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MAFIA TRANSCRIPTORA BQ
Profesor: Daniela Seelenfreund
Autor: Fabián Pinto
Proteínas Recombinantes I
BIOTECNOLOGIA
DIAZ – LAS HERAS – PINTO – REYES – RIVERA – RIVERA – ROMERO
TRANSCRIPCIONES DE CÁTEDRAS
SEMESTRE PRIMAVERA 2012
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Proteínas Recombinantes I
BIOTECNOLOGIA
Las proteínas recombinantes son
aquellas que podemos obtener a partir de
una especie o línea celular distinta de la
original. Su producción en la actualidad es
“pan de cada dia” ya que sus aplicaciones
ya se han instaurado en el mercado y están
teniendo un gran impacto en la sociedad.
Es así como diversas proteínas de
características relevantes y que no pueden
producirse masivamente en su organismo
nativo, pueden ser instauradas
estratégicamente en otros organismos con
el fin de promover su superproducción. Evidentemente esto tiene una gran serie de implicancias,
limitantes y demases, todo lo cual será explicado más adelante.
Dentro de las proteínas que podríamos describir como de carácter relevante encontramos al
Fibrinogeno, la cual se produce en cantidades superiores a 500 kilos al año, lo cual es equivalente a
una enorme cantidad de donante, con fines terapéuticos. Asimismo hay una ingente cantidad de
dinero asociada a la producción de esta proteina, lo cual revela el impacto que esta misma ha tenido
(50 – 1000 dolares por mg!)
Las proteinas recombinantes pueden ser expresadas en una gran gamma de hospederos, sin
embargo hay que tener en cuenta las características de cada uno de ellos para poder maximizar la
producción de ésta y su eficacia. Muchas de ellas son de carácter complejo y precisan de
interacciones Disulfuros, glicosilaciones, fosforilaciones y otras modificaciones postraduccionales, las
cuales no podrán ser llevadas a cabo en una bacteria por ejemplo, dado que carecen de Aparato de
Golgi.
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La forma de producir una proteina recombinante no será purificándola de su medio natural
sino mas bien aislando el gen de la especie nativa que lo porta e introducirlo en un vector plasmidial
de expresión, no de clonamiento solamente porque deseamos que éste posea las señales
moleculares que permita no solo el clonamiento del gen sino su transcripción. Este vector debe
introducirse en alguna celula hospedera para poder expresarse, y posteriormente permitir la
purificación de la proteina, para luego generar alguna metodología de administración en el paciente.
En la imagen inferior podemos ver todos los tipos de sistemas a utilizar como método de
producción: bacterias, levaduras, hongos filamentosos, plantas transgénicas, animales transgénicas,
líneas celulares de mamíferos, sistemas de insectos y microalgas
¿Cuál ocuparemos? NO EXISTE un sistema ideal para todos, por lo cual tenemos que barajar
los pro y los contra de cada uno. La ingeniería genética comenzó utilizando E Coli como sistema de
producción de proteinas recombinantes. Hay trabajos pioneros del año 1977 donde se reporta la
utilización de E Coli para la producción de proteinas eucariontes como la Insulina. Otros trabajos de
la época sintetizaron un gen para la hormona humana Somatostatina, la cual tambien fue clonada en
E. Coli.
Sin embargo, como sabemos el Sistema de E. Coli tiene sus pros y contras bien marcados:
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En relación a lo anterior, es importante destacar que E. Coli es un Pirogeno, o sea es un
agente productor de fiebre, lo cual ejecuta mediante polisacáridos como el LPS, irrumpiendo en el
sistema inmune del hospedero. Es importante que tambien posee una preferencia codogenica
distinta, lo cual se manifiesta en que la eficiencia del sistema baja. Por otro lado, tambien se pueden
formar agregados proteicos insolubles que podrían ser un problema si la proteina tiene
características importantes. En este caso puede evitarse la formación de éstos fomentando un buen
plegamiento de dichas proteinas, para lo cual seria preciso la co-expresión de Chaperonas junto con
el clonamiento del gen en cuestión. Se logra asi mejorar la solubilidad, disponibilidad de la proteina,
etc. El problema con este sistema es que no
promueve una mejora universal ya que no
para todas las proteinas no resulta, de hecho
para otras puede ser perjudicial.
Por lo tanto podríamos cambiarnos
de sistema heterologo, ya que además E. Coli
no es una buena bacteria secretora. Si
quisiésemos expresar una proteina que se
exporte, no nos seria óptimo. Para esto
podría utilizarse otro sistema procariotico
como Bacillus Subtillis
El hecho de que este considerado como organismo GRAS le da mucha relevancia al momento
de ser aplicada la proteina en aspectos terapéuticos. Dentro de las desventajas es que secreta
proteasas, lo cual obviamente va en desmedro de la producción de la proteína de interés.
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Si ningún sistema de estos nos satisface, nos cambiamos a otro: Sistemas Eucariontes. Estos
son muy importantes para las proteínas esencialmente de carácter terapéutico, ya que es importante
mantener las condiciones tanto bioquímicas como funcionales, idénticas con respecto a la nativa.
Esto se asocia con el concepto de Autenticidad, que es sencillamente poder probar cuan idéntica
puede ser dicha proteína con la de su sistema original. Esto no es nada de fácil. Por ejemplo, EGF
(facto de crecimiento epidermal) se ha producido de forma recombinante y se usa para tratar
cicatrices, quemaduras, etc. Se produce de forma natural en el calostro, el cual contiene muchas
isoformas distintas de la proteína, por lo cual no es trivial elegir cual es la forma nativa de la proteina.
Otro ejemplo es Eritropoyetina, la cual se utiliza bastante hoy en dia para el tratamiento de los
dializados, ya que la EPO se produce en el riñon, por lo cual debe administrársele. Si bien se
encuentra en la orina, nadie va a extraer eritropoyetina del pichi asi que hay que buscar otra manera.
La forma recombinante no es igual a la nativa y recibe el nombre de Epoetina, agente promotor de la
hematopoiesis
Hay distintas EPO humanas. Tienen distintas modificaciones en general. En el recuadro de
arriba se ven algunos ejemplos. Una causa importante de estas modificaciones es que algunas de
ellas promueven un aumento de la vida media de estas proteinas, lo cual es sumamente importante
si las estamos considerando como un fármaco estable que debe pasar por todo el proceso de
generación farmacéutica hasta que llegue al paciente.
El primer sistema eucarionte que se utilizo fue Levaduras. La ingeniería genética en estos
organismos comenzó en el año 1981. Ya se había visto que este sistema sí era capaz de procesar
intrones, aunque uno podría pensar ¿No es posible poner el cDNA y ahorrarse el problema de los
intrones? Ocurre que el rendimiento en la expresión es mucho más eficiente si se retiene al menos
el primer intrón, por lo tanto la proteína será más optima de si yo pusiese solo el cDNA. Por otro
lado, tambien las levaduras pueden llevar a cabo un monton de modificaciones postraduccionales.
Muchos de los vectores que se utilizan son aquellos que se pueden usar tanto en procariontes como
eucariontes porque es mas fácil realizar algunas primeras etapas de la clonación, en procariontes, y
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luego tranfectar el plasmido a una celula eucarionte. Es asi como se utiliza ampliamente los vectores
Shuttle o lanzadera, ya que tienen además elementos propios de E. Coli como marcadores de
selección y un Ori de replicación.
En la imagen lateral se puede
apreciar un vector prototipo “pro-euca”.
Posee dos orígenes de replicación, uno
para cada género. Posee marcadores de
selección tanto para bacterias (Ampr)
como para eucariontes, que en este
caso es algún marcador auxotrófico y
que esta delimitado por un promotor y
un terminador.
La gran mayoría de los vectores que se utilizan en levaduras provienen del plasmidio 2um el
cual no se sabe muy bien la función que tiene en levaduras.
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Si bien pueden las levaduras ejecutar
muchas modificaciones post-traduccionales existe
un problema. El tema radica en que las levaduras
hiperglicosilan, ya que agregan manosas en
excesos, a diferencia de las glicosilaciones
características de mamíferos que son en menor
grado y mas variadas, ya que poseen acido sialico,
pocas manosas y varios otros azucares. ¿Qué se
puede hacer al respecto? Se podría “humanizar la
glicosilacion” de la levadura, de forma de modificar la levadura con el objetivo de que las
glicosilaciones que introduzca sean como las de mamíferos.
Esto se hace acoplando a la via de la glicosilacion de levadura varias enzimas de la via de
glicosilacion de mamíferos. Asi se logra controlar de forma precisa dicha modificación.
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Todos los vectores de expresión de levaduras deben cumplir con las siguientes
características:
Recordemos que la señal de terminación será la poliadenilacion. Hay distintas formas para poder
transformar levaduras. Existen diferentes tipos:
El método del acetato de litio tiene el mismo fundamento que el CaCl2. El procedimiento de
remoción de la pared celular es bastante mas engorroso y no se utiliza mucho.
Al dia de hoy se han producido muchísimas
proteínas utilizando el sistema de Levadura. Algunos
ejemplos están listados en la imagen del costado.
Tambien la primera vacuna recombinante fue producida
en levaduras.
¿Que promotores deberíamos usar para
levadura? Se usan generalmente aquellos de la via
glicolitica dado que esta via es super eficiente en
levadura. Actualmente se utilizan los promotores que
están listados en la imagen inferior, donde por lo general
se activan constitutivamente, pero otras veces se utilizan promotores inducibles. Esto se decide
según el tipo de proteínas que quisiésemos expresar, por ejemplo en el caso de expresar una
proteasa, lógicamente tendrá que estar bajo el control de un promotor inducible ya que de lo
contrario se expresara constitutivamente (peor si el organismo está en su fase de crecimiento) y
dejara la cagá en la pobre levadura . Para evitar esto, se cultiva la celula del hospedero hasta que
alcance el total de la biomasa y de ahí inducir la producción de la proteína recombinante bajo el
promotor inducible, ya que da lo mismo que no pueda seguir creciendo.
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En relación a los vectores utilizable en levadura, hay de distintos tipos, según hemos visto en
otros cursos.
Vectores Episomales (YEP)
Son unos de los mas utilizados y
corresponde al mismo plasmido 2um que
se encuentra naturalmente dentro de la
levadura. A este se le han agregado
elementos como secuencias de origen de
E.Coli, marcadores de selección a
antibioticos, promotores de alta expresión en levaduras como el de Gliceraldehido fosfato
deshidrogenasa, un promotor y un terminador, aparte de un marcador de selección eucarionte, que
como ya fue mencionado, son marcadores de selección auxotrofica. Ademas, el origen eucariotico es
el propio origen de replicación del plasmidio 2um nativo y aveces este lo remplazan por las
secuencias ARS que son aquellas que permiten replicación autónoma en levaduras.
Lo malo es que el plasmidio es inestable, por lo que en el tiempo se ira perdiendo, por lo que
no tendré niveles de proteína adecuados. Pero es posible estabilizarlo agregando secuencias de
centromero de cromosomas de levadura y se ha visto que esto lo hace bastante independiente y
estable.
El vector pAUR123 es un tipo de YEP. Observa que realmente posee los elementos
mencionados.
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Vectores YIP
Se denominan Yeast Integrating Plasmid. Son plasmidios muy estables y, si bien se insertan
en el cromosoma, solo lo hacen poquisimas copias (incluso puede ser una), por lo que el nivel de
expresión proteica es muy bajo. Si se integran varias copias de genes, aumenta su expresión, pero
también su inestabilidad. Es decir, uno debe elegir si desea alto numero de copias por corto tiempo,
o un bajo numero de copias por largo tiempo. Se integran mediante recombinación homologa
mediante secuencias llamadas HIS4 que se repiten en el cromosoma de levadura.
No solo se recombinan mediante
secuencias HIS4 sino también
mediante una Recombinación doble
entre el YIP y el DNA genómico entre
las secuencias AOX.
Vectores CEN
Son básicamente plasmidios formados por secuencias centromericas de levadura .
(Recordar que todos estos vectores caen dentro de la clasificación de Shuttle vectors)
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Vectores YAC
Son vectores diseñados para clonar grandes fragmentos de DNA de un tamaño aproximado
mayor de 1500 kb. No son vectores de expresión por lo que no producirán la proteína. Son
cromosomas artificiales de levadura lineales y contienen todos los elementos propios de un
cromosoma, por ejemplo telomeros y centromeros.
Por mas grande sean las secuencias que estén entre
los centromeros y los telomeros, mas estable será
el cromosoma artificial. Por esto sirven para hacer
genotecas grandes usando trozos de cromosomas
de otros organismos, por lo que es mas fácil que
estar clonando por ejemplo en fago Lambda que
tiene como tope 40kb, ya que aca se pueden meter
hasta megabases y por mas que meta, mas estable
será el YAC. Por lo tanto se puede subclonar un
genoma de otro organismo en estos YAC y es
mucho mas manejable.
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