5 Isidre Transferencia Metodos HPLC a UHPLC

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Transferencia de

Mtodos de HPLC

a UHPLC:

Estrategias y

Criterios de

Seleccin de

Columnas.

Isidre Masana

Agilent Technologies

Especialista Productos UHPLC/MS

UHPLC MasterClass Junio 2013

Agenda

1. Introduccin

2. Cmo convertir mtodos de HPLC

a UHPLC?:

Estrategias de Traspaso de Mtodos

Isocrtico y Gradientes Concentracin

Criterios de Seleccin de Columna

Longitud y Tamao Partcula

Fase estacionaria y tipo de columnas

Dimetro

3. Conclusiones.

4. Anexo con informacin adicional.

Pgina: 2

Agenda

1. Introduccin


a UHPLC?:






Dimetro

3. Conclusiones.


Pgina: 3

Introduccin Mtodos HPLC UHPLC

Pgina: 4

HPLC UHPLC:

Columnas HPLC 5 y 3.5m UHPLC: 1.8m (TP) o 2.7m (SP).

OBJETIVOS / Estrategias:

Reducir Tiempos de Anlisis SIN perder Resolucin.

Aumentar la Resolucin SIN incrementar tiempo de Anlisis.

Fundamentos:

Poder trabajar a flujos elevados sin perder eficacia con rellenos TP

Transferencia de mtodos de HPLC a UHPLC/RRLC

www.agilent.com/chem Instruments

Liquid Chromatography

Buscar: Method translator

Pgina: 5

http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe para descargrselo (6Mb requiere Flash Player).

Agenda

1. Introduccin


a UHPLC?:






Dimetro

3. Conclusiones.


Pgina: 6

Estrategias de Traspaso de Mtodos HPLC a

UHPLC

Mtodo ya validado? Se quieren mantener condiciones

dentro del rango de cambios admitidos por USP?

Admite 5m 2.7m (SP). Pero NO a < 2.5m.

3.5m 2.7m (SP), 1.8m (TP). Pero NO < 1.75 m.

Mantener validacin USP Adicionalmente estar limitado a:

Reduccin Dimetro columna: : 0.50 x D p.e. 4.6mm3mm (NO a 2.1mm)

Subida Flujo: 1.50 x F

Subida Temperatura: T+10C

OBJETIVO:

Reducir tiempos de Anlisis?

Aumentar Resolucin?

Combinacin de ambas?

Poroshell 120: 2.7m

Superficialmente

porosas

Pgina: 7

Cuanto Puede Cambiarse en HPLC/UHPLC

un Mtodo USP Standard?

pH de la Fase Mvil: +/- 0.2 unidades

Concentracin de sales en tampn: +/- 10%

Ratio de componentes in fase mvil para componentes minoritarios: < +/- 30% relativo. /

Conversin Mtodos de HPLC a UHPLC/RRLC:

Estrategias en el Traspaso de Mtodos Reduccin de Tiempo:

Reducir la longitud y tamao de partcula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 m (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 m).

Aumentar el flujo.

Aumentar la temperatura.

Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo).

Mejora de Resolucin :

Reducir el tamao de partcula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 m (TP), 2.7 (SP) (o 3.5 m).

Aumentar el flujo con gradientes de concentracin.

Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)

Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5m.

1.8 m Mxima eficacia / min. cm columna. 5 m Mxima eficacia / bar presin (pero tiempo)

Pgina: 9




Aumentar el flujo.






Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo)

Alternativa: acoplar varias columnas en serie de 5m.


Pgina: 10

min5 10 15 20 25 30 35 40

mAU

0

5

10

15

20

25

30

Gradiente = 67min

Capacidad picos = 694 (10/min)

Resolucin GC

Mapa pptidico de BSA digerida con tripsina con

Agilent 1200-RRLC (SL)

Zorbax SB-C18, 2.1x150mm, 1.8m

min2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

mAU

0

10

20

30

40

50

60

Gradiente = 30min

Capacidad picos = 540 (18/min)

Cromatografa de Alta Resolucin con el Agilent

1200 RRLC (SL) + Columnas 1.8m y 150mm

Capacidad de Separacin de Picos: 700

Eficacia : 36.000 platos/columna 15cm x 1.8m

(tpica de columna GC de 10metros x 0.32mm)

8 Columnas x 5m 200.000 platos/ 2 metros

Pgina 11

Pgina 12

Cromatografa de Alta Resolucin por Acoplamiento

en Serie de Columnas de 5m

0.4ml/min H2O/CH3CN 60/40 80C

4 Columnas en serie 5 x 25cm x 4.6mm - 5m


1 Columna 25cm x 4.6mm - 5m

70bars

177bars

360bars

20.000 platos

100.000 platos

200.000 platos

105min

14min

Pgina 13

Cromatografa de Alta Resolucin con 5m y 80C 100.000 platos en 30min

380bars


1 y 2 ml/min H2O/CH3CN 60/40 30 y 80C 29min




Aumentar el flujo.






Utilizar eluyentes menos viscosos (p.e. acetonitrilo

Acoplar varias columnas en serie de 5m.


Pgina: 14

Traspaso de Mtodos Isocrticos a UFLC.

Columna referente: 5m x 150mm (12.500 platos)

Reduccin del Tiempo de Anlisis*

Flujo Constante Flujo x 2 Flujo x 3

1.8m x 50mm

(12.000 platos)

1/3

30min10min

1/6

30min5min

1/9

30min3.3 min

3.5m x 75mm

(10.500 platos)

1/2

30min15min

1/4

30min7.5min

1/6

30min5 min

3.5m x 100mm

(14.000 platos)

2/3

30min20min

1/3

30min10min

2/9

30min6.7 min

La resolucin ser semejante a la original. La misma proporcin aplica a D.I. 2.1 y 3mm *Nota: Reduccin del tiempo de anlisis calculada con respecto a columna de 150x4.6mm 5m

**Incremento presin: +2% para 7.5cm x 3.5m +35% para 10cm x 3.5m +150% para 5cm y 1.8m (P = f (.u.L/ dp2))

Mantener: composicin y n puntos muestreo pico ( Hz).

Subir Flujo (hasta p.e. 80% presin mxima columna/ instrumento).

Reducir volumen inyeccin (proporcionalmente a. reduccin volumen columna).

Pgina: 15

Ajuste de la Frecuencia de Adquisicin de Datos: Compromiso entre Resolucin Cromatogrfica y Sensibilidad.

Aumentar la frecuencia de adquisicin de datos proporcionalmente a la reduccin del tiempo de anlisis.

Ajustar Peak width adquisicin al width de integracin de los resultados del pico ms fino de inters.

Proporcionar unos 35-40 puntos de medicin por pico para mxima resolucin cromatogrfica.

El ruido se reduce con el aumento del n de puntos promediados:

Ruido ~ 1 / n promedios

Para mxima sensibilidad ajustar a 8-10 puntos (RSD% 10-15%).

Para ptima repetibilidad cuantitativa adquirir >15 puntos (RSD< 1%).

Pgina: 16

Pgina 17

Parmetros Optimizacin Resolucin Cromatogrfica

Rs= 2 (T1-T2) /( Wb1+Wb2) N= 5.54 ( Tr / w50%)1/2

= (T2 T0)/(T1 T0) K = (Tr T0) / T0 * Para picos de tamaos muy distintos se recomienda Rs > 2

Parmetro

Modificado

% Mejora

Resolucin Incremento

Tiempo Anlisis

Long. x 2 40% x 2

K: 0.5 2 100% x 2

K: 5 10 10% x 2 El incrementar la retencin por encima de K=5 apenas mejorar la resolucin.

OBJETIVO Rs > 1.5 (2)*

1 < K'< 10 Rs= 0.25 N

1/2 ((- 1)/ ) (K'/(K'+1))

RETENCIN Poder Eluotrpico Eluyente

% modificador Orgnico SELECTIVIDAD Fase Estacionaria y Soporte

pH Fase Mvil (si pH prximo a pK)

Modificador Orgnico y su %

Aditivos Fase Mvil

Temperatura

EFICACIA

Tamao Partcula del Relleno Longitud de la Columna Excesivos Volmenes Muertos (-) Flujo:

ISOCRTICO:

k' k'/k'+1 T. anlisis

0,2 0,17 1.2 x T 0

0,5 0,33 1.5 x T 0

1 0,50 2 x T 0

2 0,67 3 x T 0

3 0,75 4 x T 0

4 0,80 5 x T 0

5 0,83 6 x T 0

10 0,91 11 x T 0

20 0,95 21 x T 0

La mejora de Resolucin

es muy importante al

incrementar la retencin

hasta K= 5

Rs = f ( K/[K+1] )

0,2

0,5

1

2

3 4

5 10

20

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

K'

k'/k

'+1

k'/k'+1

La mejora de Resolucin

es muy importante al

incrementar la retencin

hasta K= 5

N= f(L/ 2dp)

Para mejorar resolucin de picos con K > 5 mejor

aumentar long. columna. Para K K2 = (2 3) x K1 Log K =aprox flineal(%orgnico)

Traspaso de Mtodos con Gradientes

S: definir la sensibilidad del analito a variaciones en la proporcin de modificador orgnico.

Valores tpicos S: aumentan con el tamao de la molcula 2-5 molculas pequeas / 10 molculas grandes (pptidos) / 40 molculas muy grandes (protenas)

Al aumentar el tamao de la molcula aumenta su sensibilidad a cambios de composicin del eluyente.

K = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Parmetro dependiente de:

Analito Modificador Orgnico

Volumen muerto de la columna

% de incremento de Modificador Orgnico Tiempo del gradiente (min)

Flujo (ml/min)

Factor de Capacidad Retencin en Gradientes

Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8

4.6x50, 3.5m Gradiente 45 90% B en 3 y 2 min Fase Mvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3

B: Metanol

Flujo: 2 y 3 mL/min

Temperatura: 35C Muestra: Frmacos Cardiacos:1. Diltiazam

2. Dipyradamole 3. Nifedipina

4. Lidoflazina 5. Flunarizina

EJEMPLO 1 - REDUCCIN TIEMPO ANLISIS: Reducir Tg Aumentando F

Al mantener TG x F = constante el perfil de la separacin NO vara

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)

F = 2.0 mL/min

Tg = 3 min

3 min

1

2 3

4

5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)

F = 3.0 mL/min

Tg = 2 min

2 min

Si K se mantiene constante el poder de separacin no variar

Pgina: 18

Comparacin Estrategias Mejora de la Resolucin

k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)

Columna: ZORBAX SB-C8

Gradiente: 20 60% B en 10 min o 60 min Fase Mvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2

B: Acetonitrilo

Flujo: 1.0 mL/min Temperatura: 35C

Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine 5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor

Tg = 10 min

4.6 x 150 mm, 5 m

N = 12,000

V0=1.5ml

15 min

1,2

3 4 5

6

7

8

0 5 10 15 Time (min)

Aumentar Tg (el resto de parmetros no se modifican ) 1

Tg = 60 min a 1mL/min 4

2

0 25 50 Time (min)

3

5

8

6

7 40 min

4.6 x 150 mm, 5 m

N = 12,000

V0=1.5ml

Tradicional

Reducir V0 y Subir Flujo 4.6 x 75 mm, 3.5 m V0=0.75ml

N = 10,000

Tg = 15 min a 2mL/min

Moderna:

Si k se aumenta (Tg, F, V0) el poder de separacin mejorar.

Pgina: 19

Time (min) 0 5 10

2

3

4 5

6 7

8

1

7 min

1x10/1.5= 6,7

2x15/0.75= 40

1x60/1.5= 40

Se reduce Tiempo anlisis

a 1/6 pero se mantiene la

Separacin !!!

Cmo mejorar?

Ejemplo de Reduccinde Tiempo SIN Cambiar de

Columna 5m 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg

1mL/min 10 min Gradiente FxTg=10

1290 Infinity Cuaternario

Columna: 5m 4.6x150mm Eclipse XDB-C8

Gradiente: H20/ACN50/50-0/100 en X min

Flujo: 1, 2, 3 y 4mL/min (pruebas respetando

Pmx. columna: 400bars) 40C

Inyeccin: 2 l muestra (1500ppm dimetilftalato y

dietilftalato, 100 ppm bifenilo, y 300ppm

o-terfenilo en metanol)

12min.


6min.

3mL/min 3.33min Gradiente FxTg=10

4min.

4mL/min 2.5 min Gradiente FxTg=10

3min.

Pgina: 20


Columna 5m 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg Representacin Normalizada en el Eje de Tiempo










12min.


6min.

3mL/min 3.33min Gradiente FxTg=10

4min.

4mL/min 2.5 min Gradiente FxTg=10

3min.

Pgina: 21


Columna 5m 4.6x150mm. Manteniendo Constante FxTg Representacin Normalizada en el Eje de Tiempo









1mL/min 10 min Gradiente AZUL FxTg=10

2mL/min 5 min Gradiente ROJO

3mL/min 3.33 min Gradiente VERDE

4mL/min 10 min Gradiente FUCSIA

50% altura pico 0.006min 0.08% 0.012min 0.16%

10% altura pico 0.015min 0.19% 0.024min 0.29%

8min. F=1ml/min

8min. F=1ml/min

14mL/min

ancho pico

0.018min

26% pk wd

0.24% Tr

14mL/min

ancho pico

0.0398min

30% pk wd

0.48% Tr

Pgina: 22

Agenda

1. Fundamentos de la UHPLC:

Ecuacin de Van Deemter


a UHPLC?:



Longitud y Tamao Partcula.

Nuevos tipos de columnas para poder hacer UHPLC en HPLC's

convencionales (Poroshell).

Dimetro

3. Conclusiones.

Pgina: 23

Seleccin de la Longitud Columna y Tamao de Partcula del Relleno versus Eficacia

Longitud

(mm)

Eficacia

N(5 m)

Eficacia

N(3.5 m)

Eficacia

N(1.8 m)

150 12,500 21,000 36.000

100 8,500 14,000 24,000

75 6000 10,500 18.000

50 4,200 7,000 12,000

30 2.500 4,200 6,500

15 1.250 2,100 2,500

Tiempo

Anlisis*

-

- 33%

- 50%

- 67%

- 80%

- 90%

La Eficacia aumenta con la reduccin del tamao de partcula ( N= f(L / 2dp) )

El tiempo de anlisis se reduce acortando la longitud de la columna. ( Tr = f(L / F) )

Reduciendo Longitud y Tamao de partcula, pero manteniendo flujo y n platos proporcionados por la

columna, se conseguir reducir el tiempo de anlisis y consumo de disolvente sin perder Resolucin.

* Reduccin con respecto a una columna de 150 mm

+ Eficacia

(N)

+

Presin

- Tiempo Anlisis

- Volumen Pico

- Consumo Solvente

Pgina: 24

Recomendacin: Columnas 5cm para gradientes 5min, 10cm para 5-30min, 15cm para > 30min

Viscosidad versus Composicin Orgnico/Agua. En UHPLC se suele utilizar Acetonitrilo

Gradiente 10100% Metanol

Tener en cuenta:

La alta viscosidad de las mezclas metanol/agua (mximo a 40/60)

3 3

0 20 40 60 80

1

2

1

2

Vis

cosid

ad

[cP]

a 20 C

100%

n-Propanol

Etanol

Metanol

Acetonitrilo

Perfiles de Presin con Gradientes Concentracin

Perfil de Concentracin

Presin CH3-CN / H2O

Presin CH3OH / H2O

Este grfico es til para poder calcular relaciones

aproximadas de viscosidad entre distintas

composiciones de eluyentes y poder calcular

presiones equivalentes: p.e. 100 bars con CH3-CN/H20 70/30 equivalen a 100 x

(1.3/0.6) = 217 bars con CH3OH/H20 70/30

~ 0.6

~ 1.3

70/30 org. /agua

CH3OH

CH3CN

mAU

0

50

100

150

200

250

300

350

Bar 25 o C (355b)

80C (140bars)

% Orgnico[w/w]

50C (220bars)

C Posible flujo con

respecto a 25C

50C x 1.6

80C x 2.5

Pgina: 25 + info en Anexo final

Traspaso de Mtodos de H20/CH30H a H20/CH3CN. Composiciones Fase Mvil con Fuerza Eluotrpica

Equivalente

Acetonitrilo / Agua (da menor presin)

Metanol / Agua

Tetrahidrofurano / Agua

%MeOH %ACN %THF

20 15 10

40 30 25

60 50 38

80 72 53

100 98 72

%ACN %MeOH %THF

20 30 18

40 50 30

60 72 45

80 85 58

100 >100 72

%THF %MeOH %ACN

20 35 28

40 65 55

60 88 82

80 >100 >100

100 >100 >100

72%

53%

80%

En RRLC se recomienda trabajar con fases poco viscosas

Pgina: 26

Pgina 27

Reduccin del Tiempo de Anlisis mediante Incremento de la Temperatura Ejemplo a Flujo Constante

Trabajar a temperaturas elevadas permitir reducir considerablemente los tiempos de anlisis y

en ocasiones cambiar la selectividad de la separacin. la alta estabilidad trmica de las columnas

StableBond a pHs cidos: hasta 80C (90 para las SB-C18) amplan esta posibilidad.

Optimizacin

Mtodo

Alta

Temperatura

Baja

Temperatura Columna: Zorbax SB-C18, 4.6 x 75 mm, 5 m Eluyente: 74% 7.4 mM hexano sulfonato y

0.07% cido fosfrico

26% MeOH

Flujo: 1 mL/min (constante) Deteccin: UV 280 nm

Muestras: Vitaminas B

min.

Acorta a 1/3 el

tiempo anlisis

Cuando se trabaja a altas temperaturas se

recomienda enfriar el eluyente a la salida de la

columna antes de entrar en el detector (no hace

falta con MS). En los Agilent Series 1100 / 1200

utilizar el 2 intercambiador (el de 3l) de los

T.C.C, o el especfico del 1200-SL (1.5l).

Cte Dielctrica Agua: 20C=80 / 60C=67 / 90C=58

Metanol a 25C=33 Hexano a 20C=2

+ info en Anexo final

Agenda




a UHPLC?:




Fase estacionaria y tipo de columnas.

Dimetro

3. Conclusiones.

Pgina: 28

Seleccin Fase Estacionaria (Relleno)

Si es posible, mantener el mismo relleno que en HPLC simplemente cambiando tamao partcula

(p.e. Zorbax XX).

Si NO se quiere revalidar de nuevo los mtodos al transferir HPLCUHPLC, la limitacin en la reduccin de tamao de partcula en mtodos validados obliga a

pasar de rellenos 5m (TP) a 2.7m (SP) cambio fase.

Con HPLC convencionales (400 bars) utilizar rellenos SP de 2.7m

Pgina: 29

Para 1.8m utilice las Zorbax de 600-1200bars. Adems reducen la presin de trabajo en >20%, gracias a la distribucin del tamao de

partcula ingeniada por Agilent.

Utilice el mismo tipo de Zorbax: muy fcil escalabilidad debido a la idntica selectividad

de Zorbax - independiente del tamao de

partcula (5, 3.5,1.8m) y dimensiones de la columna.

Zorbax Eclipse Plus / XDB para separaciones a pHs intermedios y traspaso de columnas de otros fabricantes (excepto a pHs extremos).

Zorbax Stablebond (SB) para separaciones a pH muy cidos (hasta pH 0.8) y/o a Alta Temperatura hasta 90 C (100C).

Zorbax Extended para separaciones a pH bsicos (hasta pH 11.5)

Excelente tiempo de vida y resistentes a las ms altas presiones gracias a la alta resistencia mecnica de las partculas ZORBAX (+1300 b) .

Seleccin del Tipo de Fase Estacionaria con

Columnas ZORBAX 1.8m


Tabla de Similitud* de Fases Recomendadas para el

Traspaso de mtodos a RRLC con Zorbax 1.8m 2.7m.

Ace C18, Develosil-ODS-HG,Develosil-ODS-MG, Develosil-

ODS-UG, Hichrom C18, Hichrom RPB, Hypersil HyPURITY

C18, Inertsil ODS, Inertsil ODS2, Luna 5 C18(2), Nucleosil

C18 HD, Prodigy ODS2, Symmetry C18, Xterra MS C18,

YMC ODS A, YMC ODS AM, YMC Pro C18

ECLIPSE PLUS o XDB

(C18 o C8 segn el caso)

Poroshell 120 EC (C18 o C8)

Cosmosil C18-AR, Exsil ODS, Hypersil BDS C18,

LiChrosorb RP-18, Novapak C18, Nucleosil C18AB, Partisil

ODS3, Resolve C18, Synchropak CR101, TSK ODS-120T,

TSK ODS-80TM, u-Bondapak C18, Ultrasphere ODS,

Vydac 218MS, Vydac 218TP,Vydac Selectapore 300M,

Vydac Selectapore 300P, Vydac Selectapore 90M, Waters

Spherisorb ODS1, Waters Spherisorb ODS2, Waters

Spherisorb ODSB, YMC J'Sphere ODS M80

STABLEBOND (SB)

(SB-C18 o C8 segn el caso)

Poroshell 120 SB C18

Genesis C18, Inertsil ODS3, Kromasil C18, Prodigy ODS3,

Purospher RP18-e

EXTENDED o XDB

(C18 o C8 segn el caso)

*Sugerencia de columna a probar en primer lugar, por su mayor similitud. Obviamente pueden

haber diferencias de selectividad. La mejor depender de los analitos a separar.


Pgina 32

Ejemplo Comparativo

min0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8

mAU

-2

0

2

4

6

8

10

DAD1 B, Sig=275,8 Ref=400,80 (ACECLO070918\004-0301.D)

0.0

07

0.9

10 0

.964

1.0

33

1.4

29

1.5

16

1.6

73

1.67 min

20.2 min

Symmetry C18 5 m 250 x 4.6 mm;

Gradiente 1ml/min

Zorbax Eclipse Plus C18 1.8 m 50 x 4.6 mm;

Gradiente 3.4 ml/min

500bars- 50C

Agilent 1200 RRLC

1.67 2.4min a 25C y 2.4ml/min -500 bars

Tipo de Columna: Superficial o Totalmente Porosas?

Superficial Totalmente Porosa

Poroshell-120 reduce 40-50% de presin con similar resolucin

2.7m (capa porosa: 0,5m)

1.8m

Ventajas Poroshell 120:

Reducir la presin para aumentar el flujo. Importante con HPLC de 400 bars

Mejorar la resolucin en Mtodos USP con 5m (2.7m

Comparacin Eficacia Partculas Superficial

versus Totalmente Porosas (SP vs TP)

Poroshell 120 proporciona:

Eficacia muy similar* (>80-90%.) a partculas 1.8m totalmente porosas.

Curva de Van Deemter plana en un amplio rango de flujos.

Su mayor permeabilidad le permite trabajar a flujos ms elevados.

* Tambin su capacidad de carga

Poroshell -120

Mnimo flujo recomendado (columna 4.6mm d.i.) PF


Muestra de tranquilizantes

Columna: Porosa superficial

Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um

Flujo 3.5ml/min, ~ 700 bar Gradiente 2-92% ACN en 0.4min

T= 80 C

0.095sec PW

0.140secPW

Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de separacin con todo tipo y marcas de columnas

Columnas Superficialmente Porosas:

permiten muy elevadas velocidades lineales

con elevada resolucin y menor presin

0.5 s

Ncleo

Slido

1.7um

} 0.5m

2.7m


1.8m Eclipse Plus C18 vs. Poroshell 120 EC-C18

Anlisis de 17 Aminocidos con 1290 Infinity

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

min 0 2 4 6 8 10 12

mAU

0

50

Poroshell 120 EC-C18

3.0 x 100mm, 2.7um

Pmax=331 bar

F=0.86 mL/min

RRHT Eclipse Plus C18

3.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=474 bar (Porosh.+43%)

F=0.86 mL/min

RRHD Eclipse Plus C18

3.0 x 100mm, 1.8um

Pmax=528 bar (HT+11%)

F=0.86 mL/min

Rs6,5=1.98

Rs6,5=2.28

Rs6,5=2.90

Rs14,13=1.81

Rs14,13=2.34

Rs14,13=1.81

W 9 =0.043 min.

W 9 =0.036 min.

W 9 =0.045 min.

Selectividad Poroshell 120 EC-C18 ~ Eclipse Plus C18 (o Eclipse XDB)

Pmx.=1200bars

Pmx.=600bars

Pmx.=600bars


Tipos Instrumentos y Columnas UHPLC

Tipos Instrumentos UHPLC

Presin mx. 1000-1200 bars y Flujo mx. 5 10 mL/min. (Fluj. elev.todo tipo columnas)

Presin mx. 1000-1200 bars y Flujo mx. 1 -2 mL/min (Fluj. elev. columnas 2-3mm d.i.)

Presin mx. 600 bars y Flujo mx. 5 10 mL/min (Fluj. elev. Columnas SP)

Tipos Columnas UHPLC

Totalmente porosas

NO es imprescindible un cromatgrafo de Alta

Presin (600-1200bars) para trabajar en UHPLC

Tipo Cromatgrafo

(Presin Mxima)

Mxima Longitud Columna*

1.8m (TP)** Poroshell-120 2.7m (SP)**

400 (HPLC) 5 (10) cm 10 (15) cm

600 (UHPLC) 10 (15) cm 15 (20) cm

1200 (UHPLC) 25 (30) cm 35 (40) cm

* En UHPLC suele utilizarse acetonitrilo; el utilizar metanol reducir los flujos mximos de trabajo (especialmente con

contenidos de agua alrededor del 60% ).

** TP: Totalmente Porosa *** SP: Superficialmente Porosa; las columnas SP permiten utilizar columnas entre un 40 y

60% ms largas que las TP (o trabajar a flujos mayores).

Equivalencia Eficacia columnas UHPLC

(1.8m TP/ 2.7m SP)

Columnas HPLC

5m

5 cm 15 cm

10 cm 30 cm

25 cm 75 cm

+ info en Anexo final Pgina: 38

Agenda




a UHPLC?:




Nuevos tipos de columnas para poder hacer UHPLC en HPLC's

convencionales (Poroshell).

Dimetro

3. Conclusiones.

Pgina: 39

Qu Dimetro de Columna Utilizar?: d.i. (mm): 2.1, 3, 4.6?: Mantener la del mtodo validado.

Recomendacin LC/MS: 2.1mm con Electrospray (ptimo 0.5-0.8mL/min) // 3-4.6mm con APCI (/APPI con dopante): ptimo ~ 1.5mL/min (acta como detector que

responde a la cantidad absoluta de analito mejor inyectar cantidades lo mayores posible).

Recomendacin LC/DAD/UV/FLD/. : 2.1- 3 - 4.6mm.

El flujo debe ser proporcional a la seccin de la columna utilizada.

Al reducirse el dimetro se reducir el flujo de trabajo (para mantener la misma velocidad lineal dentro de la columna).

3mL/min en 4.6mm d.i. ~ 1.26mL/min en 3.0mm ~ 0.6mL/min en 2.1mm

Reducir el dimetro permite reducir consumo de disolvente y si se inyecta la misma cantidad absoluta de muestra, ganar sensibilidad pero:

Se debe de inyectar menor volumen/cantidad de muestra para:

NO sobrecargar la columna de analito (prdida de resolucin por saturacin columna).

NO deformar el perfil del pico por un exceso de poder de elucin del volumne (p.e. en fase reversa disolver la muestra en solvente orgnico)

Se debe reducir los volmenes del sistema: bombas, capilares, celdas de deteccin,. (a 1/5 al pasar de d.i. 4.6mm a 2.1 mm)

Pgina: 40

Influencia Volumen de Dispersin en la Eficacia

Flujos ajustados al d.i. de la columna:

4.6 mm columna 1 mL/min

3 mm columna 0.43 mL/min

2.1 mm columna 0.21 mL/min

Ejemplo para compuesto con K=4

Columna:

50 mm long.

1.8 m tam. part.

Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 x V0 columna 10L

Requerir

HP

LC

s

adecuados

Seleccin D.I. de Columna segn Sistema de Bombeo Mejora de la Sensibilidad y Consumo Disolvente con la Reduccin del D.I.

MS con Nano-Electrospray o

HPLC-Chip Cube

Nano LC 100 m

75 m

50 m

500 nl/min

250 nl/min

100 nl/min

Micro LC 1 mm

800 m

40 l/min

20 l/min

LC Capilar 300 m

180 m

4 l/min

2 l/min

LC Estndar 4.6 mm

2.1 mm

1000 l/min

200 l/min

Flujo tpico

D.I. Columna Ganancia Terica

en Sensibilidad UV

~ 1

~ 5

~ 20

~ 30

~ 200

~ 600

~ 2000

~ 3500

~ 8500

Celdas DAD / MWD:

x10

x200

Muy utilizadas en ESI

LC Estndar 4.6 mm

2.1 mm

1000 l/min

200 l/min

CUATERNARIA*

Mezcla a baja presin

Na

no-1

200

1

20

0 C

ap

ilar

UV

/ VIS

Standard: 13l y 10mm, 120bar tpica para columnas D.I.: 3 - 4.6 mm Semi-Micro: 5l y 6mm, 120bar para columnas D.I.: 2.1 - 3 mm Micro - Alta Presin: 1.7l y 6mm columnas D.I 1 mm Semi-Nano: 500nl y 1cm para columnas DI > 1mm Nano: 80nl y 6mm para columnas DI >= 180-300m.

Con columnas cortas de 1.8m y flujos elevados

se deber reducir el volumen de la celda

BINARIA

Mezcla alta presin

LC

/MS

D.I. Dimetro de referencia (D.I.): 4.6mm

Sensibilidad Consumo Disolvente Vo columna

2.1 mm x 5 1/5 (-80%) 1/5 (-80%)

3 mm x 2.35 1/2.35.(-57%) 1/2.35.(-57%)

d.i. columna Vmuertos que recorre la muestra (d.i. capilares,

volumen de la celda de deteccin,)

Pgina: 42

*1290 cuaternario permite

tambin 2.1mm d.i.

???

Aumento Tiempo de Retardo del Gradiente

0 min 0 min

Reducir flujo (/d.i. columna) gradiente tardar ms en llegar a la columna: se deber reducir volumen barrido por el gradiente

en inyector y bomba.

Pgina: 43

d.i.: 4.6mm d.i.: 2.1mm

Configuracin del Volumen de Retardo del Gradiente de Concentracin

El volumen de retardo se recomienda no sea superior al Vo de la columna utilizada (como valor orientativo).

Con columnas de D.I. 2.1mm (usuales en LC/MS con ESI) o columnas cortas de 1.8m se recomienda utilizar un sistema con mezclado en alta presin (bombas

binarias) o 1290 cuaternarias.

Con columnas largas de 1.8m o flujos muy elevados se requerir sistemas de bombeo de alta presin como el Agilent 1200-RRLC (SL), 1220, 1260 y 1290 infinity.

Gradientes con Mezclado a Alta

Presin

Menor volumen de retardo Configurable 120-800L (1100,1200,1260) // 10-45L (1290)

Bombas binarias 1100, 1200, 1260 y 1290

Gradientes con Mezclado a Baja Presin

(en vlvula proporcional)

Vlvula proporcional

Mayor volumen de retardo NO configurable 600-900L / (

Bomba Binaria Serie 1200-RRLC: Muy Fcil Cambio

de Configuracin

Configuracin 1:

Volumen de retardo

estndar (mixer 400L)

Retardo: 600-800l

Retardo con Mixer 200L*: 400-600l

B A

600bar Amortiguador

200 o 400l

Mezclador

600 bars Sensor

Presin

Vlvula Purga

Configs. 1 2: Desconectar slo estos punto!

Configuracin 2: Bajo volumen de retardo

Retardo: 120l

Conectar slo este punto!

B A

Sensor

Presin

Vlvula Purga

600bar Damper

400l Mixer

Sensor Presin

Vlvula Purga

Inicio Mezcla: T

Recorrido del Flujo

T

T

Incorpora amortiguador electrnico de pulsaciones

Sensor Presin

Vlvula Purga

Inicio Mezcla: T

Amortiguador

Mezclador 400 o 200l

*Solvent mixer, 200 l (600bars) ref.: 5067-1565

Pgina: 45

Reduccin Volumen de Retardo del Gradiente con

Bombas Binarias*: 1100/1200/ 1220/1260 versus 1290

Infinity

1220/60 Series

Channel A

Passive Damper

0 - 300 l

Passive Mixer

400 l (opcional 200)

1220/60 Series

Channel B

1290 Inifinity

Chanel A

1290 Inifinity

Chanel B

Very Low Noise

~ 600-800 l

+ =

Active Damping

10l

Jet Weaver Mixer

35l

Delay Volume

10l / 45l

80x / 20x lower

1290 Infinity

Pgina: 46

* En bombas con mezclado en baja presin sin mezclador (cuaternarias) el volumen de retardo NO se puede reducir.

Agilent 1200 Series HP Autosampler SL

Delay Volume Reduction and Overlapped Injections

Main Pass Bypass

Simultaneous Speed and Carry Over optimization by

Simple one-valve flow-through design

Automatic delay volume reduction (6ul)

Overlapped injection

Programmable sample flush-out time

External needle wash

Minimized Carry Over by additional valve switches

Permitir reducir el volumen de retardo del gradiente, al

colocar la vlvula en posicin de Bypass cuando la muestra ha salido del inyector (Sample Flush-Out Factor)

Pgina: 47

Problema: Reproduccin de Analisis en Gradiente con

diferentes HPLCs: - Impacto del volumen muerto y de la calidad de la mezcla. Columna: 3 x 50 mm, 2.7 m Poroshell

min 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Rs= 1.90 1100 Series Binary LC

1290 Infinity LC - El gradiente llega antes

Rs= 1.15

Me

tam

itro

n

Chlo

rid

azo

ne

Sim

azin

e

Chlo

rtolu

ron

Diu

ron

Pro

pa

zin

e

Te

rbu

tyla

zin

e

Pro

me

tryn

Cya

niz

ine

1290 Infinity LC

with iSET

Rs= 1.87

Pgina: 48

June 26, 2013

Confidentiality Label 49

Emulacin de cualquier HPLC/UHPLC con el 1290 y la nueva tecnologa ISET.

ISET: Tecnologa de Emulacin Inteligente - Como trabaja (1290 con un 1200)

Programa de gradiente

1290 gradiente

1200 gradiente

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

0

50

100

150

200

250

300

350

400

min

mAU

Inyecctin

Mismas condiciones de gradiente

pero desplazando el gradiente y

emulando el perfil del gradiente a

clonar

+ info en Anexo final Pgina: 50

Agenda

1. Introduccin


a UHPLC?:






Dimetro

3. Conclusiones.


Pgina: 51

Resumen Traspaso de Mtodos a UHPLC/RRLC

Reducir Tiempo Anlisis sin perder Resolucin:

Reducir tamao de partcula y longitud de la columna pero manteniendo constante n platos columna (15cm x 5m = 10cm x 3.5m = 5cm x 1.8m).

Las columnas TP de 1.8m o SP de 2.7m permiten trabajar a flujos elevados para reducir tiempo de anlisis y mejorar resolucin en gradientes.

Maximizar la Resolucin:

Sin aumentar tiempo de anlisis: Reducir tamao de partcula y mantener la longitud de la columna (p.e. 150mm x 1.8m).

Aumentado tiempo de anlisis: acoplar varias columnas en serie de 5m requieren un equipo de alta presin como el Agilent 1200-RRLC (SL).

Columnas Poroshell 120 (superficialmente porosas):

Le permiten trabajar en UHPLC con HPLCs convencionales.

Poder trabajar a mayores flujos para:

reducir sus tiempos de anlisis.

incrementar la capacidad de separacin y resolucin en gradiente.

Pgina: 52

Capacidad de separacin en gradientes proporcional a F x Tg / V0 Trabajar a flujos elevados permite mejorar la capacidad de separacin en gradientes de concentracin

1200 Infinity Method Translator http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

para descargrselo (6Mb requiere Flash Player).

Pgina: 53

Agilent 1290 Infinity LC

Muchas

Gracias

por su

Atencin

Estamos a su disposicin en

tel.: 901.11.6890 [email protected]

[email protected] www.agilent.com/chem




Preguntas?

Agenda

1. Introduccin


a UHPLC?:






Dimetro

3. Conclusiones.


Pgina: 56

Columnas Poroshell-120 (600bars) 9 Fases: EC-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), Phenyl (USP L11), SB-

CN (USP L10), SB-Aq, SB-bonus RP, HILIC. 3 Dimetros y 6 Longitudes

Info 2013

Pgina 57

Especificaciones Columnas Poroshell-120 9 Fases: EC-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), Phenyl (USP L11),

SB-CN (USP L10), SB-Aq, SB-bonus RP, HILIC.

Info 2013

Pgina 58

13 Fases: Eclipse Plus C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Eclipse XDB-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Extend-C18 (USP L1), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), SB-Phenyl (USP L11), SB-CN (USP L10), SB-Aq, Rx-SIL

(USP L3), Bonus-RP (USP L60), Eclipse PAH (USP L1)

Pgina 59

La Mayor Flexibilidad: Especificaciones 17 Fases Diferentes RRHD de 1.8 m y 1200bars para Cualquier Aplicacin

Pgina 60

La Mayor Flexibilidad: + 120 Columnas Diferentes RRHT de 1.8 y 600bars para Cualquier Aplicacin

1.0

2.1

3.0

4.6

IDs

Longitudes: 20,30, 50, 100 y 150mm n Fases: 10

Con igual selectividad que los rellenos de 3.5 y 5m

Pgina 61

La Mayor Flexibilidad: + 120 Columnas Diferentes RRHT de 1.8 y 600bars para Cualquier Aplicacin

13 Fases: Eclipse Plus C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Eclipse XDB-C18 (USP L1) y C8 (USP L7), Extend-C18 (USP L1), SB-C18 (USP L1) ) y C8 (USP L7), SB-Phenyl (USP L11),

SB-CN (USP L10), SB-Aq, Rx-SIL (USP L3), Bonus-RP (USP L60), Eclipse PAH (USP L1)

Designaciones USP

Pgina 62

Designaciones USP

Pgina 63

Designaciones USP

Pgina 64

Designaciones USP

Pgina 65

Workshop 1200-RRLC: Conversin de Mtodos de HPLC Convencional a

Cromatografa de Resolucin Rpida

Pgina 66

Flujo (mL/min)

Reduccin de la Presin de Trabajo mediante la Optimizacin de la Distribucin del Tamao de Partcula con Nuevos Rellenos Zorbax de 1.8m

0

50

100

150

200

250

300

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0

Pre

sin (B

ars

)

+25% MS de

Presin a (2.0

mL/min)

Rellenos 1.8m standard

Nuevos Rellenos 1.8m

Distribucin Optimizada

Columnas: ZORBAX SB-C18 Dimensiones: 4.6 x 30mm, 1.8 m

Eluyenty: 85:15 ACN:Agua

Flujos: 0.05 5.0 mL/min Temp: 20C

Muestra: 1.0L Octanofenona en Eluyente

Deteccin: UV 245nm

Presin Sistema (1100 sin Columna)

Manteniendo la eficacia, las nuevas columnas Zorbax de 1.8m

reducen la presin en + 20% y permiten trabajar hasta 600bares

Workshop 1200-RRLC: Conversin de Mtodos de HPLC Convencional a

Cromatografa de Resolucin Rpida

Pgina 67

600 bar

5m 3.5m

2.3 2.1

1.8m

0

100

200

300

400

500

600

700

800

400 bar

Presin versus: Dimetro Partcula y Longitud de Columna

Presin 1/(dp)2

700-800

600-700

500-600

400-500

300-400

200-300

100-200

0-100

Presin (bars)

Longitud Columna (mm) Dimetro Partcula (m)

1 mL/min H2O/CH3CN 50/50* Temp.: 25C

Calculado en base Agilent 1100 y columnas

Zorbax 4.6mmx1.8m con tecnologa de 400bars

15cm 3.5m

10cm

5cm

1.8m

400bars

600bars

200bars

25cm

5m

* Viscosidad 10-15% inferior a la del agua J

-35%

-55%

-65%

Reduccin viscosidad

Pgina 68

Efecto del Incremento de la Temperatura en la

Viscosidad del Eluyente y Presin de Trabajo

La viscosidad se reduce con

respecto a 25C:

a 80C: entre un 35 y 65%.

a 60C: entre un 25-50%.

Flujo x 1.5-3) P = f ( . u . L / dp2)

Subir temperatura permite trabajar a mayores flujos

Pgina: 69

1220 Infinity 1260 Infinity 1290 Infinity

Modelo

UHPLC

Pres. Mx

bars

Mxima Longitud Columna UHPLC cm

Rango d.i. Columna mm

Delay

Volume Bomba

L

Flujo

mx. mL/min

1.8m (TP)** Poroshell-120 2.7m (SP)**

1220 binario

1260 cuaternario 600 10 (15) cm 15 (20) 3-4.6 (16) 600-900 10

1260 binario 600 10 (15) cm 15 (20) 2.1-4.6 (8) 120 /600-800 5

1290 cuaternario 1200 25 (30) cm 35 (40) 2.1-4.6 (16)

Bomba Binaria Series 1200/1100*- Configuraciones *excepto modelo 1200-SL

Configuracin 1: Volumen de retardo estndar

Retardo: 600-900l

Sensor Presin

Vlvula Purga

Inicio Mezcla: T

Amortiguador

400l Mezclador

Configs. 1 2: Desconectar slo estos puntos!

Recorrido del Flujo

B A

400bar Amortiguador

+Sensor Presin

400l

Mezclador

Sensor

Presin

Vlvula Purga

T

Sensor Presin

Vlvula Purga

Inicio Mezcla: T

Amortiguador

80l filtro

Configs. 2 3: Desconectar slo estos puntos!

Recorrido del Flujo

B A

Configuracin 2: Volumen de retardo medio**

Retardo: 300-600l**

400bar Amortiguador

+Sensor Presin

80l

Filtro en

Lnea (400 bars) Sensor

Presin

Vlvula Purga

T

** Al eliminarse el mezclador el ruido

de mezcla puede aumentar

Pgina: 70

Bomba Binaria Series 1200/1100- Configuraciones *excepto modelo 1200-SL

Configuracin 3: Volumen de retardo medio*

Retardo: 200-500l

** Al eliminarse el mezclador el ruido

de mezcla puede aumentar

Inicio Mezcla: T

Vlvula Purga

Amortiguador +

Sensor Presin

Configuracin 4: Volumen de retardo muy bajo**

Retardo: < 200l

B A

400bar Amortiguador

+Sensor Presin Sensor

Presin

Vlvula Purga

400l

Mezclador

T

Amortiguador +

Sensor Presin

Vlvula Purga

Inicio Mezcla: T

B A

400bar Amortiguador

+Sensor Presin Sensor

Presin

Vlvula Purga

400l

Mezclador

T

Recorrido del Flujo

Pgina: 71

Soluciones 1290 Infinity LC - 2000 muestras/da usando ACR (Reg. Aut. de Columna)

Anlisis y Regeneracin de columna simultneos con vlvula de 2

posiciones / 10 puertos

Tiempos de ciclo ms cortos y mayor capacidad de anlisis de muestras para

laboratorios de HT y desarrollo de

mtodos

Respuestas ms rpidas en los controles de calidad durante la fase de

produccin o de liberacin de producto

acabado

Pgina 73

Adaptacin HPLC: Mnimizar los Volmenes Extra-

Columna en Funcin su Tamao: Capilares de Conexin

Columna Vol. Col. Flujo tip. Vol. pico

d.i. mm L, mm V0 l l/min l @k'=3

4.6

2.1

1

0.5

0.3

0.075

150 1329 1400 667

150 417 292 139

150 94 66 31

150 23.6 17 7.9

150 8.5 6.0 2.8

150 0.53 0.37 0.18

Capilar de 0,17 mm de d.i. x 150 mm = 3,4 l de vol. interno

Capilar de 0,12 mm de d.i. x 150 mm = 1,7 l de vol. interno

Capilar de 0,05 mm de d.i. x slice fundida 150 mm = 0,3 l vol

Capilar de 0,025 mm de d.i. x slice fundida 150 mm = 0,07 l vol

Re

qu

iere

n in

str

um

en

tos

es

pe

cf

icam

en

te d

ise

a

do

s

mx. D.I. cap. 0.17

0.12

0.075 0.05

0.025

(0.025)

Volumen muerto conexiones+celda detector < 0.02 X V0 columna

Pgina 74

Reduccin Volmenes Extra-Columna: Celdas Deteccin y Volumen de Retardo con Gradientes de Concentracin

Celdas de Deteccin DAD & MWD: (opciones parecidas con VWD)

Standard: 13l, 10mm, 120bar tpica para columnas D.I.: 3 - 4.6 mm

Semi-Micro: 5l, 6mm, 120bar tpica para columnas D.I.: 2.1 - 3 mm

Micro: 2l, 3mm, 120bar tpica para columnas D.I.: 1 2.1 mm

Alta Presin 1.7l, 6mm, 400bar tpica para MS y columnas D.I 1 mm

Semi-Nano: 500nl, 10mm, 50bar tpica para columnas D.I.: 0.5 1 mm

Nano: 80nl, 6mm, 50bar tpica para columnas D.I.: 0.18 0.5mm

Preparativas: 3mm, 120bar / 0.3mm, 20bar / 0.06mm, 20bar

Con columnas cortas de 1.8m y flujos elevados

se deber reducir el volumen de la celda

Pgina 75

Adaptacin HPLC: Cromatogramas < 1min pueden

Requerir Frecuencias de Adquisicin Superiores a 20Hz: Detectores DAD-SL y MWD-SL pueden adquirir hasta a 80Hz para picos de

tan slo 0.15 segundos de ancho

Para picos con PW (peakwidth al 50% de su altura)

> 0.01min (0.6seg) el DAD standard a 20Hz es suficiente

min 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0

80Hz

PW=0.30sec

40Hz

PW=0.33sec

20Hz

PW=0.42sec

10Hz

PW=0.67sec

5Hz PW=1.24sec

DAD standard

20Hz

Agilent SL Fast DAD

RSD%

Pgina 76

Configuracin para Inyeccin Grandes Volmenes

Bomba Gradientes Detector

Columna Inyector

Configuracin con Inyeccin Directa*: segn las condiciones utilizadas el volumen de inyeccin est limitado por las dimensiones de la columna*

Vlvulas controladas por Agilent LC-1200/1100

Configuracin con Columna Concentradora

Bomba de

Carga Isocrtica

Pre-Columna

Concen-

tradora en vlvula 2

posiciones

Desecho

Bomba

Gradientes

Inyector

Columna Separadora Detector

Carga (p.e. 2 min)

Anlisis

Requiere 2 bombas

Concentracin

Permitir la inyeccin de grandes

volmenes. La elucin de la columna concentradora se realiza en sentido contrario

a su sentido de carga

* Volumen tpico de inyeccin 1-2 (5) % del V0 de la columna utilizada. V0(col. 100 x 4.6mm) =1.0ml

Posibilidades 1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario Prestaciones UHPLC para TODOS LOS LABORATORIOS:

Resolucin optimizada

3x100mm, 1.8m

Resolucin pico 5 = 7.16

Tiempo anlisis: 7 min

Velocidad y Resolucin optimizadas

3x50mm, 1.8m


Tiempo anlisis: 1.1min

Convencional

4.6x150, 5m


Tiempo anlisis: 11 min

min 0 2 4 6 8 10

min 0 2 4 6 8 10

min 0 2 4 6 8 10

10 x PRODUCTIVIDAD mayor n de datos y de mejor calidad!

Pgina: 77

600 bars

Posibilidades 1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario 100% Compatibilidad con Mtodos HPLC

Reemplazo Sin Riesgo

1260/1220 Infinity LC

Sistema Cuaternario

1100/1200 Series

Sistema Cuaternario

Columna: 4.6 x 150mm, 5m

Gradiente: 0 min 20 % B

10min 95 %

Flujo: 1 mL/min

min 0 2 4 6 8 10

Ejecute sus actuales mtodos de HPLC y obtenga los mismos resultados

Pgina: 78

1100/1200 Binarios seran remplazados por 1260 Binario o 1290+ISET

600 bars

Problema: Reproduccin de Analisis en

Gradiente con diferentes HPLCs: - Impacto del volumen muerto y de la calidad de la mezcla

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 B, Sig=275,4 Ref=400,40 (B:\RIC\AGI...RIC DATA\1 PHARMA METOCLOPRAMIDE\WAD PHARMA\XBRIDGE-2000004.D) 2

.747

3.0

49

8.1

21

8.3

23

8.7

47 8

.930

9.5

45

9.9

75

12.

005

12.

215

12.

393

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000001.D)

2.7

44 2

.884

6.0

88

6.3

28

6.6

73

6.8

72

7.4

80

7.9

23 9.9

37

10.

249

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

50

100

150

200

DAD1 C, DAD1B, DAD: Signal B, 275 nm/Bw:4 nm Ref 400 nm/Bw:60 nm (B:\RIC\AGI...A\GV 1PHARMA\HPLC000003.D)

2.8

87

3.3

20

8.5

38

8.7

44

9.1

59 9

.325

9.9

51

10.

379

12.

395

12.

630

12.

763

1200 Series LC Bomba Cuaternaria

1290 Infinity bomba Binaria

Sample: 0.5% impurities in formulation

(metoclopramide)

Xbridge C18, 150x3 mm, 3.5 m dp,

0.45 ml/min, Eluent: A =0 .25 % AmAc, B = ACN,

Gradient: 0-15 min; 5-57 % B

El resultado:

Diferencias en los RT y resolucin Se juntan 2 picos!

Pgina: 79

June 26, 2013

Confidentiality Label 80

Emulacin de cualquier HPLC/UHPLC con el 1290 y la nueva tecnologa ISET.

Pesticidas: Ejemplo Emulacin 1100 con ISET Columna: 3 x 50 mm, 2.7 m Poroshell

min 1 1.5 2 2.5 3 3.5

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Rs= 1.90 1100 Series Binary LC

1290 Infinity LC - El gradiente llega antes

Rs= 1.15

Me

tam

itro

n

Chlo

rid

azo

ne

Sim

azin

e

Chlo

rtolu

ron

Diu

ron

Pro

pa

zin

e

Te

rbu

tyla

zin

e

Pro

me

tryn

Cya

niz

ine

1290 Infinity LC

with iSET

Rs= 1.87

Intelligent System Emulation Technology

ISET: - Cmo programarlo?

Select pump

Select autosampler

Agilent 1100 Agilent 1200 Agilent 1220 Agilent 1260 Agilent 1290 Waters Alliance

Tecnologa de Emulacin Inteligente - Como trabaja (1290 con un 1200)

Programa de gradiente

1290 gradiente

1200 gradiente

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

0

50

100

150

200

250

300

350

400

min

mAU

Inyecctin

Mismas condiciones de gradiente

pero desplazando el gradiente y

emulando el perfil del gradiente a

clonar

Pgina 84

Resumen Conclusiones Adicionales Posibilidades Adicionales para Reducir Tiempo Anlisis :

Trabajar a temperaturas elevadas permitir reducir el tiempo de anlisis, trabajar a flujos ms elevados y reducir la resistencia a la transferencia de masa (til con rellenos de 5m).

Aumentar el flujo con gradientes de concentracin permitir reducir proporcionalmente el tiempo del gradiente manteniendo la separacin.

Reducir el Vo de la columna permitir reducir proporcionalmente el tiempo del gradiente manteniendo el poder de separacin (si FxTg/ V0 = cte).

Requisitos de la Cromatografa Ultra-rpida:

Requerir reducir el volumen de los capilares de conexin y de las celdas de deteccin, y aumentar la frecuencia de adquisicin de datos.

Requerir adecuar el volumen de retardo al flujo y dimensiones de la columna utilizada.

Columnas de 2.1mm de D.I. requerirn un equipo con mezcla a alta presin y mnimo volumen de retardo (como las bombas 1290, 1260, 1200, 1100 binarias o 1290 cuaternaria)

Requisitos de la Cromatografa de Alta-Resolucin:

Requerir un equipo de alta presin como el Agilent 1220, 1260 o 1290 y columnas 150mm x 1.8m, o acoplar varias columnas en serie de 250mm x 5m.

La flexibilidad de la Serie Agilent 12X0-Infinity le permite trabajar en

ptimas condiciones con todo tipo de cromatografa

Agilent 1290 Infinity LC

Muchas

Gracias

por su

Atencin




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5 Isidre Transferencia Metodos HPLC a UHPLC