5. Microscopía. Tinciones bacterianas

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5. MICROSCOPA. TINCIONES BACTERIANAS 5.1. INTRODUCCIN La microbiologa se ha podido desarrollar a partir de la aparicin y progreso del microscopio, gracias al cual se pueden visualizar las bacterias. El ojo humano no es capaz de discriminar ms all de 0,1 mm. El microscopio ptico tiene como lmite de poder de resolucin unos 0,20 microns. Estn a su alcance estructuras celulares como cromosomas, nucleolos, cloroplastos, mitocondrias. El microscopio electrnico, que tiene un poder de resolucin del orden de 4 Angstrom (C), es capaz de visualizar la estructura de las membranas, ribosomas, etc. 5.2. EL MICROSCOPIO PTICO En microscopa nos podemos encontrar un microscopio simple, que no es ms que una lente biconvexa o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas, consiguiendo con ello mayores aumentos. Todo microscopio compuesto constar de: Un sistema ptico que aumenta la imagen. Un sistema de visualizacin que amplifica adecuadamente dicha imagen. 5.2.1. Contraste. Absorcin diferencial de la luz entre la muestra y el medio. El grado de contraste se puede mejorar, aumentndolo mediante tcnicas de tincin. 5.2.2. Amplificacin. La amplificacin de la imagen en un microscopio se obtiene mediante dos sistemas de lentes: Un primer sistema de lentes situado ms cerca de la muestra, el objetivo que aumenta la imagen real. El segundo sistema de lentes, que se sita ms alejado de la muestra y ms prximo al ojo humano, es la lente ocular, que se encargar de ampliar esa imagen real originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo humano. Los microscopios en la mayora de laboratorios de microbiologa presentan los objetivos siguientes: objetivos secos, de x4, x10, x40 objetivos de inmersin, x100 aumentos. La amplificacin total de un microscopio ptico se obtiene multiplicando la ampliacin del objetivo, por la ampliacin del ocular.

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5.2.3 Poder de resolucin. El poder de resolucin de una lente es la capacidad que sta presenta para poder observar dos puntos adyacentes como distintos y separados.El poder de resolucin en un microscopio est en funcin de la longitud de onda () de la luz empleada y de las caractersticas del sistema de lentes, llamado apertura numrica.

Fig. 5.1 El lmite o poder de resolucin de un microscopio (d) es la distancia mnima entre dos puntos que permite distinguirlos uno de otro. Se expresa como: d = 0,5 / N sen = longitud de onda de la luz empleada Nsen = apertura numrica (medida del tamao del cono de luz refractada por la preparacin que admite el objetivo) N, es el ndice de refraccin del medio (aire/aceite de inmersin) que hay entre la muestra y la lente del objetivo , es la mitad del ngulo que forma el cono de la lente del objetivo.

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Cuanto ms pequeo sea el poder de resolucin de un microscopio, ms capacidad de amplificacin tendr. Esto se consigue aumentando la apertura numrica (para microscopio ptico, 1,25 es un valor normal de apertura numrica, 1,4 es un valor mximo). La apertura numrica depende del ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y el objetivo. Como que el ndice de refraccin del aire es menor que el del vidrio, los rayos luminosos se refractan cuando pasan del portaobjetos al aire. La mayora de los rayos luminosos que han atravesado la muestra se desvan en un ngulo tan grande que se pierden. El aceite de inmersin (N = 1,56) tiene, aproximadamente, el mismo ndice de refraccin que el vidrio. Si ponemos una gota de aceite entre la preparacin y el objetivo, la mayora de los rayos luminosos procedentes de la muestra pasan directamente al objetivo, aumentando la resolucin del microscopio y observndose una imagen ms clara. (Naire = 1) No se ha de utilizar nunca aceite de inmersin con objetivos secos. La distancia a la muestra es mayor y los rayos refractados son recogidos por estas lentes. La resolucin podra aumentarse tambin, disminuyendo la longitud de onda de la luz, empleando luz ultravioleta. En este caso al no ser nuestro ojo sensible a tales radiaciones, la observacin no puede ser vista y es necesario utilizar una placa fotogrfica, adems comporta tambin utilizar lentes de cuarzo y modificar la parte ptica del microscopio. Sin embargo el microscopio ptico debido a la misma naturaleza de la luz y de su longitud de onda no puede superar un cierto poder de resolucin. El lmite de resolucin con onda corta ( = 426 nm) es de 200 nm = 0,2 . Al utilizar en el microscopio electrnico haces de electrones de longitud de onda corta se consiguen mayores resoluciones con lo que se supera el problema resolutivo del microscopio ptico pasando de 2.000 C a 5 C, adems consigue un mayor poder amplificador. 5.2.4. Estructura de un microscopio Un microscopio se divide en dos partes, el soporte y el sistema ptico. I. Soporte. En los modelos modernos el soporte es una pieza fija en la que nicamente la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Las partes principales son: a) La base, que normalmente alberga la fuente de iluminacin (lmpara incandescente halgena). En determinados modelos la base incorpora adems un sistema portafiltros con varios filtros y un diafragma de campo luminoso. b) El brazo soporta todo el sistema ptico, el cabezal portaoculares (mono o binocular) y el revlver portaobjetivos. En el brazo se dispone tambin el mecanismo de anclaje de la platina dotado del correspondiente sistema de enfocado de la preparacin. c) La platina es la pieza donde se coloca la preparacin microscpica para su observacin. Presenta un orificio central por donde pasa la luz y est equipada con un sistema de fijacin de la preparacin y de desplazamiento en cruz, lo que permite posicionar cmodamente la zona de la preparacin que hay que observar. En su parte inferior se dispone el sistema de fijacin del condensador.

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d) El macromtrico y el micromtrico permiten enfocar la preparacin. El primero se emplea para un enfoque rpido cuando se trabaja con el objetivo de menor aumento (x10), mientras que el micromtrico permite afinar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de mayor aumento (x40, x100).

Fig. 5.2 II. Sistema ptico. El Sistema ptico est formado por un cuerpo tubular donde se instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. Como se indica ms adelante, tanto oculares como objetivos no son lentes simples, sino conjuntos que funcionan como una nica lente que aumenta considerablemente la calidad de la imagen. Un microscopio convencional posee tres sistemas de lentes: a) El condensador, colocado entre la fuente de luz y la preparacin. Concentra los rayos de luz en un punto o foco, que, para una observacin ptima, debe hacerse coincidir con el plano de la muestra. Incorpora tambin un diafragma tipo iris que permite ajustar la cantidad de luz que llega a la preparacin y acta de un modo muy eficaz sobre el contrastado de la preparacin (mayores aumentos requieren ms iluminacin, es decir, mayor apertura del diafragma).

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b) Los objetivos proporcionan una imagen ampliada de proyeccin real e invertida que se forma en el plano focal anterior del ocular. Los objetivos estn montados sobre un dispositivo portaobjetos giratorio de revlver. En bacteriologa se hace uso frecuentemente del objetivo de inmersin (normalmente de 100 aumentos), que acostumbra presentar grabada una raya negra o la inscripcin Inm. Este objetivo debe ser empleado incluyendo entre l y la preparacin aceite de inmersin para microscopa. c) El ocular aumenta a modo de lupa la imagen real proyectada por el objetivo y permite que sea percibida por el ojo. Lleva grabado el nmero de aumentos. Para evitar los defectos pticos de tipo aberracin cromtica1 y esfrica2 inherentes a las lentes nicas, tanto el ocular como los objetivos estn formados por sistemas o conjuntos de lentes cuyo diseo reduce al mximo estos defectos. La disposicin correcta del condensador es de gran importancia a la hora de obtener una imagen clara y contrastada. Cuando se emplean grandes aumentos, es fundamental conseguir una iluminacin ptima; en este caso es necesario realizar un centrado tanto de la fuente de la luz como del condensador, adems de un correcto diafragmado. Informacin objetivos Longitud del tubo: Distancia que media entre la superficie de conexin del objetivo en el revolver y el extremo del tubo en el cual se introduce el ocular. Nmero de campo: Dimetro en nanmetros (nm) del campo de visin que puede ser observado a travs del ocular. Distancia de trabajo: Es el espacio entre la lente frontal del objetivo y la superficie superior del cubreobjetos, cuando est enfocada la imagen de una muestra. A mayor aumento de objetivo, menor distancia de trabajo. Los distintos aumentos que podemos encontrar en los objetivos estn codificados por un anillo de color de la siguiente forma: 1 x negro 2 x castao 4 x, 5 x rojo 10 x amarillo 20 x verde 40 x, 50 x azul claro 60 x azul cobalto 100 x blanco

Los objetivos de inmersin en aceite llevan una marca de identificacin que es un anillo negro.

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aberracin cromtica. Se producen irisaciones (anillos coloreados) en torno a los objetos que estn en el campo del microscopio.2

aberracin esfrica. No logran enfocar simultneamente todo el campo del microscopio, lo que produce imgenes borrosas.

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Fig. 5.3

Nomenclatura de los objetivos

5.2.5. Manejo y uso del microscopio 1. Compruebe que las lentes del ocular y los objetivos estn limpias. De no ser as, limpiarlas con papel de fumar. Si el objetivo estuviera muy sucio, se puede humedecer el papel con un poco de alcohol. No tocar las lentes con los dedos. 2. Coloque la preparacin sobre la pletina sujetndola con el