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El descubrimiento de Stolp es un tributo al poder del microscopio y a
la capacidad de observación.
• Entre porta y cubre
• Gota pendiente
• Permite ver mo vivos
• No se puede incrementar el contraste
FRESCO
• Los microbios quedan fijados por el calor
• Pueden deformarse por exceso de flameado
• Los mo están muertos
• Tinción y aceite de inm
FROTIS
Entre porta y cubre Gota pendiente
Portaobjetos
excavado
Marcar el área por debajo del
porta
CULTIVO SÓLIDO CULTIVO LÍQUIDO
Cloque 1 o 2 gotas de
agua
Cloque 1 o 2 asadas de medio de
cultivo con asa estéril
Distribuir en la zona marcadaTomar una muestra de la
colonia y mezclarla con la
gota de agua
Dejar secar al aire Dejar secar al aire.
Repetir los
procedimientos
anteriores dos veces
Pasar rápidamente sobre
la flama del mecheroFijar con dos gotas de
alcohol y dejar secar al aire
• Los colorantes aumentan el contraste.
• Colorantes vitales: pueden añadirse directamente a una
preparación en fresco, (colorean células vivas).
• La mayoría de los colorantes son solamente efectivos
después de que los microorganismos hayan sido fijados,
es decir, cuando se encuentren muertos y adheridos al
portaobjetos.
– Fijación por calor
– Fijación química: ácido ósmico, formaldehído, o glutaraldehído...
Sales• Formadas por iones cargados
Básicos
• El colorante es el ión cargado positivamente
• Los colorantes más utilizados son los de tipo básico, va que la mayor parte de las células microbianas poseen cargas débilmente negativas en su superficie, lo cual facilita su unión a la parte ácida de la célula
• Safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el azul de metileno
Ácidos
• El colorante es el ión cargado negativamente
• Los colorantes ácidos se unen a las partes de las células cargadas positivamente (básicas)
• Eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo
Simples
Se usa un solo colorante de tipo básico
Diferenciales
1) Tinción primaria 2) Tinción de contraste
- Tinción de Gram- Tinción Ziehl-Neelsen
Específicas
Se revelan estructuras específicas
Endosporas, flagelos, cápsulas
Mordientes
Intensifican la tinción
Aumentan la afinidad de la célula
por el colorante
También produce
engrosamiento de ciertas estructuras
Suelen ser sales
metálicas, ácidos o
bases
• ACTIVIDAD:
– Elabora en tu libreta
diagramas de flujo
para cada una de las
técnicas descritas en
la información de
“TINCIONES”
• Nos permite diferenciar a las bacterias en
dos grandes grupos:
GRAM
POSITIVAS
GRAM
NEGATIVAS
GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS
Tienen bajo contenido lipídico en su
pared celular (1-4%)
Tienen alto contenido lipídico en su
pared celular (11-22%)
Poseen una gruesa capa de
peptidoglicano que es capaz de retener
el complejo colorante-mordiente (CV-I).
Durante la decoloración con alcohol
acetona se provoca una deshidratación
de esta gruesa pared y se reduce la
porosidad, atrapando entonces al
complejo en el interior de la célula (azul)
Poseen una delgada capa de
peptidoglicano que no puede impedir la
salida del complejo colorante-mordiente
(CV-I) y es entonces fácilmente teñida
por el colorante secundario o de
contraste (safranina).
Poseen elevada cantidad de
peptidoglicano
Poseen baja cantidad de peptidoglicano
Gram Positivas Gram negativas
Susceptibilidad a la
penicilina
Mas susceptibles Menos susceptibles
Inhibición por colorantes
básicos
Inhibición notable Menor inhibición
Necesidades
nutricionales
Muchas especies
relativamente mas
complejas
Relativamente simples
Resistencia a la
desintegración por
métodos físicos
Mas resistentes Menos resistentes
Especie representativa Staphylococcus aureus Escherichia coli
• Desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich
para poner de manifiesto a los bacilos
causantes de la tuberculosis
• Separa dos grandes grupos de bacterias:
– BAAR positivas y BAAR negativas– Bacilo ácido alcohol resistente
1) Hacer un frotis
2) Secar a aire y fijar por calor
3) Cubrir el portaobjetos con fucsina fenicada
4) Calentar suavemente con mechero hasta emisión de vapores
5) El colorante no debe secarse ni hervir, añadir mas si es necesario
6) Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos
7) Lavar con un chorro suave de agua
8) Decolorar con alcohol-ácido
9) Lavar con agua
10)Cubrir el frotis con azul de metileno y dejarlo actuar durante 1 minuto
11)Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire. Observar con el objetivo de
inmersión
Las bacterias ZN positivas o BAAR positivas se observarán teñidas
intensamente de color rojo
• Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen
ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos
de carbono) que les confiere la propiedad de resistir la decoloración
con alcohol ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por
eso se denominan ácido-alcohol resistentes.
• Las micobacterias como M. tuberculosis, M. marinum y los parásitos
coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus
propiedades de ácido-alcohol resistencia.
• La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para
que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
• Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una
nueva solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante
ya no puede salir de las bacterias.
• Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las
moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las
bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color
rojo y las que no, se ven de color azul.
Se pueden observar estructuras como:
• Pared celular, esporas
• Cápsula
• Flagelos
• Material nuclear
• Inclusiones:
– el poli-β-hidroxibutirato, glucógeno (material de reserva)y gránulos metacromáticos.
• La tinción de Wirtz-Conklin se
utiliza para observar endosporas.
• Bacilius cereus es una bacteria
esporulada.
• Las endosporas mantienen la
tinción primaria verde, mientras
que las otras células se observan
teñidas con la coloración de
contraste rosa.
• Las endosporas son impermeables a los colorantes, por
lo que cuando se hace una tinción, se observan al
microscopio como cuerpos altamente refringentes y sin
teñir.
• Sin embargo, se pueden teñir aplicando calor a la
preparación previamente cubierta con una solución
colorante que en la técnica de Shaeffer y Fulton es el
verde de malaquita.
• El lavado con agua elimina este colorante de las células
vegetativas y la aplicación de un colorante de contraste
permitirá distinguir claramente a las esporas de color
verde.
• La tinción negativa con tinta china
permite observar que esta
bacteria posee cápsula, lo que
facilita su identificación
como Klebsiella pneumoniae,
agente causal de la neumonía.
Vista con el objetivo 100X Vista al microscopio electrónico
• Algunas bacterias presentan una capa externa a la pared
denominada cápsula. Está compuesta de azúcares y proteínas. No
es una estructura vital para la bacteria, de modo que es posible que
bajo determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo
genere cápsula y bajo otras no lo haga. Se ha comprobado que la
presencia de cápsula dificulta de algún modo la fagocitosis de las
bacterias, es decir, las cápsulas constituyen un factor de virulencia
de los microorganismos.
• La tinción de cápsula se denomina tinción negativa porque tiñe el
fondo de la preparación y no el microorganismo. Se parece mas a
una preparación en fresco. En el microscopio se observa el fondo
negro y los microorganismos con cápsulas sin color.
Flagelos
• La tinción de Leifson revela que
este microorganismo posee
flagelos, lo cual contribuye a su
identificación como Spirillum
volutans
• Se aplica mordiente (como ácido
tánico y alumbre de potasio) para
aumentar el grosor de los flagelos
y se tiñen con pararosanilina.
También se puede teñir con
fucsina básica (método de Gray)
• Poder de resolución de un microscopio
– ¿Qué es?
– ¿De que depende?
• Apertura numérica de los objetivos
– ¿Qué objetivo tiene la mayor AN?
– ¿Qué nos indica este valor?
• Aceite de inmersión
– ¿Por qué se utiliza con el microscopio?
– Índice de refracción del aceite y el vidrio
Tipos de microscopios
De luz transmitida
Campo claroCampo oscuro
Luz UV FluorescenciaContraste de
fases
Electrónicos
MET MEB
PARTES DE UN MICROSCOPIO
SISTEMA ÓPTICO
SISTEMA MECÁNICO
SISTEMA LUMÍNICO
• La capacidad de una lente para mostrar por separado y con nitidez dos puntos cercanos en el objeto
Poder de resolución es
• La longitud de onda de la luz empleada y
• De la apertura numérica del objetivo
Depende de• A menor longitud de
onda, mayor resolución
• Se puede usar un filtro azul en los microscopios
Por lo que
PR= λ
2 x AN
El ojo no puede ver claramente objetos mas pequeños de la mitad de la
longitud de onda de la luz empleada.
La luz generalmente empleada en el microscopio tiene una longitud de onda
de 0.5 a 0.6 micras.
La muestras mas pequeñas que podemos esperar ver claramente con el de
inmersión tienen una dimensión de 0.25 a 0.3 micras.
• Es una característica de la lente empleada, brinda una indicación de
la capacidad de colección de luz y poder de resolución (a una
distancia fija) de un objetivo.
• Esta puede variar desde 0.04 para objetivos de bajo aumento hasta
1.3 o 1.4 para objetivos apocromáticos de altos aumentos para uso
con aceite de inmersión.
Apertura numérica
Distancia de trabajo:
distancia entre la
superficie frontal
Aceite de inmersión
N aire 25º C=1.18
• Según lo anterior, el poder de resolución del microscopio de luz
está limitado por la apertura numérica de los lentes objetivos y por
la longitud de onda de la luz visible.
• El límite de resolución, o sea, el objeto mas pequeño que puede
verse nítidamente, se logra cuando usamos la longitud de onda mas
pequeña de la luz visible y un objetivo que tenga la máxima AN
• En la práctica, el límite de resolución es cercano a 0,2 μm.
• En el microscopio electrónico el poder de resolución es de 10
angstrom
