UNIVERSIDAD DE PANAMA

VICERRECTORIA DE INVESTIGACIÓN Y POSTGRADO

PROGRAMA CENTROAMERICANO DE MAESTRIA EN ENTOMOLOGÍA

"Caracterización Molecular de 6 cepas del gusano barrenador del ganadoCochliomyia hominivorax (Coquerel) y de la especie

Cochlíomyia macellaria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae)".

CLAUDIA E. TOLEDO PERDOMO

TESIS SOMETIDA COMO REQUISITO PARA OPTAR AL GRADO DE MAESTRAEN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN ENTOMOLOGÍA AGRÍCOLA

Asesor principal Dr. Steven Skoda, Ph.D.

Panamá, República de Panamá

2007

UNIVERSIDAD DE PANAMÁ

VICERRECTORIA DE INVESTIGACIÓN Y POSTGRADO

PROGRAMA CENTROAMERICANO DE MAESTRIA EN ENTOMOLOGÍA

"Caracterización Molecular de 6 cepas del gusano barrenador del ganado

Cochliomyia hominivorax (Coquerel) y la especie

Cochliomyfa mace//aria (Fabricius) (Diptera: Calliphoridae)".

CLAUDIA E. TOLEDO PERDOMO

2007

APROBADO

AGRADECIMIENTO

Deseo expresar mi eterno agradecimiento a Dios y la Virgen María, por sus múltiplesbendiciones que he recibido y a mis padres Julio y Bety por el apoyo que me hanbrindado.

Al comité de asesores Doctor Steven Skoda, Doctora Oris Sanjur, Magister Ivan Luna yMagister Percis Garcés.

•.. De una manera muy especial, quiero dar mi profundo agradecimiento a la Doctora OrisSanjur, del Instituto Smithsonian, por todo su apoyo incondicional y tiempo dedicado aesta investigación, además quiero resaltar mi agradecimiento por su calidad humana y suvaliosa amistad.

Agradezco al Doctor Steven Skoda, de ARS — USDA, quien depositó su confianza en miy me brindó la oportunidad de realizar esta investigación, además de su gran apoyo.

A los profesores Doctora Yolanda Águila, Magister Iván Luna y Magister Percis Garcéspor todo su apoyo durante todo el tiempo de mi desempeño en la maestría.

Al Servicio Alemán de Intercambio Académico -DAAD- por la beca otorgada para poderrealizar mis estudios de maestría, especialmente a Magister Neddy Zamora.

Al Doctor Eldrege Bermingham por darme la oportunidad de realizar mi investigación enel laboratorio de Biotecnología del Instituto Smithsonian.

A la Doctora Laura Geyer, Grethel Grajales, Maribel Gonzáles, Carlos Vergara, MabelleChong, Eyda Gómez y Javier Jara del laboratorio de Biotecnología del InstitutoSmithsonian. Así también a Jorge Castillo, Gladys Quinteros y Mario Vásquez dellaboratorio de Investigación del gusano barrenador del ganado ARS-USDA; y finalmente aRicardo Rovira y Rolando Torres del Instituto Conmemorativo Gorgas. A Todos ellos porsu amistad y apoyo.

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^1

Índice General

Índice de Figurasíndice de Cuadros jiResumen 1Summary 2Introducción 3Revisión de literatura 91. Descripción taxonómica y biológica del gusano barrenador del ganado

-GBG — C. hominivorax 102. Aspectos ecológicos en el comportamiento del GBG C. hominivorax 123. Distribución geográfica del GBG C. hominivorax 134. Descripción taxonómica y biológica de Cochliomyia macellaria 145. Principales características utilizadas para diferenciar C. hominivorax de

C. macellaria 166. Miasis 176.1. Signos clínicos 197. Miasis en humanos 20

8. Importancia económica 219. Métodos de control y erradicación 229.1. Sacrificio y tratamientos químicos 229.2. Producción masiva en laboratorio 229.3. Técnica del insecto estéril - TIS - 239.4. Programa de erradicación del gusano barrenador del ganado 2510. Análisis moleculares 2610.I El ADN mitocondrial de los insectos 2610.2 El ADN mitocondrial de Cochliomyia hominivorax 2710.3 Técnicas moleculares utilizadas 2815. Estudios genéticos realizados de C. hominivorax y C. macellaria 3115.1. Estudios para C. hominivorax 3115.2. Estudios para C. macellaria 3316. Características ecológicas de los lugares de origen de

las cepas de C. hominivorax 3416.1 Oaxaca, México 3416.2 Quintana Roo, México 3416.3 Chiapas, México 3516.4 Oeste de San José, Costa Rica 3616.5 Norte de la Ciudad de Panamá, Panamá 3617. Descripción de la crianza de las cepas 3718. Características de área de colecta de C. macellaria 38Materiales y métodos 391. Material biológico 402. Colecta de C. macellaria 423. Extracción del mtADN 434. Amplificación de PCR 445. Evaluaciones para cada Cebador 45

5.1 Cebador 3 455.2 Cebador 4 475.3 Cebador 7 485.4 Cebador 8 495.5 Cebador 9 495.6 Cebador 10 506. PCR para cada Cebador 517. Visualización de PCR 518. Preparación para cortar bandas 529. Secuenciación en ciclo (cycle sequencing) 5210. Columnas de Sephadex 5311. Optimización de protocolos de PCR para Cochliomyia macellaria 5311.1. Cebador 7 5311.2 Cebador 8 5311.3 Cebador 9 5411. Regiones amplificadas 5512. Análisis filogenéticos 55Resultados 571. Optimización de los cebadores para C. hominivorax 582. Optimización de los cebadores para C. macellaria 583. Tamaño de las regiones amplificadas 584. Relaciones filogenéticos de las cepas 584.1. Cebador 7 584.2. Cebador 8 604.3. Cebador 9 604.4. Consenso 60Discusión 661. Regiones amplificadas 672. Caracterización molecular de las cepas de C. hominivorax y C. macellaria 673. Relación molecular entre las 6 cepas de Cochliomyia hominivarax 69Conclusiones 76Recomendaciones 78Literatura citada 80Anexo 88Anexo 1 89Anexo 2 91

Índice de Figuras

Figura 1. Representación circular de mtDNA de C. hominivorax 28Figura 2. Jaulas de reproducción de las moscas y bandejas con pupas,

laboratorio de ARS-USDA, Pacora, Panamá. 38Figura 3. Localización geográfica del origen de las cepas evaluadas 41Figura 4. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax de la región

NADH5, mtADN 62Figura 5. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax de la región

NADH4/NADH5, mtADN 63Figura 6. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax de la región

NADH4 mtADN 64Figura 7. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax del consenso,

región NADH4 -NADH5, mtADN 65

II

Índice de Cuadros

Cuadro 1. Principales características para diferenciar C. hominivoraxy C. macellaria. 16

Cuadro 2. Latitud, longitud y año de colecta de las cepas deC. hominivorax y la especie C. macellaria. 40

Cuadro 3. Principales características de las cepas de C. hominivorax. 40Cuadro. 4. Principales características para diferenciar a los adultos de

C. hominivorax de C. macellaria en el campo 42Cuadro 5. Cebadores utilizados en la investigación. 45

RESUMEN

El gusano barrenador del ganado, Cochliomyia hominivorax (Coquerel) es una

plaga de importancia económica para animales de sangre caliente, principalmente el

ganado vacuno. El programa Agriculture Research Service (ARS) de USDA tiene

identificados a 6 cepas procedentes de México, Panamá y Costa Rica, las cuales fueron

caracterizadas molecularmente. Para ello se optimizaron 3 cebadores de 6 que fueron

evaluados. Por medio del método de secuenciación cíclica se obtuvieron las regiones del

genoma mitocondrial NADH4 —His tRNA — NADH5. Para establecer las relaciones

filogenéticas se realizaron los análisis de Parsimonia, NJ, Máxima Verosimilitud y

Bayesiano, mostrando la misma topología de la formación de 4 clados definidos. El

primero formado por las cepas de Oaxaca y Quintan Roo, el segundo por las cepas

procedentes de Chiapas, el tercero por las cepas de Costa Rica y Panamá y el cuarto por

una población de Brasil, la cual fue obtenida de GenBank. En la investigación también se

incluyó a la especie Cochliomyia macellaria (Fabricius), donde se evaluaron los tres

cebadores que se optimizaron para C. hominivorax, de los cuales se lograron optimizar

dos, amplificando la región de NADH4 y una pequeña región de NADH5. Con esta

región amplificada es posible la diferenciación molecular con C. hominivorax.

2

SUMMARY

The screwworm, Cochliomyia hominivorax (Coquerel) is an important pest which

parasitizes livestock and other warm-blooded animals. The Agriculture Research Service

(ARS) of the USDA identified 6 Zines from Mexico, Panama and Costa Rica, which nave

been characterized molecularly. Six primers were evaluated and three were optimized

and successfully amplified. Using cycle sequencing we obtained sequences from the

regions NADH4 — His tRNA -- NADH5. We used Parsimony, NJ, Maximum Likelihood

and Bayesian methods to analyze the phylogeny of the six lines and another population

from Brazil. These analyses resulted in singular topologies with four clades: the first

consisting of the fines from Oaxaca and Quintana Roo, the second clade consisting of the

lines from Chiapas, the third clade with the lines from Costa Rica and Panama and fourth

clade formed by ene population from Brazil, which we obtained from GeneBank. We

also included Cochliomyia macellaria (Fabricius). We evaluated three primers and

successfully amplified and optimized two. We obtained sequences from NADH4 and

part of NADH5. It is possible to differentiate between C. hominivorax and C. macellaria

using this region.

INTRODUCCIÓN

4

INTRODUCCIÓN

El gusano barrenador del ganado (GBG), Cochliomyia hominivorax (Coquerel),

es una plaga de importancia económica para animales de sangre caliente, principalmente

el ganado vacuno y también afecta a los humanos. Desde 1965 los gobiernos de Estados

Unidos y México iniciaron acercamientos a fin de compartir acciones para contrarrestar

los efectos del gusano barrenador. En 1966 el Departamento de Agricultura de los

Estados Unidos declara a la nación libre del gusano barrenador del ganado, asumiendo la

responsabilidad de mantener una barrera biológica a lo largo de las dos mil millas que

comprenden la frontera de México y Estados Unidos con el objetivo de prevenir una

nueva migración del gusano barrenador que reinfestara el territorio norteamericano. En

1972 se concretó la colaboración conjunta para la erradicación del gusano barrenador del

ganado. Para esto fueron necesarios 19 años para erradicarlo en México, por lo que en

1991 este país fue declarado oficialmente libre de esta plaga, siendo necesario la

dispersión de 250 mil 631 millones de moscas estériles. Los avances en la campaña de

erradicación en México definieron el establecimiento de una nueva barrera biológica

entre México y Estados Unidos en 1999 (Elizalde, 2005).

Posteriormente, el Programa se ha extendido con el propósito de abarcar todo el

Istmo Centroamericano, incluyendo Panamá, hasta llegar al Tapón de Darién. Mediante

esta nueva etapa del Programa de Erradicación del Gusano Barrenador se iniciaron los

programas de Guatemala en 1987, Belice en 1989, El Salvador y Honduras en 1991,

Nicaragua 1992 y Costa Rica en 1995. El avance del Programa hizo posible la

erradicación del gusano en Belice y Guatemala (1994), El Salvador (1995), Honduras

G

(1996) y Nicaragua (1999), Costa Rica (2000) (Embajada de Estados Unidos, Costa

Rica, 2005).

Las operaciones aéreas y de campo en Panamá iniciaron en 1998 y el avance en el

programa de erradicación del gusano barrenador del ganado ha sido significativo. Para

septiembre de este mismo año se registraron más de dos mil casos del gusano barrenador.

Para eI año 2004 ya las tres cuartas partes del territorio panameño se declararon

técnicamente libres de este insecto. En el 2005, un segundo caso de GBG ocurrió en

Metetí-Darién, identificado el 9 de junio del 2005 (COPEG, 2005; Embajada de Estados

Unidos en Panamá, 2005). Finalmente, en julio de 2006 Panamá fue declarado libre del

gusano barrenador del ganado.

El costo del Programa para la Erradicación del Gusano Barrenador en

Centroamérica ha sido de aproximadamente 200 millones de dólares y en Costa Rica de

41 millones. La relación de costo - beneficio de este programa en Costa Rica estuvo

entre 4.8 y 12.8. Si el programa costó 41 millones de dólares, se obtuvieron entre 168 y

448 millones de dólares en beneficios. Después de erradicado el gusano barrenador de

Costa Rica, los beneficios directos a los productores costarricenses se estimaron en más

de 13 millones de dólares por año. Los dos gobiernos compartieron los costos, de igual

manera que se hizo con los otros países centroamericanos 85 % de los costos los cubrió el

gobierno de los Estados Unidos de América y 15 % cada uno de los países

centroamericanos (Embajada de Estados Unidos en Costa Rica, 2006).

n

En la actualidad el gusano barrenador del ganado se encuentra presente en algunos

países del Caribe como Cuba, Republica Dominicana, Haití, Jamaica, Trinidad y Tobago

y en América del sur, exceptuando Chile, afectando la sanidad pecuaria y pública,

además de la economía de esas regiones, donde la población ganadera es de 463,392

millones (bovinos, equinos, sumos, ovinos, caprinos). Con respecto a la población

humana, existen 330,570 millones de personas en riesgo de ser atacados por el gusano

barrenador del ganado (FAO, 2005a). Asimismo, esta situación continúa poniendo en

riesgo de nuevas infestaciones a los países donde la plaga ya ha sido erradicada.

Una de las actividades importantes del programa de erradicación del gusano

barrenador del ganado es su correcta identificación. En estudios realizados se han

encontrados diferencias morfológicas entre individuos de distintas poblaciones del

gusano barrenador del ganado como la variación del color de cuerpo y de los ojos,

anormalidades de la venación de las alas y otras diferencias morfológicas. Estas

variaciones podrían influir en el vuelo, la visión, comportamiento, vigor, longevidad, etc.,

además de poner en duda su correcta identificación. Así, según Baumhover (1966) para

confirmar la identificación y separación de la plaga en estudios ecológicos o separar las

especies de poblaciones nativas es necesario el desarrollo de marcadores genéticos para

adultos. El estudio de los genomas mitocondriales (mtADN) se ha venido incrementando,

debido a que estos aportan información genética que puede ser usada en investigaciones

moleculares y de evolución. Estudios realizados por Litjens et al. (2001) demostraron que

en el gusano barrenador del ganado basando el análisis específico en las regiones mtDNA

a

7

facilitan el potencial de acercamiento para la identificación taxonómica y relaciones entre

poblaciones.

Actualmente el Servicio de Investigación Agrícola —ARS- del Ministerio de

Agricultura de los Estados Unidos —USDA- poseen 6 cepas del gusano barrenador del

ganado, las cuales presentan algunas diferencias morfológicas. Estas cepas son

procedentes de México, Costa Rica y Panamá. Su caracterización molecular, por medio

de las secuencias del mtADN ayudará a demostrar si existe alguna relación filogenética

entre ellas.

Cochliomyia macellaria (Fabricius) es una especie muy común en el neotrópico

de América, con un rango de distribución comprendido desde el sur de Canadá hasta

Argentina. Es considerada como una plaga secundaria de miasis en el ganado,

alimentándose principalmente de tejidos muertos (Litjens et al. 2001). Su distribución

geográfica se traslapa con la de C. hominivorax además que morfológicamente son muy

similares. Además del alto parecido morfológico entre los adultos de ambas especies,

también lo es en el estado inmaduro; es decir, en los distintos estadios larvales, que en

determinado momento resulta muy dificil identificarlas. Esto representa un problema

para el programa de erradicación del Gusano Barrenador del Ganado, debido a que las

liberaciones de moscas estériles, declarar una zona libre, una zona infestada o una zona

re-infestada dependerá de la correcta identificación de C. hominivorax. Una liberación

errónea en zonas donde ya no está la plaga representa un alto costo para el programa.

Debido a lo anterior es importante caracterizar molecularmente a las especies

8

Cochliomyia hominivorax y Cochliornyia macellaria porque esto aportará información

que posteriormente facilitar la separación entre ambas especies en las muestras de las

larvas colectadas en el campo y así permitirá tomar decisiones para el manejo del

programa de erradicación del ganado como por ejemplo realizar liberaciones de C.

hominivorax solo cuando realmente sean necesarias.

El presente trabajo tiene como objetivos: determinar la relación molecular entre las 6

cepas evaluadas de Cochliomyia hominivarax. Para cumplir con este objetivo se

realizaron los análisis filogenéticos de Neighbor Joining (NJ), Máxima Parsimonia,

Máxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML) y el Análisis Bayesiano. Asimismo,

caracterizar molecularmente cada una de las cepas de Cochliomyia hominivorax y

Cochliomyia macellaria por el método de secuenciación cíclica. Finalmente, optimizar

el protocolo para PCR y el programa para el termociclador utilizado por Maliphan et al.

(2006) para cada uno de los 6 cebadores utilizado en la investigación.

Revisión de Literatura

I[^7

El género Cochliomyia posee cuatro especies: C. aldrichi, C. hominivorax, C.

macellaria y C. mínima; de las cuales la que presenta mayor importancia económica por

su impacto sanitario en animales mamíferos y los seres humanos es C. hominivorax,

muy conocida comúnmente como el gusano barrenador del ganado, GBG (Hall, 1973 y

Cunninghain, 1993).

1. DESCRIPCIÓN TAXONOMICA Y BIOLOGICA DEL GUSANOBARRENADOR DEL GANADO —GBG- C. hominivorax

Phylum: Arthropoda

Clase: Insecta

Orden : Diptera

Suborden: Cyclorrhapha

Superfamilia: Muscoidea

Familia: Calliphoridae

Género: Cochliomyia

Especie: Cochliomyia hominivorax (Coquerel).

Cochliomyia hominivorax es un parásito obligado de los mamíferos, siendo

especie endémica en las regiones del trópico y sub-trópico del continente americano

(Norte, centro, sur América e islas del caribe). La temperatura templada es la que

presenta las condiciones óptimas para su desarrollo; sin embargo las sequías prolongadas,

temperaturas altas o muy bajas son condiciones sub-óptimas. La actividad de los adultos

de C. hominivorax decrece cuando la temperatura está por debajo de los 21°C y no

pueden sobrevivir cuando la temperatura es menor de los 9°C por un período de 3 meses

ó 4 días de vida las hembras copulan y comienzan a alimentarse. Dos días después

11

consecutivos o 12°C por 5 meses consecutivos durante el año (Erziclioglu, 1987 y

Jasiorowski, 1993). Los adultos poseen un alto poder de vuelo y dispersión, los cuales se

han reportado en moscas que han alcanzado una dispersión hasta de 290 Km en dos

semanas (Jasiorowski, 1993).

Según Baumhover (1966) y Drugueri (2004), el ciclo de vida de C. hominovorax

dura en total aproximadamente de 3 semanas a 2 meses, dependiendo de la temperatura y

de la humedad. Se ha demostrado que el ciclo es más corto en verano. Las hembras

ovipositan en los bordes de las heridas, ombligos de los neonatos, mordeduras, mucosas

lesionadas, orbita ocular, orejas, etc., las cuales son atraídas por el olor de la sangre del

animal. Estas pueden ovipositar en grupos de 200 a 500 en líneas que se superponen

como tejas en el borde de una herida. Las masas de huevos tardan entre 12 y 21 horas

para que eclosionen las larvas, pasando por tres estadios, dentro del tejido subcutáneo

del hospedero. Las larvas permanecen sobre el hospedero sólo de 5 a 7 días, luego caen

al suelo, donde se transforman en pupa y dependiendo de la temperatura, entre 1 a 8

semanas emergen los adultos (imagos). Los estudios han demostrado que las pupas

pueden sobrevivir un mes a una temperatura de -5°C, mostrando un 70% de eclosión.

Estudios más recientes indican que pueden permanecer de 45 a 50 días vivas a intervalos

continuos a esta temperatura.

En cuanto a los adultos, menos del 1% de los mismos sobrevivieron una noche a

temperatura de -6.7°C (Cunningham, 1993; Krafsur y Lindquist, 1996). A la edad de 3

ó 4 días de vida las hembras copulan y comienzan a alimentarse. Dos días después

12

empiezan a depositar los huevos. Con clima cálido el ciclo total dura 21 días

(Baumhover, 1966; Drugueri, 2004).

Crystal (1967) y Adams (1979) reportan que la edad de apareamiento de las

hembras es únicamente del tercero al quinto día. Las hembras incrementan gradualmente

su receptividad para aparearse desde el 3 al 14 día, ovipositan aproximadamente 200

huevos, en donde la condición nutricional de la hembra y los factores ambientales son

influyentes en esta cantidad.

2. ASPECTOS ECOLÓGICOS EN EL COMPORTAMIENTO DEL GBG, C.hominivorox

Según Thomas (1993), está especie es un parásito obligado, causante de una

miasis. Los adultos se localizan entre los arbustos de una zona boscosa en donde

reposan y se alimentan. Los árboles que están floreciendo son los preferidos,

alimentándose del néctar y miel, los cuales son necesarios para que el adulto sobreviva.

En general Thomas y Mangan (1989) demostraron la preferencia de la mayor cantidad de

moscas en zonas boscosas que en los pastizales abiertos. Entre el tercer y cuarto día de

edad las hembras llegan a ser sexualmente activas y el apareamiento ocurre generalmente

cuando los machos se agregan en algún sitio seleccionado de acuerdo al camino utilizado

normalmente por las hembras. Al quinto día de edad las hembras están listas para la

oviposición. La fase de apareamiento es la que reporta la mayor mortalidad debido a que

en este momento están distraídas y son presa fácil de hormigas y otros deperedadores y

oportunistas.

13

En cuanto a la dinámica poblacional de los adultos de C. hominivorax, Krafsur

(1987) reporta que existe una relación con veranos calientes y húmedos asociados a la

abundancia de las poblaciones de C. hominivorax, indicando la preferencia de estos

especimenes a dicho clima. Así también, estudios realizados por Gomes et al. (1998), en

Brasil, demostraron que en los meses donde se registraron medias de temperaturas

máximas de 29.7°C en enero y 29.3°C en febrero, combinadas con precipitación de

364.2mm y 185.0 mm, respectivamente, hubo disminución de la población de C.

hominivorax. Sin embargo, para el mes de marzo, donde se registró una temperatura

máxima de 30.1°C y una precipitación de 165.1 mm aumentó la población, por lo que

consideran que el nivel poblacional está asociado a la temperatura y la precipitación, en

donde a medida que aumenta la precipitación disminuye la población. Así también, las

influencias de la vegetación y su relación con el nivel poblacional de las moscas lo

demostraron Gomes et al. (1998), al obtener mayor captura en los lugares que

presentaban mayor cantidad de árboles, sugiriendo que estas moscas tienen preferencia

hacia lugares con mayor cantidad de árboles o arbustos.

3. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DEL GBG C. hominivorax

,' hominivorax, es nativa de las regiones tropicales y subtropicales del continente

americano. Previo a la erradicación, su distribución original estaba comprendida entre la

región de los paralelos 30° norte y 30° sur, abarcando el centro y sureste de los Estados

Unidos, México, Centro América, Panamá, las islas del Caribe y Sur América. En la

actualidad el gusano barrenador del ganado se encuentra presente en forma endémica en

América del Sur, excepto en Chile. También está presente en algunos paises del Caribe

14

como Cuba, Republica Dominicana, Haití, Jamaica, Trinidad y Tobago, poniendo en

riesgo una población ganadera susceptible de más de 515 millones de animales (FAO,

2005c).

4. DESCRIPCIÓN TAXONOMICA Y BIOLOGICA DE Cochliomyiamacellaria

Phylum: Arthropoda

Clase: Insecta

Orden : Diptera

Suborden: Cyclorhapha

Superfamilia: Muscoidea

Familia: Calliphoridae

Género: Cochliomyia

Especie: Cochliomyia macellaria (Fabricius).

Cochliomyia macellaria (Fabricius) es una de las principales especies que causan

miasis cutánea secundaria. Su distribución original se limita al continente americano

desde México hasta la Patagonia y en la región ártica hasta el sur de Canadá (Guimaraes,

1983).

Debido al hábito necrófago de las larvas, los adultos generalmente están asociados

con tejidos muertos junto con otras especies de las familias Caliphoridae, Sarcophagidae

y Muscidae. Económicamente, esta especie es menos importante que C. horninivorax; sin

embargo, C. macellaria también es encontrada parasitando tejidos necrótico en

mamíferos vivos, contribuyendo con la gravedad de la lesión ya existente en el mamífero.

15

Sin embargo, no se desarrolla en zonas profundas de los tejidos vivos como lo hace C.

hominivorax (Cunninghaim, 1993).

La longevidad de los adultos es de dos a seis semanas, encontrándolos con

frecuencia visitando carroña, animales muertos, depósitos de basura, frutos caídos, peces

expuestos en mercados, etc. (Guimaraes, et al. 1978; Byrd, 1995). Las hembras

ovipositan hasta 1,000 huevos en lotes de 40 a 250. En condiciones óptimas los huevos

eclosionan dos horas después de ser ovipositados y el período de desarrollo larval es de

aproximadamente de 6 a 20 días. Posteriormente, las larvas caen al suelo, donde pupan y

permanecen en este estado durante un período de 3 a 27 días. Finalmente, el período total

de desarrollo de huevo a adulto es de 39 días (FAO, 1993).

La selectividad de la distribución en el campo, cerca de carroña o animales

muertos responde en mayoría a las hembras con un 90%, debido a que estas buscan un

substrato para la oviposición. Un estudio realizado por Gomes et al. (2000) en Brasil,

reporta la presencia de C. macellaria todos los meses del año, coincidiendo el incremento

de la población con el aumento de la temperatura y el inicio de las lluvias. Los picos

poblacionales se presentaron en los meses de septiembre, octubre y diciembre durante el

periodo lluviosos y disminuyeron durante la época seca, en los meses de junio y julio.

Así también, Butler (1996) realizó estudios de laboratorio con C. macellaria, indicando

que la temperatura óptima para las larvas fue de 39°C. En el desarrollo del huevo a

adulto se evaluaron 3 temperaturas: 21°C, 26°C y 32.2°C mostrando mayor preferencia

por las altas temperaturas.

16

5. PRINCIPALES CARACTERISTICAS UTILIZADAS PARADIFERENCIAR C. hominivorax DE C. macellaria

Cuadro 1. Principales características para diferenciar C. hominivorax y C. macellaria(Cunninhaim, 1993).

C. hominivorax C. macellaria

Huevo Depositados en masas en forma de tejados Depositados en masas irregulares

Huevo La sutura dorsal extendiéndose desde el La sutura dorsal se extiende desde el

micrópilo hasta casi el extremo posterior, micrópilo abarcando el 80% del huevo.

Larvas Esclerito dorsofaríngeo pequeño Esclerito dorsofaríngeo grandePrimer InstarLarvas Troncos traqueales dorsales con pigmentación Troncos traqueales dorsales no tan

Segundo oscura. pigmentados.InstarLarvas Troncos traqueales dorsales de los estigmas Troncos traqueales dorsales

Tercer Instar posteriores con una pigmentación oscura pigmentados en la cuarta parte posterior

desde la unión con los estigmas hacia delante del último segmento, donde se unen con

hasta el segmento 9 ó 10. los estigmas posteriores.

Pupa Aproximadamente 10.2 mm de longitud y 4.3 Aproximadamente 7.6 mm de longitud

mm de ancho y 2.8 mm de ancho

Adultos Placas frontoorbitales con setas negras. Placas frontoorbitales con setas de color

Basicosta de la hembra de color pardo oscuro. claro.

Las hembras tienen en la parte posterior de la Basicosta de la hembra de color

cabeza una franja anaranjada rojiza. En los amarillo.

machos esta mancha es pequeña. En la parte posterior de la cabeza, los

En la parte ventral del abdomen, en el tercer y dos sexos tienen una mancha negra.

cuarto segmento, en los bordes laterales no En los bordes de la parte ventral del

tienen manchas blancas, solamente puntos abdomen, en el tercer y cuarto

blancos. segmento, presenta manchas blancas.

La herida Las larvas producen una herida profunda, en En los casos de miasis, las larvas se

forma de bolsa, alimentándose de manera alimentan de tejidos necróticos,

gregaria de los tejidos vivos, situadas con la alrededor de los bordes de la herida. En

cabeza hacia abajo y sin moverse mucho en la los animales de pelo largo por la lana o

superficie de la herida, pelo que la rodea, no producen una

herida en forma de bolsa.

17

6. MIASIS

Esta palabra proviene del griego myias (myia= mosca; ase = enfermedad), que

significa enfermedad causada por moscas. Representando la infestación de tejidos de

animales vertebrados por larvas de mosca. La ecología de la miasis es definida como el

conjunto de interacciones biológicas entre el huésped y los parásitos, causando una

infestación sobre animales y humanos por las larvas de algunas moscas (Diptera) de las

familias Calliphoridae, Sarcophagidae, Oestridae, Muscidae, Phoridae y Fannidae

(Poudevigne, 1995; Enciclopedia Microsoft Encarta, 2004; Boros, et al. 2006). Dentro de

las especies causantes de miasis se encuentran C. hominivorax, Chrysomya bezziana y

Wohlfahrtia magnifica (Jasiorowski, 1993).

Dos especies de Cochliomyia se encuentran asociadas a miasis, C. hominivorax y

C. macellaria. Sin embargo, en un principio, erróneamente C. macellaria ha sido

implicada como causante de miasis primaria durante muchos años, confundiéndola con

C. hominivorax. Las larvas de C. macellaria pueden ser muy abundantes en carroña.

Cuando estas se encuentran en miasis, son solamente invasoras en tejidos secundarios,

encontrándose en la superficie de la herida. Es vital para establecer un control una

correcta identificación del insecto causante del daño (Poudevigne, 1995; Boros, et al.

2006).

En función del parasito que provoca la infección se distinguen tres tipos de miasis (FAO

2005b).

a. Miasis Obligatoria: moscas cuyo desarrollo larvario tiene lugar íntegramente sobre

los vertebrados vivos.

18

b. Miasis Facultativa: mosca cuyas larvas se alimentan de carroña, pero, que

ocasionalmente pueden parasitar animales vivos.

c. Miasis Accidental: larvas de ciertas moscas que siendo habitualmente coprófagas o

saprófagas pueden llevar a cabo la oviposición sobre los alimentos, siendo capaces de

resistir la acción de los jugos gástricos y alcanzar el intestino.

Desde el punto de vista clínico, según Jasiorowski (1993) las miasis se pueden

agrupar en:

a. Miasis Cutánea: las larvas perforan la piel para alimentarse de la sangre del

hospedero (hematófagas). En otras especies de moscas las larvas atraviesan la piel sana

provocando un forúnculo o excavan galerías y túneles en la epidermis o tejidos más

profundos, provocando graves daños en el hospedero. En otros casos, los adultos son

atraídos por las heridas abiertas del futuro hospedero, depositando sobre estas los huevos.

Generalmente, la herida se torna circular y muy profunda de aproximadamente 5 a 10 cm

de profundidad o más, resultando en un extenso tejido destruido por las larvas. Estas

heridas tienen un característico olor a putrefacción. Las larvas de C. hominivorax se

encuentras en las partes profundas de la herida, a diferencia de las especies de daño

secundario que se encuentran cercanas a la superficie.

b. Miasis de las cavidades corporales: moscas que ovipositan en las cavidades

nasofaríngeas y oculares y en los conductos auditivos.

19

c. Miasis intestinales y urogenitales: infestaciones accidentales de esas zonas al

ingerir larvas o al penetrar estas por el recto. Ciertos adultos son atraídos por zonas

infestadas o sucias, infestando las larvas el tracto urogenital.

Según Poudevigne (1995), las características necesarias de la herida para que se

desarrollen las larvas de C. hominivorax son: tener una tasa alta de humedad y un pH de

7.2 como una condición mínima para la oviposición y para el desarrollo de las larvas. El

pH óptimo se ubica a 7.6 y se encuentra en miasis de tipo 3 o en herida con fuerte

contaminación por bacterias proteolíticas.

Los efectos patológicos que se producen de la infestación del gusano barrenador

del ganado pueden ser (Poudevigne, 1995):

• Efecto traumático causado por las larvas al alimentarse del tejido del animal;

• Efecto de irritación causado por el movimiento de las larvas dentro de la herida.

• Infección secundaria causada en la herida por otros organismos contaminantes como

bacterias, virus, protozoos u hongos.

• Efectos tóxicos a través de la excreción de las larvas.

6.1. Signos Clínicos

Las infestaciones comienzan en cualquier lesión abierta incluyendo algunas tan

pequeñas como las picaduras de garrapatas. Las hembras grávidas depositan sus huevos

en los bordes de las heridas. Las primeras larvas se mueven inmediatamente hacia la

herida y comienzan a alimentarse. En las primeras etapas es extremadamente dificil

K1]

detectar las larvas en la herida por su pequeño tamaño. Estas se hacen visibles sólo por

ligeros movimientos en la superficie de la herida (FAO, 2005a).

Después del tercer día de la infestación la herida se va haciendo

significativamente más grande por las larvas. Estas se pueden notar fácilmente

alimentándose en posición vertical a la herida con sus espiráculos expuestos en la

superficie y generalmente puede ser diferenciada de otras larvas de moscas por su

comportamiento en la herida. Las larvas se encuentran normalmente profundamente en

los tejidos del huésped y no en la superficie de la herida (FAO, 2005a).

En el quinto día la lesión es obvia, con grandes larvas de tercer estadio. La herida

tiene olor fétido característico del gusano barrenador del ganado y con un exudado

oscuro. En esta etapa la herida está mayormente predispuesta para subsecuentes

oviposiciones de otras hembras, contribuyendo así, a una mayor debilidad y la posible

muerte del animal (FAO, 2005a).

7. MIASIS EN HUMANOS

Desde 1935 se han venido reportando casos de miasis en humanos. A pesar que

existe poca información y divulgación de miasis en humanos es muy importante alertar a

la población humana que viven en áreas donde se encuentra la plaga del gusano

barrenador del ganado. Se ha demostrado que los casos en humanos han sido

prevalentemente en las poblaciones de grupos socioeconómicos bajos. Se han

encontrado casos donde se inicia la miasis por heridas, en mucosas con producción de

secreciones y otros donde los seres humanos han ingerido accidentalmente larvas de

21

dípteros en los alimentos. Otras larvas se desarrollan dentro de ella y pasan al ser

humano que las ingiere. Algunas de estas larvas, con cutícula muy resistente a los jugos

digestivos, son capaces de pasar a través del tracto digestivo y emerger vivas por el ano

(FAO, 2005a).

También se han presentado casos donde la miasis causa deformaciones

anatómicas permanentes (FAO, 2005 b). En la actualidad en Medellín, Colombia, se

han reportado 24 casos entre el año 2001 al 2005 en un hospital de tercer nivel,

presentándose los casos en las mucosas, oídos y el cerebro (Valderrama, 2006).

La miasis en humanos ha sido clasificada clínicamente según las cavidades

infestadas en los humanos: estomatomiasis, nasomiasis, rinomiasis, otomiasis (Boros, et

al. 2006).

8. IMPORTANCIA ECONÓMICA

El gusano barrenador del ganado (GBG), Cochliomyia hominivorax se le

considera una zoonosis; es decir, una enfermedad de los animales que puede ser

transmitida a los humanos. No obstante, los efectos de este problema en la producción

pecuaria resultan verdaderamente dramáticos. Las pérdidas económicas que se originan

con la infestación del gusano barrenador implican anualmente cientos de millones de

dólares. En los Estados Unidos previo a la erradicación, las perdidas anuales eran de

aproximadamente US$ 650 millones. El impacto de esta plaga en los animales es

inmediato: presentan disminución de peso, se deteriora la producción láctea y cárnica,

muestran daños en pieles y presentan infecciones en las heridas por bacterias

22

oportunistas. En algunas ocasiones llevan al animal a la muerte a través de la anorexia,

perdida de peso, anemia y hemorragia, etc. Aunque existen tratamientos para revertir el

problema, en la mayoría de los casos la solución implica el sacrificio e incineración del

animal; además, de los costos constantes de la vigilancia y el tratamiento. En el año

2002 las pérdidas ocasionadas por las gusaneras del gusano barrenador del ganado en

Brasil fueron de 150 millones de dólares (Crozariol, 2005).

9. METODOS DE CONTROL Y ERRADICACIÓN

9.1. Sacrificio y Tratamientos Químicos

Inicialmente se aplicó el control de la plaga mediante el empleo de tratamientos

químicos como lo son los insecticidas para matar la larva de la mosca y como medida

preventiva para evitar la reinfestación. En casos extremos algunos productores optaron

por el sacrificio de los animales (Jasiorowsky, 1993).

9.2. Producción Masiva en Laboratorio

El gusano barrenador del ganado fue reproducido artificialmente por primera vez

utilizando una dieta artificial para las larvas, que básicamente consistía en una mezcla de

leche, sangre, carne sin grasa y formalina. Para la colonia de adultos, se colocan en

jaulas, se alimentan con agua, miel y huevo molido (Baumhover, et al. 1969). Estudios

posteriores para la dieta de los adultos, han utilizando miel, producto del huevo

deshidratado y otra con miel y proteína de carne (Chaudhury, 2000). Actualmente se

producen masivamente en laboratorio con dieta artificial para larvas basada en leche,

23

sangre de ganado bovino, agua, huevo disecado y molido, fibra y formalina. La fábrica

de producción de la mosca estéril del gusano barrenador del ganado estuvo ubicada desde

1976 en Tuxtla Gutiérrez, México, produce aproximadamente 500 millones de moscas

por semana (Anderson y Leppla, 1992) y en el año 2006 fue trasladada a Pacora,

Panamá.

9.3. Técnica del Insecto Estéril - TIS -

La técnica del insecto estéril puede ser descrita de la forma más simple como una

forma de control de la natalidad. En 1937, el doctor E. F. Knipling fue el primero en

proponer la erradicación del gusano barrenador del ganado a través de la esterilización

de los machos, para que luego de su liberación en el campo estos se apareen con las

hembras nativas. En 1951 Bushland y Hopkins esterilizaron moscas del gusano

barrenador del ganado con 5 kv de rayos X o radiación gamma (60 Co) administrado a

pupas de 5 días de edad (Baurnhover, 1966). Las primeras experiencias de liberaciones

de la mosca del gusano barrenador del ganado en campo se realizaron en el sureste de

Estados Unidos de América, y posteriormente en la isla de CuraQao. Los estudios han

demostrado que la dosis de esterilización de rayos X y rayos gamma administradas al

gusano barrenador del ganado puede afectar seriamente la longevidad de los machos o

su competitividad bajo condiciones de laboratorio (Baumhover, 1966).

Según Knipling (1983), biológicamente el gusano barrenador del ganado presenta

las siguientes características a considerar en la aplicación de la técnica del insecto estéril

como herramienta del control autocida:

24

a. Es principalmente un insecto tropical y los estudios han demostrado una merma en

su población en los meses de invierno.

b. Las hembras presentan un comportamiento monógamo para aparearse.

c. Las larvas pueden infestar y madurar en un amplio rango de hospederos.

La técnica del insecto estéril requiere semanalmente una producción de millones

de insectos producidos en laboratorio, para posteriormente ser tratados con radiación X o

gamma para su esterilización, utilizando Cesium 137. Luego del tratamiento, los

insectos son dispersados en las áreas destinadas para la erradicación de la plaga en una

proporción de 10 moscas estériles por cada silvestre o su dispersión preventiva en áreas

erradicadas. Con esto se pretende que en el campo se produzca el apareamiento de los

machos esterilizados en laboratorio con hembras silvestres, nativas de la región. De esta

forma se interrumpe el ciclo de vida y progresivamente se reduce la población

(Jasiorowski, 1993).

La técnica goza de total selectividad; es decir, que los insectos estériles liberados

copulan solo con los de su misma especie, no alterando el equilibrio biológico del

agroecosistema, dirigiéndose sólo hacia la plaga que se desea controlar y no se

desarrollan resistencias (Jasiorowski, 1993).

25

9.4. Programa de Erradicación del Gusano Barrenador del Ganado -GBG —

En 1933 el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos determinó que la

mosca del gusano barrenador del ganado C. hominivorax era distinta a la especie C.

macellaria, la cual en 1858 Coquerel, médico francés, la descubrió en lo senos frontales

de un convicto que finalmente murió. Desde entonces se han registrado muchos casos en

humano (Romero, 2003).

En 1936 se llevó a cabo la producción masiva bajo condiciones artificiales por

Melvin y Bushland. En la erradicación fue decisivo también el uso de la técnica de los

insectos estériles propuesta por Knipling en 1937. La técnica del insecto estéril ha sido

su primera y más ambiciosa aplicación en todo el mundo hasta el momento. En 1972 se

estableció la Comisión México- Americana para la erradicación del gusano barrenador

del ganado y ha continuando a partir de ese momento a extendiéndose por toda Centro

América. La erradicación del gusano barrenador en los Estados Unidos de América y en

México se ha conseguido con un costo superior a los 500 millones de dólares EE.UU

(Bram, 1985; FAO, 1992; Elizalde, 2005; Vargas- Terán, et al, 2005).

En respuesta a la emergencia sanitaria acontecida por esta plaga, la Organización

de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) designó y realizó

con éxito un programa de erradicación basado en la técnica del insecto estéril (TIE). Una

de las primeras acciones de la FAO fue recomendar que la miasis ocasionada por el

gusano barrenador del ganado se incluyera en la lista internacional de enfermedades de

26

los animales de notificación obligatoria (Lista B). La recomendación fue aprobada por la

sesión general en la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) en París, el 12 de

mayo de 1989. Esto significó que la enfermedad se incluiría en los sistemas de reporte

internacional y los datos de ocurrencia se publicarían en el Libro Anual de Salud Animal

de la FAOIWHO/OIE. Asimismo, que las recomendaciones especiales para la

importación y exportación de animales se incluyeran en el Código Zoosanitario

Internacional de la OIE (FAO, 2005a).

10. ANALISIS MOLECULARES

10.1 El ADN Mitocondrial de los Insectos

Los genes de los artrópodos están formados por el DNA localizado en los

cromosomas y consisten en proteínas. RNA y DNA. El DNA es un polímetro de

nucleótidos. Cada nucleótido consiste de un azúcar pentosómico, una de las cuatro bases

nitrogenadas (adenina, timina, guanina, citosina) y un grupo fosfato (Hoy, 2003).

El DNA en los insectos presenta una estructura compleja, por lo que las diferentes

especies de los insectos tienen un número diferente de cromosomas haploides,

constituidos en un rango de 1 a 221. El porcentaje de bases nitrogenadas es menor en

los insectos que en los vertebrados. Por ejemplo, guanina + citosina ((3+C) presentan un

32% - 43% del ADN, comparado con los vertebrados que presentan el 45% (Hoy, 2003).

27

El ADN mitocondrial es el material genético ubicado en las mitocondrias y

generan energía para la célula. Este no se recombina, así que los únicos cambios que

puedan presentarse se deben a mutaciones a lo largo de múltiples generaciones, es decir,

durante el tiempo evolutivo. El rango del tamaño del genoma mitocondrial se encuentra

de 6 kb a más de 2 Mb. En el ADN mitocondrial (mtADN) se da la fosforilación

oxidativa que da como resultado la formación de trifosfato de adenosina (ATP), que es la

molécula primaria de almacenamiento de energía química en la célula. El mtADN es un

componente significativo de el total del ADN en las células de los insectos y es

transmitido por la madre a la progenie (Hoy, 2003).

10.2 El ADN Mitocondrial de Cochliomyia hominivorax

Los aspectos que favorecen el uso del mtADN como un marcador evolutivo son:

el predominio de la línea materna, la falta de una extensiva recombinación y la rápida

proporción de sustitución de nucleótidos.

El genoma mitocondrial de C. hominivorax, según Lessinger et al. (2000) es una

molécula circular de 16022 pb. Al analizar el contenido del gen y la organización en

general corresponde a una típica Brachycera. En el genoma de C. hominivorax se

encontró un gen que usualmente contiene 13 proteínas codificables, 22 genes tRNA y 2

genes rRNA. La principal región no codificable, identificada como la Región Control

del mtADN, está localizada entre el tRNA y rRNA y los genes 12S con un tamaño de

1175 pb. Además, la Región Control posee un alto contenido de A+T (77%) al igual

28

que otras especies del orden Diptera (Ceralitis capitala, Drosophila yacuha, Drosophila

melanogaster, Anopheles gambie, Anopheles quadrimaculatus).

tRNR-Val

tO-Leu

15KND1

tRNH-Ser

12.5K

CYTB

tRFIR -T 6 ./ L@K-Pro

ND4L

rRNR -H

- CDS +trnd- CtS -trard

tRNR-MettP.NR-1 le

tRNA-CystRNA-Tyr

2.SK "

C07S1

- CpxptRNH-Leu •SK ,,

• -tR-LysffPá11 Yk3• tRNR

COM3

ND3N45 NR-G y

trr+n °stRkR-Arg

tHNR-RlatRNR-Rsn

YRNF-C1utRNF-p€

- RNp +strand- RHH -strand

Fig 1. Representación Circular de mtDNA de C. honúnivorax(Fuente: Maliplian eta!. 2006).

10.3 Técnicas Moleculares Utilizadas

a. Extracción de ADN

La aplicación de diversas técnicas para la investigación en el campo de la biología

molecular para el análisis del genoma depende de la extracción del ADN puro, con alto

rendimiento y de muy buena calidad. Existen varios métodos para la extracción del

ADN. Su elección dependerá del tipo de tejido a utilizar. Las membranas celulares

deben destruirse de manera que el ADN sea liberado dentro del buffer de extracción. El

ADN debe ser protegido de la acción enzimática, por lo que se utiliza detergentes como

EDTA (ácido etilene-diamintetracético), agente quelante que une los iones de magnesio.

Luego de la incubación inicial, las proteínas desnaturalizadas y la mayoría de los

29

carbohidratos son removidos al emulsificar la mezcla buffer y tejido con fenoles o

cloroformo (Gallego, 2002).

b. Reacción en Cadena de la Polimerasa —PCR-

El PCR es una metodología in vitro utilizada para sintetizar enzimáticamente

secuencias definidas de ADN. Este método fue inventado por Kary Mullis en 1983. La

reacción en cadena de la polimerasa permite la amplificación masiva de las secuencias de

ADN específicas, siendo una herramienta importante en la biología molecular. Esta tiene

su fundamento en la anexión de dos cebadores cortos. Cada uno de ellos son

complementarios en la secuencia del ADN flanqueante de la región a ser amplificada

(Gaitán y Gallego, 2002). La reacción usa una plantilla de ADN, dos oligonucleótidos

cebadores que hibridizan a la cadena opuesta del ADN y la enzima Taq ADN

polimerasa, que cataliza la elongación de los "cebadores. La mezcla de los cebadores,

ADN, dNTPs (dexonucleótidos trifosfatos), MgCb y Taq es calentada para separar las

cadenas del ADN que tienen la secuencia de interés (Cox y Sinclair, 1998; Gaitán y

Gallego, 2002).

c. Electroforesis

Se conoce como electroforesis al transporte de partículas a través de un disolvente

mediante un campo eléctrico. Esta técnica fue desarrollada inicialmente por Ame Tiselius

en 1930 para la separación de proteínas séricas (Bernal, 2002). La mayoría de los

polímeros biológicos poseen cargas eléctricas, siendo capaces de migrar bajo la

30

influencia de un campo eléctrico. Esta es una técnica muy utilizada en la separación de

ácidos nucleicos. En la electroforesis de ácidos nucleicos, el efecto de tamiz molecular

del gel también es el principal factor de la separación, puesto que la relación carga- masa

es la misma para todos los polinucleótidos. Las moléculas de menor tamaño avanzan más

rápidamente a través del gel que las de mayor tamaño (Freifelder, 1991).

d. Secuenciación

La secuenciación de nucleótidos en el ADN es la portadora de la información

genética que codifica por proteínas y RNA. En los años 70 se generaron dos métodos

para realizar este procedimiento. El primero es el método de Maxam y Gilbert

(Degradación química), que consiste en la utilización de reactivos químicos que

modifican especialmente las purinas y pirimidinas presentes en el ADN, realizando

cuatro reacciones. La cadena se rompe de un modo selectivo en cada una de las

posiciones ocupadas por las cuatro bases modificadas. El segundo método es el de

Sanger en Inglaterra (enzimático), el cual se fundamenta sobre dos propiedades del ADN

polimerasa, es decir, su habilidad para sintetizar una copia complementaria de una

plantilla de ADN y de utilizar 2'3'-dideoxinucleósidos trifosfatos como sustratos. Este

método consiste en la síntesis de una cadena complementaria al ADN que se pretende

secuenciar. En un ADN de cadena sencilla se aparea un oligonucleótido cebadores

complementario que actúa como cebador (Gaitán, 2002). Según Hoelzel (1992), la

secuenciación es un método óptimo para la comparación de poblaciones debido a su alta

resolución y facilidad de interpretación.

31

e. Secuenciación en Ciclo

Este procedimiento consiste en una amplificación lineal de la reacción de

secuencia, usando 25 ciclos de desnaturación y alineamiento de un cebador específico a

una cadena y la extensión en presencia de Taq DNA polimerasa más dideoxinucleotidos

marcados (Fluorescencia). Una de las principales ventajas de esta técnica es reducir la

cantidad de ADN necesaria para la secuenciación, debido a que se produce una cantidad

suficiente después de 25 ciclos de amplificación (Gaitán, 2002).

Según Gaitán (2002) se han determinado las siguientes aplicaciones de la

secuenciación en ciclo:

• Evolución de genes, incluyendo estudios del proceso que produce la variación a nivel

de secuencias, estudios del origen de alelos nuevos o loci nuevos e investigaciones de

convergencia y selección.

• Estudios de poblaciones o intraespecíficos incluyendo estudios de variación

geográfica, flujo de genes, hibridización y conservación genética.

• Estudios interespecíficos tales como la construcción de filogenias de especies para

evaluar la macroevolución de patrones y procesos.

15. ESTUDIOS GENÉTICOS REALIZADOS A C. hominivorax y C macellaria

15.1. Estudios para C. hominivorax

Lessinger et al. (2000) determinaron la secuencia del genoma mitocondrial del

gusano barrenador del ganado, obteniendo una secuencia de 16,022 pb (pares de bases),

indicando que este tamaño es típico de un genoma mitocondrial del suborden Brachycera.

32

También se han realizado varios estudios genéticos poblacionales en el gusano

barrenador del ganado en varias regiones de América. Por ejemplo, Roehrdanz (1989)

realizó estudios de la variabilidad genética intraespecífica del mtDNA de 30 cepas de C.

hominivorax, desde Texas hasta Costa Rica utilizando 15 enzimas de restricción,

demostrando que estas poblaciones presentan variación genética. Azeredo-Spin, (1993)

realizó estudios para 12 poblaciones de Brasil procedentes de 7 localidades encontrando

alta variabilidad en el genoma mtADN. De igual forma, estudios de análisis

citogenéticos y morfológicos han sido desarrollados en algunas poblaciones del gusano

barrenador del ganado en Norte América y Brasil (Vargas y Lima, 1995). Narang y

Degrugillier (1995) realizaron estudios con el gusano barrenador del ganado con

poblaciones de Libia y las comparó con las de Norte y Centro América, Jamaica y Sur

América, utilizando 8 enzimas de restricción. También Jaramillo y Villada (1999),

trabajaron en 6 poblaciones panameñas del gusano barrenador del ganado secuenciando

el gen Citocromo oxidara I, encontrando que las secuencias no presentaron diferencias

significativas concluyendo que en Panamá existe panmixia entre las poblaciones

estudiadas. Lyra et al. (2005) realizaron estudios en siete poblaciones del gusano

barrenador del ganado y de C. macellaria en distintas zonas geográficas ganaderas de

mayor importancia de Uruguay, observándose nueve haplotipos, demostrando una alta

variabilidad en el mtADN de las poblaciones evaluadas. Sin embargo, al aplicar el

índice de similaridad, indicó que no hay evidencia de diferenciación en las sub-

poblaciones, concluyendo que la población de C. hominivorax de Uruguay es una única

población en equilibrio. Posteriormente, Maliphan, et al. (2006) realizó estudios en

33

poblaciones criadas en el laboratorio de Bioseguridad USDA-ARS de Lincoln,

Nebraska, utilizando 30 enzimas de restricción encontrando 16 sitios de restricción.

15.2. Estudios para C. macellaria

Lessinger y Azerdo-Espin (2000) dirigieron sus estudios en varias especies de

moscas causantes de miasis (Cochliomyia hominivorax, Cochliomyia macellaria,

Chrysomya megacephala, Luculia eximia y Dermatobia hominis) en la región de

Control del ADN mitocondrial, encontrando una variación en la longitud entre especies

comprendidas entre 1,000 pb a 1,600 pb. Litjens, et al. (2001) también realizaron

estudios en la caracterización molecular de C. hominivorax e incluyeron a la especie C.

macellaria. Ellos amplificaron dos regiones específicas, Citocromo Oxidasa subunidad I

con 870 pb y la Región Control hasta el gen 12S rRNA con 2,100 pb en siete

poblaciones de Brasil.

Con respecto a C. macellaria con técnicas como RAPD-PCR, RFLP-PCR, etc.

están el de Skoda, et al. (2002) quienes realizaron estudios comparativos con C.

hominivorax y C. macellaria utilizando la técnica ramdon amplified polymorphic DNA —

polymerase chain reaccion (RAPD-PCR) evaluando 120 "primers" elegidos al azar, de

los cuales encontraron 21 "primers" que producen marcadores. Posteriormente fueron

estudiados estos 21 "primers", en dónde encontraron que siete de estos producen claros y

reproducibles marcadores que fueron evaluados en cuatro poblaciones del gusano

barrenador del ganado y C. macellaria.

34

16. CARACTERISTICAS ECOLOGICAS DE LOS LUGARES DE ORIGENDE LAS CEPAS DE C. hominivorax

16.1 OAXACA, MEXICO

Oaxaca esta ubicada al norte 18°39', al sur 15°39' de latitud norte; al este 93°52', al

oeste 98°32' de longitud oeste. En esta región predomina el clima tropical. Su

temperatura media anual es de 18°C. Sin embargo, presenta una geografía provocando

variaciones del clima, en los litorales prevalece una temperatura promedio de 27°C,

mientras que en el valle es de 22° C con clima templado subhúmedo. En cuanto a la

altitud, la mínima está al nivel de mar, presentando un clima cálido, y la máxima se

encuentra en la Sierra Madre del sur con 3,750 msnm en donde el clima es templado con

inviernos fríos. En Oaxaca se encuentran todos los ecosistemas, desde selvas húmedas y

bosques tropicales hasta selvas secas, bosques espinosos y zonas desérticas. La

precipitación promedio anual se presenta desde los 509 mm hasta los 3795 mm,

dependiendo de la región (INEGI, 1998; INEGI, 1999; I EGI, 2000; SEP, 1997)

16.2 QUINTANA ROO, MEXICO

Geográficamente Quintan Roo está ubicada al norte 21°37', al sur 17°53' de

latitud norte; al este 86°42', al oeste 89°20' de longitud oeste. El relieve es escaso,

presentando su altitud máxima a 230 msnm. En este estado predomina el clima tropical

con lluvias en verano, excepto en el suroeste y el sureste, donde predomina una

temperatura tropical con intensas lluvias periódicas e invierno seco en el norte. Al oeste

también es tropical, pero con lluvias intensas en verano. Al norte, el clima es de sabana

con lluvias periódicas e invierno seco. La temperatura media anual es de 26 °C. Su

35

precipitación promedio anual fluctúa entre 1061 mm a 1393mm. La época seca es de

febrero a mayo y la lluviosa de mayo a octubre, aunque con frecuencia se prolonga hasta

enero en forma de chubascos procedentes del norte. La flora varía de acuerdo con el

clima, entre selva baja a alta (Campillo, 1988; INEGI, 1998).

16.3 CHIAPAS, MEXICO

Chiapas está ubicada al norte 17059', al sur 14°32' de latitud norte; al este 90

022', al

oeste 94° 14' de longitud oeste. Su territorio está conformado con zona de montaña y de

planicie. En la sierra de Chiapas existen grandes extensiones de terreno pobladas por

bosques y selvas con plantas y animales de clima templado húmedo. La parte baja de

Chiapas está compuesta de bosques caducifolios y praderas y la zona costera de

manglares. En general, su clima es tropical húmedo y sub-húmedo, debido a que este

cambia dependiendo de la altura del lugar. En Los Altos es templado húmedo y con

muchas lluvias en verano. En las localidades de lugares bajos, como Tapachula, tienen

clima cálido con una temperatura media anual de 27.8 °C. En Chiapas llueve en los

meses más calurosos y las lluvias disminuyen en los meses fríos. Su precipitación

promedio es muy variable, dependiendo de la localidad, siendo entre 3,977.5 mm para la

zona más lluviosa (Pichucalco) a 1,105.5 mm en San Cristobal de las Casas (Gordillo y

Ortíz, 1977; SEP, 1997; INEGI, 2000).

UNIVERSIDAD DB PANAMA

BIBLIOTECA

36

16.4 OESTE DE SAN JOSE, COSTA RICA

Las colectas de la cepa de Costa Rica se llevó a cabo en el oeste de San José,

donde se encuentra el territorio de San Ramón de Tres Ríos y Coronado presentando una

latitud de 9° 53'13.70" Norte y una longitud 83° 59' 4.95" Este. Esta región se

caracteriza por tener una altitud de 1500 msnm. Pertenece a la zona de vida Bosque

Pluvial Montano Bajo. Su precipitación media anual de 1834.5 mm con una temperatura

promedio anual de 19.1 °C. Esta región posee suelos volcánicos con pendientes de 15% a

60%, topografia bastante accidentada. La época lluviosa está comprendida ente mayo a

noviembre y la época seca de diciembre a abril (Herrera y Gómez, 1985; Gómez y

Herrera, 1986; Anónimo 1988; Herrera y Gómez, 1993).

16.5 NORTE DE LA CIUDAD DE PANAMA, PANAMA

La ciudad de Panamá está ubicada a los 9 00' 53" de latitud Norte y 79 31' 02"

de longitud Oeste. Su altitud oscila entre 0 y 125 msnm. Presenta clima tropical con una

temperatura promedio de 27.7°C y humedad relativa promedio anual 70%. El clima

en el entorno del distrito y en el área de la ciudad es lluvioso durante los meses de mayo

a diciembre y cuenta con una temporada seca de enero a abril. El viento norte veraniego

mantiene el clima fresco constantemente. Esta región presenta una precipitación media

diaria de 5.1 mm y una humedad relativa media anual de 75%. La temperatura a lo largo

del año oscila entre 25° C y 35° C, dependiendo del mes. La precipitación anual

promedio es de 1900 mm (Diccionario Geográfico de Panamá, 2001; Hidromet, 2006).

37

17. DESCRIPCION DE LA CRIANZA DE LAS CEPAS

Cada una de las cepas del gusano barrenador del ganado fueron criadas en

laboratorio como poblaciones aisladas. El laboratorio actualmente se encuentra en la

planta productora de moscas estériles ubicada en Pacora, Panamá. Estas instalaciones

cumplen con las características de un laboratorio de bio-seguridad de nivel 2 (BSL2),

siendo apropiado para trabajar fluidos corporales y tejidos que presentan un agente de

infección que podría ser desconocido. Si el laboratorio es usado correctamente funciona

como una barrera primaria. Su uso correcto implica el empleo de mascarillas protectoras,

guantes, batas o uniforme especial para el laboratorio. El personal y visitantes deben

bañarse antes y después de accesar a eI. Las instalaciones del laboratorio cuentan con

las siguientes áreas relacionadas con la cría de las moscas:

• Cuarto de preparación de la dieta para las larvas. Lugar donde se tiene los

ingredientes y equipo para prepara las dietas.

• Cuarto de crecimiento larvario, apareamiento y oviposición. Lugar que posee

bandejas plásticas que contienen las dietas.

• Cuarto de eclosión: en este cuarto las pupas han sido colocadas en pequeños vasos de

plástico dentro de una jaula para esperar que las pupas eclosionen.

Un cuarto caliente para guardar equipo de trabajo (esterilización).

38

a. b.

Figura 2. a. Jaulas de reproducción de las moscas, Laboratorio ARS-USDA, Pacora Panamá. .b. Bandejas con pupas, Laboratorio de ARS-USDA, Pacora, Panamá.

18. CARACTERISTICAS DE ÁREA DE COLECTA DE C. macellaria

La colecta fue realizada en el corregimiento de Pacora, el cual se encuentra

dentro del perímetro de la ciudad de Panamá, a una latitud de 9 04' 59" norte y una

longitud de 79 17' 27" oeste. Presenta una altitud entre 20 a 199 msnm. Su temperatura

promedio en los meses de colecta (15 de marzo — 15 mayo) es de 27.4 °C y

precipitación promedio anual 1300 mm. Se ubica en la zona de vida según Holdridge de

Bosque húmedo tropical, aunque parte de ese bosque ha sido deforestado por el

crecimiento urbano (Diccionario Geográfico de Panamá, 2001; Hidromet, 2006).

K

MATERIALES Y MÉTODOS

40

1. MATERIAL BIOLÓGICO

Se utilizaron especimenes de 6 cepas del gusano barrenador del ganado

Cochliomyia hominivorax y la especie Cochliomyia macellaria. Las cepas, fueron

colectadas en México, Costa Rica y Panamá, en las localidades descritas en el cuadro 2 y

figura 4. Posteriormente se levantó un pie de cría, donde hasta la fecha se mantienen en

laboratorio como poblaciones aisladas en jaulas. El cuadro 3 muestra las principales

características morfológicas que diferencian a cada cepa del gusano barrenador en este

estudio.

Cuadro 2. Latitud, Longitud y año de colecta de las cepas de C. hominivorax y la especieC. macellaria.

Especie Cepa Lugar de Procedencia Latitud Longitud Año

C. hominivorax LH Oaxaca, México 17.05 -96.7167 1983

C. hominivorax P-95 Norte de la ciudad de Panamá, Panamá 9.3333 -82.25 1995

C. hominivorax CECH Quintana Roo, México 19.6667 -88.5 1983

C. hominivorax PA-34 Chiapas, México 16.5 -92.5 1983

C. hominivorax CR-92 Oeste de San José, Costa Rica 10 -84.25 1992

C. hominivorax Limón Chiapas, México 16.5 -92.5 1993

C. macellaria Pacora, Panamá 8.41667 -81.67 2006

Cuadro 3. Principales características de las cepas de C. hominivorax.

Especie Cepa Principales caraterísticasC. hominivorax LH ojos amarillosC. hominivorax CECH ojos rojosC. hominivorax LIMON ojos verde claroC. hominivorax PA-34 ojos anaranjadosC. hominivorax P-95 tipo salvajeC. hominivorax CR-92 tipo salvaje

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42

2. COLECTA DE C. macellaria

Durante dos meses (15 marzo — 15 mayo de 2006) se realizó la colecta en el campo,

iniciando la actividad con la selección del sitio adecuado. Estas actividades se realizaron

en los campos de Pacora, Panamá. Para esto se utilizó como atrayente hígado de pollo,

que fueron colocados en un recipiente plástico con tapadera y dejado en un cuarto a

temperatura ambiente durante 3 días previos al inicio de la colecta para que se iniciara el

proceso de descomposición y sirviera como atrayente de las moscas. Se colocó el

hígado en una bandeja de plástico a un lado del cerco de los potreros, se capturaron las

moscas con la ayuda de una red entomológica. Estas se identificaron y se colocaron en

viales. Para la identificación de la mosca en el campo se usaron los criterios que

aparecen en el cuadro 4.

Cuadro. 4. Principales características para diferenciar a los adultos deC. hominivorax de C. macellaria en el campo (Álvarez, 1996).

Características C. hominivorax C. macellaria

Cabeza Vista dorsal: punto rojo entre los ojos en Vista dorsal: sin punto rojo en

las hembras. hembras y machos.

Vista frontal: con pelos frontales Vista frontal: con pelos frontales

entrecruzados. NO entrecruzados

Tórax Vista dorsal: con 3 líneas oscuras (las dos Vista dorsal: con 3 líneas oscuras

externas de iguales y la interna más corta). (las tres del mismo tamaño).

Ala: Basicosta Pigmento café oscuro Pigmento café claro

ABDOMEN Vista ventral: pubescencia blanca poco Vista ventral: pubescencia blanca

notoria, muy notoria.

Los viales que contenían las moscas vivas se llevaron al laboratorio, donde se

colocaron en un congelador con una temperatura de -26°C para que murieran congeladas.

43

Luego de un periodo de 4 horas de permanecer en el congelador se sacaron del mismo y

se le aplicó a cada vial alcohol al 95%. De esta forma, las moscas estaban listas para ser

llevadas al laboratorio de Biología Molecular del Instituto Smithsonian en Naos, Panamá.

3. EXTRACCIÓN DEL mtADN

El ADN se extrajo utilizando CTAB (bromuro de 6,10,3 metilamonio) como

extracción inicial. El tórax de cada mosca de las cepas en estudio se maceró en la

solución de 2X CTAB (500 µl) y se le agregó 10 µl de proteinasa K (20p.glµi), luego se

incubó a 55 °C por toda la noche. Posteriormente, la mezcla se lavó con 5O0µ1 de fenol:

cloroformo: alcohol isoamilico (PCI) y mezcló por 5 minutos. Luego se centrifugó a

14,000 rpm durante 3 minutos. El sobrenadante se colocó en un tubo nuevo y limpio.

Posteriormente, la mezcla se lavó nuevamente con 500pl de fenol: cloroformo: alcohol

isomilico (PCI) y mezcló por 5 minutos. Después esta se centrifugó a 14,000 rpm

durante 3 minutos. El sobrenadante de estas muestras se extrajo con 500 pl de

cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló a mano por 5 minutos y se centrifugó a

14,000 rpm durante 3 minutos. Posteriormente, el sobrenadante de esta mezcla se

extrajo con 500 µl de cloroformo: alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló a mano por 5

minutos y se centrifugó a 14,000 rpm durante 3 minutos. Finalmente el sobrenadante de

esta última mezcla se agregó 1000 p.l de etanol al 100% y dejó precipitar el ADN toda la

noche a -20°C. Luego de la precipitación, la mezcla se centrifugó a 12,000 rpm durante

45 minutos a 4 °C para formar un pellet con el ADN en el fondo del tubo, al cual se le

decantó el etanol. Posteriormente se agregó 1000 ji1 de etanol 70% a -20°C para lavar el

44

pellet de ADN y se centrifugó a 14,000 rpm durante 15 minutos, este etanol se decantó y

se con la máquina "Speed Vac" o en la incubadora a 55°C. Finalmente, a esta muestra

se le agregó 100 µl de buffer TE para resuspender el ADN. Al ADN extraído se verificó

la calidad mediante electroforesis en agarosa.

4. AMPLIFICACIÓN DE PCR

Los cebadores rediseñados fueron apareados y utilizados en la amplificación del

mt ADN. La reacción de PCR que se estableció para iniciar la investigación fue la

propuesta por Maliphan et al. (2006). Las reacciones de PCR fueron conducidas en una

mezcla de PCR de 25p.l conteniendo 2 µg del stock de ADN extraído anteriormente; 2.5

µl de la solución buffer lI T OX PCR; 0.25 pi de Qiagen Taq DNA polimerasa; 2 µl de

200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; 0.2 µM de cada cebador; 2.5 µl de 2.5

mM de MgC12 y agua doblemente destilada para completar el volumen. La mezcla de

PCR se colocó en el termociclador PTC-200 Peltier Thermal Cycler.

La reacción que fue desarrollada en el termociclador empleó como base una

desnaturalización inicial del DNA a 94°C por tres minutos. Posteriormente, 94°C por un

minuto. Después se dio el reconocimiento de cada cebador de la cadena de DNA a una

temperatura entre 50°C — 60°C por 30 segundos (más adelante se especifica para cada

cebador). Luego se pasó a la etapa de alargamiento de la nueva hélice de DNA a 72°C

por un minuto. Después de 35 termociclos, se hizo un alargamiento final a 72°C por dos

minutos. Algunos de estos pasos fueron optimizados para lograr la amplificación,

45

procedimiento que se detalla mas adelante. Finalmente, una muestra de los productos

amplificados fue visualizada en electroforesis de gel de agarosa. El residuo de la muestra

fue almacenado a 4°C para futuros análisis. Los cebadores que fueron evaluados y sus

regiones de amplificación son descritas en el cuadro 5.

Cuadro No. 5 Cebadores utilizados en la investigación (Maliphan et al. 2006).

CÓDIGO NOMBRE SECUENCIAS TAMAÑO ( h)3F N2-J-1480 TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC 24503R C2-N-3793 GAGACCATTACTTGCTTTCAGTCATCT

4F C2-J-3662 GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG 2320

4R N3-N-5942 TGATTTCATTCATGATATAAGTCC

7F N5-J-7660 TTCTGATCATCCCTGATC 11947R N5-N-8853 GTAAAATCTTATAATGCTGG8F N5-J-8621 GCTATAGCAGCTGGCAATCAAG 10768R N4-N-9676 CTTATGAACGGATGGGGAGTC

9F N4-J-9580 TAGGAGGAGCAGCCATATTTGGC 11619R NL-N-10740 GAAGGTCTTGGGCTTTCT

IOF NL-J-1075 AAGCCCAAGACCTTC 11481 OR CR-N- 11872 GATGCACCATTGGCATGT

5. EVALUACIONES PARA CADA CEBADOR

5.1 CEBADOR 3

Primero se usó como base el protocolo de Maliphan et al. (2006), al cual se le

hicieron las siguientes modificaciones: 2.5 pl de la solución 1X buffer, 0.75 µl de 25 mM

de MgC12, 2 µl de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 p.l de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 µl de

0.025 U/ tl de Taq, 2µl de la extracción del ADN. A partir de este protocolo fueron

variando las concentraciones hasta optimizar el protocolo como se describe a

continuación. Las concentraciones del cebador evaluadas para este análisis fueron de 0.2

46

mM y 0.5 mM. Para este cebador también se evaluaron dos concentraciones de ADN, el

ADN concentrado de la extracción original y diluido en una relación 1:10. Para el

MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.OmM, 1.25mM, 1.5mM, 2mM,

2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM. Con respecto a dNTPs, además de 0.1 mM, se

evaluaron las concentraciones de 0.15mM y 0.2mM. Adicionalmente, se evaluaron

diversas enzimas Taq procedentes de distintas casas comerciales: Amplitaq, Qiagen Taq

y TaqGold. En el buffer también se evaluó una concentración adicional a 0.73X.

Se realizó la prueba de gradientes de temperatura utilizando un rango de 48°C —

60°C. Para este cebador también se evaluaron algunos cambios en el programa para

correr la PCR en el alargamiento de la nueva hélice de ADN a 72°C por dos minutos y

luego de los 35 termociclos un alargamiento final por 10 minutos.

El protocolo siguiente fue el mejor para obtener amplificaciones:

Taq buffer 0.73X

MgCl2 2.0 mM

dNTPs 0.15 mM

Primer 0.5 mM

QiagenTaq 1 U/µl

Sin embargo estas fueron inconsistentes entre las cepas de C. hominivorax, por lo

que se recomienda a partir del mismo iniciar nuevos estudios. El programa de PCR

quedó definido como: paso inicial de 94°C por un minuto, extensión de 94°C por un

minuto, 60°C por 30 segundos, 72°C por dos minutos, 34 termociclos, 72°C por 10

minutos.

47

5.2 CEBADOR 4

En este cebador, además del protocolo inicial descrito en el cebador 3, se

evaluaron las de 0.2 mM y 0.5 Mm de cada cebador. Para este no fue necesario evaluar

las dos concentraciones del ADN, empleándose únicamente el ADN concentrado de la

extracción original. Para el MgC12 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.OmM,

1.25mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM. Para la concentración de

dNTP's además de 0.1 mM se evaluaron las concentraciones de 0.15mM y 0.2mM.

Además, fueron evaluados diversas enzimas Taq procedentes de distintas casas

comerciales: Amplitaq, Qiagen Taq, TaqGold. En el buffer, también se evaluó una

concentración a 0.73X. Se realizó la prueba de gradientes de temperatura utilizando un

rango de 48°C — 50°C. A este cebador, al igual que el cebador 3, también fue necesario

realizar algunas evaluaciones en el programa para correr el PCR. Los cambios evaluados

fueron en el alargamiento de la nueva hélice de ADN a 72°C por dos minutos y luego de

los 35 termociclos un alargamiento final por 10 minutos.

Luego de todas estas evaluaciones se logró amplificar con el siguiente protocolo:

Taq buffer 1 X

MgC12 2.0 mM

dNTPs 0.15 mM

Primer 0.5 mM

QiagenTaq 1 U/µl

Sin embargo, la amplificación no fue consistente para todas las cepas, por lo que al

igual que el cebador 3, se recomienda a partir del anterior protocolo iniciar las futuras

evaluaciones. El programa de PCR que quedó finalmente para este cebador fue:

48

temperatura inicial 94°C por un minuto, temperatura de extensión 94°C por un minuto,

51°C por 30 segundos, 72°C por dos minutos, 34 termociclos, 72°C por 10 minutos.

5.3 CEBADOR 7

Para este cebador se realizó inicialmente el protocolo de Maliphan et al. (2006)

realizando las siguientes modificaciones: 2.5 µl de la solución 1X buffer, 0.75 pl de 25

mM de MgC12. 2 µl de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 µl de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 µl de

0.025 U/µl de Taq, 2µl de la extracción del ADN. La concentración del cebador evaluada

para este fue 0.5 mM. Se empleó el ADN concentrado de la extracción original. Para el

MgC12 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM,

3.5mM, 4mM. Para la concentración de dNTPs, además de 0.1 mM, se evaluó la

concentración de 0.2mM. A este cebador no fue necesario realizar la prueba de

gradientes de temperatura, debido a que se utilizó la recomendada por Maliphan et al.

(2006) a 52°C y funcionó perfectamente.

El protocolo quedó optimizado de la siguiente forma:

Taq buffer 1 X

MgCl2 2.0 mM

DNTPs 0.2 mM

Primer 0.5 mM

QiagenTaq 1 U/µl

El programa de PCR quedo definido con los siguientes pasos: temperatura inicial

de 94 °C por 3 minuto, una temperatura de extensión de 94 °C por un minuto, 52°C por

30 segundos, 72°C por un minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.

49

5.4 CEBADOR 8

Al igual que los cebadores anteriores se utilizó el protocolo de Maliphan et al.

(2006), con las mismas modificaciones: 2.5 pi de la solución 1X buffer, 0.75 pl de 25

mM de MgCl2. 2 pl de 0.1 mM de dNTPs, 0.5 µl de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 pl de

0.025 U/pl de Taq, 2µl de la extracción del ADN. La concentración de cebador evaluada

para este fue 0.5 mM. Para este cebador tampoco fue necesario evaluar dos

concentraciones del ADN, empleándose únicamente el ADN concentrado de la extracción

original. Para el MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.25mM, 1.5 mM

y 2.5mM_ Para la concentración de dNTPs además de 0.1 mM se evaluó la concentración

de 0.2mM. Se realizó la prueba de gradientes de temperatura utilizando un r ango de 54°C

— 60°C. El protocolo final para este cebador quedó optimizado de la siguiente forma:

Taq buffer 1 X

MgCl2 1.25 mM

dNTPs 0.2 mM

Primer 0.5 niM

QiagenTaq 1 U/µl

y el programa de PCR quedó de finido con los siguientes pasos: temperatura inicial 94°C

por 3 minuto, temperatura de extensión 94°C por un minuto, 60°C por 30 segundos, 72°C

por un minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.

5.5 CEBADOR 9

Se utilizó el protocolo de MaIiphan et al. (2006) con las siguientes

modificaciones: 2.5 pl de la solución IX buffer, 0.75 µl de 25 mM de MgCl2. 2 pl de

0.1 mM de dNTPs, 0.5 pl de 0.2 mM de cada echador, 0.25 pl de 0.025 U/pl de Taq, 2p.1

—11I^11L1QUu uc la extraccion original. Con respecto aI MgCl2, se evaluaron las

50

de la extracción del ADN. La concentración de cebador evaluada para este fue 0.5 mM.

Se empleó únicamente el ADN concentrado de la extracción original. Con respecto al

MgCl2 se evaluaron las concentraciones de 0.75mM, 1.5 mM, 2.5mM, 3.OmM, 3.5mM y

4mM. Para la concentración de dNTPs además de 0.1 mM se evaluó la concentración de

0.2mM. No fue necesario realizar la prueba de gradientes de temperatura, debido a que la

temperatura propuesta por Maliphan et al. (2006) funcionó muy bien. El protocolo final

quedó optimizado de la siguiente forma:

Taq buffer 1 X

MgC12 3.0 mM

dNTPs 0.2 mM

Primer 0.5 mM

QuigenTaq 1 U/µ1

y el programa de PCR quedó definido con los siguientes pasos: temperatura inicial de

94°C por 3 minuto, temperatura de extensión de 94°C por un minuto, 57°C por 30

segundos, 72°C por un minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.

5.6 CEBADOR 10

Se utilizó inicialmente el protocolo de Maliphan et al. (2006), con algunas

modificaciones: 2.5 pl de la solución 1X buffer, 0.75 µl de 25 mM de MgC12, 2 µl de 0.1

mM de dNTPs, 0.5 ul de 0.2 mM de cada cebador, 0.25 µl de 0.025 Ulp.l de Taq, 2µd de

la extracción del ADN. Se utilizó 0.5 mM de cada cebador. Se empleó el ADN

concentrado de la extracción original. Con respecto al MgC12, se evaluaron las

concentraciones de 0.75mM, 1.5 mM, 2 mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM y 4mM, también se

realizó la prueba de gradientes de temperatura utilizando un rango de 50°C — 60°C.

51

El cebador 10 no se logró optimizar, fue inconsistente al amplificar todas las

cepas en estudio, sin embargo el protocolo que amplificó para algunas cepas fue:

Taq buffer I X

MgC12 2.0 mM

dNTPs 0.2 mM

Primer 0.5 mM

QuigenTaq l Ulµl

y el programa de PCR que se utilizó para este protocolo fue: temperatura inicial 94°C por

un minuto, temperatura de extensión 94°C por un minuto, 59°C por 30 segundos, 72°C

por dos minutos, 34 termociclos, 72°C por 10 minutos.

6. PCR PARA CADA CEBADOR

Luego de establecido el protocolo óptimo para cada cebador se realizó el PCR,

utilizando el ADN extraído de dos individuos de cada cepa de C. hominvorax y de C.

macellaria.

7. VISUALIZACIÓN DE PCR

Para la visualización del producto del PCR se corrió la electroforesis con gel de

agarosa a una concentración de 1.5 a 98v. por aproximadamente 45 minutos. Luego se

visualizó con luz ultravioleta y se fotografió el gel.

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52

8. PREPARACIÓN PARA CORTAR BANDAS

El producto de la PCR se coloco en un gel de "Low Melting temperature agarose"

a una concentración de 2.0%. La cámara de electroforesis se cargó con el producto del

PCR. Esta se dejó correr a 98v. aproximadamente por 45 minutos. Luego se visualizó

con luz ultravioleta y se fotografió el gel. Posteriormente, el gel se llevó a una mesa con

luz ultravioleta Foto/Prep I by Fotodyne para cortar las bandas de cada individuo

amplificado. Cada una de estas se colocó en un tubos que se llevaron a la máquina

termocicladora Perkin Elmer Cetus DNA Therma Cycler 480 en donde permanecieron

por 5 minutos a 70°C. Luego, se colocaron a 45°C, dejándolos por 15 minutos. Después

de transcurrido este tiempo, se les agregó a cada tubo 1.2 µl de gelasa y se dejaron en la

máquina a 45°C.

9. SECUENCIACIÓN EN CICLO (CYCLE SEQUENCING)

La secuenciación en ciclo se realizó utilizando el siguiente protocolo: 2µl de agua

doble destilada, 3µl de buffer BD 5X, lp.l del cebador "F"/"R", 1 µl de big dye y 3µl de

la banda cortada y tratada con gelasa. Luego la mezcla se centrifugó por 30 segundos.

Después de centrifugada se llevaron al termociclador PTC-200 utilizando el programa

CS3 100, el cual consistió en una temperatura inicial de 96 °C por un minuto, luego 96 °C

por 10 segundos, seguido de 50 °C por 5 segundos, luego a 60 °C por 4 minutos, y

finalmente 24 ciclos desde el segundo paso. Al terminar este proceso, a los tubos se les

agregó 10 µl de agua doblemente destilada.

53

10. COLUMNAS DE SEPHADEX

Las columnas se prepararon con Sephadex G-50. A cada columna se le agregó 780

pl de Sephadex. Luego se colocaron en una centrifugadora a 400 rpm, por dos minutos.

A cada columna se le agregó la reacción de secuenciación. Luego se colocaron en una

centrifugadora a 3,600 rpm por 3 minutos. La reacción que quedó se llevó a la máquina

Speed vac, se centrifugó por 30 minutos para secarlos. A los tubos secos se les agregó 10

pl de diformamida y se corrieron las secuencias en una secuenciadora Applied Biosystem

3130x1 Genetic Analyzer (Hitachi) con un lectura del fragmento del 98.5% de exactitud.

11. OPTIMIZACION DE PROTOCOLOS DE PCR PARA Cochliomyia macellaria

Para C. macellaria, se evaluaron únicamente los 3 cebadores que se lograron

optimizar para C. hominivorax, los cuales son:

a. cebador (7) F: N5-J-7660; R: N5-N-8853

b. cebador (8) F: N5-J-8621; R: N4-N-9676

c. cebador (9) F: N4-J-9580; R: NL-N-10740

11.1. CEBADOR 7

Varias pruebas se realizaron para optimizar este cebador, sin embargo, no se logró

la amplificación. Todas estas pruebas efectuadas se describen en el anexo 1.

11.2. CEBADOR 8

Inicialmente se realizó el protocolo que había sido optimizado para C.

hominivorax. A partir de este protocolo se varió las concentraciones hasta optimizarlo.

Las siguientes concentraciones de MgC12 fueron evaluadas: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y

54

3mM. A cada una de ellas se les realizó una prueba de gradiente de temperatura de 50 °C

a 60 °C. Finalmente quedó optimizado con el siguiente protocolo:

Taq buffer 1 X

MgClz 1.25 mM

dNTPs 0.2 mM

Primer 0.5 mM

QiagenTaq 1 Ulµl

El programa de PCR quedó definido con los siguientes pasos: temperatura inicial 94°C

por un minuto, extensión 94°C por un minuto, 52°C por 30 segundos, 72°C por dos

minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.

11.3 CEBADOR 9

Inicialmente se realizó el protocolo para C. hominivorax que había sido

optimizado. A partir de este protocolo se evaluaron las siguientes concentraciones de

MgC12 : 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM. A cada una de ellas se les realizó una prueba

de gradiente de temperatura de de 50 °C a 60 °C. El protocolo que quedó optimizado fue:

Taq buffer 1 X

MgCl2 2.0 mM

dNTPs 0.2 mM

Primer 0.5 mM

QiagenTaq 1 Ulµl

El programa de PCR quedó definido con los siguientes pasos: temperatura inicial

94°C por un minuto, de extensión 94°C por un minuto, 52°C por 30 segundos, 72°C por

dos minutos, 34 termociclos, 72°C por 2 minutos.

55

12. REGIONES AMPLIFICADAS

A partir de los protocolos definidos se hicieron las PCRs para cada una de las

regiones que amplifica cada cebador. Posteriormente, se realizó la secuenciación en

ciclo para obtener las secuencias de cada una de las regiones amplificadas para las dos

especies en estudio: C. hominivorax y C. macellaria, lo que permitió obtener el genoma

de las regiones NADH4 — NADH5 para C. hominivorax y NADH4 para C. macellaria

más una pequeña región de NADH5 que se logró amplificar con el cebador 8.

13. ANALISIS FILOGENETICOS

Las secuencias obtenidas fueron comparadas y corregidas en el programa

Sequencher 6.4. Luego fueron alineadas y se prepararon las matrices NEXUS en

PAUP*4.Ob10(Altivez). Cada una de las tres regiones secuenciadas fueron analizadas

independientemente. Para cada una de las regiones se realizaron análisis utilizando los

criterios de distancias (NJ) y de Parsimonia con el programa PAUP*4.Ob10(Altivez).

Para determinar si se podía realizar una análisis combinado de las tres regiones se realizó

un análisis de Partición en el programa PAUP*4.Ob10(Altivez). Además se realizó el

análisis de Máxima Verosimilitud (Maximum Likelihood, ML). Luego se realizó el

análisis en MrModeltest y posteriormente se realizó el análisis Bayesiano. El análisis de

Parsimonia fue realizado utilizando heuristic searches con TBR Branch Swapping. Para

conocer el grado de soporte de las ramas se utilizó el análisis de Bootstrap (1000

replicas). Para el análisis ML se utilizó Modeltest 3.6 para elegir el mejor modelo de

56

sustitución en los datos. Los modelos que se utilizaron para el análisis fueron HKY+1 y

GTR+G. El análisis filogenético Bayesiano fue conducido utilizando MrBayes 3.1.

Todos los análisis mostraron árboles con similar topologías. Se eligió el árbol

filogenético del análisis Bayesiano para presentarlo en los resultados de la investigación

debido a que este proporciona al mismo tiempo un árbol filogenético con soporte, el cual

según Harrison y Langdale (2006) es conceptualmente equivalente a Maximum

Likelihood (ML) con Bootstrapping. Los árboles filogenéticos obtenidos de estos

análisis fueron editados en el programa Canvas 9TM.

57

RESULTADOS

58

1. OPTIMIZACION DE LOS CEBADORES PARA C. hominivorax

Cuadro 6. Protocolos optimizados de cada cebador evaluado.C.hominivorax C. macellaria

Cebador 7 Cebador 8 Cebador 9 Cebador 8 Cebador 9Buffer 1 X 1 X I X I X 1 X

MgC12 2 mM 1.25 mM 3 mM 1.25mM 2 mM

dNTPs 0.2 mM 0.2 mM 0.2 mM 0.2 mM 0.2 mM

"primer" 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM 0.5 mM

QiagenTaq 1 U/µ 1 U/µ 1 J/ji 1 Ulµ 2 U1µ

Inicialmente se hicieron las pruebas para optimizar los protocolos para las

mezclas de la PCR y para el programa del termiciclador. Tres pares de cebadores se

Iograron optimizar para C. hominivorax: 7, 8 y 9. Sin embargo no se logró amplificar los

cebador: 3, 4 y 10.

2. OPTIMIZACION DE LOS CEBADORES PARA C. macellaria

Debido a que los cebadores 7, 8 y 9 fueron los que se lograron optimizar para C.

hominivorax, estos también se eligieron para el caso de C. macellaria. De los cuales se

lograron optimizar el 8 y 9.

3. TAMAÑO DE LAS REGIONES AMPLIFICADAS

El tamaño de las regiones amplificadas del cebador 7 fue de 1,110 pb (abarca la

región NADH4), para el cebador 8 fue de 1,000 pb (abarca parte de las dos regiones

NADH4 y NADH5 y el lis ARN). Finalmente el cebador 9 fue de 1,038 pb (abarca la

región NADH5) (Anexo 2).

59

4. RELACIONES FILOGENETICAS DE LAS CEPAS

Como se explicó en la metodología, debido a que todos los análisis (N3,

Parsimonia, Máxima Verosimilitud, Bayesiano) mostraron la misma tendencia, los

árboles que se presentan en la investigación son los obtenidos con el análisis Bayesiano.

A continuación se describen los resultados obtenidos por cada región evaluada y el

consenso.

4.1. Cebador 7

Los resultados de análisis de las secuencias obtenidas con el cebador 7 muestran

un árbol con una politomía basal para cuatro clados. El primer ciado formado por las

cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) presenta un soporte Bayesiano de 86. El

segundo ciado, formado por las cepas procedentes de Chiapas (PA-34 y Limón) posee un

soporte Bayesiano de 83. El tercer ciado, presentó un soporte Bayesiano débil, de 66,

constituido por las cepas de Panamá (P95) y Costa Rica (CR-92) y finalmente el cuarto

ciado comprendiendo solo la población de Brasil. En general, estos resultados indican

que a nivel de la región mitocondrial que abarca principalmente el gen NADHS las

relaciones filogenéticas muestran una sólida tendencia monofilética entre los clados de

Oaxaca y Quintana Roo con el ciado de las cepas de Chiapas. A pesar que el tercer

elado está bien definido, como se había mencionado, su soporte es un poco débil en esta

región (Figura 4).

60

4.2. Cebador 8

Los análisis de las secuencias obtenidas con el cebador 8 muestra un árbol con

poca variabilidad entre las cepas. Se observó una politomía a nivel basal y de caldos.

Uno formado por las cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) con un soporte

Bayesiano de 99. El segundo está formando por las cepas de Chiapas (Limón y PA-34)

con un soporte Bayesiano de 6I (Figura 5).

4.3. Cebador 9

El árbol filogenético de las secuencias obtenidas del cebador 9, que amplifica

principalmente la región NADH4, presenta un nodo basal de donde nacen dos dados bien

definidos, el primero que agrupa a las cepas de Oaxaca (LH) y Quintana Roo (CECH),

presenta un soporte Bayesiano de 84. El segundo nace de una rama de donde salen dos

grupos, el primero formado únicamente por la población de Brasil, mientras que el

segundo presenta un soporte Bayesiano de 77, de donde nacen nuevamente dos ramas, la

primera formando un grupo con las cepas de Chiapas (Limón y PA-34) con un soporte

Bayesiano de 96, siendo este también un grupo monofilético sólido. El segundo grupo

esta formado por las cepas de Panamá (P-95) y Costa Rica (CR-(92) (Figura 6).

4.4. Consenso

Finalmente se unieron las tres regiones amplificadas, abarcando completamente

NADH4 — His tRNA — NADH5, mostrando consistencia. Este árbol formó los mismos

cuatro dados de los cebadores 7 y 9, pero con un mayor soporte, siendo estos: el primero

formado por las cepas de Quintana Roo (CECH) y Oaxaca (LH) con un 100 de soporte

61

Bayesiano, el segundo con un soporte Bayesiano de 91 y está comprendido por tres

ramas de donde nacen tres grupos. El primero formado únicamente por la población de

Brasil, el segundo un con soporte Bayesiano de 100, formando por las cepas de Chiapas

(Limón y PA-34) y el tercero con un soporte Bayesiano de 94 formado por las cepas de

Panamá (P-95) y Costa Rica (CR-92) (Figura 7).

t.l

f^ F;

i1fuzRts i1!_X

•:"tatas- If\

I1]

I1 5?

62

Figura 4. Arbol filogenético de las cepas C. horinivorax de la región NAD1i5, mtADN

"ya

W►►4

MX

la Roo, MX

6)

la Ro o, MX

63

^R - ^¿ i QUA

5 changos Costa Rica

Figura 5. Árbol hiogenético de las cepas C. hoiyzinivorcrx de la región NADH4/NADI I5, mtADN

lón(55)

tipas, MX

ión (56)apas. MX

-34 (36)apas, MX

-34 (35)apus, MX

64

Chrysarnya

1'-95 (2()Panamá

5(25)iamá

2 (65). Rica

2 (66). Rica

,o, MX

&-^ « I5 changcs Quintana Roo, MX

Figura 6. Árbol filogenético de las cepas C. hominivorax de la región NADI-14 mtADN

Chrtnonya

li vora

Lim— (56)Chiapas, MX

Lirv--fl (55)Chiapas, MX

?A-34 (36)Chiapas, MX

?A-34 (35)hiapas, MX

.95 (26)unan*

)5 (25)

92 (66)

ta Rica

92 (65)

ta Rica

H(5)'aria Roo, MX

(46)aca, MX

45)3ca, MX

(6)Quintara Roo, MX— 10 th uiges

65

Figura 7. Árbol filogenético del consenso de las cepas C. hnniinriorrr.x: región NADH4 - NAD1T5,rntADN

DISCUSIÓN

67

1. Regiones Amplificadas

Los cebadores 7 y 9 muestran la misma topología formando cuatro clados

definidos. Sin embargo, el cebador 8, corno se explicó anteriormente, amplifica una

pequeña región de los genes NADH 4 y NADHS y la región completa del tRNA. Los

resultados obtenidos con el cebador 8 demuestran una politomía para las muestras

procedentes de Panamá, Costa Rica y Brasil. Esto puede darse debido a una baja

variabilidad en la secuencia de esta región.

2. Caracterización molecular de las cepas de C. hominivorax y C. macellaria

Las secuencias obtenidas de las distintas cepas de C. honainnivorax de las regiones

amplificadas pertenecen al ADN mitocondrial, que representa la expresión genética de la

línea maternal y es considerada como una herramienta muy importante para realizar

estudios de poblaciones intraespecificas. En estas secuencias se pueden observar la

existencia de un polimorfismo a través de los cambios que se presentaron en las bases

nitrogenadas entre las cepas; así copio los sitios en donde se dan dichos cambios.

Estos cambios son importantes porque son la principal fuente de información que

se utilizó para realizar los análisis filogenéticos que permitieron demostrar la relación

entre las cepas, tornando en cuenta que estas proceden de zonas actualmente erradicadas,

las cuales fueron colectadas y reproducidas en laboratorio.

68

La variación genética que se observó en los fragmentos amplificados del mtADN

permite aplicar otros métodos, tales como: PCR-RFLP. Este método permite una rápida

identificación de los diversos haplotipos que puedan estar presentes y establecer

relaciones entre poblaciones.

Como se ha mencionado, C. macellaria es considerada una plaga secundaria del

gusano barrenador del ganado y es morfológicamente muy similar a este, principalmente

en los primeros estadíos larvales. Uno de los requisitos indispensables para la eficiencia

del programa de erradicación del gusano barrenador del ganado es la correcta

identificación de las especies en los sitios muestreados, debido a que un error puede

llevar a liberaciones innecesarias, además del alto costo de las mismas para la

erradicación de áreas erróneamente identificadas como infestadas o el diagnóstico

erróneo de una re-infestación. El aporte de las secuencias de la región amplificada para

C. macellaria y C. hominivorax proporciona información genética para diferenciarlas

entre sí, principalmente en los muestreos realizados por el programa de erradicación del

gusano barrenador del ganado.

El desarrollo de estas secuencias en la presente investigación aportan información

importante para estas regiones del genoma (NADH4/NADH5), permitiendo la

comparación entre cepas y poblaciones. Además, estas ayudarán para futuras

comparaciones con otros estudios entre especies del orden Diptera. Por ejemplo, la

región NADH4, has sido estudiada y comparada entre especies del género Drosophila

por Yu, eta!. (1999).

69

Para el caso de C. macellaria, el aporte también es muy importante debido a que

GenBank reporta secuencias de los genes tRNA Ile, 28S rRNA, subunidad I de

Citocromo Oxidasa B, Subunidad I de Citocromo Oxidasa (COI), tRNA-Leu y

Citocormo Oxidasa II (COII). Las regiones secuenciadas en esta investigación es una

contribución que ayuda a incrementar la información de su genoma.

3. Relación molecular entre las 6 cepas de Cochliomyia hominivarax (Coquerel).

El análisis de los resultados muestra que las cepas de Quintana Roo y Oaxaca son

genéticamente muy similares y forman un solo ciado. Mientras que las cepas procedentes

de Chiapas forman un ciado separado y muestran una mayor divergencia genética con

respecto a las cepas de Quintana Roo y Oaxaca (Figura 9). De manera que es muy

importante señalar que a pesar que los estados de Oaxaca, Chiapas y Quintana Roo son

geográficamente cercanos en el territorio del área sur de México, las cepas de estas

regiones se separan filogenéticamente.

Una estrecha relación entre las dos cepas de Chiapas podría esperarse debido a la

cercanía territorial entre ellas, factor que permite su posible apareamiento y retrocruza.

Además, puede considerarse el movimiento interno del ganado en el territorio de

Chiapas. Adicional a esto, el territorio de Chiapas está ubicada en un área montañosa, lo

que podría limitar la dispersión de las moscas a otros territorios, principalmente a la

planicie del norte de territorio de Chiapas. Por otro lado, el estado de Oaxaca está

ubicado más cercano al territorio de Chiapas que al de Quintana Roo. Sin embargo, en el

árbol del consenso, las cepas de Oaxaca (LH) y Quinta Roo (CECH) forman un ciado

70

bien definido. Esto pudo haberse debido a un movimiento migratorio de los animales

domésticos, principalmente el ganado, ya sea por comercialización o por pertenecer a

fincas afines. La facilidad de dispersión de las propias moscas es relativamente limitada,

debido a que el territorio de Oaxaca está localizado en un área ampliamente montañosa,

lo que puede funcionar como una barrera natural para la dispersión de las moscas.

Aunque, este territorio también presenta una planicie que se extiende hacia Quintana

Roo, pudiendo facilitar esta vía para su dispersión entre ambos territorios.

Con respecto al último ciado, conformado por las cepas de Costa Rica (CR-92) y

Panamá (P-95). Esta relación filogenética pudo haberse debido a las mismas razones que

el ciado formado por las dos cepas de Chiapas, ambos países están territorialmente

cercanos. Además, es muy probable que se diera el movimiento del ganado, así como la

migración de las moscas entre zonas fronterizas entre los dos países.

En el árbol filogenético del consenso, se observa una relación entre el ciado

formado por las dos cepas de Chiapas y el constituido por las cepas de Panamá y Costa

Rica. Esto indica una relación monofilética más cercana. Debido a esto, es posible

considerar que el territorio de Chiapas, la ciudad de San José, Costa Rica y la Ciudad de

Panamá tienen en común la cercanía con la carretera Panamericana. Por lo que se puede

suponer que este parentesco se deba al tránsito o migración del ganado. Este

movimiento vehicular pudo haber contribuido de alguna manera a que se diera esta

relación genética. Pese a esto, los clados se dividen conservando claramente su relación

anteriormente mencionada.

71

Sin embargo, en el estado de Oaxaca, también pasa la carretera Panamericana.

Entonces, por qué no existe relación entre estas cepas con Chiapas? Para contestar esto

hay que tomar en cuenta que el territorio de Chiapas está estrechamente cercano con los

países centroamericanos, por lo que la comercialización ganadera es más fácil que se

llevara a cabo entre Chiapas y Guatemala (áreas fronterizas) y los demás países de Centro

América que con los de Quintana Roo (que se encuentra lejos de la carretera

Panamericana) y Oaxaca. Adicional a esto, el departamento de Petén, Guatemala, que

está muy cercano a Quintana Roo, es un departamento de áreas boscosas con una

cobertura de 1,880,000 Ha. perteneciente a la Reserva de la Biosfera Maya, pudiendo

representar una barrera natural entre el territorio de Quintan Roo con Guatemala (López y

Véliz, 1999).

Esta misma cercanía entre Chiapas y Guatemala pudo influir en su relación

filogenética, debido a que se ha reportado que la capacidad de dispersión de las moscas

ha alcanzado hasta los 290 Km en dos semanas (Jasiorowski, 1993). Esta distancia

abarca territorialmente desde Chiapas hasta las fronteras con Guatemala, El Salvador y

Honduras. Adicional a esto el territorio de Chiapas tiene 653.55 Km de frontera con

Guatemala, convirtiéndolo en la puerta de entrada y salida con el mercado

Centroamericano (Secretaria de Desarrollo Económico del Estado de Chiapas, 2006;

Rodríguez, 1996).

En cuanto a la relación filogenética entre las seis cepas evaluadas con la población

de Brasil se observó una relación más cercana con el ciado formado por las cepas de

72

Chiapas, Panamá y Costa Rica. En relación a las áreas fronterizas de Panamá con

América del Sur, la provincia de Darién es limítrofe con Colombia, donde se encuentra

el Tapón del Darién, que se extiende a lo largo de la frontera en un 90%. Esta región,

alberga una rica biodiversidad de flora y fauna, que incluye muchas especies endémicas y

en peligro de extinción. Además de su riqueza biológica, presenta una gran extensión de

áreas protegidas (Conte, 2006). A pesar de la existencia de esta barrera natural, en

1972 fue firmado un acuerdo cooperativo entre Panamá y Estados Unidos, creándose para

ello la Comisión para la Prevención de la Fiebre Aftosa (COPFA), donde se prohibe la

cría, ceba, compra o venta de ganado vacuno y porcino en una franja de 20 millas (32

Km) paralela a la frontera con Colombia que Iimitó las explotaciones a las existentes a la

fecha de la ley en el resto de la provincia (Secretaría General de la Organización de los

Estados Americanos, 1978). Tomando en cuenta que la capacidad de dispersión de

mosca del gusano barrenador del ganado es hasta 290 Km en dos semanas, es posible la

dispersión y migración de la mosca entre Panamá y Colombia. Debido a lo anterior es

importante considerar la implementación de una barrera permanente de liberación de

moscas estériles en toda el área fronteriza de Panamá con Colombia.

Adicional a todos los factores anteriormente mencionados, también puede

considerarse aI istmo de Panamá como un puente biogeográfico. En Panamá,

conjuntamente con Colombia y Ecuador se localiza una de las biotas más abundantes de

tierras bajas, de excepcional riqueza y endemismo, con un amplio rango de especies. Las

características fisiogeográficas del istmo de Panamá, también han generado una riqueza

faunística que lo ubica como una de las regiones de máxima diversidad biológica del

73

planeta y ha facilitado el intercambio de especies entre el continente americano

(Autoridad Nacional del Ambiente, 2003).

Para poder hacer una discusión más precisa de la relación filogenética entre las

cepas de Costa Rica, Panamá y Brasil, es importante conocer la caracterización molecular

de otras poblaciones de América del Sur. Ya se han realizado estudios moleculares entre

poblaciones de Brasil, por ejemplo Azeredo-Espin (1993) realizó una caracterización

molecular de doce poblaciones de C. hominivorax procedentes de siete localidades de

Brasil, demostrando alta variabilidad. Vargas y Azeredo-Espin (1995) encontraron 15

haplotipos entre cuatro poblaciones de C. hominivorax procedentes de So Paulo, los

cuales fueron interpretados como un resultado que reduce el flujo de genes entre estas

poblaciones. El cladograma de la distribución geográfica de los haplotipos observados

sugiere que las muestras del barrenador probablemente pertenecen a un mismo linaje

evolutivo. Estos patrones que indican polimorfismo intraespecífico entre distintas

poblaciones de Brasil lo demostraron Litjens et al, (2001) con el estudio de cinco

poblaciones de Brasil.

Por otro lado Lyra et al. (1995) realizaron estudios en siete poblaciones de C.

hominivorax, procedentes de Uruguay donde también demostraron un alto polimorfismo.

El índice de similaridad, la divergencia promedio de nucleótidos y la varianza del análisis

molecular demostraron que no hay evidencia de diferenciación entre subpoblaciones

indicando que las poblaciones de Uruguay forman una panmixia. A pesar de que todas

estas investigaciones han sido realizadas en algunos países de América del Sur; no se

74

conocen las relaciones filogenéticas de toda la región sur americana y su relación con las

de Norte América, Centro América y el Caribe.

Otro factor muy importante que hay que considerar en las poblaciones sur

americanas, es que durante muchos años han sido controladas por varios métodos,

principalmente con insecticidas, los cuales con el tiempo pueden llegar a obtener

resistencia selectiva, producto de mutaciones. En 1962, LaChance y Hopkins

realizaron estudios en mutaciones de C. hominivorax, considerando que estas podrían

desarrollar efectos como: desigualdad en la proporción del sexo en la progenie, causar la

muerte de los homocigotos, afectando a un solo sexo de la especie o produciendo otras

características genéticas útiles en programas de entomología. Ellos encontraron nueve

mutaciones, que afectan principalmente el color de cuerpo y la venación de las alas. En

Brasil, C. hominivorax ha sido controlada mayormente con insecticidas organofosforados

y su uso inadecuado pudo dar lugar a resistencia por selección de las moscas. Cambios

en la actividad de la carboxilesterasa han sido asociados con el insecticida

organofosforado. Por ejemplo, Carvalho et al. (2006) aislaron y caracterizaron el gen

E3 en C. hominivorax, el cual presentó similares substituciones responsables por estar

sometidos al organofosforado, como lo presentó la especie Lucilia cuprina

(Calliphoridae).

En general, una relación filogenética similar a nuestros resultados ha sido

reportada en estudios con C. hominivorax en otras poblaciones. Por ejemplo, Roehrdanz

(1989) demostró que dentro de los 16 haplotipos encontrados se presentó una relación de

75

parentesco entre las cepas de Oaxaca con las de Quintana Roo, mientras que las cepas de

Chiapas, Costa Rica y Jamaica formaban haplotipos distintos. Skoda et al. (2002),

estudiaron las poblaciones de C. hominivora, procedentes de México (Chiapas, cepa PA-

34), Costa Rica, Brasil y Jamaica. Ellos demostraron la existencia de un polimorfismo

intraespecífico entre las poblaciones, obteniendo a través del análisis de agrupamiento

UPGMA y posteriormente bootstrapping cuatro dados definidos. Asimismo, estos

investigadores obtuvieron un ciado formado por las poblaciones procedentes de México,

otro formado por las poblaciones procedentes de Costa Rica. Un tercero constituido por

las poblaciones procedentes de Brasil y un último con las poblaciones procedentes de

Jamaica. Adicional a estos dados, ellos demostraron una relación entre la cepa de

México (Chiapas, PA-34) con la de Costa Rica, aunque con un soporte de 54%.

Con todos estos análisis se puede conocer parte de la biogeografia histórica de C.

hominivorax, debido a sus consistencia en la formación de los dados. A pesar de su

capacidad de dispersión, las cepas demuestran su procedencia filogenética claramente.

También, con esta investigación se aporta información de las regiones del ADN

mitocondrial estudiadas previamente estudiadas, las que pueden ser comparadas con

poblaciones de sur América, que actualmente son una plaga. Es importante continuar con

estudios en el genoma del C. hominivorax en áreas donde actualmente es una plaga

establecida, debido a que en un futuro puede entrar el programa de erradicación a Sur

América. De esta manera se asegurar el éxito de las liberaciones de moscas estériles

producidas en laboratorio para la erradicación, así como evitar la re-infestación en las

áreas erradicadas.

76

CONCLUSIONES

77

1. Se optimizaron tres cebadores para C. hominivorax: el cebador 7 (F: N5-J-7660; R:

N5-N-8853), el cebador 8 (F: N5-J-8621; R: N4-N-9676) y el cebador 9 (F: N4-J-

9580; R: NL-N-10740). Amplificando las regiones del mtADN NADH4 —tRNA-

NADH5.

2. Para C. macellaria se lograron optimizar únicamente dos "primers": el primer 8 (F:

N5-J-8621; R:N4-N-9676) y el primer 9 (F: N4-J-9580; R: NL-N-10740)

amplificando la región del mtADN NADH4 más una pequeña región de NADH5.

3. Se presentó un evidente polimorfismo que agrupa a las cepas en 3 clados definido y

la población de Brasil obtenida del Genbank queda fuera de estos tres clados. Los

clados son:

1. Las dos cepas de Chiapas (Limón y PA-34)

2. Las cepas de Panamá y Costa Rica (P-95 y CR-92)

3. Las cepas de Quintana Roo y Oaxaca (CECH y LH)

4. Población de Brasil

4. Las diferencias genéticas encontradas entre C. macellaria y C. hominivorax permite

distinguirlas molecularmente.

78

RECOMENDACIONES

79

Optimizar los demás cebadores que quedaron sin amplificar en este estudio, tanto

para C. hominivorax como para C. macellaria debido a que esta información permitirá las

comparaciones de otras regiones del genoma entre ambas especies, lo que facilitará la

separación entre ellas a nivel del genoma mitocondrial.

Continuar con los estudios de las cepas trabajadas, incluyendo las moscas estériles

producidas en laboratorio y su comparación con cepas actualmente establecidas como

especies nativas procedentes de Sur América e islas del Caribe. Información que

permitirá conocer las relaciones tlogenéticos entre ellas lo que aportará conocimientos

que contribuirán al éxito del programa.

Dentro de los estudios genéticos también se recomienda incluir los estudios con

genes nucleares de C. hominivorax.

Compararlas también con poblaciones controladas con insecticidas y áreas

reinfectadas tomando en cuenta la posible resistencia a ciertos insecticidas.

80

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81

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88

Anexo

89

ANEXO 1

EVALUACIONES REALIZADAS PARA EL PRIMER 7 EN LA ESPECIECochliomyia macellaria

Se realizó inicialmente el protocolo optimizado en la investigación para C.

hominivorax. Posteriormente se evaluaron las siguientes concentraciones de MgC12: 1.5

mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a cada una de ellas se les realizó una prueba de gradiente de

temperatura de de 50 °C a 60 °C. Luego se evaluaron dos concentraciones de MgCl2:

1.5mM y 2.5 mM, con gradiente de temperatura de 40 °C a 50 °C. Todas estas pruebas

descritas fueron corridas con eI programa de PCR siguiente: Una desnaturalización inicial

del DNA a 94 °C, por tres minuto, luego 94 °C por un minuto, entre 50 °C — 60 °C por 30

segundos (o de 40 a 50, dependiendo del gradiente evaluado). Un alargamiento de 72 °C

por un minuto. Después de 35 termociclos ser hizo un alargamiento final a 72 °C por dos

minutos.

Posteriormente se evaluaron las concentraciones MgCl2 de 1.5 mM, 2 mM,

2.5mM y 3mM, con el mismo programa de PCR pero con eI único cambio del tiempo del

alargamiento de la nueva hélice de DNA a 72 °C por 10 minutos, en dónde tampoco se

tuvo éxito por Io que fue necesario evaluar dos concentraciones de MgC12: 1.5 y 2.5 mM

con los siguientes programas de PCR:

n Una desnaturalización inicial del DNA a 94 °C, por tres minuto, luego 94 °C por un

minuto, 45 °C por 30 segundos, 72 °C por un minuto y luego cuatro termociclos;

luego un paso de 94 °C por un minuto, 50 °C por 30 segundos. Un alargamiento de

72 °C por un minuto. Después de 30 termociclos ser hizo un alargamiento final a 72

°C por dos minutos.

n Una desnaturalización inicial del DNA a 94 °C, por tres minuto, luego 95 °C por dos

minutos, 50 °C por dos minutos, 72 °C por cuatro minutos y luego dos termociclos;

luego un paso de 93 °C por un minuto, luego 50 °C por un minuto. Un alargamiento

de 72 °C por cuatro minutos. Después de 32 termociclos, 93 °C por un minuto, 50 °C

por un minuto y finalmente 72 °C por diez minutos.

Posteriormente se hicieron evaluaciones utilizando el mismo protocolo donde se

evaluaron las siguientes concentraciones de MgCl2: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a

las que se Ie hizo prueba de gradiente de temperatura de de 50 °C a 60 °C. También se

evaluaron las enzimas TagGold, Amplitaq y Qiagen.

Se evaluaron con el protocolo inicial 3 diluciones diferentes de ADN: 1:10, 1:50 y

1:100. Posteriormente se hicieron evaluaciones utilizando el mismo protocolo,

adicionándole DMSO al 5% y además donde se evaluaron las siguientes

concentraciones de MgC12: 1.5 mM, 2 mM, 2.5 mM y 3mM, a cada una de ellas se les

realizó una prueba de gradiente de temperatura de de 50 °C a 60 °C.

A pesar de todas estas evaluaciones realizadas el primer no trabajo.

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