente quando os mesmos são normalizados pela

atividade de suas respectivas construções selvagens (Fig. 4.6). A atividade dos

controles negativos M1775R e Y1853X, em ambos os contextos, difere dos controles

positivos em larga extensão (mais do que 95%). De forma análoga, a atividade

observada do variante S1613G é semelhante à atividade da construção selvagem em

ambos os contextos.

73

Figura 4.4: Análise da atividade de transativação transcricional em levedura de controles de BRCA1.

Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de levedura S. cerevisiae EGY48. O gráfico


DBD LexA:BRCA1 selvagem ou variante e um sistema repórter de β-galactosidase. Os desvios padrão

estão indicados em cada barra. (A) Análise da atividade de BRCA1 13/24. Os resultados percentuais são

dados em relação à atividade da construção BRCA1 wt 13/24. (B) Análise da atividade de BRCA1 11/24.

Os resultados percentuais são dados em relação à atividade da construção BRCA1 wt 11/24. (*)

Variantes diferem significativamente (p<0,0001) dos controles positivos wt e S1613G.

A

B

Ativ

idad

e re

lativ

a da

β-g

alac

tosi

dase

(%

) A

tivid

ade

rela

tiva

da β

-gal

acto

sida

se (

%)

74

Figura 4.5: Análise da atividade de transativação transcricional em célula de mamífero de controles de

BRCA1. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de mamífero HEK293T. O gráfico


DBD LexA:BRCA1 selvagem ou variante e um sistema repórter de luciferase. A atividade de BRCA1

13/24 – barras pretas - comparativamente a atividade de BRCA1 11/24 – barras cinzas - está

apresentada em relação à atividade da construção BRCA1 wt 13/24, os desvios padrão estão indicados

em cada barra. Todos os variantes analisados diferem significativamente (p<0,0001) dos controles

positivos wt 13/24 e S1613G 13/24. * p<0,05; **p<0,0001.

Ativ

idad

e re

lativ

a da

luci

fera

se (

%)

75

Figura 4.6: Análise da atividade de transativação transcricional em células humanas de controles de

BRCA1. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células humanas HEK293T. O gráfico


DBD LexA:BRCA1 selvagem ou variante e um sistema repórter de luciferase. Os desvios padrão estão

indicados em cada barra. (A) Análise da atividade de BRCA1 13/24. Os resultados percentuais são dados

em relação à atividade da construção BRCA1 wt 13/24. (B) Análise da atividade de BRCA1 11/24. Os

resultados percentuais são dados em relação à atividade da construção BRCA1 wt 11/24. (*) Variantes

diferem significativamente (p<0,0001) dos controles positivos wt e S1613G.

A

B

Ativ

idad

e re

lativ

a da

luci

fera

se (

%)

Ativ

idad

e re

lativ

a da

luci

fera

se (

%)

76

4.2 ESTRUTURAÇÃO DA AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE VARIANTES MISSENSE DE

BRCA1 NA REGIÃO DE EXTENSÃO DO ENSAIO (RESÍDUOS 1315-1395):

DESENHO DE VARIANTES CONTROLE

A análise da capacidade de ativação transcricional dos controles situados na

porção C-terminal da proteína revelou um perfil de comportamento semelhante entre os

contextos 11/24 e 13/24, como apresentado no item 4.1. A inexistência de registros de

variantes caracterizados na população quanto à susceptibilidade ou não ao câncer na

região de extensão do ensaio limitou a disponibilidade de variantes controle no estudo.

Assim, para determinar a influência dessa região na capacidade de ativação

transcricional de BRCA1 foram gerados variantes sintéticos com perfil putativamente

neutro ou putativamente deletério situados na região limitada pelos resíduos 1315-1395

(Fig. 4.1). A identificação/classificação desses variantes foi conduzida originalmente por

estratégias in silico.

O que orientou a escolha de variantes sintéticos foi, primeiramente, a análise do

alinhamento de ortólogos de BRCA1, mais especificamente, o alinhamento da região

limitada pelos resíduos 1315-1395, observando a conservação evolutiva dos resíduos

de aminoácido ao longo das espécies utilizadas no alinhamento. A análise revelou

resíduos conservados e variáveis evolutivamente, como mostra a figura 4.7. Segundo

Tavtigian (2006), resíduos conservados evolutivamente em uma proteína podem indicar

um aminoácido importante estrutural ou funcionalmente e ao contrário, resíduos

variáveis ao longo de ortólogos podem indicar aminoácidos não definitivos na estrutura

ou função protéica.

O Align GV/GD foi usado como ferramenta complementar para o desenho de

variantes sintéticos na região dos resíduos 1315-1395. Foram analisadas todas as

77

possíveis substituições nos resíduos de aminoácidos na região estudada e suas

classificações preditivas – os dados gerados nesta análise se encontram no Anexo 1. O

Align GV/GD gera classes preditivas quanto ao grau de interferência na função da

proteína, onde a menor classe (C0) indica um variante possivelmente neutro/benigno

(funcional) e a maior classe (C65) indica um variante possivelmente deletério (não

funcional). A análise dos possíveis variantes na região de extensão do ensaio

identificou 541 possíveis variantes missense, dos quais apenas 25 apresentaram

classificação diferente de C0.

Através das análises in silico foi selecionado um grupo de variantes sintéticos

com diferentes perfis para uso no estudo.

Os variantes L1317F, K1322E e S1360G foram selecionados por se encontrarem

em sítios variáveis evolutivamente e por seu caráter preditivo neutro (Quadro 4.1, Fig.

4.7, Fig. 4.8). Por outro lado, os variantes S1370F, D1381Y, Q1388L e T1394I foram

selecionados por se encontrarem em sítios mais conservados evolutivamente e por seu

caráter preditivo deletério (Quadro 4.1, Fig. 4.7, Fig. 4.8).

Quadro 4.1: Variantes sintéticos selecionados para o estudo. Fonte: BIC, IARC.

Variantes Éxon Variação nucleotídica

Classificação Align GV/GD

L1317F 11 G4069C C0

K1322E 11 A4083G C0

S1360G 11 A4197G C0

S1370F 12 C4228T C15

D1381Y 12 G4260T C15

Q1388L 12 A4282T C15

T1394I 12 C4300T C65

78

Fig

ura

4.7

: A

linha

men

to d

e or

tólo

gos

de B

RC

A1,

res

íduo

s 13

15-1

395.

As

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ões

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íduo

s m

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dos.

Aba

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sin

tétic

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o, e

sua

s re

spec

tivas

pos

içõe

s na

seq

üênc

ia d

e am

inoá

cido

s re

pres

enta

da.

79

4.3 ESTRUTURAÇÃO DA AVALIAÇÃO FUNCIONAL DE VARIANTES MISSENSE DE

BRCA1 NA REGIÃO DE EXTENSÃO DO ENSAIO (RESÍDUOS 1315-1395): SELEÇÃO

DE VARIANTES NATURAIS.

Foram identificados dezesseis variantes naturais missense encerrados na região

limitada pelos resíduos 1315-1395 de BRCA1, segundo a análise no banco de dados do

BIC (Quadro 4.2). Todos os variantes naturais identificados foram classificados segundo

a ferramenta Align GV/GD. Foram selecionados para o estudo os variantes E1352K,

C1372Y e Q1395R (Quadro 4.2, Fig 4.8).

O variante E1352K, assim como o variante C1372Y, foi selecionado para o

estudo em função da sua classificação pela ferramenta Align GV/GD como

putativamente neutro (C0). O variante Q1395R foi selecionado por ser o único variante

natural na região com classificação maior que C0 segundo o Align GV/GD (C35).

80

Quadro 4.2: Variantes naturais de BRCA1 identificados na região limitada pelos aminoácidos 1315-1395.

A classificação dos variantes pelo Align GV/GD está descriminada no quadro. * Variantes selecionados

para o estudo. Fonte: BIC; IARC.

Variantes Éxon Variação nucleotídica

Classificação Align GV/GD

P1315H 11 C4063A C0

K1322I 11 A4084T C0

D1337E 11 C4130G C0

D1344G 11 A4150G C0

E1346K 11 G4155A C0

R1347G 11 A4158G C0

R1347K 11 G4159A C0

T1349P 11 A4164C C0

T1349M 11 C4165T C0

E1352K* 11 G4173A C0

M1361L 11 A4200C C0

C1372Y* 12 G4234A C0

T1376R 12 C4246G C0

S1377R 12 C4250A C0

V1378I 12 G4251A C0

Q1395R* 12 A4303G C35

4.4 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE TRANSATIVAÇÃO TRANSCRICIONAL DOS

VARIANTES SELECIONADOS.

Todos os variantes selecionados para o estudo (totalizando dez variantes,

representados na figura 4.8) foram analisados segundo sua capacidade de

transativação transcricional nos modelos em células de levedura e células humanas,

comparativamente a construção selvagem 11/24 e os demais controles no mesmo

contexto.

81

No modelo em células de levedura, a atividade de transativação transcricional

dos variantes foi avaliada comparativamente ao comportamento dos controles S1613G

11/24, M1775R 11/24 e Y1853X 11/24 e representada em função da atividade da

construção selvagem 11/24.

A figura 4.9 mostra a atividade relativa de ativação transcricional dos variantes

sintéticos avaliados no estudo. Os variantes sintéticos preditivos neutros L1317F,

K1322E e S1360G apresentaram comportamento semelhante à construção selvagem e

ao controle positivo S1613G, com atividades relativas superiores a 92%.

Curiosamente, as atividades relativas observadas dos variantes sintéticos

preditivos deletérios S1370F, D1381Y, Q1388L e T1394I foram sempre superiores à

construção selvagem e ao controle positivo S1613G, com resultados que variaram de

116,8 % para T1394I até 143,7% para Q1388L.

A atividade relativa de ativação transcricional dos variantes naturais avaliados no

estudo está representada na figura 4.10. Os variantes naturais (de perfil preditivamente

neutro) E1352K e C1372Y apresentaram atividade relativa semelhante à construção

selvagem e ao controle positivo S1613G, com atividades de 118,7% e 122,4%,

respectivamente. Diferente dos variantes sintéticos preditivamente deletérios, o

variante Q1395R mostrou atividade de ativação transcricional diminuída (72,2%) em

relação à construção selvagem e controle positivo S1613G.

82

Figura 4.8: Representação esquemática de BRCA1aa1315-1863 fusionado a um domínio heterólogo de

ligação ao DNA (DBD) e a localização dos variantes analisados no estudo. No retângulo azul, localização

do domínio coiled-coil (CC). Os retângulos em verde delimitam a região dos domínios BRCTs. As setas

em azul indicam variantes neutros ou putativamente neutros. As setas em vermelho indicam variantes

deletérios ou putativamente deletérios. Os variantes controles estão identificados dentro dos retângulos

em branco.

83

Figura 4.9: Análise da atividade de transativação transcricional em célula de levedura de variantes

sintéticos de BRCA1 no contexto 11/24. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de

levedura S. cerevisiae EGY 48. O gráfico apresentado é representativo de um experimento. As células

foram co-transformadas com a quimera DBD LexA:BRCA1 selvagem ou variante e um sistema repórter

de β-galactosidase. A atividade dos variantes está apresentada em relação à atividade da construção

BRCA1 wt 11/24, os desvios padrão estão indicados em cada barra.

Ativ

idad

e re

lativ

a da

β-g

alac

tosi

dase

(%

)

84

Figura 4.10: Análise da atividade de transativação transcricional em célula de levedura de variantes

naturais de BRCA1 no contexto 11/24. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de

levedura S. cerevisiae EGY 48. O gráfico apresentado é representativo de um experimento. As células

foram co-transformadas com a quimera DBD LexA:BRCA1 selvagem ou variante e um sistema repórter

de β-galactosidase. A atividade dos variantes está apresentada em relação à atividade da construção

BRCA1 wt 11/24, os desvios padrão estão indicados em cada barra.

Ativ

idad

e re

lativ

a da

β-g

alac

tosi

dase

(%

)

85

A análise dos variantes no contexto 11/24 foi conduzida no modelo em células

humanas HEK293T. Como nos ensaios funcionais em levedura, foram utilizadas quatro

construções controle, duas com perfil neutro (a construção selvagem de BRCA1, e o

variante S1613G) e duas com perfil deletério (os variantes M1775R e o Y1853X). Cada

variante foi analisado em, pelo menos, dois ensaios funcionais independentes, tendo

cada variante sido analisado em quadruplicata. A atividade de transativação

transcricional foi avaliada comparativamente com o comportamento dos controles e

representada em função da atividade da construção selvagem.

A atividade de ativação transcricional dos variantes sintéticos avaliados no

estudo está representada na figura 4.11. Os variantes sintéticos preditivos neutros

L1317F, K1322E e S1360G apresentaram um perfil de ativação transcricional

semelh47ante ou superior à construção selvagem e o controle positivo S1613G, com

atividades relativas que variaram de 101,3% para S1360G a 153,0% para K1322E.

Em consonância com os resultados obtidos no modelo em levedura, as

atividades relativas observadas dos variantes sintéticos preditivos deletérios S1370F,

D1381Y, Q1388L e T1394I foram sempre superiores à construção selvagem e ao

controle positivo S1613G, com resultados que variaram de 146,8 % para T1394I até

179,5% para D1381Y.

A atividade relativa de ativação transcricional dos variantes naturais avaliados no

estudo está representada na figura 4.12. Os variantes naturais (de perfil preditivamente

neutro) E1352K e C1372Y apresentaram atividade relativa semelhante à construção

selvagem e ao controle positivo S1613G, com atividades de 94,6% e 108,4%

(respectivamente). Diferente do modelo em levedura, o variante Q1395R mostrou

atividade de ativação transcricional também semelhante à construção selvagem e

controle positivo S1613G (97,1%).

86

Figura 4.11: Análise da atividade de transativação transcricional em célula de mamífero de variantes

sintéticos de BRCA1 no contexto 11/24. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de

levedura HEK293T. O gráfico apresentado é representativo de um experimento. As células foram co-

transfectadas com a quimera DBD GAL4:BRCA1 selvagem ou variante e um sistema repórter de

luciferase. A atividade dos variantes está apresentada em relação à atividade da construção BRCA1 wt

11/24, os desvios padrão estão indicados em cada barra.

Ativ

idad

e re

lativ

a da

luci

fera

se (

%)

87

Figura 4.12: Análise da atividade de transativação transcricional em célula de mamífero de variantes

naturais de BRCA1 no contexto 11/24. Ensaio de transativação transcricional quantitativo em células de

levedura HEK293T. O gráfico apresentado é representativo de um experimento. As células foram co-

transfectadas com a quimera DBD GAL4:BRCA1 selvagem ou variante e um sistema repórter de

luciferase. A atividade dos variantes está apresentada em relação à atividade da construção BRCA1 wt

11/24, os desvios padrão estão indicados em cada barra.

Ativ

idad

e re

lativ

a da

luci

fera

se (

%)

88

4.6 ANÁLISE DE EXPRESSÃO

A análise da expressão das construções pLex9-BRCA1 e pcDNA3-BRCA1, foi

conduzida por imunoblotting; foram usados anticorpos específicos para o

reconhecimento dos domínios de ligação ao DNA das diferentes proteínas quiméricas

(Fig. 4.13 e 4.14).

WT S1613G M1775R Y1853X WT S1613G M1775R Y1853X13/24 13/24 13/24 13/24 11/24 11/24 11/24 11/24

L1317F K1322E E1352K S1360G C1372Y S1370F D1381Y Q1388L T1394I Q1395R

LexA:BRCA113/24

LexA:BRCA111/24

LexA:BRCA111/24





LexA:BRCA113/24

LexA:BRCA111/24

LexA:BRCA111/24

Figura 4.13: Análise da expressão de proteínas de fusão LexA:BRCA1 no modelo de levedura por

immunoblotting. As setas indicam as diferentes proteínas identificadas.

89



GAL4:BRCA113/24

GAL4:BRCA111/24

GAL4:BRCA111/24





GAL4:BRCA113/24

GAL4:BRCA111/24

GAL4:BRCA111/24

Figura 4.14: Análise da expressão de proteínas de fusão GAL4:BRCA1 no modelo de células HEK293T

por immunoblotting. As setas indicam as diferentes proteínas identificadas.

Como esperado, o peso molecular das proteínas quiméricas expressas a partir

das construções de BRCA1 11/24 foram maiores do que os produtos BRCA1 13/24 (Fig.

4.13 e 4.14). As proteínas quiméricas LexA:BRCA1 13/24 apresentaram peso

molecular de ~77kD, enquanto os produtos LexA:BRCA1 11/24 apresentaram peso de

~85kD. Os produtos GAL4:BRCA1 13/24 apresentaram peso molecular de ~70kD e os

produtos GAL4:BRCA1 11/24, ~75kD.

Todos os produtos de expressão das construções de BRCA1 foram detectados

no ensaio de immunoblotting, independentemente do contexto (11/24 ou 13/24) ou do

modelo (levedura ou células humanas).

90

5 DISCUSSÃO

Desde 1994, quando da clonagem posicional de BRCA1 e sua associação ao

câncer hereditário de mama e ovário, houve um grande empenho para que o gene

fosse sequenciado em famílias identificadas como de alto risco para o desenvolvimento

de câncer de mama e ovário (MIKI et al, 1994; LEE et al, 2010). A partir dessa iniciativa

foram identificadas diversas mutações fortemente associadas ao câncer, o que permitiu

um melhor direcionamento das condutas clínicas adotadas nos pacientes portadores.

Ao mesmo tempo, foi também identificado um grande número de variantes de menor

frequência na população. A associação desses variantes ao risco de desenvolvimento

da doença é limitada em função da falta de dados epidemiológicos informativos (LEE et

al, 2010).

Cerca de 70% dos variantes de BRCA1 reportados na população levam à

geração de proteínas truncadas. Esses variantes incluem mutações em regiões

regulatórias, alterações em sítios de splicing, grandes rearranjos, grandes ou pequenas

deleções ou inserções, além de mutações nonsense. No entanto, a caracterização de

mutações missense como neutras ou deletérias é mais complexa, pois o significado

funcional da substituição de um único aminoácido não pode ser avaliado diretamente

(SZABO, WORLEY e MONTEIRO, 2004).

Os variantes do tipo missense de BRCA1, assim como deleções e inserções in-

frame são mutações particularmente problemáticas no que diz respeito ao acesso ao

risco, devido ao efeito dessas mutações em funções protéicas serem incertos (SZABO

WORLEY e MONTEIRO, 2004). Não é surpreendente o fato de que a maioria das

mutações missense reportadas não possuam uma designação clara: deletérias

91

(associadas ao câncer) ou neutras (benignas) - permanecendo assim como variantes

não classificados (VNC) (CARVALHO, COUCH e MONTEIRO, 2007).

De maneira a melhor compreender o comportamento desses variantes e,

também, contornar a escassez de informações genéticas, diversos ensaios foram

desenvolvidos buscando avaliar funcionalmente a proteína e predizer sua relevância

clínica (BILLACK e MONTEIRO, 2004).

A crescente disponibilidade de dados sobre o papel de BRCA1 em diferentes

mecanismos da fisiologia celular contribuiu para que fossem desenvolvidos ensaios

capazes de contemplar diferentes funções da proteína, e associá-las de maneira

sistemática a sua capacidade supressora de tumor e consequentemente à

predisposição ou não ao câncer (BILLACK e MONTEIRO, 2004).

O ensaio funcional para determinação da capacidade de transativação

transcricional de BRCA1 surgiu a partir da observação de que a porção C-terminal da

proteína (mais precisamente os domínios BRCT em tandem, resíduos 1649-1855)

quando fusionada a um domínio heterólogo de ligação ao DNA, era capaz de

transativar um gene repórter (MONTEIRO, AUGUST e HANAFUSA, 1996). Inicialmente,

estes ensaios foram conduzidos com a região limitada aos resíduos de aminoácido

1560-1863 da proteína (região correspondente aos éxons 16 a 24) (MONTEIRO,

AUGUST e HANAFUSA, 1996; HAYES et al, 2000; VALLON-CHRISTERSSON, 2001).

Até esse momento acreditava-se que o ensaio estaria limitado à avaliação de variantes

situados nos domínios BRCT e na sua circunvizinhança mais próxima.

A cobertura do ensaio foi posteriormente estendida para a região limitada pelos

resíduos 1396 a 1863 (região correspondente aos éxons 13 a 24) (PHELAN et al, 2005;

CARVALHO et al, 2007). Estes ensaios demonstraram que variantes localizados em

regiões mais distais aos domínios BRCT também influenciam na sua capacidade de

92

transativação transcricional, mostrando uma excelente correlação entre os dados de

classificação funcional obtidos e dados de estudos de epidemiologia clínica disponíveis

(CARVALHO et al, 2007).

Nosso estudo teve como objetivo a extensão do contexto do ensaio de

transativação transcricional validado, compreendendo a região dos éxons 13 ao 24

(CARVALHO et al, 2007), para a região do final do éxon 11 ao 24 (resíduos 1315-1863).

Os resultados obtidos através dos ensaios com a região C-terminal de BRCA1

neste contexto revelaram dados singulares referentes à atividade de transativação

transcricional mediada pela região em estudo.

Demonstramos que a porção C-terminal de BRCA1 no contexto 11/24 apresenta

a capacidade de transativação transcricional, tanto nos modelos em levedura e células

humanas. Porém, quando comparados com o contexto 13/24, a construção selvagem

11/24 e o variante S1613G 11/24 (controles positivos) apresentaram atividade reduzida

(Figs. 4.3 e. 4.5). Em 2005, Phelan e colaboradores, analisaram comparativamente a

capacidade de transativação transcricional de diversos contextos da porção C-terminal

de BRCA1, demonstrando uma variação entre as atividades dos contextos. Os

contextos utilizados para essa análise se tratavam do contexto BRCA1 16/24 (resíduos

1560-1863, contexto utilizado até então em ensaios funcionais), BRCA1 13/24 (resíduos

1396-1863) e BRCA1 12/24 (resíduos 1366-1863, compreendendo a região dos éxons

12 ao fim do éxon 24) (PHELAN et al, 2005). A capacidade de transativação

transcricional foi determinada nos modelos em levedura e em células humanas; em

ambos foi observado uma maior atividade de transativação transcricional de BRCA1

selvagem no contexto 13/24 em relação a observada no contexto 16/24. O contexto

12/24 mostrou atividade de transativação transcricional inferior que a observada no

contexto 13/24; ainda sim, uma maior atividade do que a observada no contexto 16/24

93

(PHELAN et al, 2005). Esses dados sustentam os resultados observados em nosso

estudo; apesar do contexto 12/24 não ter sido objeto de nossa análise, é sugestivo

considerar que contextos maiores que o contexto 13/24, quando avaliados quanto sua

capacidade de transativação transcricional, apresentam menor atividade.

Tomando como referência construções selvagens em cada um dos contextos

estudados (13/24 e 11/24), as atividades dos controles S1613G (positivo), M1775R e

Y1853X (negativos) apresentaram comportamento equivalente; onde a atividade de

ativação transcricional dos controles positivos foi semelhante a da construção selvagem,

enquanto os controles negativos apresentaram atividades reduzidas Esses resultados

foram observados tanto no modelo em levedura quanto em células humanas (Figs. 4.4

e 4.6). Este mesmo comportamento foi observado em estudos prévios (VALLON-

CHRISTERSSON et al, 2001, PHELAN et al, 2005; CARVALHO et al, 2007).

Uma questão crítica na avaliação funcional de variantes é a disponibilidade de

controles validados para uso no estudo. A localização dos controles avaliados até então

se limitava a região dos domínios BRCT e circunvizinhança próxima, não permitindo

uma clara definição sobre o eventual comportamento de variantes na região de

extensão do estudo (resíduos 1315-1395). No entanto, não há registro na literatura ou

bancos de dados de variantes caracterizados na população quanto à susceptibilidade

ou não ao câncer nessa região. Dessa forma o uso de variantes de caráter preditivo

neutro ou deletério sintéticos, como controles, foi uma estratégia para contornar essa

limitação.

Ferramentas de análise in silico (alinhamento de ortólogos e Align GV/GD) foram

utilizadas para a predição da classificação dos variantes de BRCA1 analisados no

estudo, tanto os denominados sintéticos quanto os naturais.

94

O alinhamento de ortólogos realizado no estudo (Fig. 4.7) atendeu a uma

primeira visualização de regiões conservadas ou não na região de extensão. A

informação determinante para a escolha dos variantes utilizados como controles no

estudo (variantes sintéticos) foi a classificação preditiva realizada pelo programa Align

GV/GD (Anexo 1; Quadro 4.1). Foram selecionados sete variantes sintéticos para a

condução do estudo, três variantes classificados como putativamente neutros (C0), um

variante putativamente deletério (C65) e três intermediários (C15).

Foram identificados todos os variantes naturais missense situados na região de

extensão do estudo (Quadro 4.2). Foram selecionados três variantes naturais, dois

classificados como putativamente neutros (C0) e um putativamente deletério (C35).

No estudo de Carvalho e colaboradores (2007), variantes que possuíam

características clínicas já definidas (associadas e não associadas ao câncer) por

estudos populacionais foram comparados quanto sua capacidade de transativação

transcricional no contexto 13/24; foi, então, determinado limiar de atividade que

pudesse permitir a classificação de variantes como neutros (atividade maior que 50%) e

deletérios (atividade menor que 45%) (CARVALHO et al, 2007).

Nos estudos conduzidos no contexto 11/24 os variantes sintéticos de caráter

putativamente neutro (L1317F, K1322E, S1360G) e os de caráter putativamente

deletério (S1370F, D1381Y, Q1388L, T1394I) apresentaram atividades semelhantes ou

mesmo maiores que os controles positivos (wt e S1613G), tanto no modelo em levedura

quanto no modelo em células humanas (Figs. 4.9, 4.10; 4.11 e 4.12). Os variantes

naturais putativamente neutros E1352K e C1372Y, tanto no modelo em levedura quanto

em células humanas, apresentaram atividades semelhantes aos controles positivos.

Assim como os demais variantes naturais, o variante putativamente deletério Q1395R

mostrou atividade semelhante aos controles positivos no modelo em células humanas,

95

porém, no modelo em levedura, sua atividade foi comparativamente menor (72,2%),

mas este resultado não foi estatisticamente significativo (Fig. 4.10).

A classificação prévia dos variantes do estudo pelas ferramentas in silico,

particularmente pelo Align GV/GD, não corroborou os resultados obtidos no ensaio

funcional, ao menos quando são usados os mesmos critérios (limiares) adotados para

análise no contexto 13/24.

A inexistência de variantes controle na região do estudo não nos permitiu estimar

um limiar (uma referência) de atividade que discriminasse variantes neutros e deletérios.

Assim, torna-se questionável classificar os variantes utilizando os critérios adotados

para o contexto 13/24, como também há margem para o questionamento da

confiabilidade da classificação a partir das ferramentas in silico.

Lee e colaboradores (2010) demonstraram a inconsistência entre a classificação

quanto à atividade de transativação transcricional de alguns variantes e sua

classificação preditiva pelo Align GV/GD (LEE et al, 2010). Tendo em vista essa

premissa, variantes classificados como deletérios por essa ferramenta poderiam ser

neutros.

Alguns variantes analisados no estudo apresentaram atividades

significativamente maiores do que a construção selvagem, como por exemplo, no

ensaio em levedura, os variantes D1381Y (142,2%) e Q1388L (143,7%) e no ensaio em

células humanas, os variantes S1370F (173,4%), D1381Y (179,5%) e Q1388L (168,3%)

(Figs. 4.9 e 4.11). Phelan e colaboradores (2005) reportaram variantes com atividade

de transativação transcricional relativa bastante elevada quando comparada a

construção selvagem. Os variantes H1402Y e H1421Y apresentaram atividades

superiores a 150% em células de levedura 250% em células humanas; já o variante

96

S1521I apresentou atividade em torno de 300% no ensaio em células humanas

(PHELAN et al, 2005).

Curiosamente, os variantes H1402Y e H1421Y residem em sítios do domínio

coiled-coil (resíduos 1391-1424) de BRCA1, e os variantes S1370F, D1381Y e Q1388L

se localizam na circunvizinhança próxima ao domínio. É possível esse fenômeno seja

característico de variantes localizados nessa região que reflitam variações na estrutura

tridimensional do domínio, e, por conseguinte, na capacidade de transativação

transcricional da proteína (Fig. 4.8).

Diferente das análises funcionais no contexto 13/24, onde apenas uma parte do

domínio coiled-coil está presente nas construções (resíduos 1396-1424), nas análises

no contexto 11/24 todo o domínio coiled-coil está presente nas construções (resíduos

1391-1424). É possível que a presença do domínio coiled-coil completo no contexto de

análise modifique funcionalmente o comportamento da proteína no ensaio (Fig. 4.8).

A região de extensão do ensaio, além de englobar o domínio coiled-coil, encerra

parte de uma região previamente denominada como domínio AD1 (resíduos 1293-1560)

(HU et al, 2000). Foi demonstrado que o domínio AD1 promove transativação

transcricional de forma análoga porém independente dos domínios BRCT; quando

juntos no mesmo contexto, os domínios AD1 e BRCT promovem ativação transcricional

de forma sinérgica (HU et al, 2000). É plausível inferir que, de alguma forma, AD1

influencie mais consistentemente o contexto 11/24 do que o contexto 13/24.

Os domínios coiled-coil são conhecidos por sua capacidade de interação com

outras proteínas (LUPAS, 1996). O domínio coiled-coil de BRCA1 não é diferente, e ao

se ligar a um parceiro de interação, poderia influenciar a capacidade de transativação

transcricional da proteína. Dados não publicados de nosso grupo indicam uma provável

interação estrutural entre os domínios BRCTs de BRCA1 e o domínio coiled-coil.

97

Segundo essa hipótese essa interação deveria ser desfeita para que os BRCTs

tivessem acesso à maquinaria transcricional e mediar sua atividade de transativação

transcricional. Logo, a presença de um parceiro de interação na região coiled-coil faria

com que os BRCTs ficassem livres para conduzir a transcrição. Caso confirmada, a

hipótese poderia ser considerada para justificar a atividade transcricional particular dos

variantes localizados na região de extensão do estudo. Dados do grupo indicam PALB2

como provável participante nesse processo.

A interação de BRCA1 com PALB2 é mediada pelos domínios coiled-coil de

ambas as proteínas (ZHANG et al, 2009). BRCA1 interage com a porção N-terminal de

PALB2 (região que encerra seu domínio coiled-coil) através da região limitada pelos

resíduos de aminoácidos 1314-1537; deleções seriadas dessa região de BRCA1

diminuem a capacidade de interação. Uma vez alterada a estrutura do domínio coiled-

coil de BRCA1 a capacidade de interação entre as proteínas é perdida (SY, HUEN e

CHEN, 2009).

Considerando as limitações observadas na análise de variantes na região de

extensão do estudo (resíduos 1315-1395), avaliar a capacidade de interação das

construções no contexto 11/24 com PALB2.

Baseado nessas observações, nosso grupo vem trabalhando numa estratégia

para contornar a limitação observada na análise de variantes presentes na região de

extensão do estudo (1315-1395). É possível que a presença desses variantes possa

interferir na capacidade de BRCA1 interagir com PALB2, essa característica pode ser

utilizada para estruturar uma possível ferramenta de avaliação funcional alternativa.

Sy e colaboradores (2009) mostraram que a interação de BRCA1 com BRCA2 é

mediada por PALB2, sugerindo que essa interação seria determinante para o controle

ideal de processos de recombinação homóloga mediados por BRCA1 e BRCA2, haja

98

visto que mutações deletérias que abolem a interação BRCA1-PALB2 (logo BRCA1-

BRCA2) diminuem significativamente o potencial de recombinação homóloga (SY,

HUEN e CHEN, 2009). Assim, a capacidade de um variante de interferir ou não nessa

interação poderia ser avaliada como uma característica funcional.

O padrão de expressão protéica de todas as construções avaliadas no estudo foi

analisado por immunoblotting (Figs. 4.13 e 4.14). Foram observadas variações no

padrão de expressão entre os produtos analisados. Diferenças nos níveis de expressão

protéica já foram observadas em outros estudos de avaliação de transativação

transcricional de BRCA1 (HAYES et al, 2000; CARVALHO et al, 2007), e essas

diferenças são comumente associadas a variações na estabilidade dessas proteínas

e/ou de seus transcritos (NELSON e HOLT, 2010).

O ensaio de transativação transcricional conduzido no contexto 11/24

demonstrou limitações quanto à capacidade de se classificar variantes que localizados

na região de extensão do estudo (resíduos 1313-1395). É possível que variantes nessa

região não interfiram na capacidade de transativação transcricional dos domínios BRCT,

demonstrando uma limitação desse ensaio funcional, restringindo-o à região

previamente validada, no contexto dos éxons 13 a 24 (resíduos 1396-1863).

O status funcional de um variante sempre será acessado por ensaios baseados

em dados funcionais previamente caracterizados (CARVALHO et al, 2007; MILLOT et al,

no prelo). Esse status nem sempre pode ser acessado de maneira eficiente por um

único estudo funcional, pois é necessário que este variante seja capaz de modificar a

função específica em avaliação, o que não ilustra necessariamente o real impacto

dessa mutação na função global da proteína (MILLOT et al, no prelo).

Dessa maneira, estudos que contribuam para um melhor conhecimento sobre as

funções de BRCA1 favorecem o desenvolvimento de novos ensaios funcionais, ou o

99

aperfeiçoamento dos já existentes, para que possam, eventualmente, contemplar novas

regiões e/ou novas funções, aumentando assim a gama de variantes satisfatoriamente

classificados quanto ao risco de associação ao câncer.

100

6 CONCLUSÕES

• Foram comparadas as atividades de transativação transcricional de construções

selvagens de BRCA1 no contexto 13/24 e 11/24; a atividade de ativação

transcricional observada no contexto 11/24 foi menor do que a observada no

contexto 13/24.

• Foi avaliado o comportamento de controles previamente validados no contexto

13/24 e seus correspondentes no contexto 11/24; a atividade de ativação

transcricional observada nos controles no contexto 13/24 e 11/24 foram

equivalentes.

• Foram identificados dezesseis variantes naturais (descritos na população)

presentes na região limitada pelos resíduos 1315-1395 (região de extensão do

estudo); destes, três foram selecionados para análise neste estudo.

• Foram analisadas todas as possíveis substituições nos resíduos de aminoácido

na região de extensão do estudo e suas classificações preditivas por ferramentas

in silico; entre os variantes analisados foram selecionados sete variantes

sintéticos de perfil preditivo putativamente neutros e deletérios.

• Foram avaliados funcionalmente, nos modelos em levedura e células humanas,

dez variantes selecionados no estudo juntamente com os controles positivos e

negativos; segundo os critérios de classificação definidos para o contexto 13/24,

todos os variantes analisados no contexto 13/24 apresentam um perfil neutro.

• A inexistência de variantes controle na região de extensão do estudo limita, por

ora, a utilização do ensaio de transativação transcricional no contexto 11/24

101

como uma ferramenta confiável para a classificação de variantes situados na

região que encerra os resíduos 1315-1395.

102

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115

8 ANEXO 1

Align GV/GD dos resíduos de aminoácido 1315-1395 de BRCA1 (IARC).

Exon

Nt

position Nt subs

Codon

variation

Aa

position Aa subs GV GD Grade

exon11 3943 c.3943C>A CCT ⇒ ACT 1315 p.P1315T 353.86 0 C0

exon11 3943 c.3943C>G CCT ⇒ GCT 1315 p.P1315A 353.86 0 C0

exon11 3943 c.3943C>T CCT ⇒ TCT 1315 p.P1315S 353.86 0 C0

exon11 3944 c.3944C>A CCT ⇒ CAT 1315 p.P1315H 353.86 0 C0

exon11 3944 c.3944C>G CCT ⇒ CGT 1315 p.P1315R 353.86 0 C0

exon11 3944 c.3944C>T CCT ⇒ CTT 1315 p.P1315L 353.86 0 C0

exon11 3946 c.3946T>C TTC ⇒ CTC 1316 p.F1316L 353.86 0 C0

exon11 3946 c.3946T>G TTC ⇒ GTC 1316 p.F1316V 353.86 0 C0

exon11 3946 c.3946T>A TTC ⇒ ATC 1316 p.F1316I 353.86 0 C0

exon11 3947 c.3947T>C TTC ⇒ TCC 1316 p.F1316S 353.86 0 C0

exon11 3947 c.3947T>G TTC ⇒ TGC 1316 p.F1316C 353.86 0 C0

exon11 3947 c.3947T>A TTC ⇒ TAC 1316 p.F1316Y 353.86 0 C0

exon11 3948 c.3948C>A TTC ⇒ TTA 1316 p.F1316L 353.86 0 C0

exon11 3948 c.3948C>G TTC ⇒ TTG 1316 p.F1316L 353.86 0 C0

exon11 3949 c.3949T>G TTG ⇒ GTG 1317 p.L1317V 353.86 0 C0

exon11 3949 c.3949T>A TTG ⇒ ATG 1317 p.L1317M 353.86 0 C0

exon11 3950 c.3950T>C TTG ⇒ TCG 1317 p.L1317S 353.86 0 C0

exon11 3950 c.3950T>G TTG ⇒ TGG 1317 p.L1317W 353.86 0 C0

exon11 3951 c.3951G>C TTG ⇒ TTC 1317 p.L1317F 353.86 0 C0

exon11 3951 c.3951G>T TTG ⇒ TTT 1317 p.L1317F 353.86 0 C0

exon11 3952 c.3952A>C ATT ⇒ CTT 1318 p.I1318L 353.86 0 C0

exon11 3952 c.3952A>G ATT ⇒ GTT 1318 p.I1318V 353.86 0 C0

exon11 3952 c.3952A>T ATT ⇒ TTT 1318 p.I1318F 353.86 0 C0

exon11 3953 c.3953T>C ATT ⇒ ACT 1318 p.I1318T 353.86 0 C0

exon11 3953 c.3953T>G ATT ⇒ AGT 1318 p.I1318S 353.86 0 C0

exon11 3953 c.3953T>A ATT ⇒ AAT 1318 p.I1318N 353.86 0 C0

exon11 3954 c.3954T>G ATT ⇒ ATG 1318 p.I1318M 353.86 0 C0

exon11 3955 c.3955G>C GGT ⇒ CGT 1319 p.G1319R 353.86 0 C0

exon11 3955 c.3955G>A GGT ⇒ AGT 1319 p.G1319S 353.86 0 C0

exon11 3955 c.3955G>T GGT ⇒ TGT 1319 p.G1319C 353.86 0 C0

exon11 3956 c.3956G>C GGT ⇒ GCT 1319 p.G1319A 353.86 0 C0

exon11 3956 c.3956G>A GGT ⇒ GAT 1319 p.G1319D 353.86 0 C0

exon11 3956 c.3956G>T GGT ⇒ GTT 1319 p.G1319V 353.86 0 C0

exon11 3958 c.3958T>C TCT ⇒ CCT 1320 p.S1320P 353.86 0 C0

exon11 3958 c.3958T>G TCT ⇒ GCT 1320 p.S1320A 353.86 0 C0

exon11 3958 c.3958T>A TCT ⇒ ACT 1320 p.S1320T 353.86 0 C0

exon11 3959 c.3959C>A TCT ⇒ TAT 1320 p.S1320Y 353.86 0 C0

exon11 3959 c.3959C>G TCT ⇒ TGT 1320 p.S1320C 353.86 0 C0

exon11 3959 c.3959C>T TCT ⇒ TTT 1320 p.S1320F 353.86 0 C0

exon11 3961 c.3961T>C TCC ⇒ CCC 1321 p.S1321P 353.86 0 C0

exon11 3961 c.3961T>G TCC ⇒ GCC 1321 p.S1321A 353.86 0 C0

exon11 3961 c.3961T>A TCC ⇒ ACC 1321 p.S1321T 353.86 0 C0

exon11 3962 c.3962C>A TCC ⇒ TAC 1321 p.S1321Y 353.86 0 C0

exon11 3962 c.3962C>G TCC ⇒ TGC 1321 p.S1321C 353.86 0 C0

116

exon11 3962 c.3962C>T TCC ⇒ TTC 1321 p.S1321F 353.86 0 C0

exon11 3964 c.3964A>C AAA ⇒ CAA 1322 p.K1322Q 353.86 0 C0

exon11 3964 c.3964A>G AAA ⇒ GAA 1322 p.K1322E 353.86 0 C0

exon11 3965 c.3965A>C AAA ⇒ ACA 1322 p.K1322T 353.86 0 C0

exon11 3965 c.3965A>G AAA ⇒ AGA 1322 p.K1322R 353.86 0 C0

exon11 3965 c.3965A>T AAA ⇒ ATA 1322 p.K1322I 353.86 0 C0

exon11 3966 c.3966A>C AAA ⇒ AAC 1322 p.K1322N 353.86 0 C0

exon11 3966 c.3966A>T AAA ⇒ AAT 1322 p.K1322N 353.86 0 C0

exon11 3967 c.3967C>A CAA ⇒ AAA 1323 p.Q1323K 353.86 0 C0

exon11 3967 c.3967C>G CAA ⇒ GAA 1323 p.Q1323E 353.86 0 C0

exon11 3968 c.3968A>C CAA ⇒ CCA 1323 p.Q1323P 353.86 0 C0

exon11 3968 c.3968A>G CAA ⇒ CGA 1323 p.Q1323R 353.86 0 C0

exon11 3968 c.3968A>T CAA ⇒ CTA 1323 p.Q1323L 353.86 0 C0

exon11 3969 c.3969A>C CAA ⇒ CAC 1323 p.Q1323H 353.86 0 C0

exon11 3969 c.3969A>T CAA ⇒ CAT 1323 p.Q1323H 353.86 0 C0

exon11 3970 c.3970A>C ATG ⇒ CTG 1324 p.M1324L 353.86 0 C0

exon11 3970 c.3970A>G ATG ⇒ GTG 1324 p.M1324V 353.86 0 C0

exon11 3970 c.3970A>T ATG ⇒ TTG 1324 p.M1324L 353.86 0 C0

exon11 3971 c.3971T>C ATG ⇒ ACG 1324 p.M1324T 353.86 0 C0

exon11 3971 c.3971T>G ATG ⇒ AGG 1324 p.M1324R 353.86 0 C0

exon11 3971 c.3971T>A ATG ⇒ AAG 1324 p.M1324K 353.86 0 C0

exon11 3972 c.3972G>C ATG ⇒ ATC 1324 p.M1324I 353.86 0 C0

exon11 3972 c.3972G>A ATG ⇒ ATA 1324 p.M1324I 353.86 0 C0

exon11 3972 c.3972G>T ATG ⇒ ATT 1324 p.M1324I 353.86 0 C0

exon11 3973 c.3973A>G AGG ⇒ GGG 1325 p.R1325G 353.86 0 C0

exon11 3973 c.3973A>T AGG ⇒ TGG 1325 p.R1325W 353.86 0 C0

exon11 3974 c.3974G>C AGG ⇒ ACG 1325 p.R1325T 353.86 0 C0

exon11 3974 c.3974G>A AGG ⇒ AAG 1325 p.R1325K 353.86 0 C0

exon11 3974 c.3974G>T AGG ⇒ ATG 1325 p.R1325M 353.86 0 C0

exon11 3975 c.3975G>C AGG ⇒ AGC 1325 p.R1325S 353.86 0 C0

exon11 3975 c.3975G>T AGG ⇒ AGT 1325 p.R1325S 353.86 0 C0

exon11 3976 c.3976C>A CAT ⇒ AAT 1326 p.H1326N 353.86 0 C0

exon11 3976 c.3976C>G CAT ⇒ GAT 1326 p.H1326D 353.86 0 C0

exon11 3976 c.3976C>T CAT ⇒ TAT 1326 p.H1326Y 353.86 0 C0

exon11 3977 c.3977A>C CAT ⇒ CCT 1326 p.H1326P 353.86 0 C0

exon11 3977 c.3977A>G CAT ⇒ CGT 1326 p.H1326R 353.86 0 C0

exon11 3977 c.3977A>T CAT ⇒ CTT 1326 p.H1326L 353.86 0 C0

exon11 3978 c.3978T>G CAT ⇒ CAG 1326 p.H1326Q 353.86 0 C0

exon11 3978 c.3978T>A CAT ⇒ CAA 1326 p.H1326Q 353.86 0 C0

exon11 3979 c.3979C>A CAG ⇒ AAG 1327 p.Q1327K 353.86 0 C0

exon11 3979 c.3979C>G CAG ⇒ GAG 1327 p.Q1327E 353.86 0 C0

exon11 3980 c.3980A>C CAG ⇒ CCG 1327 p.Q1327P 353.86 0 C0

exon11 3980 c.3980A>G CAG ⇒ CGG 1327 p.Q1327R 353.86 0 C0

exon11 3980 c.3980A>T CAG ⇒ CTG 1327 p.Q1327L 353.86 0 C0

exon11 3981 c.3981G>C CAG ⇒ CAC 1327 p.Q1327H 353.86 0 C0

exon11 3981 c.3981G>T CAG ⇒ CAT 1327 p.Q1327H 353.86 0 C0


exon11 3982 c.3982T>G TCT ⇒ GCT 1328 p.S1328A 353.86 0 C0


exon11 3983 c.3983C>A TCT ⇒ TAT 1328 p.S1328Y 353.86 0 C0

exon11 3983 c.3983C>G TCT ⇒ TGT 1328 p.S1328C 353.86 0 C0


exon11 3985 c.3985G>C GAA ⇒ CAA 1329 p.E1329Q 353.86 0 C0

117

exon11 3985 c.3985G>A GAA ⇒ AAA 1329 p.E1329K 353.86 0 C0

exon11 3986 c.3986A>C GAA ⇒ GCA 1329 p.E1329A 353.86 0 C0

exon11 3986 c.3986A>G GAA ⇒ GGA 1329 p.E1329G 353.86 0 C0

exon11 3986 c.3986A>T GAA ⇒ GTA 1329 p.E1329V 353.86 0 C0

exon11 3987 c.3987A>C GAA ⇒ GAC 1329 p.E1329D 353.86 0 C0

exon11 3987 c.3987A>T GAA ⇒ GAT 1329 p.E1329D 353.86 0 C0

exon11 3988 c.3988A>C AGC ⇒ CGC 1330 p.S1330R 353.86 0 C0

exon11 3988 c.3988A>G AGC ⇒ GGC 1330 p.S1330G 353.86 0 C0

exon11 3988 c.3988A>T AGC ⇒ TGC 1330 p.S1330C 353.86 0 C0

exon11 3989 c.3989G>C AGC ⇒ ACC 1330 p.S1330T 353.86 0 C0

exon11 3989 c.3989G>A AGC ⇒ AAC 1330 p.S1330N 353.86 0 C0

exon11 3989 c.3989G>T AGC ⇒ ATC 1330 p.S1330I 353.86 0 C0

exon11 3990 c.3990C>A AGC ⇒ AGA 1330 p.S1330R 353.86 0 C0

exon11 3990 c.3990C>G AGC ⇒ AGG 1330 p.S1330R 353.86 0 C0

exon11 3991 c.3991C>A CAG ⇒ AAG 1331 p.Q1331K 353.86 0 C0

exon11 3991 c.3991C>G CAG ⇒ GAG 1331 p.Q1331E 353.86 0 C0

exon11 3992 c.3992A>C CAG ⇒ CCG 1331 p.Q1331P 353.86 0 C0

exon11 3992 c.3992A>G CAG ⇒ CGG 1331 p.Q1331R 353.86 0 C0

exon11 3992 c.3992A>T CAG ⇒ CTG 1331 p.Q1331L 353.86 0 C0

exon11 3993 c.3993G>C CAG ⇒ CAC 1331 p.Q1331H 353.86 0 C0

exon11 3993 c.3993G>T CAG ⇒ CAT 1331 p.Q1331H 353.86 0 C0

exon11 3994 c.3994G>C GGA ⇒ CGA 1332 p.G1332R 353.86 0 C0

exon11 3994 c.3994G>A GGA ⇒ AGA 1332 p.G1332R 353.86 0 C0

exon11 3995 c.3995G>C GGA ⇒ GCA 1332 p.G1332A 353.86 0 C0

exon11 3995 c.3995G>A GGA ⇒ GAA 1332 p.G1332E 353.86 0 C0

exon11 3995 c.3995G>T GGA ⇒ GTA 1332 p.G1332V 353.86 0 C0

exon11 3997 c.3997G>C GTT ⇒ CTT 1333 p.V1333L 353.86 0 C0

exon11 3997 c.3997G>A GTT ⇒ ATT 1333 p.V1333I 353.86 0 C0

exon11 3997 c.3997G>T GTT ⇒ TTT 1333 p.V1333F 353.86 0 C0

exon11 3998 c.3998T>C GTT ⇒ GCT 1333 p.V1333A 353.86 0 C0

exon11 3998 c.3998T>G GTT ⇒ GGT 1333 p.V1333G 353.86 0 C0

exon11 3998 c.3998T>A GTT ⇒ GAT 1333 p.V1333D 353.86 0 C0

exon11 4000 c.4000G>C GGT ⇒ CGT 1334 p.G1334R 353.86 0 C0


exon11 4000 c.4000G>T GGT ⇒ TGT 1334 p.G1334C 353.86 0 C0




exon11 4003 c.4003C>A CTG ⇒ ATG 1335 p.L1335M 243.92 0 C0

exon11 4003 c.4003C>G CTG ⇒ GTG 1335 p.L1335V 243.92 0 C0

exon11 4004 c.4004T>C CTG ⇒ CCG 1335 p.L1335P 243.92 0 C0

exon11 4004 c.4004T>G CTG ⇒ CGG 1335 p.L1335R 243.92 27.62 C0

exon11 4004 c.4004T>A CTG ⇒ CAG 1335 p.L1335Q 243.92 24.28 C0

exon11 4006 c.4006A>C AGT ⇒ CGT 1336 p.S1336R 264.55 0 C0

exon11 4006 c.4006A>G AGT ⇒ GGT 1336 p.S1336G 264.55 0 C0

exon11 4006 c.4006A>T AGT ⇒ TGT 1336 p.S1336C 264.55 0 C0

exon11 4007 c.4007G>C AGT ⇒ ACT 1336 p.S1336T 264.55 0 C0

exon11 4007 c.4007G>A AGT ⇒ AAT 1336 p.S1336N 264.55 0 C0

exon11 4007 c.4007G>T AGT ⇒ ATT 1336 p.S1336I 264.55 0 C0

exon11 4008 c.4008T>G AGT ⇒ AGG 1336 p.S1336R 264.55 0 C0

exon11 4008 c.4008T>A AGT ⇒ AGA 1336 p.S1336R 264.55 0 C0

exon11 4009 c.4009G>C GAC ⇒ CAC 1337 p.D1337H 268.84 0 C0

exon11 4009 c.4009G>A GAC ⇒ AAC 1337 p.D1337N 268.84 0 C0

118

exon11 4009 c.4009G>T GAC ⇒ TAC 1337 p.D1337Y 268.84 25.33 C0

exon11 4010 c.4010A>C GAC ⇒ GCC 1337 p.D1337A 268.84 0 C0

exon11 4010 c.4010A>G GAC ⇒ GGC 1337 p.D1337G 268.84 0 C0

exon11 4010 c.4010A>T GAC ⇒ GTC 1337 p.D1337V 268.84 0 C0

exon11 4011 c.4011C>A GAC ⇒ GAA 1337 p.D1337E 268.84 0 C0

exon11 4011 c.4011C>G GAC ⇒ GAG 1337 p.D1337E 268.84 0 C0

exon11 4012 c.4012A>C AAG ⇒ CAG 1338 p.K1338Q 266.34 0 C0

exon11 4012 c.4012A>G AAG ⇒ GAG 1338 p.K1338E 266.34 0 C0

exon11 4013 c.4013A>C AAG ⇒ ACG 1338 p.K1338T 266.34 0 C0

exon11 4013 c.4013A>G AAG ⇒ AGG 1338 p.K1338R 266.34 5.07 C0

exon11 4013 c.4013A>T AAG ⇒ ATG 1338 p.K1338M 266.34 0 C0

exon11 4014 c.4014G>C AAG ⇒ AAC 1338 p.K1338N 266.34 0 C0

exon11 4014 c.4014G>T AAG ⇒ AAT 1338 p.K1338N 266.34 0 C0





exon11 4016 c.4016A>T GAA ⇒ GTA 1339 p.E1339V 251.14 33.99 C0

exon11 4017 c.4017A>C GAA ⇒ GAC 1339 p.E1339D 251.14 11.33 C0

exon11 4017 c.4017A>T GAA ⇒ GAT 1339 p.E1339D 251.14 11.33 C0




exon11 4019 c.4019T>G TTG ⇒ TGG 1340 p.L1340W 272.33 51.67 C0

exon11 4020 c.4020G>C TTG ⇒ TTC 1340 p.L1340F 272.33 13.17 C0

exon11 4020 c.4020G>T TTG ⇒ TTT 1340 p.L1340F 272.33 13.17 C0

exon11 4021 c.4021G>C GTT ⇒ CTT 1341 p.V1341L 353.86 0 C0

exon11 4021 c.4021G>A GTT ⇒ ATT 1341 p.V1341I 353.86 0 C0

exon11 4021 c.4021G>T GTT ⇒ TTT 1341 p.V1341F 353.86 0 C0

exon11 4022 c.4022T>C GTT ⇒ GCT 1341 p.V1341A 353.86 0 C0

exon11 4022 c.4022T>G GTT ⇒ GGT 1341 p.V1341G 353.86 0 C0

exon11 4022 c.4022T>A GTT ⇒ GAT 1341 p.V1341D 353.86 0 C0

exon11 4024 c.4024T>C TCA ⇒ CCA 1342 p.S1342P 353.86 0 C0

exon11 4024 c.4024T>G TCA ⇒ GCA 1342 p.S1342A 353.86 0 C0

exon11 4024 c.4024T>A TCA ⇒ ACA 1342 p.S1342T 353.86 0 C0

exon11 4025 c.4025C>T TCA ⇒ TTA 1342 p.S1342L 353.86 0 C0

exon11 4027 c.4027G>C GAT ⇒ CAT 1343 p.D1343H 353.86 0 C0

exon11 4027 c.4027G>A GAT ⇒ AAT 1343 p.D1343N 353.86 0 C0

exon11 4027 c.4027G>T GAT ⇒ TAT 1343 p.D1343Y 353.86 0 C0

exon11 4028 c.4028A>C GAT ⇒ GCT 1343 p.D1343A 353.86 0 C0

exon11 4028 c.4028A>G GAT ⇒ GGT 1343 p.D1343G 353.86 0 C0

exon11 4028 c.4028A>T GAT ⇒ GTT 1343 p.D1343V 353.86 0 C0

exon11 4029 c.4029T>G GAT ⇒ GAG 1343 p.D1343E 353.86 0 C0

exon11 4029 c.4029T>A GAT ⇒ GAA 1343 p.D1343E 353.86 0 C0



exon11 4030 c.4030G>T GAT ⇒ TAT 1344 p.D1344Y 353.86 0 C0

exon11 4031 c.4031A>C GAT ⇒ GCT 1344 p.D1344A 353.86 0 C0


exon11 4031 c.4031A>T GAT ⇒ GTT 1344 p.D1344V 353.86 0 C0




119














exon11 4039 c.4039A>G AGA ⇒ GGA 1347 p.R1347G 353.86 0 C0

exon11 4040 c.4040G>C AGA ⇒ ACA 1347 p.R1347T 353.86 0 C0

exon11 4040 c.4040G>A AGA ⇒ AAA 1347 p.R1347K 353.86 0 C0

exon11 4040 c.4040G>T AGA ⇒ ATA 1347 p.R1347I 353.86 0 C0

exon11 4041 c.4041A>C AGA ⇒ AGC 1347 p.R1347S 353.86 0 C0

exon11 4041 c.4041A>T AGA ⇒ AGT 1347 p.R1347S 353.86 0 C0

exon11 4042 c.4042G>C GGA ⇒ CGA 1348 p.G1348R 264.92 5.07 C0

exon11 4042 c.4042G>A GGA ⇒ AGA 1348 p.G1348R 264.92 5.07 C0

exon11 4043 c.4043G>C GGA ⇒ GCA 1348 p.G1348A 264.92 0 C0

exon11 4043 c.4043G>A GGA ⇒ GAA 1348 p.G1348E 264.92 0 C0

exon11 4043 c.4043G>T GGA ⇒ GTA 1348 p.G1348V 264.92 0 C0

exon11 4045 c.4045A>C ACG ⇒ CCG 1349 p.T1349P 241.6 0 C0

exon11 4045 c.4045A>G ACG ⇒ GCG 1349 p.T1349A 241.6 0 C0

exon11 4045 c.4045A>T ACG ⇒ TCG 1349 p.T1349S 241.6 0 C0

exon11 4046 c.4046C>A ACG ⇒ AAG 1349 p.T1349K 241.6 34.45 C0

exon11 4046 c.4046C>G ACG ⇒ AGG 1349 p.T1349R 241.6 39.51 C0

exon11 4046 c.4046C>T ACG ⇒ ATG 1349 p.T1349M 241.6 20.52 C0

exon11 4048 c.4048G>C GGC ⇒ CGC 1350 p.G1350R 253.47 41.54 C0

exon11 4048 c.4048G>A GGC ⇒ AGC 1350 p.G1350S 253.47 0 C0

exon11 4048 c.4048G>T GGC ⇒ TGC 1350 p.G1350C 253.47 0 C0

exon11 4049 c.4049G>C GGC ⇒ GCC 1350 p.G1350A 253.47 0 C0

exon11 4049 c.4049G>A GGC ⇒ GAC 1350 p.G1350D 253.47 0 C0

exon11 4049 c.4049G>T GGC ⇒ GTC 1350 p.G1350V 253.47 2.03 C0




exon11 4052 c.4052T>G TTG ⇒ TGG 1351 p.L1351W 260.21 51.67 C0

exon11 4053 c.4053G>C TTG ⇒ TTC 1351 p.L1351F 260.21 13.17 C0

exon11 4053 c.4053G>T TTG ⇒ TTT 1351 p.L1351F 260.21 13.17 C0

exon11 4054 c.4054G>C GAA ⇒ CAA 1352 p.E1352Q 223.67 17.92 C0

exon11 4054 c.4054G>A GAA ⇒ AAA 1352 p.E1352K 223.67 36.8 C0

exon11 4055 c.4055A>C GAA ⇒ GCA 1352 p.E1352A 223.67 56.64 C0

exon11 4055 c.4055A>G GAA ⇒ GGA 1352 p.E1352G 223.67 42.08 C0








120




exon11 4060 c.4060A>C AAT ⇒ CAT 1354 p.N1354H 233.64 13.17 C0

exon11 4060 c.4060A>G AAT ⇒ GAT 1354 p.N1354D 233.64 0 C0

exon11 4060 c.4060A>T AAT ⇒ TAT 1354 p.N1354Y 233.64 66.27 C0

exon11 4061 c.4061A>C AAT ⇒ ACT 1354 p.N1354T 233.64 0 C0

exon11 4061 c.4061A>G AAT ⇒ AGT 1354 p.N1354S 233.64 0 C0

exon11 4061 c.4061A>T AAT ⇒ ATT 1354 p.N1354I 233.64 61.91 C0

exon11 4062 c.4062T>G AAT ⇒ AAG 1354 p.N1354K 233.64 36.47 C0

exon11 4062 c.4062T>A AAT ⇒ AAA 1354 p.N1354K 233.64 36.47 C0

exon11 4063 c.4063A>C AAT ⇒ CAT 1355 p.N1355H 271.19 0 C0

exon11 4063 c.4063A>G AAT ⇒ GAT 1355 p.N1355D 271.19 0 C0

exon11 4063 c.4063A>T AAT ⇒ TAT 1355 p.N1355Y 271.19 0 C0

exon11 4064 c.4064A>C AAT ⇒ ACT 1355 p.N1355T 271.19 0 C0

exon11 4064 c.4064A>G AAT ⇒ AGT 1355 p.N1355S 271.19 0 C0

exon11 4064 c.4064A>T AAT ⇒ ATT 1355 p.N1355I 271.19 16.18 C0

exon11 4065 c.4065T>G AAT ⇒ AAG 1355 p.N1355K 271.19 0 C0

exon11 4065 c.4065T>A AAT ⇒ AAA 1355 p.N1355K 271.19 0 C0

exon11 4066 c.4066C>A CAA ⇒ AAA 1356 p.Q1356K 268.84 8.11 C0



exon11 4067 c.4067A>G CAA ⇒ CGA 1356 p.Q1356R 268.84 13.17 C0

exon11 4067 c.4067A>T CAA ⇒ CTA 1356 p.Q1356L 268.84 0 C0

exon11 4068 c.4068A>C CAA ⇒ CAC 1356 p.Q1356H 268.84 0 C0

exon11 4068 c.4068A>T CAA ⇒ CAT 1356 p.Q1356H 268.84 0 C0








exon11 4072 c.4072G>C GAG ⇒ CAG 1358 p.E1358Q 222.81 29.2 C0

exon11 4072 c.4072G>A GAG ⇒ AAG 1358 p.E1358K 222.81 39.9 C0

exon11 4073 c.4073A>C GAG ⇒ GCG 1358 p.E1358A 222.81 67.97 C0

exon11 4073 c.4073A>G GAG ⇒ GGG 1358 p.E1358G 222.81 53.41 C0

exon11 4073 c.4073A>T GAG ⇒ GTG 1358 p.E1358V 222.81 103.6 C0

exon11 4074 c.4074G>C GAG ⇒ GAC 1358 p.E1358D 222.81 0 C0

exon11 4074 c.4074G>T GAG ⇒ GAT 1358 p.E1358D 222.81 0 C0

exon11 4075 c.4075C>A CAA ⇒ AAA 1359 p.Q1359K 233.89 34.45 C0



exon11 4076 c.4076A>G CAA ⇒ CGA 1359 p.Q1359R 233.89 39.51 C0

exon11 4076 c.4076A>T CAA ⇒ CTA 1359 p.Q1359L 233.89 56.67 C0

exon11 4077 c.4077A>C CAA ⇒ CAC 1359 p.Q1359H 233.89 11.15 C0

exon11 4077 c.4077A>T CAA ⇒ CAT 1359 p.Q1359H 233.89 11.15 C0

exon11 4078 c.4078A>C AGC ⇒ CGC 1360 p.S1360R 353.86 0 C0

exon11 4078 c.4078A>G AGC ⇒ GGC 1360 p.S1360G 353.86 0 C0

exon11 4078 c.4078A>T AGC ⇒ TGC 1360 p.S1360C 353.86 0 C0

exon11 4079 c.4079G>C AGC ⇒ ACC 1360 p.S1360T 353.86 0 C0


exon11 4079 c.4079G>T AGC ⇒ ATC 1360 p.S1360I 353.86 0 C0

121

exon11 4080 c.4080C>A AGC ⇒ AGA 1360 p.S1360R 353.86 0 C0

exon11 4080 c.4080C>G AGC ⇒ AGG 1360 p.S1360R 353.86 0 C0

exon11 4081 c.4081A>C ATG ⇒ CTG 1361 p.M1361L 353.86 0 C0

exon11 4081 c.4081A>G ATG ⇒ GTG 1361 p.M1361V 353.86 0 C0

exon11 4081 c.4081A>T ATG ⇒ TTG 1361 p.M1361L 353.86 0 C0

exon11 4082 c.4082T>C ATG ⇒ ACG 1361 p.M1361T 353.86 0 C0

exon11 4082 c.4082T>G ATG ⇒ AGG 1361 p.M1361R 353.86 0 C0

exon11 4082 c.4082T>A ATG ⇒ AAG 1361 p.M1361K 353.86 0 C0

exon11 4083 c.4083G>C ATG ⇒ ATC 1361 p.M1361I 353.86 0 C0

exon11 4083 c.4083G>A ATG ⇒ ATA 1361 p.M1361I 353.86 0 C0

exon11 4083 c.4083G>T ATG ⇒ ATT 1361 p.M1361I 353.86 0 C0



exon11 4084 c.4084G>T GAT ⇒ TAT 1362 p.D1362Y 236.84 60.79 C0

exon11 4085 c.4085A>C GAT ⇒ GCT 1362 p.D1362A 236.84 14.57 C0


exon11 4085 c.4085A>T GAT ⇒ GTT 1362 p.D1362V 236.84 50.17 C0





exon11 4087 c.4087T>A TCA ⇒ ACA 1363 p.S1363T 209.54 28.88 C0

exon11 4088 c.4088C>T TCA ⇒ TTA 1363 p.S1363L 209.54 94.04 C0

exon11 4090 c.4090A>C AAC ⇒ CAC 1364 p.N1364H 266.51 0 C0

exon11 4090 c.4090A>G AAC ⇒ GAC 1364 p.N1364D 266.51 0 C0

exon11 4090 c.4090A>T AAC ⇒ TAC 1364 p.N1364Y 266.51 25.33 C0

exon11 4091 c.4091A>C AAC ⇒ ACC 1364 p.N1364T 266.51 0 C0

exon11 4091 c.4091A>G AAC ⇒ AGC 1364 p.N1364S 266.51 0 C0

exon11 4091 c.4091A>T AAC ⇒ ATC 1364 p.N1364I 266.51 0 C0

exon11 4092 c.4092C>A AAC ⇒ AAA 1364 p.N1364K 266.51 8.11 C0

exon11 4092 c.4092C>G AAC ⇒ AAG 1364 p.N1364K 266.51 8.11 C0

exon11 4093 c.4093T>G TTA ⇒ GTA 1365 p.L1365V 248.74 0 C0

exon11 4093 c.4093T>A TTA ⇒ ATA 1365 p.L1365I 248.74 0 C0

exon11 4094 c.4094T>C TTA ⇒ TCA 1365 p.L1365S 248.74 48.55 C0

exon11 4095 c.4095A>C TTA ⇒ TTC 1365 p.L1365F 248.74 0 C0

exon11 4095 c.4095A>T TTA ⇒ TTT 1365 p.L1365F 248.74 0 C0

exon11 4096 c.4096G>C GGT ⇒ CGT 1366 p.G1366R 251.13 39.51 C0


exon11 4096 c.4096G>T GGT ⇒ TGT 1366 p.G1366C 251.13 6.47 C0











exon12 4102 c.4102G>C GCA ⇒ CCA 1368 p.A1368P 353.86 0 C0

exon12 4102 c.4102G>A GCA ⇒ ACA 1368 p.A1368T 353.86 0 C0

exon12 4102 c.4102G>T GCA ⇒ TCA 1368 p.A1368S 353.86 0 C0

exon12 4103 c.4103C>A GCA ⇒ GAA 1368 p.A1368E 353.86 0 C0

122

exon12 4103 c.4103C>G GCA ⇒ GGA 1368 p.A1368G 353.86 0 C0

exon12 4103 c.4103C>T GCA ⇒ GTA 1368 p.A1368V 353.86 0 C0

exon12 4105 c.4105G>C GCA ⇒ CCA 1369 p.A1369P 353.86 0 C0

exon12 4105 c.4105G>A GCA ⇒ ACA 1369 p.A1369T 353.86 0 C0

exon12 4105 c.4105G>T GCA ⇒ TCA 1369 p.A1369S 353.86 0 C0

exon12 4106 c.4106C>A GCA ⇒ GAA 1369 p.A1369E 353.86 0 C0

exon12 4106 c.4106C>G GCA ⇒ GGA 1369 p.A1369G 353.86 0 C0

exon12 4106 c.4106C>T GCA ⇒ GTA 1369 p.A1369V 353.86 0 C0

exon12 4108 c.4108T>C TCT ⇒ CCT 1370 p.S1370P 208.55 19.43 C0

exon12 4108 c.4108T>G TCT ⇒ GCT 1370 p.S1370A 208.55 17.8 C0

exon12 4108 c.4108T>A TCT ⇒ ACT 1370 p.S1370T 208.55 30.95 C0

exon12 4109 c.4109C>G TCT ⇒ TGT 1370 p.S1370C 208.55 64.25 C0

exon12 4109 c.4109C>A TCT ⇒ TAT 1370 p.S1370Y 208.55 116.02 C15

exon12 4109 c.4109C>T TCT ⇒ TTT 1370 p.S1370F 208.55 120.23 C15

exon12 4111 c.4111G>C GGG ⇒ CGG 1371 p.G1371R 231.75 41.54 C0

exon12 4111 c.4111G>A GGG ⇒ AGG 1371 p.G1371R 231.75 41.54 C0

exon12 4111 c.4111G>T GGG ⇒ TGG 1371 p.G1371W 231.75 105.66 C0

exon12 4112 c.4112G>C GGG ⇒ GCG 1371 p.G1371A 231.75 14.57 C0

exon12 4112 c.4112G>A GGG ⇒ GAG 1371 p.G1371E 231.75 0 C0

exon12 4112 c.4112G>T GGG ⇒ GTG 1371 p.G1371V 231.75 50.21 C0

exon12 4114 c.4114T>C TGT ⇒ CGT 1372 p.C1372R 271.19 0 C0

exon12 4114 c.4114T>G TGT ⇒ GGT 1372 p.C1372G 271.19 0 C0

exon12 4114 c.4114T>A TGT ⇒ AGT 1372 p.C1372S 271.19 0 C0

exon12 4115 c.4115G>C TGT ⇒ TCT 1372 p.C1372S 271.19 0 C0

exon12 4115 c.4115G>A TGT ⇒ TAT 1372 p.C1372Y 271.19 0 C0

exon12 4115 c.4115G>T TGT ⇒ TTT 1372 p.C1372F 271.19 4.86 C0

exon12 4116 c.4116T>G TGT ⇒ TGG 1372 p.C1372W 271.19 34.49 C0

exon12 4117 c.4117G>C GAG ⇒ CAG 1373 p.E1373Q 251.13 0 C0

exon12 4117 c.4117G>A GAG ⇒ AAG 1373 p.E1373K 251.13 34.45 C0

exon12 4118 c.4118A>C GAG ⇒ GCG 1373 p.E1373A 251.13 0 C0

exon12 4118 c.4118A>G GAG ⇒ GGG 1373 p.E1373G 251.13 0 C0

exon12 4118 c.4118A>T GAG ⇒ GTG 1373 p.E1373V 251.13 0 C0

exon12 4119 c.4119G>C GAG ⇒ GAC 1373 p.E1373D 251.13 0 C0

exon12 4119 c.4119G>T GAG ⇒ GAT 1373 p.E1373D 251.13 0 C0

exon12 4120 c.4120A>C AGT ⇒ CGT 1374 p.S1374R 208.55 95.56 C0

exon12 4120 c.4120A>G AGT ⇒ GGT 1374 p.S1374G 208.55 3.24 C0

exon12 4120 c.4120A>T AGT ⇒ TGT 1374 p.S1374C 208.55 64.25 C0

exon12 4121 c.4121G>C AGT ⇒ ACT 1374 p.S1374T 208.55 30.95 C0

exon12 4121 c.4121G>A AGT ⇒ AAT 1374 p.S1374N 208.55 45.82 C0

exon12 4121 c.4121G>T AGT ⇒ ATT 1374 p.S1374I 208.55 102.94 C0

exon12 4122 c.4122T>G AGT ⇒ AGG 1374 p.S1374R 208.55 95.56 C0

exon12 4122 c.4122T>A AGT ⇒ AGA 1374 p.S1374R 208.55 95.56 C0








exon12 4126 c.4126A>C ACA ⇒ CCA 1376 p.T1376P 215.24 1.62 C0

exon12 4126 c.4126A>G ACA ⇒ GCA 1376 p.T1376A 215.24 0 C0

exon12 4126 c.4126A>T ACA ⇒ TCA 1376 p.T1376S 215.24 9.71 C0

123

exon12 4127 c.4127C>A ACA ⇒ AAA 1376 p.T1376K 215.24 73.23 C0

exon12 4127 c.4127C>G ACA ⇒ AGA 1376 p.T1376R 215.24 70.85 C0

exon12 4127 c.4127C>T ACA ⇒ ATA 1376 p.T1376I 215.24 69.06 C0

exon12 4129 c.4129A>C AGC ⇒ CGC 1377 p.S1377R 217.19 68.9 C0

exon12 4129 c.4129A>G AGC ⇒ GGC 1377 p.S1377G 217.19 3.24 C0

exon12 4129 c.4129A>T AGC ⇒ TGC 1377 p.S1377C 217.19 59.88 C0

exon12 4130 c.4130G>C AGC ⇒ ACC 1377 p.S1377T 217.19 10.95 C0


exon12 4130 c.4130G>T AGC ⇒ ATC 1377 p.S1377I 217.19 85.42 C0

exon12 4131 c.4131C>A AGC ⇒ AGA 1377 p.S1377R 217.19 68.9 C0

exon12 4131 c.4131C>G AGC ⇒ AGG 1377 p.S1377R 217.19 68.9 C0

exon12 4132 c.4132G>C GTC ⇒ CTC 1378 p.V1378L 138.15 0 C0

exon12 4132 c.4132G>A GTC ⇒ ATC 1378 p.V1378I 138.15 0 C0

exon12 4132 c.4132G>T GTC ⇒ TTC 1378 p.V1378F 138.15 8.11 C0

exon12 4133 c.4133T>C GTC ⇒ GCC 1378 p.V1378A 138.15 0 C0

exon12 4133 c.4133T>G GTC ⇒ GGC 1378 p.V1378G 138.15 29.03 C0

exon12 4133 c.4133T>A GTC ⇒ GAC 1378 p.V1378D 138.15 64.42 C0





exon12 4136 c.4136C>T TCT ⇒ TTT 1379 p.S1379F 123.47 48.95 C0









exon12 4141 c.4141G>C GAC ⇒ CAC 1381 p.D1381H 125.75 42.55 C0

exon12 4141 c.4141G>A GAC ⇒ AAC 1381 p.D1381N 125.75 2.03 C0


exon12 4142 c.4142A>C GAC ⇒ GCC 1381 p.D1381A 125.75 0 C0

exon12 4142 c.4142A>G GAC ⇒ GGC 1381 p.D1381G 125.75 28.37 C0

exon12 4142 c.4142A>T GAC ⇒ GTC 1381 p.D1381V 125.75 47.48 C0

exon12 4143 c.4143C>A GAC ⇒ GAA 1381 p.D1381E 125.75 29.38 C0

exon12 4143 c.4143C>G GAC ⇒ GAG 1381 p.D1381E 125.75 29.38 C0

exon12 4144 c.4144T>C TGC ⇒ CGC 1382 p.C1382R 214.83 44.77 C0

exon12 4144 c.4144T>G TGC ⇒ GGC 1382 p.C1382G 214.83 0 C0

exon12 4144 c.4144T>A TGC ⇒ AGC 1382 p.C1382S 214.83 0 C0

exon12 4145 c.4145G>C TGC ⇒ TCC 1382 p.C1382S 214.83 0 C0

exon12 4145 c.4145G>A TGC ⇒ TAC 1382 p.C1382Y 214.83 51.67 C0

exon12 4145 c.4145G>T TGC ⇒ TTC 1382 p.C1382F 214.83 47.87 C0

exon12 4146 c.4146C>G TGC ⇒ TGG 1382 p.C1382W 214.83 86.14 C0



exon12 4147 c.4147T>A TCA ⇒ ACA 1383 p.S1383T 239.18 0 C0

exon12 4148 c.4148C>T TCA ⇒ TTA 1383 p.S1383L 239.18 22.2 C0

exon12 4150 c.4150G>C GGG ⇒ CGG 1384 p.G1384R 267.27 0 C0

exon12 4150 c.4150G>A GGG ⇒ AGG 1384 p.G1384R 267.27 0 C0

exon12 4150 c.4150G>T GGG ⇒ TGG 1384 p.G1384W 267.27 46.61 C0

124

exon12 4151 c.4151G>C GGG ⇒ GCG 1384 p.G1384A 267.27 0 C0

exon12 4151 c.4151G>A GGG ⇒ GAG 1384 p.G1384E 267.27 0 C0

exon12 4151 c.4151G>T GGG ⇒ GTG 1384 p.G1384V 267.27 0 C0

exon12 4153 c.4153C>A CTA ⇒ ATA 1385 p.L1385I 244.82 0 C0

exon12 4153 c.4153C>G CTA ⇒ GTA 1385 p.L1385V 244.82 0 C0

exon12 4154 c.4154T>C CTA ⇒ CCA 1385 p.L1385P 244.82 0 C0

exon12 4154 c.4154T>G CTA ⇒ CGA 1385 p.L1385R 244.82 24.82 C0

exon12 4154 c.4154T>A CTA ⇒ CAA 1385 p.L1385Q 244.82 21.04 C0

exon12 4156 c.4156T>C TCC ⇒ CCC 1386 p.S1386P 260.17 0 C0

exon12 4156 c.4156T>G TCC ⇒ GCC 1386 p.S1386A 260.17 0 C0

exon12 4156 c.4156T>A TCC ⇒ ACC 1386 p.S1386T 260.17 0 C0

exon12 4157 c.4157C>A TCC ⇒ TAC 1386 p.S1386Y 260.17 4.05 C0

exon12 4157 c.4157C>G TCC ⇒ TGC 1386 p.S1386C 260.17 0 C0

exon12 4157 c.4157C>T TCC ⇒ TTC 1386 p.S1386F 260.17 0 C0







exon12 4162 c.4162C>A CAG ⇒ AAG 1388 p.Q1388K 68.2 53.23 C0

exon12 4162 c.4162C>G CAG ⇒ GAG 1388 p.Q1388E 68.2 29.13 C0

exon12 4163 c.4163A>C CAG ⇒ CCG 1388 p.Q1388P 68.2 39.45 C0

exon12 4163 c.4163A>G CAG ⇒ CGG 1388 p.Q1388R 68.2 42.81 C0

exon12 4163 c.4163A>T CAG ⇒ CTG 1388 p.Q1388L 68.2 96.29 C15

exon12 4164 c.4164G>C CAG ⇒ CAC 1388 p.Q1388H 68.2 24.03 C0

exon12 4164 c.4164G>T CAG ⇒ CAT 1388 p.Q1388H 68.2 24.03 C0

exon12 4165 c.4165A>C AGT ⇒ CGT 1389 p.S1389R 95.09 71.19 C0

exon12 4165 c.4165A>G AGT ⇒ GGT 1389 p.S1389G 95.09 0 C0

exon12 4165 c.4165A>T AGT ⇒ TGT 1389 p.S1389C 95.09 107.48 C15

exon12 4166 c.4166G>C AGT ⇒ ACT 1389 p.S1389T 95.09 9.82 C0

exon12 4166 c.4166G>A AGT ⇒ AAT 1389 p.S1389N 95.09 2.03 C0

exon12 4166 c.4166G>T AGT ⇒ ATT 1389 p.S1389I 95.09 98.49 C15

exon12 4167 c.4167T>G AGT ⇒ AGG 1389 p.S1389R 95.09 71.19 C0

exon12 4167 c.4167T>A AGT ⇒ AGA 1389 p.S1389R 95.09 71.19 C0

exon12 4168 c.4168G>C GAC ⇒ CAC 1390 p.D1390H 44.6 40.79 C0

exon12 4168 c.4168G>A GAC ⇒ AAC 1390 p.D1390N 44.6 11.33 C0


exon12 4169 c.4169A>G GAC ⇒ GGC 1390 p.D1390G 44.6 75.33 C15

exon12 4169 c.4169A>C GAC ⇒ GCC 1390 p.D1390A 44.6 95.68 C25

exon12 4169 c.4169A>T GAC ⇒ GTC 1390 p.D1390V 44.6 121.34 C35

exon12 4170 c.4170C>A GAC ⇒ GAA 1390 p.D1390E 44.6 0 C0

exon12 4170 c.4170C>G GAC ⇒ GAG 1390 p.D1390E 44.6 0 C0

exon12 4171 c.4171A>C ATT ⇒ CTT 1391 p.I1391L 30.92 0 C0

exon12 4171 c.4171A>G ATT ⇒ GTT 1391 p.I1391V 30.92 0 C0

exon12 4171 c.4171A>T ATT ⇒ TTT 1391 p.I1391F 30.92 21.28 C0

exon12 4172 c.4172T>C ATT ⇒ ACT 1391 p.I1391T 30.92 69.84 C25

exon12 4172 c.4172T>G ATT ⇒ AGT 1391 p.I1391S 30.92 123.47 C35

exon12 4172 c.4172T>A ATT ⇒ AAT 1391 p.I1391N 30.92 133.1 C35

exon12 4173 c.4173T>G ATT ⇒ ATG 1391 p.I1391M 30.92 0 C0

exon12 4174 c.4174T>G TTA ⇒ GTA 1392 p.L1392V 14.3 20.52 C0

exon12 4174 c.4174T>A TTA ⇒ ATA 1392 p.L1392I 14.3 0 C0

exon12 4175 c.4175T>C TTA ⇒ TCA 1392 p.L1392S 14.3 134.86 C55

125

exon12 4176 c.4176A>C TTA ⇒ TTC 1392 p.L1392F 14.3 21.28 C0

exon12 4176 c.4176A>T TTA ⇒ TTT 1392 p.L1392F 14.3 21.28 C0

exon12 4177 c.4177A>C ACC ⇒ CCC 1393 p.T1393P 144.58 0 C0

exon12 4177 c.4177A>G ACC ⇒ GCC 1393 p.T1393A 144.58 1.01 C0

exon12 4177 c.4177A>T ACC ⇒ TCC 1393 p.T1393S 144.58 0 C0

exon12 4178 c.4178C>A ACC ⇒ AAC 1393 p.T1393N 144.58 0 C0

exon12 4178 c.4178C>G ACC ⇒ AGC 1393 p.T1393S 144.58 0 C0

exon12 4178 c.4178C>T ACC ⇒ ATC 1393 p.T1393I 144.58 28.68 C0

exon12 4180 c.4180A>C ACT ⇒ CCT 1394 p.T1394P 0 37.56 C35

exon12 4180 c.4180A>G ACT ⇒ GCT 1394 p.T1394A 0 58.02 C55

exon12 4180 c.4180A>T ACT ⇒ TCT 1394 p.T1394S 0 57.75 C55

exon12 4181 c.4181C>A ACT ⇒ AAT 1394 p.T1394N 0 64.77 C55

exon12 4181 c.4181C>G ACT ⇒ AGT 1394 p.T1394S 0 57.75 C55

exon12 4181 c.4181C>T ACT ⇒ ATT 1394 p.T1394I 0 89.28 C65

exon12 4183 c.4183C>G CAG ⇒ GAG 1395 p.Q1395E 0 29.27 C25

exon12 4183 c.4183C>A CAG ⇒ AAG 1395 p.Q1395K 0 53.23 C45

exon12 4184 c.4184A>G CAG ⇒ CGG 1395 p.Q1395R 0 42.81 C35

exon12 4184 c.4184A>C CAG ⇒ CCG 1395 p.Q1395P 0 75.14 C65

exon12 4184 c.4184A>T CAG ⇒ CTG 1395 p.Q1395L 0 112.44 C65

exon12 4185 c.4185G>C CAG ⇒ CAC 1395 p.Q1395H 0 24.08 C15

exon12 4185 c.4185G>T CAG ⇒ CAT 1395 p.Q1395H 0 24.08 C15

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343o Giuliana De Gregoris 11.03.doc)€¦ · Ao laboratório de Farmacologia, na pessoa do prof. Guilherme Suarez-Kurtz, ... Análise da atividade de transativação transcricional