5.0 Méthodes spectroscopiques d’analysethibaupi/CHM2971/DOC/CHM... · monochromateur (SBW) contrôlée par les fentes de sélection de λ et 2- la bande passante naturelle (NBW)

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5.0 Méthodes spectroscopiques

d’analyse

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Spectroscopie : Étude des interactions des radiations électro-magnétiquesavec la matière: complexe, polymère, protéines, molécules, atomes . . .

5.0 Méthodes spectroscopiquesIntroduction

Rayons-X : bris des liens chimiques et ionisation des molécules

UV/Vis et fluorescence : excitation électronique

IR :vibration

Micro-ondes :rotation

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Lumière

– Ondes : champs magnétique et électrique, oscillants et perpendiculaires

– Particules : photons transportant une énergie, E, définie

νhE =où E :Énergie (J)

h : constante de Planck (6.626 x 10-34 J.s)

ν : fréquence (s-1)


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• Relation entre fréquence et longueur d ’onde

• Nombre d ’onde

λν 1

= où ν : nombre d’onde (m-1)λ : longueur d’onde (m)

νλ

ν hcchhE ===⇒

c=νλ où c : vitesse de la lumièredans le vide (2.998 x 108 m.s-1)

λ : longueur d’onde (m)ν : fréquence (s-1)


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Absorption UV/vis

Promotion d’électrons à des niveaux plus énergétiques

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Spectre d’un atome

Émissions de raies (pic étroits) représentants les transitions électroniques accessibles aux électrons entre les orbitales atomiques occupées et vacantes (s, p, d, f)

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Transitions électroniques possibles

liens chimiques → molécule

n-π* : C=O (carbonyle)

n-σ* : O, N, S, X

π-π* : C=C (aromatique, alcène),C=O (carbonyle), N=N (azo)C≡C (alcyne)

σ-σ* : C-C (alcane)


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Spectre d’absorbance d’une moléculeObtention de bandes d’absorption car existance de plusieurs états de vibration des liens atomiques et de rotation moléculaire pour chaque niveau électronique. Dépend de plusieurs facteurs : structure de la molécule, polarité du solvant, pH du solvant, température, concentration, temps


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Transmittance (T)

• Fraction de l’intensité initiale(I0) de lumière qui traverse un échantillon

• Varie entre 0 et 1• Peut exprimée en %

(100xT=%T)

0IIT =


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Absorbance (A)

Relation entre A et T

TIIA loglog 0 −=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=

%T I/I0 A

100 1 0

10 0.1 1

1 0.01 2


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Loi de Beer-Lambert

S’applique quand une radiation monochromatique traverse une solution diluée (≈0.01M) dans laquelle les espèces absorbantes ne sont pas impliquées dans un équilibre dépendant de la concentration

où A = absorbanceI0 = intensité de lumière incidenteI = intensité de lumière transmiseε = absorptivité molaire (L.mol-1.cm-1) c = concentration d’analyte (mol.L-1)l = parcours optique (cm)

lcA ε=


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Absorptivités molaires (ε) typiques


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Limitations de la loi de Beer-Lambert

– Chimiques• Concentration : en solution concentrée, les molécules de soluté

peuvent interagir entre elles ⇒ ε• Équilibre relié à la concentration : si ε de l’espèce non dissociée

est ≠ de ε de l’espèce dissociée, A ne sera plus proportionnel avec la concentration

– Instrumentales• Rayonnement polychromatique : lié à la difficulté de produire un

rayonnement exclusivement monochromatique• Lumière parasite : causée par la diffraction sur les composantes

optiques (lentilles, prismes, filtres, cuvettes)


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SpectrophotomètreMesure la quantité de lumière absorbée ou transmise par une solution

Principales composantes :

a) sourceb) sélecteur de λc) porte-échantillon et celluled) détecteure) dispositif pour visualiser les valeurs

5.0 Méthodes spectroscopiquesInstrumentation

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Spectrophotomètre à simple faisceau


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A) Prisme/fente pour le sélecteur optique de la source et détecteur à simple λ

B) Prisme pour le sélecteur optique au détecteur avec DAD

C) Réseau pour le sélecteur optique au détecteur avec DAD

A

C

(visible)

(UV)

B

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Spectrophotomètre à double faisceau


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Prisme pour le sélecteur (λ) optique de la source et détecteur à simple λ

Réseau pour le sélecteur (λ) optique au détecteur avec DAD


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• Lampe à filament de tungstène (visible)

• Lampe au deutérium (UV)

350-2200 nm

160-380 nm


Source

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Monochromateur: réseau de diffraction


Sélecteur de λMonochromateur : prisme

Filtre: interférentiel

Filtre: d’absorption

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Bande passanteLargeur à mi-hauteur de la bande de rayonnement transmis


Sélecteur de λ

Mon

ochr

omat

eur

Filtr

es0,1 à 10 nm

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Sélecteur de λRésolution spectrale et fente

La qualité d’un spectre est directement reliée à 1- la bande passante quittant le monochromateur (SBW) contrôlée par les fentes de sélection de λ et 2- la bande passante naturelle (NBW) du produit analysée.

Un rapport SBW/NBW = 0,1 donne une précision de 99,5% pour l’absorbance mesurée et une résolution spectrale optimale (spectre rouge). Plus les fentes sont grandes plus il y a distorsion et perte de résolution.

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Exemple: spectre du benzène


Sélecteur de λ

Instrumentation

SBW

NBW

NBW

NBW

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Résolution spectrale,fente et S/N

En réduisant la largeur de la fente de la source le rendement énergétique émis est diminué. Dans le cas de la fente au détecteur, l’intensitéperçue par le détecteur est aussi diminuée. L’absorbance (A) étant un rapport, elle reste inchangée, mais le rapport S/N diminue (signal plus bruyant).


Sélecteur de λ

Instrumentation

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Résolution spectrale et vitesse d’acquisition

Une augmentation de la vitesse d’acquisition de l’absorbance mène à une déficit d’information (signal) et une diminution de A. De plus, il y a distorsion des bandes et variabilité de leurs position. Enfin, le rapport S/N augmente mais avec un perte de résolution.


Bruit (N)

Instrumentation

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Cellules

Standard et Volume réduit

Cylindrique


Matériel de compositionVerre /plastique : visibleUV : quartz

Volume (µ) etFlux continue

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Chemin optiqueD’après la loi de Beer-Lambert, l’absorbance est proportionnelle au chemin optique. Plus le chemin optique est long, plus le nombre de molécules qui absorberont la radiation sera grand et plus l’absorbance augmentera.

Quinoléine jaune

InstrumentationCellule

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Détecteur


Phototube

La lumière (photons) émise frappe une surface photosensible chargé (-) éjectant des électrons qui traversent le phototube sous vide pour être rencontrer le collecteur (+) donnant le signal électrique.

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Détecteur


Photomultiplicateur

L’électron éjecté par la surface photosensible frappe une dynode où il éjecte d’autres électrons accélérés qui frappent des dynodes succesives. Un photon donne en moyenne 106 électrons qui seront collectésà l’anode pour produire le signal.

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Détecteur


Barrette de photodiodes

Une superposition de silicone type n et p créent des jonctions pn de diodes. En électrisant cette jonction une surface photosensible (électrons-trou) est obtenue. Les photons qui viennent la frapper perturbent l’équilibre du circuit de capacitances électriques donnant ainsi le signal.

type-pisolant

réseau

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SolvantLe type de solvant utilisé affecte les spectres UV-Vis de plusieurs manières.

1) Seuil de coupure:En générale, pour une analyse quantitative il est à 90% et pour une analyse qualitative il peut etre < 90% transmittance

Préparation de l’échantillon

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5.0 Méthodes spectroscopiquesPréparation de l’échantillon

Solvant (suite)

2) Interactions solvant/analyte

Dans l’éthanol il y a formation de pont H ce qui diminue le degré de liberté de la molécule et mène à une perte de la structure fine qui apparaît dans un solvant moins polaire tel le cyclohexane

3) Constante diélectrique:

Une augmentation de la constante diélectrique du solvant mène à un shift bathochromique (↑λ)

Shift bathochromique

benzophenone

Shift hypsochromique

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dim

éris

atio

n


Concentration de l’échantillonCertains produits ont tendance à participer à des réactions secondaires (Ex. : dimérisation) lorsque présents en grande concentration.

2

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Contrôle de la température (T) 1) MultivariablesIl est essentiel d’avoir un contrôle rigoureux de la T lors d’analyses UV-Vis. La T affecte de manière complexe le pH de la solution, l’indice de réfraction, l’expansion du solvant et la solvatation des molécules.

Orange de méthyle

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ΔT↑


Contrôle de la température (T) 2) Structure fine

L’augmentation de la T augment le nombre de degré de liberté de la molécule et mène à l’apparition de la structure fine sur le spectre. L’énergie supplémentaire donnée à la molécule accélère les transitions de type vibration et rotation ce qui les rends ‘invisible’ sur le spectre permettant de mieux percevoir et résoudre les transitions électroniques.

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La décroissance de la densitéoptique (hypochromicité) du →monomère au → brin à → l’hélice indique la formation d’une structure plus ordonnée. Dans l’ADN bicaténaire, la proximitédes paires de bases voisins mène à des intéractions qui diminuent l’absorbance. En dénaturant (ΔT↑) vers les brins monocaténaires, les intéractionsmoléculaires sont affaiblies et l’absorbance augmente. Enfin, en hydrolisant le tout pour obtenir les bases libres, l’absorbance atteint un maximum.

Contrôle de la température (T) 3) Hypochromicité

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Contrôle du pHLes molécules ionisables (acide - basique) doivent être analysées dans un tampon afin de contrôler leur protonation -déprotonation. Une charge en plus ou en moins sur la molécule affecte directement les niveaux électroniques peuplés et l’absorption dans l’UV-Vis.

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Contrôle du pHApplication: Analyse des acides aminées aromatiques.

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Erreur analytique relative en spectrophotométrie

TTA ln4343.0log −=−=

TdTdA 4343.0−

=

TdTdA 4343.0−=

[1]

[2]

[3]

TTdT

AdA

ln= [4]

Erreur


[5]

[6]

TTdT

CdC

AdA

ln==

TTT

CC

AA

lnΔ

=Δ

=Δ

Analyse quantitative UV-Vis

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ΔT ≈ 0.005 (0.5%)

TTT

CC

AA

lnΔ

=Δ

=Δ

T=0.7; A=0.15T=0.2; A=0.7

Erreur analytique relative en spectrophotométrie

5.0 Méthodes spectroscopiquesAnalyse quantitative UV-Vis

Erreur

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Effet du rayonnement polychromatique


Pourquoi choisir λmax ?

1- La loi de Beer-Lambert est plus facilement respectée, même si le rayonnement n’est pas totalement monochromatique

2- La sensibilité de l’analyse est plus élevée (réponse maximale pour une concentration donnée)

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Courbe d’étalonnageLa loi de Beer-Lambert permet de construire une courbe d’étalonnage pour un standard (x) afin d’effectuer une quantification subséquente sur une solution inconnue qui contient (x). LD accessible ~10-7 M

A

[x]

λ

A Même variation de λ

Petite erreur

Grande erreur Courbe d’étalonnage direct

[ ] [ ] CxmAxlA x +=≡= )()( λλ ε

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Analyse multicomposants basée sur l’additivité des absorbances

Atot (λ) = A1(λ) + A2(λ) + … + An(λ)

- La loi de Beer-Lambert s’applique aux mélanges qui contiennent plus d’une substance absorbante, à condition qu’il n’y ait aucune interaction entre les diverses espèces.

- Les spectres des produits ne doivent pas être identiques dans tout le domaine spectral

- L’absorption doit être mesurée à autant de λ qu’il y a de constituants


[ ] [ ] [ ]nlllA ntot )()(2)(1)( ...21 λλλλ εεε ++=

[ ]∑=

=

=ni

iiitot xlA

1)()( λλ ε

Analyse quantitative UV-Vis

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Choix des λ :

- Si possible, choisir la λmaximale d’absorbance pour chaque produit

- A ne doit pas changer trop brutalement au voisinage de la λ d’analyse (λ max)

- L’absorbance totale ne doit pas être trop petite (>0,1) ou trop grande (<1,5)

- Les absorbances doivent être additives à cette λ

- Les ε des produits doivent différer le plus possible, et ce aux deux λ


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Application analytique : Dosage de la caféine et de l’acide benzoïque dans une boisson gazeuse


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Composition:Trois produits d’intérêt sont présents et absorbants dans ce breuvage

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HPLC

CE

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Spectrophotométrie différentielle

Basée sur les spectres d’absorption dérivés (algorithme Savitsky-Golay)

Ordres pairs : valeurs extrêmes (minimum ou maximum)

- Les ordres pairs respectent la loi de Beer-Lambert - 4ème dérivée : meilleur compromis entre l’augmentation de la résolution et la diminution du rapport signal sur bruit

Ordres impairs : passage par zéro

Maximum

Point d’inflexion

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Avantages :

• Lissage du spectre d’absorption et atténuation des interférences: diffractions, diffusions, matrice …• Résolution de bandes chevauchées rendant possible l’analyse quantitative• Discrimination des bandes larges

Désavantages :

• Génération d’un profil complexe• Perte d’information suite au lissage

- déplacement du λmax (shift)- rapport S/N diminue

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Application :Détermination d’hémorphines• Peptides contenant des résidus aromatiques (F, Y, W)• Digestion protéique et séparation par HPLC des peptides de la digestion• Détection DAD et quantification par 2ème dérivée

Séparation HPLC du digestat1- VVYPWTQRF2- LVVYPWTQRF

1- VVYPWTQRF 2- LVVYPWTQRF

Phe, 259 nm

Tyr, 283,5 nm

Trp, 289,5 nm

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Applications analytiques Complexe à transfert de charge

• Espèce fortement absorbante, constituée d’une espèce donneur d’é et d’une espèce accepteur d’é

• Peut servir à la détermination indirecte d’un analyte• Propriétés du réactif chromogène

– Stabilité en solution– Réaction rapide– Réaction quantitative– Absence d’absorption gênante– Absence d’influence d’ions étrangers

• Propriétés du complexe formé– Stabilité– Couleur suffisamment intense– Absence d’influence de faibles variations de pH,

température– Obéissance à la loi de Beer-Lambert


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Ex. : Dosage du fer (thiocyanate ou o-phénanthroline)

++ →+ 23218218

2 )(3 NHCFeNHCFe 1212

)3(3 )( nnSCNFeSCNnFe −−+ →+


Documents

5.0 Méthodes spectroscopiques d’analysethibaupi/CHM2971/DOC/CHM... · monochromateur (SBW) contrôlée par les fentes de sélection de λ et 2- la bande passante naturelle (NBW)