TEMA 9

MÉTODOS ÓPTICOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

INDICE DE CONTENIDOS

� Introducción� Tipos de microscopía óptica

� Microscopía de campo claro� Microscopía de campo oscuro� Microscopía de contraste de fases� Microscopía de fluorescencia

� Examen microscópico de material fresco� Examen microscópico de material fresco levemente modificado

� Hidróxido de potasio al 10 %� Tinta china (marca Pelikan) o nigrosina� Lugol� Lugol� Anticuerpos

� Microscopía óptica � Tinción de gram� Tinción ácido alcohol resistente

� Microscopía de fluorescencia. Fundamento� Colorantes para la microscopía de fluorescencia y aplicaciones

� Auramina-Rodamina� Naranja de acridina� Blanco de calcofúor� Isotiocianato de fluoresceína

� Inmunofluorescencia� Microscopía electrónica

� Barrido� Transmisión

TIPOS DE MICROSCOPÍA

� MICROSCOPÍA ÓPTICA� MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO

� MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO

� MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES

� MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA� INMUNOFLUORESCENCIA

� MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA� TRANSMISIÓN

� BARRIDO

TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN DE MUESTRAS SIN TEÑIR

� MONTAJE DIRECTO� OBSERVACIÓN DE MOVILIDAD� OBSERVACIÓN DE ESPIROQUETAS� OBSERVACIÓN EN CAMPO OSCURO O

CONTRASTE DE FASES. (En microscopio de campo claro con el condensador bajo y el diafragma semi-cerrado)

� TÉCNICA DE LA GOTA PENDIENTE� MOVILIDAD� OBSERVACIÓN EN CAMPO OSCURO O

CONTRASTE DE FASES. (En microscopio de campo claro con el condensador bajo y el diafragma semi-cerrado)

OBSERVACIÓN DE Treponema pallidum ENCAMPO OSCURO O CONTRASTE DE FASES

PREPARACIONES LEVEMENTE MODIFICADAS

� MONTAJE EN KOH 10%� AZUL DE LACTOFENOL PARAOBSERVACIÓN DE HONGOS

� TINTA CHINA O NIGROSINA� OBSERVACIÓN DE HONGOS

� MONTAJE EN YODO (LUGOL)� OBSERVACIÓN DE PARÁSITOS

� REACCIÓN DE NEUFELD “QUELLUNG” PARA DETECCIÓN DE Streptococcus pneumoniae Y Haemophilus influenzae tipo b capsulado

Observación de hongos

Observación de huevos y parásitos

MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO. OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES TEÑIDAS

•Tinción de Gram

•Gram positivos y Gram negativos

•Morfología

•Agrupaciones•Agrupaciones

Ejemplos de bacterias y levaduras teñidas

Cocos gram positivos en extendidos directos de pus

Ejemplos de bacterias gram positivas y gram negativas

OBSERVACIÓN DE BAAR EN EXTENDIDOS DIRECTOS

Tinción ácido alcohol resistente:

Método en caliente (Ziehl-Nielsen)

Método en frío (Kinyoun)

Micobacterias, Nocardia, algunos Micobacterias, Nocardia, algunos hongos como Cryptococcus neoformans

PRINCIPIO DE LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

Principales fluorocromos utilizados

� Naranja de acridina colorante vital

� Auramina-Rodamina micobacterias

� Blanco de calcoflúor hongos

� Isotiocianato (inmunofluorescencia)

de fluoresceínade fluoresceína

COMPARACIÓN DE LA TÉCNICA FLUORESCENTE CON LA TINCIÓN DE GRAM

COMPARACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE FLUORESCENCIA Y ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENCIA PARA LA DETECCIÓN DE MICOBACTERIAS

Ventajas de la fluorescencia

� Ventajas de la fluorescencia� Mayor sensibilidad

� Microscopio 25x ó 40x

� Especificidad en la tinción de auramina-� Especificidad en la tinción de auramina-rodamina

� Naranja de acridina colorante vital (permite ver si son viables)

PRINCIPIO DE LA INMUNOFLUORESCENCIA

DETECCIÓN DE LEGIONELLA Y BORDETELLAMEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA

DETECCIÓN DE YERSINIA PESTIS

Detección de Yersinia pestis mediante inmunofluorescencia

DETECCIÓN DE VIRUS POR INMUNOFLUORESCENCIA

Detección de CMV mediante inmunofluorescencia directa

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

� MICROSCOPÍA ÓPTICA� HAZ DE LUZ� LENTES� MUESTRAS INTACTAS O

FIJADAS� AMPLIFICACIÓN 1000X

� MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

� HAZ DE ELECTRONES� CAMPOS

MAGNÉTICOS

TRANSMISIÓN BARRIDO

�MUESTRAS FIJADAS E INCLUIDAS EN RESINA�CORTES ULTRAFINOS (TRANSMISIÓN)�AMPLIFICACIÓN 100.000X

�MUESTRAS FIJADAS SOBRE UNA SUPERFICIE�BARRIDO DEL HAZ SOBRE LA SUPERFICIE�AMPLIFICACIÓN 100.000X

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

DETECCIÓN DE PARTÍCULAS DE VIRUS POR MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

USOS MÁS FRECUENTES DE LOS DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPÍA

GRUPO DE MICROORGANISMO

MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO

MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

BACTERIAS + + +/- -

HONGOS + + - -+ + - -

PARÁSITOS + + - -

VIRUS - + - ´+

Características clave Aspecto de la imagen Principales aplicaciones

Microscopia óptica

Campo claro El contraste se logra por absorción. Imagen clara. Las muestras requieren tinción. Para

observar organismos completos.

Contraste de fases El contraste se consigue por

interferencia; las diferencias en

el indice de refracción cambian

la fase de la luz

Imágenes claras y detalladas rodeadas

de un balo.

No requiere tinción; se pueden observar

preparaciones en fresco de

células vivas.

Movilidad

Campo oscuro Solamente la luz dispersada por la

muestra entra en el objetivo,

produciéndose un contraste

elevado.

Imagen brillante contra un fondo

oscuro.

Para observar células vivas o flagelos

demasiado finos para la

microscopia de contraste de

fases; pocos detalles internos.

CARACTERÍSTICAS CLAVE DE LOS DIFERENTES TIPOS DE MICROSCOPÍA UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

elevado. fases; pocos detalles internos.

Movilidad.

Fluorescencia Se basa en la capacidad de emitir luz

visible que tienen los

especimenes fluorescentes

cuando se les ilumina con luz uv.

Especimenes muy coloreados

(luminosos) contra un fondo

oscuro.

Utilizando anticuerpos fluorescentes se

pueden identificar tipos

especificos de microorganismos

en una mezcla compleja.

Microscopía electrónica

Transmisión (MET) Hace pasar un haz de electrones a través

de la preparación, produciendo

un gran aumento útil

Imágenes muy ampliadas con gran

detalle.

Para observar virus y la ultraestructura

celular. No se pueden observar

organismos vivos porque las

preparaciones ban de ser

totalmente desecadas.

Barrido (MEB) Barre los especimenes con un chorro de

electrones, produciendo la salida

de electrones secundarios que

crean una señal, que, a su vez,

genera una imagen por

ordenador.

Imagen tridimensional. Para ver estructuras de organismos

intactos, e incluso estructuras

internas con detalles reales. Las

muestras han de ser desecadas,

por tanto, no se puede aplicar a

organismos vivos