4. Tinción

ATLAS de HISTOLOGÍA VEGETAL y ANIMAL

Técnicas histológicas

TINCIÓN

Manuel Megías, Pilar Molist, Manuel A. Pombal

Departamento de Biología Funcional yCiencias de la Salud.

Facultadde Biología. Universidadde Vigo.

(Versión: Enero 2016)

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Introducción .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

El proceso histológico .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Tinción .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Ttinciones generale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Histoquímica .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

Lectinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Inmunocitoquímica .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

Hibridación in siut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

ÍNDICE

En estas páginas dedicadas a las técnicashistológicas vamos a describir los procesosexperimentales necesarios para obtener seccionesteñidas y listas para observar al microscopiopartiendo de tejidos vivos extraídos de un animalo de una planta. Por tanto, dedicaremos espaciosa la obtención, fijación, inclusión, corte y tinciónde los tejidos. Todos estos apartados seguirán elmismo esquema que los capítulos dedicados a lostejidos o a la célula, partir de un esquema básicoy ampliar la información sucesivamente enpáginas adicionales. No dedicaremos demasiadoespacio a los instrumentos, desde el punto devista operativo, pero sí a la conveniencia de suuso y a sus capacidades.

La mayoría de las técnicas histológicas vanencaminadas a preparar el tejido para suobservación con el microscopio, bien sea ésteóptico o electrónico. Ello es debido a que laestructura de los tejidos está basada en laorganización de los tipos de células que loscomponen y, salvo contadas ocasiones, las

características morfológicas de las células sólo sepueden observar con estos aparatos.

Existen procedimientos rápidos y simples parala observación de tejidos y células vivas quereciben el nombre de vitales. Por ejemplo, laobservación del flujo sanguíneo en capilares delsistema circulatorio. Otra forma de observarcélulas o tejidos vivos es mediante las técnicashistológicas supravitales, en los que las células ylos tejidos se mantienen o se hacen crecer fueradel organismo, como es el caso de los cultivos decélulas y de tejidos.

Las técnicas histológicas postvitales sonaquellas en las que las células mueren durante elproceso, pero las características morfológicas ymoleculares que poseían en estado vivo seconservan mejor o peor dependiendo del tipo detécnica. Estas páginas estarán dedicadas a estetipo de técnicas, puesto que son las máscomúnmente usadas en los laboratorios dehistología.

Introducción

Atlas de histología vegetal y animal. Universidad de Vigo.

Técnicas histológicas. Introducción. 4

Denominamos proceso histológico a una seriede métodos y técnicas utilizados para poderestudiar las características morfológicas ymoleculares de los tejidos. Hay diversos caminospara estudiar los tejidos, es decir, series detécnicas que se utilizarán dependiendo de quécaracterística deseemos observar. En el siguienteesquema se muestran los métodos y técnicascomúnmente empleados para el procesamientode los tejidos para su observación con losmicroscopios óptico o electrónico. Sin embargo,hay que tener en cuenta que existen muchasvariantes a estos "caminos" y su eleccióndependerá del resultado final que queramosobtener.

El proceso histológico comienza con laobtención del tejido objeto de estudio. En el casode los tejidos vegetales directamente se tomanmuestras de los distintos órganos que componenel cuerpo de la planta, mientras que para lostejidos animales podemos optar por dos opciones:coger una porción del tejido u órgano yprocesarla o procesar primero el animal completoy luego extraer la muestra que nos interese. Encualquier caso las muestras son habitualmentefijadas con unos soluciones líquidas denominadasfijadores, las cuales se usan para mantener lasestructuras celulares y moleculares inalterablesdurante el procesamiento posterior y con unaorganización lo más parecida posible a como se


El proceso histológico

Esquema del proceso histológico.


encontraban en la muestra viva. Tambiénpodemos fijar las moléculas de los tejidos porcongelación rápida. Fijar un tejido es como haceruna fotografía de dicho tejido, su estructura semantendrá hasta su observación. La fijación porcongelación se emplea cuando la fijación químicao los procesos histológicos posteriores alteran lascaracterísticas de la muestra que queremosestudiar, por ejemplo una molécula sensible adichos tratamientos.

Normalmente, tras la fijación se procede aincluir el tejido para posteriormente obtenersecciones. Cuanto más delgada queramos que seanuestra sección más tenemos que endurecernuestra muestra. Esto se consigue embebiendo eltejido con sustancias líquidas que posteriormentepolimerizarán (resinas) o se volverán consistentes(ceras). También se puede conseguir el mismoefecto mediante congelación rápida. Cortes másgruesos de 40 Cm se pueden cortar sin necesidadde inclusión usando el vibratomo. Los medios deinclusión no son normalmente hidrosolubles porlo que tendremos que sustituir el agua de lostejidos por solventes orgánicos liposolubles yposteriormente sustituirlos por el medio deinclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede acortar los tejidos, es decir, obtener secciones.Existen diferentes aparatos de corte que permitenconseguir secciones ultrafinas (del orden denanometros), semifinas (de 0.5 a 2 Cm), finas(entre unas 3 y 10 Cm) y gruesos (mayores a 10Cm). Habitualmente las secciones se procesan

para poder observarlas y estudiarlas, aunqueciertos tipos de microscopía, por ejemplo concontraste de fase, permiten observar secciones detejidos sin procesar. Normalmente las seccionesse tiñen con colorantes que son hidrosolubles, porlo que hay que eliminar el medio de inclusiónpara que los colorantes pueden unirse al tejido.Las secciones ultrafinas (observadas con elmicroscopio electrónico) o semifinas (observadascon el microscopio óptico) se pueden contrastarcon metales pesados o con colorantes,respectivamente, sin necesidad de eliminar elmedio de inclusión.

Los tejidos procesados se observan con losmicroscopios. Existen dos tipos básicos demicroscopios: óptico y electrónico. Los primerosofrecen una gran versatilidad en cuanto a modosde observar los tejidos: campo claro,fluorescencia, contraste de fase, polarización ocontraste de interferencia diferencial, mientrasque los segundos permiten un gran poder deresolución, pudiéndose observar característicasultraestructurales.

Como dijimos al comienzo existen múltiplesvariaciones sobre este esquema general deprocesamiento histológico. Por ejemplo, sepueden observar tejidos con el microscopioelectrónico de barrido sin necesidad de incluir nicortar, pero sólo observaremos superficies. En lassiguientes páginas veremos con cierto detallealgunas de las técnicas más empleadas para laobservación de los tejidos.



Los tejidos animales son en su gran mayoríaincoloros, excepto aquellos que poseen algún tipode pigmento como hemoglobina de la sangre o lamelanina de la epidermis. En las plantas, sinembargo, existe una mayor variedad depigmentos naturales que permiten su observacióndirecta con el microscopio óptico, a lo quetambién ayuda la presencia de las paredescelulares, las cuales facilitan la delimitacióncelular y la discriminación entre diferentestejidos. Cuando se inventaron los primerosmicroscopios hubo que descubrir cómo teñir lostejidos para poder desentrañar sus característicasmorfológicas. Se observó que algunos pigmentoscomo el carmín o la eosina, disueltos en agua, seunían a determinados componentes de las células.La expansión de la industria textil en el siglo XIXy su necesidad de colorear las telas provocó unrápido desarrollo de los tintes o pigmentos.Muchas de estas sustancias fueron usadas comocolorantes en la histología de los animales y delas plantas desde mediados del siglo XIX hasta laactualidad, alcanzándose un enorme desarrollo yperfeccionamiento de nuevas técnicas ymoléculas sintéticas que se usan según lasnecesidades del investigador. Con la llegada de labiología molecular se han puesto en marcha otrastécnicas mucho más sofisticadas para observarelementos celulares, entre las que se puedendestacar aquellas que usan anticuerpos,inmunocitoquímicas, las que usan sondas deADN o ARN, hibridaciones "in situ", o mássofisticadas aún como las que mediante el diseñode animales transgénicos permiten identificar yobservar a las células que expresan undeterminado gen, incluso en el organismos vivo,gracias a la fluorescencia de la proteína verdefluorescente (GFP).

No vamos a describir con detalle las técnicasmás complejas, al menos no en estas páginasbásicas, sino las más comunes, las que se suelenemplear en un laboratorio para el estudio generalde los tejidos. Dividiremos el conjunto detécnicas histológicas en cuatro categorías.

a) Tinciones generales. Aquellas que usansustancias coloreadas que se unen a componentestisulares por afinidad química.

b) Histoquímica. Son aquellas técnicas detinción que implican la modificación química dealgunas moléculas tisulares para posteriormenteponerlas de manifiesto con colorantes. En esteapartado incluiremos también a los métodos detinción basados en la capacidad catalítica dealgunas enzimas presentes en los tejidos quequeremos estudiar.

c) Lectinas. Las lectinas son dominios deproteínas, como las selectinas, que son capacesde reconocer glúcidos que forman parte depolisacáridos. Tienen una gran especificidad y seusan para determinar el tipo de glúcido queaparece en las glucoproteínas de las células o dela matriz extracelular de los diferentes tejidos.

d) Inmunocitoquímica. Son técnicashistológicas muy potentes basadas en la altaespecificidad de unión de los anticuerpos a losantígenos contra los que se produjeron. Estosantígenos pueden ser cualquier molécula tisularque, purificada en inyectada en un animal, seacapaz de desarrollar una respuesta inmune. Estosanticuerpos añadidos a una sección de tejidoreconocerán y se unirán específicamente a dichamolécula.

e) Hibridación. Son técnicas basadas en launión complementaria de las bases de ácidosnucleicos (adenina con la timina, o con el uracilo,y de la guanina con al citosina). Esto hace quedos cadenas complementarias de ácidos nucleicosse unan entre sí de forma muy específica, esdecir, hibriden. Siguiendo este principio sepueden sintetizar sondas marcadas, cadenas deADN o ARN con una secuencia de basesdeterminada que llevan una molécula unida parapoder detectarlas. La secuencia de bases de lasonda es complementaria a otra que está presenteen la célula, normalmente en forma de ARNm.Con ello podemos observar qué células expresanun determinado gen.


Tinción

Técnicas histológicas. Tinción. 7

La mayoría de los tejidos, sobre todo los de losanimales, son incoloros y por ello necesitamosteñirlos para observar sus característicasmorfológicas. Las tinciones generales estánbasadas en el uso de colorantes, sustanciasmediante las cuales se consigue colorear a lostejidos. Los colorantes son normalmentehidrosolubles y se caracterizan por unirse aciertas moléculas presentes en los tejidos graciasa afinidades electro-químicas. Se utilizannormalmente para teñir a las células ycomponentes tisulares que van a ser observadoscon el microscopio óptico y por ello se realizanhabitualmente sobre secciones de tejido, siendolas más utilizadas las secciones obtenidas a partirde inclusiones en parafina u obtenidas en elcriostato. Los colorantes son los elementosprincipales de las tinciones generales. Sonmoléculas que poseen tres componentesimportantes: un esqueleto incoloro, quenormalmente es un anillo aromático de benceno,al cual se le unen dos tipos de radicales: uno queaporta el color, denominado cromóforo, y otroque posibilita la unión a elementos del tejidodenominado auxocromo. Al conjunto de estostres elementos unidos en una molécula sedenomina cromógeno.

Según la naturaleza química del cromóforo hayvarios tipos de colorantes: nitrosos, ozoicos,derivados de la antroquinona, derivados de laacridina, derivados de iminas quinónicas,derivados de diferrilmetano y triferrilmetano,derivados del xanteno y derivados de lastalocianinas.

Según la naturaleza química del radicalauxocromo los colorantes se clasifican en:

Básicos: son sales en las que la base aporta elcolor, mientras que la parte ácida es incolora.Tienen apetencia por sustancias ácidas del tejidocomo el ADN o ciertos componentes de la matrizextracelular como los glicosaminoglicanos. Así,ponen de manifiesto el núcleo y el ARN, sobretodo el ARNr presente en los ribosomas por sermuy abundante, así como ciertas matricesextracelulares ricas en componentes ácidos.

Ejemplos de colorantes básicos son la tionina,safranina, azul de toluidina, el azul de metileno ola hematoxilina.

Ácidos: son sales con el anión coloreado y labase incolora. Tienen apetencia por sustanciasbásicas, sobre todo estructuras proteicaslocalizadas en el citoplasma celular y también porel colágeno de la matriz extracelular. Ejemplos decolorantes ácidos son la fucsina ácida, verderápido, naranja G o la eosina.

Neutros: poseen una porción ácida y otrabásica, ambas con capacidad para aportar color.Por tanto un mismo colorante puede teñir tantolas partes básicas como las ácidas de los tejidos.Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.

Indiferentes: realmente no se unen a elementosde los tejidos por afinidad química sino porque sedisuelven en ellos. Por ejemplo, el colorantesudán se disuelve en los lípidos y por tanto teñiráa las gotas de lípidos, especialmente en losadipocitos.

En algunas ocasiones necesitamos resaltarelementos tisulares de manera específica y paraello usamos colorantes que tienen apetencia pordichas estructuras. Por ejemplo, la tincióndenominada azán contiene azocarmín y naranja-anilina-ácido acético que tiñe los núcleos de rojoy sobre todo destaca el conectivo intensamenteteñido de azul. Otra tinción combinada es eltricrómio de Mallory que tiñe el colágeno deverde, las células musculares de rojo.

Cuando un colorante se une al tejido y reflejaun color diferente al que tiene en solución se diceque ha ocurrido un fenómeno de metacromasia.Esto se debe a que las propiedades de absorciónde la luz del colorante cambian al unirse acomponentes celulares. Por ejemplo, el azul detoluidina se vuelve púrpura cuando se une aciertos gránulos de los mastocitos. Cuando elcolorante unido al tejido tiene el mismo color queen solución se denomina ortocromasia.

Tinción general. Una de las tinciones máscomúnmente usada en histología es la


Tinciones generales



Sección de un glomérulo de un riñón de mamífero obtenida a partir de una

inclusión en parafina y teñido con hematoxil inaeosina. Los núcleos aparecen

de color violáceo (hemtoxil ina) y el citoplasma de color rosado (eosina).

Pasos que se siguen durante una tinción general de hematoxil inaeosina. Los tiempos son aproximativos

porque dependen del grosor de los cortes y de la concentración de los colorantes. El desparafinado permite

eliminar el medio de inclusión, la parafina. El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilena y se

denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una coloración más violácea, en vez de

púrpura. La deshidratación final es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble. Estos

medios de montaje no afectan al tej ido, ni a los colorantes y tienen unas propiedades ópticas excelentes.

Además, conservan las preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el montado y secado

(evaporación del xi leno), las secciones se puede observar con el microscopio óptico.


hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina.Como vemos se usa un colorante básico y otroácido para teñir de diferente color a lasestructuras ácidas y básicas de la célula. Antes deproceder a la tinción, si partimos de cortes deparafina, tenemos que llevar a cabo unostratamientos previos sobre las secciones como esel desaparafinado, y la hidratación puesto queestos colorantes son hidrosolubles. Si partimos decortes de criostato esto no se lleva a cabo.

Tinción de semifinos. Cuando se procesamaterial para microscopía electrónica esnecesario, a veces, hacerse una idea de qué zonadel tejido vamos a cortar. Téngase en cuenta queel área de una sección para observar con elmicroscopio electrónico es muy pequeña.Además, el proceso de osmificación que ha dellevarse a cabo previamente a la inclusión acarreael oscurecimiento del tejido, con lo que dificultaaún más la orientación de la muestra. Por ello esfrecuente hacer secciones de 0.5 a 1 Cm de

grosor con el ultramicrotomo para orientarnos enla muestra y seleccionar la zona a partir de la cualharemos las secciones ultrafinas. Los semifinossuelen tener áreas más grandes que las queposteriormente vamos a usar para la obtención delas secciones ultrafinas. El colorante usado para

teñir secciones semifinas esnormalmente el azul de toluidina, elcual puede infiltrase en la resinacalentada en un plancha y llegar hastael tejido.

Contraste de ultrafinos. El contrasteno es una tinción, puesto que noaporta color a la muestra, pero sí esun proceso habitual para poderobservar los componentesultraestructurales de la célula. Por esemotivo lo incluimos en este apartado.Aunque las secciones paramicroscopía electrónica se puedenobservar directamente con elmicroscopio electrónico se suelentratar previamente con metalespesados en un proceso denominadocontraste, obteniendo así una imagenóptima de la ultraestructura celular.Téngase en cuenta que en lamicroscopía electrónica lo importanteno es añadir sustancias coloreadassino moléculas que puedan interferircon el camino de los electronesemitidos por el microscopio y que


Sección semifina de un glomérulo de un riñón

obtenida a partir de una inclusión en resina y

teñida con azul de toluidina.

Proceso de tinción de una sección semifina. La porosidad de

la resina, el calor y las propiedades del colorante (azul de

tolouidina) hacen que se pueda teñir el tej ido sin necesidad

de eliminar previamente la resina .


chocan contra la muestra. Los electrones quelogran atravesar la muestra inciden sobre unapantalla fosforescente que emitirá destellos de luzcuando reciban el impacto de un electrón ypermite observar las características del tejido.Los metales pesados unidos al tejido impediránque pasen los electrones y por tanto se verá unazona negra en la pantalla fosforescente, mientrasque en aquellas zonas de la célula donde no esténestos metales provocarán áreas luminosas endicha pantalla. Por ello todas las imágenesoriginales de microscopía electrónica son enblanco y negro, aunque se puedan colorearposteriormente con un ordenador.


Proceso de contraste de secciones ultrafinas. Los

tiempos de incubación en citrato de plomo y

acetato de uranilo son aproximativos. Las lentejas

de hidróxido sódico eliminan humedad del aire y

dificultan la pricipitación del citrato de plomo. Los

lavados en agua se llevan a cabo sumergiendo

repetidas veces (en inglés, "deeping") la reji l la en

el agua durante un tiempo de aproximadamente

30 segundos en cada pocil lo con agua desti lada.



Incluiremos dentro de las técnicashistoquímicas a aquellas que supongan unareacción química en la que intervienen moléculaspertenecientes al propio tejido (trataremos ladetección de glúcidos mediante lectinas y lainmunohistoquímica en apartados diferentes aéste, aunque algunos autores las incluyen comoténicas histoquímicas). El objetivo de lahistoquímica es poner de manifiesto unamolécula o familia de moléculas presentes en unasección histológica y estudiar su distribucióntisular "in situ". Estas moléculas son difícilmentediscernibles con colorantes generales. Durante elprocesamiento del tejido previo a la reacciónhistoquímica, como la fijación o la inclusión, hayque evitar dañar a la molécula que queremosdetectar porque de otra manera resultaría enfalsos negativos, es decir, no tener tinción cuandoen realidad la molécula de interés sí está presenteen el tejido, aunque deteriorada. En algunasocasiones es necesario realizar pasos previos a lareacción histoquímica para descubrir la moléculaque queremos detectar, por ejemplo usando unfijador adecuado, ya que de otra manera noreaccionaría con los reactivos químicos. Vamos a

dividir las técnicas histoquímicas en dos grupos:reacciones químicas e histoquímica enzimática.

Las reacciones químicas consisten en lamodificación química de moléculas del tejidopara posteriormente poder colorearlas. Existentécnicas histoquímicas para detectar glúcidos,proteínas y nucleótidos. La técnica histoquímicamás empleada es la reacción de PAS (PeriodicAcid Schiff). Se utiliza para la detección dehidratos de carbono, libres o conjugados, cuandoestán en cantidades relativamente grandes en lostejidos. La modificación química del tejidoconsiste en la oxidación mediante el ácidoperiódico de los enlaces entre los carbonospróximos que contienen grupos hidroxilos. Estoprovoca la formación de grupos aldehídos queserán reconocidos por el reactivo de Schiff, elcual se combinará con ellos para dar un colorrojizo brillante. Entre los componentes delreactivo de Schiff está la pararosanilina (uncomponente de la fucsina básica) tratada conácido sulfúrico. Una gran ventaja de la tinciónhistoquímica PAS es su capacidad dediscriminación de tipos de glúcidos con pequeñasmodificaciones de la técnica.

Histoquímica

Tinción con hematoxil inaeosina (imagen de la izquierda) y PAShematoxil ina (imagen de la derecha) de

las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las células

caliciformes teñidas de rosado con la ténica de PAS por su alto contenido en mucopolisacáridos,

mientras que en una tición general aparecen transparentes, sin teñir.


La histoquímica enzimática ohistoenzimología se basa en la capacidad quetienen algunos enzimas del tejido de mantenerfuncional su centro activo tras el proceso defijación. Estos enzimas y las células que losposeen se ponen de manifiesto mediante unareacción enzimática que convierte a unossustratos solubles e incoloros en productosinsolubles y coloreados. Los sustratos sonespecíficos para el enzima y los productos sedepositan en el lugar preciso donde se produjo lareacción, es decir, donde se localiza el enzima.Las enzimas que se pueden detectar son variadascomo las peroxidasas, fosfatasas,deshidrogenasas, diaforasas, acetilcolinesterasa,etcétera. Hay que tener en cuenta que cuandoqueremos detectar una actividad enzimática esrecomendable no incluir el material en medios

como la parafina puesto que la deshidratación yla temperatura elevada pueden dañar laconformación de la enzima y por tanto laactividad de su centro activo. Por ello estastécnicas se realizan normalmente en seccionesobtenidas por congelación o con el vibratomo.

La actividad NADPH diaforasa se asocia a laenzimas sintasas del óxido nítrico en sistemanervioso y vascular. A estos enzimas se les harelacionado con el control del flujo sanguíneo ycon ciertos aspectos de la fisiología del sistemanervioso. Esta técnica permite detectar neuronasque expresan la enzima sintasa del óxido nítricode una forma sencilla y rápida. La reacción esNADPH + tetrazolio = NADP+ + formazán. Esel formazán el producto coloreado e insoluble quese puede observar con el microscopio óptico,incluso con el electrónico.


Tinción con hematoxil inaeosina (imagen de la izquierda) y PAShematoxil ina (imagen de la derecha) de

las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a las células

caliciformes teñidas de rosado con la ténica de PAS por su alto contenido en mucopolisacáridos,

mientras que en una tición general aparecen transparentes, sin teñir.


Criostato. El mecanismo de rotación y corte del criostato se

encuentra dentro de una cámara refrigerada.


Los pasos para la detección histoquímica de la actividad diaforasa es muy sencil la.

Tras una fi jación, preferentemente por perfusión, hay que permeabil izar el tej ido con un

disolvente de lípidos como el TritonX100. El revelado se produce a 37 oC y el final de

la reacción se controla mediante observaciones periódicas. La concentración de los

sustratos (NADPH y azul de tetrazolio) varía según el tej ido o el proceso de fi jación.


Aparte de las técnicas de tinción generales ylas histoquímicas, más específicas, existen otrasque se usan para detectar moléculas tisulares conuna alta especificidad. Ello es posible gracias a lacapacidad que tienen ciertas moléculas como laslectinas o las inmunoglobulinas para reconocer yunirse sólo a una molécula determinada presenteen el tejido. En esta página vamos a tratar sobreel uso de las lectinas para la detección en lostejidos de distintos tipos de glúcidos de maneraespecífica. En muchos textos la técnica de laslectinas se incluye dentro del apartado de lahistoquímica.

Las lectinas son proteínas que tienen dominioso secuencias de aminoácidos que son capaces dereconocer y unirse a glúcidos terminales queforman parte de cadenas de oligosacáridos, bienlibres o formando parte de otras moléculas comolas glicoproteínas. Por ello se dice que las lectinasreconocen glicoconjugados. Las lectinas estánampliamente distribuidas en los tejidos animalesy vegetales y sus funciones son muy variadas. Porejemplo, la salida de los linfocitos desde eltorrente sanguíneo hacia los tejidos dañados se

produce gracias a la acción de unas lectinasdenominadas selectinas que expresan las célulasendoteliales próximas al lugar de la lesión. Esdecir, el linfocito puede salir por la paredendotelial gracias a la unión de las selectinasendoteliales a los glúcidos de la membrana dellinfocito. En el laboratorio de histología laslectinas se usan, sin embargo, para estudiar ladistribución tisular de distintos tipos de azúcaresde manera específica. Se pueden usar diferentestipos de lectinas en base a su especificidad dereconocimiento de azúcares determinados. Hay almenos cinco grupos de lectinas según se unan amanosa (Man), a galactosa/n-acetilgalactosamina(Gal/GalNAc), a N- acetilglucosamina (GllNAc),a fucosa (Fuc) o a ácido siálico (Neu5Ac),respectivamente.

Comercialmente hay disponibles docenas delectinas diferentes que se nombran según elorganismo animal o la planta de la que seobtienen. En el siguiente cuadro se listan laslectinas usadas comúnmente según el glúcido quereconocen.

Lectinas

Detección de lectinas mediante métodos indirectos en cortes adyacentes de epitel io del pie de

Haliotis tuberculata (oreja de mar, invertebrado prosobranquio). La imagen de la izquierda

muestra la detección de glucosamina mediante la lectina WGA biotini lada y su posterior

revelado de la peroxidasa unida a avidina (color marrón). En la imagen de la derecha se

muestra la detección de fucosa mediante la lectina AAA unida a digoxigenina. Mediante un

anticuerpo contra la digoxigenina unido a fosfatasa alcalina se pone de manifiesto la

localización de la fucosa (color azul).



Para poder observar el lugar deunión específica entre la lectina ysu glúcido tenemos que unir a lalectina un marcador que nosproduzca una señal visible con elmicroscopio óptico o electrónicode transmisión. Normalmente elmarcaje consiste en la unión deuna enzima como la peroxidasa derábano o la fosfatasa alcalina. Es elresultado de la reacción enzimáticalo que se puede observar. Tambiénse usa como marcador unamolécula fluorescente que sepuede observar directamente en eltejido con un microscopio defluorescencia. Cuando la enzima ola molécula fluorescente estándirectamente unidas a la lectina sedenomina método de deteccióndirecta y cuando se unen a lalectina mediante una moléculainterpuesta se denomina detecciónindirecta. Las moléculasinterpuestas más comunes son labiotina o anticuerpos específicos(inmunoglobulinas tipo G)obtenidos contra la lectina.

La técnica con lectinas se suelecomplementar con una serie detratamientos que sirven paraobtener más información acerca dela composición sacarídica de losglicoconjugados. Por ejemplo, ladesulfatación se usa parademostrar las uniones tipo ésteresde sulfato de las cadenasterminales y la eliminación tipobeta permite conocer si las cadenassacarídicas son uniones con enlacestipo O (uniones covalentemente agrupos hidroxilo) o tipo N (enlacesconvalentes a grupos amino). Eneste último caso la alcalinizaciónde los cortes elimina las unionestipo O.

Pasos para la detección de glúcidos con lectinas. Los tiempos

pueden variar según el material o la lectina usada. En este

ejemplo se usa un método de detección indirecta puesto que la

lectina lleva unida una proteína intermendiaria que es la biotina,

la cual será reconocida por la avidina del complejo ABC ("avidin

biotincomplex") que contiene moléculas de la enzima

peroxidasa. Es la reacción de este enzima tras añadir los

sustratos apropiados, diaminobencidina más peróxido de

hidrógeno, la que produce productos insolubles y visibles con el

microscopio óptico. El paso de BSA (albúmina de suero bovino)

sirve para saturar posibles sitios de unión inespecíficos de la

lectina. Si en vez de cortes en parafina hubiésemos usado

cortes de vibratomo podrímos procesar, tras la reacción de la

peroxidasa, dichos cortes para observar el producto de reacción

con el microscopio óptico y también con el electrónico de

transmisión.



La inmunocitoquímica es una técnica para lalocalización de moléculas en los tejidos medianteel empleo de anticuerpos. Es una técnica quegracias a la oferta comercial de anticuerpos y a laestandarización de su protocolo se ha convertidoen un método sencillo, rápido y muy potente. Sebasa en la gran especificidad y alta afinidad quetienen los anticuerpos para reconocer a moléculasy unirse a ellas. Además, la conjugación ocombinación de los anticuerpos con enzimas ocon sustancias fluorescentes permite detectarcantidades ínfimas de moléculas presentes en eltejido.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas que seusan en las técnicas inmunocitoquímicas son deltipo G, producidas por unas células del sistemainmunitario denominados linfocitos B durante larespuesta inmune. La producción masiva deanticuerpos se produce en un animal cuando leinyectamos una molécula, en este caso nuestramolécula problema, que reconoce como extraña.Estos anticuerpos pasan al suero sanguíneo quese extrae del animal inmunizado y a partir delcual se purifican. Éstos se usarán posteriormenteen la técnica inmunocitoquímica. Las moléculascomplejas como la proteínas tienen en suestructura varios determinantes antigénicos, es

decir, lugares que soncapaces de desencadenaruna respuesta inmune. Elloimplica que cadadeterminante antigénicoactivará un clon, línea delinfocitos B, que produciráanticuerpos contra él. Losanticuerpos de todos losclones de linfocitos Bactivados por la moléculainyectada irán a parar alsuero. Cuando se empleansueros purificados de estetipo en inmunocitoquímicase dice que se estánempleando anticuerpospoliclonales. Existe unatécnica que perimite aislary cultivar en el laboratorio(in vitro) de formainividualizada a cada unode los clones de linfocitos Bactivados durante larespuesta inmune. Cada unode esos cultivos produciráun solo tipo deinmunoglobulina G quereconocerá sólo a uno delos determinantesantigénicos de la moléculainyectada. A estosanticuerpos se les denomina


Inmunocitoquímica

Esquema resumido de las diferencias en la obtención de anticuerpos

policlonales (izquierda) y monoclonales (centro y derecha).


monoclonales ya que proceden de linfocitos queproducen inmunoglobulinas idénticas.

Las inmunoglobulinas tipo G pueden dividirseen dos dominos: la fracción cristalizable y lavariable. El dominio variable es el que se encargade reconocer al determinante antigénico denuestra molécula. Hay dos sitios de unión por loque cada inmunoglubulina podría reconocer a dosmoléculas o determinantes antigénicos, que hande ser iguales. La fracción cristalizable tiene unaestructura similar para todas lasinmunoglubulinas G producidas por losindividuos de una misma especie.

Para que un anticuerpo se una a sudeterminante antigénico localizado en unamolécula, ésta no debe alterarse. De otro modoese determinante antigénico no será reconocidopor el anticuerpo. Por ello el proceso de fijacióndel tejido debe elegirse para preservar al máximoa la molécula que queremos detectar. Así, se usan

diferentes fijadores según el tipo de molécula enla que estemos interados. También es necesarioconsiderar el método de obtención de los cortes.Inclusiones en parafina pueden dañar lasmoléculas por lo que en la mayoría de los casosse suele trabajar con cortes de vibratomo o consecciones obtenidas por congelación.

Las inmunoglobulinas, aunque se unan a lamolécula que queramos detectar, no son visiblescon el microscopio por lo que la tendremos queconjugar (unirla) a otras moléculas que nos denuna señal visible. Estas moléculas que aportanvisibilidad a los anticuerpos suelen ser de dostipos: moléculas fluorescentes y enzimas. Lasprimeras se pueden observar con el microscopiode fluorescencia mientras que las segundaspueden convertir determinados sustratos solublesen productos insolubles y coloreados. La señalaparece allí donde está la sustancia fluorescente oel enzima, que es donde se ha unido la

inmunoglubulina.

El método del marcado con sustanciasfluorescentes tiene una serie de ventajasque veremos más adelante, pero tiene ladesventaje de que no son marcajespermanentes puesto que la luz emitidapor la molécula fluorescente sedesvanece con el tiempo. Sin embargo,las secciones procesadas conanticuerpos unidos a enzimas puedendeshidratarse, montarse y mantenersepermanentemente para su obeservación.Las enzimas habituales que se unen alas inmunoglobulinas son la peroxidasay la fosfatasa alcalina.

La conjugación directa de unmarcador (enzima o fluorescente) con lainmunoglobulina se denomina métodode detección directa. Hoy en día sesuele emplear el método de detecciónindirecta, que consiste en colocar unaserie de intermediarios entre lainmunoglobulina y la moléculamarcadora. Inicialmente se usó elmétodo indirecto denominadoperoxidasa-antiperoxidasa (PAP; verfigura anterior), pero actualmente es


Métodos de marcaje para detectar los anticuerpos primarios

unidos específicamente a una molécula del tej ido.



Detección de la molécula tirosina hidroxilasa mediante

inmunocitoquímica usando un anticuerpo primario sin

marcar, un anticuerpo secundario conjugado con biotina y el

complejo avidiabiotinaperoxidasa.

Inmunocitoquímica con detección indirecta y enzimática. La sección se obtiene de tejido

previamente fi jado. Inmediantemante después se incuban en una solución de bloqueo que

satura los posibles sitios de unión inespecífica, gracias a una alta concentración de

proteína como la albúmina de suero bovino. Tras cada paso de unión de anticuerpos o del

complejo avidinabiotinaperoxidasa se procede a lavar los cortes en una solución

tamponada de fosfato (tampón fosfato), en la que también van disueltos los anticuerpos.

La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos, la diaminobencidina y el peróxido

de hidrógeno, en un producto insoluble y coloreado visible con el microscopio ótico.


Detección con inmunofluorescencia de dos antígenos en una sección de tejido

nervioso: la molécula calbindina (a la izquierda) y parvoalbúmina (a la derecha),

usando fluoresceína y texas red como fluorocromos, respectivamente, mediante

un método de marcaje indirecto. Se pueden observar cuerpos celulares y

prolongaciones nerviosas. Las flechas blancas indican células que poseen

ambas proteínas (calbindina y parvoalbúmina) mientras que la flechas azules

indican cuerpos celulares que sólo expresan parvoalbúmina. Obsérvense las

zonas oscuras, negativas, en la imagen de la izquierda.

más frecuente usar el método del complejoavidina-biotina-peroxidasa (ABC; ver figuraanterior). El método indirecto permite una mayorversatilidad de la técnica y mayor intensidad deseñal frente a una misma cantidad de antígeno.

La inmunofluorescencia se basa en laspropiedades de los fluorocromos. Son moléculasque emiten luz visible cuando se les ilumina conuna determinada longitud de onda. Aunque lainmunofluorescencia se puede usar para detectara una sola molécula tisular, su verdaderopotencial se muestra cuando necesitamos unamúltiple inmunodetección, es decir, dos o másmoléculas presentes en una misma célula o

matriz extracelular de forma simultánea. Esto esposible porque existe una gran variedad defluorocromos que son capaces de emitir luzvisible tras ser excitados con diferentes longitudesde onda, luego seleccionando el intervalo delongitudes onda con el que iluminamos un tejidopodemos excitar de modo individual, ysecuencial, varios fluorocromos que hayamosusado, unidos a inmunoglubulinas diferentes,para detectar moléculas diferentes. Tomandofotografías tras cada excitación y superponiendodichas imágenes podemos averiguar si lasmoléculas se expresan, por ejemplo, en la mismacélula.




Detección simultánea de dos moléculas situadas en misma sección mediante

inmunofluorescencia. La razón de que los dos anticuerpos primarios procedan de

dos animales diferentes es que los anticuerpo secundarios, obtenidos de otro

animal, normalmente cabra u oveja, inmunizados con las inmunoglobulinas de

ratón y conejo, respectivamente, es lo que permite a cada anticuerpo secundario

reconocer y unirse a un anticuerpo primario determinado y no al otro.


No se puede considerar a la hibridación in situcomo una técnica de uso general. Sin embargo,aporta una información sobre la fisiología de lascélulas y los tejidos que no es posible obtener conotras técnicas. La hibridación in situ se usaampliamente en investigación en desarrolloembrionario, diferenciación de células madre,manipulaciones genéticas o cambios en lafisiología celular frente a señales externas, entreotras. Permite descubrir la expresión de un genmediante la detección de su transcrito procesado,el ARN mensajero. Podemos descubrir quécélulas expresan un gen determinado y cuándo loexpresan. La expresión génica es un testimoniodirecto de la funcionalidad celular. Existe otraaplicación de la hibridación in situ y consiste enla localización física de un gen sobre uncromosoma.

La hibridación in situ se basa en lacomplementariedad de bases de nucleótidos. Delmismo modo que en la inmunocitoquímica seusan los anticuerpos, en la hibridación in situ seusa una secuencia de nucleótidos, denominadasonda, que es complementaria a la secuencia delARN mensajero que queremos detectar y queestá conjugada con una molécula que luegopondremos de manifiesto y que nos sirve demarcador.

Quizá una de las razones por las que lahibridación in situ no es común todavía en loslaboratorios de histología es porque sintetizar unasonda es complicado y generalmente no se puedeusar en una especie animal o vegetal distinta aaquella para la que se ha producido dicha sonda.Ello es porque un mismo gen (ARN mensajero)en dos especies distintas tienen secuencias que noson idénticas y por tanto hay que fabricar unasonda para cada especie. Sin embargo, una vezobtenida la sonda el proceso de hibridación essencillo.

Para obtner una sonda de un ARNm deseado loprimero que tenemos que hacer es conocer lasecuencia de bases de dicho ARNm. Si esa esasecuencia está publicada en las bases de datos enInternet todo el proceso se simplifica enormente

puesto que hoy en día se pueden pedircomercialmente la síntesis de forma química desecuencias largas de ARN (hasta 1000nucleótidos es común). Incluso, se puedencomprar las sondas ya marcadas, con lo que nosahorramos una gran cantidad de tiempo en ellaboratorio.

Sin embargo, en muchos casos no conocemosla secuencia de bases del gen deseado por lo quehay que averiguarlo primero para obtenerposteriormente la sonda. Para obtener una sondahay primero que clonar la secuencia de bases delgen (ARN mensajero) que queremos detectar.Clonar implica realizar una serie de pasos: 1 )Una vez purificado el ARN de nuestro tejido, losARN mensajeros se retrotranscriben(transcripción inversa), es decir, se hacen copiascomplementarias de ADN de todos losfragmentos de ARN mensajero. Se obtienenhebras de ADN denominadas cDNA. 2)Mediante la técnica de PCR ("polymerase chainreaction") se consiguen multitud de copias demanera específica de la secuencia de ARNmensajero que queremos estudiar. 3) Dichascopias se integran en un plásmido yposteriormente se introduce en bacterias. 4) Secultivan las bacterias para que proliferen y asítambién conseguir gran cantidad de plásmidos,que se duplican en cada división bacteriana. 5)Los plásmidos se extraen y purifican. 6)Mediante un proceso de transcripción similar alque ocurre en el núcleo de las células, a partir deestos plásmidos se consiguen numerosas réplicascomplementarias a nuestra secuencia inserta, queserá también complementaria a la secuencia delARN mensajero que queremos detectar. Elresultado de la transcripción realizada repetidasveces es un gran número de cadenas de ARNdenominadas sondas. Durante su síntesis escuando se añaden los nucleótidos conjugados conlas moléculas marcadoras que nos servirán paradetectarla una vez la hibridación se hayaproducido. Normalmente son moléculaspequeñas como la digoxigenina y la biotina,aunque también se pueden utilizar moléculasfluorescentes, que se unen a los nucleótidos que


Hibridación in situ



Esquema resumido del proceso de hibridación in situ. NBT (nitro

blue tetrazolium) y el BCIP (5Bromo4chloro3indolyl fosfato,

sal de toluidina) son los sustratos de la fosfatasa alcalina

Imagen que muestra neuronas (de color azul) que expresan el

receptor D1 para la dopamina en el cerebro basal de una

lamprea

formarán parte de la sonda.

La hibridación in situ se puede combinar con

otras técnicas como la inmunocitoquímica otinciones generales.


Esquema del proceso de hibridación in situ sobre secciones de

criostato.


24Técnicas histológicas. Tinción.

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4. Tinción