3/11/2015

1

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEMÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR

www.aok.pte.hu

SZÉTVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK:

BIOFIZIKA 2.2015. március 10.Dr. Bugyi BeátaBiofizikai Intézet

� SZEDIMENTÁCIÓ� ELEKTROFORÉZIS

Alkalmazásokhematológia - vér frakcionálása

1000 g, 5- 10 min

vérplazma (55 %)

fehérvérsejtekvérlemezke (< 1%)

vörösvérsejt (45 %)

Példa: teljes vérkép

Alkalmazásokvérszérum elektroforézise

Forrás: http://bestpractice.bmj.com/best-practice/monograph/179/diagnosis/step-by-step.html

Példa: egészséges (A, C) és mielóma multiplex (plazmasejtes mielóma, Kahler betegség, plazmasejt rák)-ben szenvedő páciens (B, D) elektroforetogrammja Biofizikai aspektus

� RÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBENRÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBENRÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBENRÉSZECSKÉK MOZGÁSA ERÕTEREKBEN

� SZEDIMENTÁCIÓ

részecskék mozgása centrifugális erõtérben

� ELEKTROFORÉZIS

részecskék mozgása elektromos erõtérben

Szedimentáció, elektroforézis

3/11/2015

2

Folyamatábra

� vizsgált objektum: részecske szuszpenzió (vér-, vizelet, csontvelõminta, sejt, sejtalkotók, fehérjék, nuklein savak…)

� mûszer: laboratóriumi centrifuga/elektroforéziskészülék

� mért mennyiségek: optikai jel (abszorpció, fényszórás, fluoreszcencia emisszió)

� információ/eredmény: fizikai, kémiai, biológiai jellemzõk (méret, molekulatömeg, alak, sûrûség, izoelektromos pont, nukleotid szekvencia)

� SZEDIMENTÁCIÓSZEDIMENTÁCIÓSZEDIMENTÁCIÓSZEDIMENTÁCIÓ� részecskék mozgása centrifugális erõtérben

� ANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁSANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁSANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁSANALITIKAI ULTRACENTRIFUGÁLÁS• részecskék tömegének és méretének meghatározása

� SZEDIMENTÁCIÓS SEBESSÉGI MÓDSZER� SZEDIMENTÁCIÓS EGYENSÚLYI MÓDSZER

� PREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁSPREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁSPREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁSPREPARATÍV ULTRACENTRIFUGÁLÁS• részecskék elválasztása

� DIFFERENCIÁLCENTRIFUGÁLÁS» méret és molekulatömeg alapján

� GRADIENS CENTRIFUGÁLÁS» sûrûség alapján

Szedimentáció

��ú��ó�á� ���� ��ó��ő

����é��é�

� ���1 �

����

�

���� ��ó � !"� � #"$�

��ú��ó�á� � %

����é��é� � !� � #$�

A TEST „RÉSZECSKE” ÜLEPEDÉSI (SZEDIMENTÁCIÓS) SEBESSÉGE

tömeg

alak

sűrűség

gyorsulásgravitációs

erőtér

�

Részecskék mozgása a Föld gravitációs erõterében

& �'(

��

'(

6*+,

! � ����é��é� - ��ú��ó�á� - ���� ��ó

� 9.81�

12

��: sűrűségközeg < �:sűrűségrészecske

Részecskék mozgása a Föld gravitációs erõterében� Becsüljük meg, hogy a fenti körülmények között mennyi ideig

tart, míg egy fehérje a Föld gravitációs terében 1 cm-tülepszik?

A) néhány nap

B) hónapok

C) több száz évC) több száz évC) több száz évC) több száz év 4 �1

�~107�1~300é�

� ��

� �1 �

��

��

nem a részecskére jellemző, hanem az erőtérre

� HOGYAN?GYORSÍTHATÓ A RÉSZECSKE ÜLEPEDÉSE?TÉRERŐ > DIFFÚZIÓ

� MIÉRT?GRAVITÁCIÓS TÉRERŐ < DIFFÚZIÓ!

�~1092:' , &~10977;<

=,

' � 1.38 ∗ 1092?@

A, ( � 273D,

� 9.81;

=<, 1 � 1092�

3/11/2015

3

Mûszer – laboratóriumi centrifuga Egy kis kitekintés

20 G centrifuga (NASA Ames Research Center, Kalifornia)

��ú��ó�á�

���� ��ó��ő�E����F�á��

��: sűrűségközeg < �:sűrűségrészecske

���� ��ó � !"�GH � #"$�G

H

��ú��ó�á� � %

�E����F�� � !�GH � #$�GH

A RÉSZECSKE ÜLEPEDÉSI (SZEDIMENTÁCIÓS) SEBESSÉGE

�

forgástengely

I � 2π�

körfrekvencia

Részecskék mozgása a centrifuga erõterében helyett KI2

� ���1 �

����

�KI2

tömeg

alak

sűrűséggyorsulás

centrifugális erőtér

forgó mozgás

A részecske sebessége a forgástengelyhez közeledvecsökken.

& �'(

�~

'(

6*+,

! � �E����F�á�� - ��ú��ó�á� - ���� ��ó

Részecskék mozgása a centrifuga erõterében helyett KI2

LMNO �LPNQRMSTUVáOS=�KI

2�

�0.011KW2

K � 10X�

RELATÍV GYORSULÁS

GRAVITÁCIÓS GYORSULÁS: g = 10 m/s2

sebesség változás: 36 km/h másodpercenkéntAz emberek átlagosan 3-5*g-t tolerálnak.

MAGAS FORDULATSZÁMN ~ 100.000 rpm (100x)

��� � Y.Y"". """*g (10.000x!! = 1002)

visszatérve a fehérjére

4 �1

�~10Z1~3óKL

ALACSONY FORDULATSZÁMN ~ 1000 rpm ��� � YY"*g

visszatérve a fehérjére

4 �1

�~10[1~3é�

3/11/2015

4

�\]^_^4á1 �1`]`11é

`Kő4éK

SZEDIMENTÁCIÓS MOBILITÁS (S: Svedberg, Theodore Svedberg)

a ��

KI2�

��1 �b�b�

�

Svedberg:� a részecskék ülepedését jellemző fizikai mennyiség� szedimentációs sebesség egységnyi erőre� [Svedberg] = 1S = 10-13s (SI egység)

Szedimentációs mobilitás

& �'(

�~

'(

6*+,

Szedimentációs mobilitás

részecskeszedimentációs mobilitás

(S, 10-13 s, 20oC)molekulatömeg

(Dalton)

O2 0.12 32

glükóz 0.18 180

inzulin monomer 1.5 6000

ribonukleáz 1.75 13.683

lizozim 2.03 17.200

inzulin 1.84 24.430

szérum albumin 4.3 68.460

kataláz 10.7 250.000

dohánymozaik vírus 175 31.340.000

a � 175a � 175 ∗ 1097?s

KI2 � 10e�

12% � aKI2 � 175 ∗ 1097?s ∗ 10e

�

12�

� Yf.g ∗ Y"9h!

��ij

k�

Analitikai ultracentrifugálásszedimentációs sebességi módszer

forgástengelytől mért távolság (r)

a részecskék koncentrációjának időbeli eloszlása a forgástengely mentén: X�K, 4�

tömeg

Boltzmann állandóhőmérséklet

X�K, 4� →a

&~��1 �

b�b�

'(

diffúziós együttható(mérni kell!)

ülepedésülepedésülepedésülepedésnX

n4� &

n2X

nK2-1

K

nX

nK� aI2oK

nX

nK- 2Xp

időidőidőidő

E��, ��

A tömeg meghatározása diffúziós mérésekkel!

~ centrifugálás sebességekoncentráció (c)

~abszorpció~ fluoreszcencia

N magas

Analitikai ultracentrifugálásszedimentációs egyensúlyi módszer

forgástengelytől mért távolság (r)

a részecskék egyensúlyi koncentráció eloszlása a forgástengely mentén (Boltzmann eloszlás): X�K�

X�K�~��1 �

b�b�I2

'(

tömeg

Boltzmann állandóhőmérséklet

~ centrifugálás sebessége

X�K� � X�`qr��1 �

b�b�I2

'(�K2 � K�

2

2�

koncentráció~abszorpció~ fluoreszcencia

diffúziódiffúziódiffúziódiffúzió ülepedésülepedésülepedésülepedés ülepedési sebesség = 0egyensúly a diffúzió és az ülepedés között

E���

A tömeg meghatározása!

N alacsony

3/11/2015

5

szövet homogenizátum

sejt, sejtmag, citoszkeleton, membrán

mitokondrium, lizozómák, perixóma

mikroszóma (ER, kis vezikulák)

riboszómák, makromolekulák

Preparatív ultracentrifugálásdifferenciálcentrifugálás

SZÖVETALKOTÓK SZÉTVÁLASZTÁSA ÜLEPEDÉSI SAJÁTSÁGAIK ALAPJÁN

� ���Y �

#"#�

�KI2

# � #" → % � "

SŰRŰSÉG GRADIENS

minta

Preparatív ultracentrifugálásgradiens centrifugálás

ALKOTÓK SZÉTVÁLASZTÁSA SŰRŰSÉGÜK ALAPJÁN

� ELEKTROFORÉZISELEKTROFORÉZISELEKTROFORÉZISELEKTROFORÉZIS� részecskék mozgása elektromos erõtérben

� SZABAD ELEKTROFORÉZISSZABAD ELEKTROFORÉZISSZABAD ELEKTROFORÉZISSZABAD ELEKTROFORÉZIS� GÉLELEKTROFORÉZISGÉLELEKTROFORÉZISGÉLELEKTROFORÉZISGÉLELEKTROFORÉZIS

• POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS –––– fehérjék fehérjék fehérjék fehérjék � NATÍV GÉLELEKTROFORÉZIS

» részecskék szétválasztása méret, alak és töltés alapján

� DENATURÁLÓ GÉLELEKTROFORÉZIS» részecskék szétválasztása méret alapján

� IZOELEKTROMOS FÓKUSZÁLÁS» részecskék szétválasztása izoelektromos pont alapján

� 2D ELEKTROFORÉZIS» részecskék szétválasztása méret és izoelektromos pont alapján

• AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS AGARÓZ GÉLELEKTROFORÉZIS –––– nukleinnukleinnukleinnuklein savaksavaksavaksavak» részecskék szétválasztása méret alapján

Elektroforézis Mûszer – elektroforézis készülék

3/11/2015

6

��ú��ó�á� � %

�stF�t!u � vw � x�w

Pozitív Pozitív Pozitív Pozitív elektróda

Negatív Negatív Negatív Negatív elektróda

negatív részecskékanionok

pozitív részecskékkationok

po

ten

ciál

külö

nbsé

g

��ú��ó�á�

�stF�t!u

A RÉSZECSKE ELEKTROFORETIKUS SEBESSÉGE

töltés

Részecskék mozgása elektromos erõtérben

� �y`

�z

alak

elektromos térerősség

! � �stF�t!u - ��ú��ó�á�

Elektroforetikus mobilitás

u:� a részecske elektroforetikus mobilitását jellemzi� a részecske elektroforetikus sebesség egységnyi erőre � [u] = m2*V-1*s-1

�\]^_^4á1 �1`]`11é

4éK`Kő

ELEKTROFORETIKUS MOBILITÁS

F �%

w�x�

Gélelektroforézismátrix, gél

� poliakrilamid (PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis), agarózalapú térhálós polimer� térháló pórusméret� makromolekulák méret szerinti szétválasztása

akrilamidkoncentráció

(%)

lineáris szétválasztási

tartomány(kDa)

agarózkoncentráció

(%)

DNS méret (bázispár)

5 57-212 0.2 5000-40000

7.5 36-94 0.4 5000-30000

10 16-68 0.6 3000-10000

15 12-43 0.8 1000-7000

1 500-5000

2 200-1500

3 100-1000

koncentráció ↑pórusméret ↓

mérebartomány↓

Natív és denaturáló gélelektroforézis

NATÍV DENATURÁLÓ (SDSPAGE)

REDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZETREDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZETREDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZETREDUKÁLÓ ÉS DENATURÁLÓ KÖRNYEZET

� SDS (nátrium dodecil szulfát, anionos detergens)� negatív töltésnegatív töltésnegatív töltésnegatív töltés

� β−MEA (β-merkaptoethanol) � diszulfid hidak felbomlása

� hőkezelés �denaturációdenaturációdenaturációdenaturáció

szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:MÉRET SZERINTMÉRET SZERINTMÉRET SZERINTMÉRET SZERINTfüggetlen a részecske natív töltésétőlfüggetlen a részecske natív alakjától

NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ NEM REDUKÁLÓ ÉS NEM DENATURÁLÓ KÖRNYEZETKÖRNYEZETKÖRNYEZETKÖRNYEZET

� natív állapotú fehérje

szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:MÉRET MÉRET MÉRET MÉRET SZERINTSZERINTSZERINTSZERINTALAK SZERINTALAK SZERINTALAK SZERINTALAK SZERINTTÖLTÉS SZERINTTÖLTÉS SZERINTTÖLTÉS SZERINTTÖLTÉS SZERINT

3/11/2015

7

Izoelektromos fókuszálás

KEZDETBEN: inhomogén eloszlás

pH gradienspH gradienspH gradienspH gradiens

pH gradienspH gradienspH gradienspH gradiens

EREDMÉNY: izoelektromos pont szerinti eloszlás

pozitív töltésűnegatív töltésű

szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:szétválasztás:IZOELEKTROMOS PONT SZERINTIZOELEKTROMOS PONT SZERINTIZOELEKTROMOS PONT SZERINTIZOELEKTROMOS PONT SZERINT

2D elektroforézis

1D: pH gradiensizoelektromos fókuszálás

1D: SDSPAGEméret szerinti szétválasztás

2D elektroforézis

Egér agyából származó minta 2D elektroforézise, forrás: www.bio-rad.com

izoelektromos pont

méret

Gélek színezése

Coomassie bluefehérje

ezüst festésfehérje

fluoreszcensfestés

fehérje

ethidiumbromide

DNS/RNS méret (bázispár)

érzékenység 5 - 25 ng 0.25 - 1 ng 0.25 – 8 ng 0.5 - 5.0 ng

mechanizmus

Coomassie bluekötődése a bázikus

és hidrofób aminosavakhoz

ezüst ionok kötődnek a karboxilsav,

imidazol, szulfhidril, amino csoportokhoz

DNS interkalátor

megjelenésabszorpció

kékabszorpciósötétbarna

fluoreszcenciaemisszió

fluoreszcenciaemisszió

3/11/2015

8

Alkalmazásokkvantitaív és kvalitatív elemzés

kvalitatív elemzés:� MÉRET (MOLEKULATÖMEG, BÁZISPÁR)

MEGHATÁROZÁS� MENNYISÉG MEGHATÁROZÁS� IZOELEKTROMOS PONT MEGHATÁROZÁS

kvantitatív elemzés, szétválasztás:� MÉRET SZERINT (MOLEKULATÖMEG,

BÁZISPÁR)� TÖLTÉS SZERINT� ALAK SZERINT� IZOELEKTROMOS PONT SZERINT

Alkalmazásokkvalitatív elemzés – molekulatömeg meghatározás

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/Protein_Properties/protein_purification.htm

1. ismeret molekulatömegű fehérjék (standard)2. ismeretlen molekulatömegű fehérje

Alkalmazásokvérszérum elektroforézise

protein normál érték

Albumin Albumin Albumin Albumin 55.8 55.8 55.8 55.8 ---- 65% 65% 65% 65%

α1 α1 α1 α1 globulinglobulinglobulinglobulin 2.2 2.2 2.2 2.2 ---- 4.6 % 4.6 % 4.6 % 4.6 %

α2 α2 α2 α2 globulinglobulinglobulinglobulin 8.2 8.2 8.2 8.2 ---- 12.5 % 12.5 % 12.5 % 12.5 %

β(1+2) β(1+2) β(1+2) β(1+2) globulinglobulinglobulinglobulin 7.2 7.2 7.2 7.2 ---- 14.2 % 14.2 % 14.2 % 14.2 %

γ γ γ γ globulinglobulinglobulinglobulin 11.5 11.5 11.5 11.5 ---- 18.8 % 18.8 % 18.8 % 18.8 %

mennyiség

elektroforetikusmobilitás

ELEKTROFORETOGRAMM

www.aok.pte.hu

Szedimentáció, elektroforéziskulcsfogalmak� Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos)Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos)Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos)Részecskék mozgása erõterekben (centrifugális, elektromos)

� Analitikai és Analitikai és Analitikai és Analitikai és preparatívpreparatívpreparatívpreparatív ultracentrifugálási módszerekultracentrifugálási módszerekultracentrifugálási módszerekultracentrifugálási módszerek

� SzabadSzabadSzabadSzabad----, és , és , és , és gélgélgélgél----elektroforéziselektroforéziselektroforéziselektroforézis

� Natív, denaturáló Natív, denaturáló Natív, denaturáló Natív, denaturáló gélelektroforézisgélelektroforézisgélelektroforézisgélelektroforézis, izoelektromos fókuszálás, 2D , izoelektromos fókuszálás, 2D , izoelektromos fókuszálás, 2D , izoelektromos fókuszálás, 2D gélektroforézisgélektroforézisgélektroforézisgélektroforézis

� Minõségi és mennyiségi elemzésMinõségi és mennyiségi elemzésMinõségi és mennyiségi elemzésMinõségi és mennyiségi elemzés

Korábban ismertetett fogalmak:

� hidrosztatika - felhajtóerõ, abszorpció, fluoreszcencia, fényszórás