Κεφάλαιο7 Αλυσιδωτήαντίδρασηπολυμεράσης · 2016-06-28 · i i “Papanikolaou” — 2015/12/13 — 22:20 — page 129 — #140 i i i i i i Κεφάλαιο7

ii

ldquoPapanikolaourdquo mdash 20151213 mdash 2220 mdash page 129 mdash 140 ii

ii

ii

Κεφάλαιο 7

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Δ Παλαιολόγου Ε Κατσαρέλη και Γ Παπανικολάου

Περίληψη Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι η μέθοδος που έφερε πραγματική επανάστασηστη μοριακή βιολογία από την ανακάλυψή της το 1983 Η PCR είναι ένας απλός τρόπος πολλαπλασια-σμού συγκεκριμένων τμημάτων του αρχικού γενετικού υλικού έτσι ώστε να είναι είναι εφικτή η περαι-τέρω μελέτη του με διάφορες μεθόδους όπως η αλληλούχηση η πέψη με περιοριστικές ενδονουκλεάσεςη ηλεκτροφόρηση κά Η ταχύτητα η ειδικότητα η μεγάλη ευαισθησία και το χαμηλό της κόστος τηνέχουν κάνει μια από τις συχνότερα χρησιμοποιούμενες μεθόδους σε ερευνητικό και διαγνωστικό επί-πεδο Η αντίδραση εκτελείται σε τρία επαναλαμβανόμενα στάδια (α) αποδιάταξη του γενετικού υλικού(β) υβριδισμός των εκκινητών στη συμπληρωματική τους αλληλουχία του DNA και (γ) επιμήκυνση τηςνεοσυντιθέμενης αλυσίδας DNA Μέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί πολυάριθμες παραλλαγές της PCRΣτο κεφάλαιο αυτό αναπτύσσεται συνοπτικά η αντίστροφη μεταγραφή (reverse transcription RT) πουχρησιμοποιείται για τη μετατροπή μορίων RNA σε συμπληρωματικά μόρια DNA και η ποσοτική PCRΣτο πρακτικό μέρος της άσκησης θα σχεδιαστούν εκκινητές για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίουTAS2R38 και θα πραγματοποιηθεί PCR για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου που φέρει τον πολυμορ-φισμό rs1726866

Προαπαιτούμενη γνώση Κατανόηση της δομής των μορίων DNA και RNA και βασικές γνώσεις τηςδιαδικασίας αντιγραφής του DNA

71 Θεωρητικό μέρος

711 Κλασική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσηςΗ αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase chain reaction PCR) είναι ίσως η ευρύτερα

χρησιμοποιούμενη μέθοδος της μοριακής βιολογίας με αναρίθμητες εφαρμογές τόσο σε ερευνητικόόσο και σε διαγνωστικό επίπεδο

Ανακαλύφθηκε το 1983 από τον βιοχημικό Karry Mullis που εργαζόταν σε μια εταιρεία βιοτε-χνολογίας της Καλιφόρνιας Για την ανακάλυψη αυτή τιμήθηκε 10 χρόνια αργότερα με το βραβείοΝόμπελ

Η PCR είναι μια ενζυμική μέθοδος ενίσχυσης συγκεκριμένων τμημάτων γενετικού υλικού in vitroΚατά τη διάρκεια μιας τυπικής αντίδρασης PCR το επιθυμητό τμήμα γενετικού υλικού πολλαπλασιά-

129

ii


ii

ii

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ

ζεται μέχρι και ένα τρισεκατομμύριο φορές γεγονός που είναι απαραίτητο για μετέπειτα χειρισμούςόπως η ηλεκτροφόρηση η πέψη με ένζυμα περιορισμού η ανάγνωση της αλληλουχίας βάσεων κά

Τα στάδια της PCR

Η αντίδραση PCR πραγματοποιείται σε τρία στάδια τα οποία επαναλαμβάνονται διαδοχικά (ει-κόνα 71)

Εικόνα 71 ndash Τα στάδια της αντίδρασης PCR

1 Αποδιάταξη Οι δύο αλυσίδες του DNA διαχωρίζονται (αποδιατάσσονται) με θέρμανση σε θερ-μοκρασία 94-95deg C για περίπου 30 sec έως 1 min

2 Υβριδισμός εκκινητών Με μείωση της θερμοκρασίας στους 55-65deg C για περίπου 30 sec έως1 min οι εκκινητές υβριδίζονται στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στο εκμαγείο DNA

3 Επιμήκυνση Για τη σύνθεση της νέας αλυσίδας αυξάνουμε τη θερμοκρασία στους 72deg C τηβέλτιστη θερμοκρασία δράσης της Taq πολυμεράσης Η πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινη-τές εισάγοντας τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (Deoxynucleotide triphosphates dNTPs)χρησιμοποιώντας τη συμπληρωματική αλληλουχία DNA ως εκμαγείο Η ταχύτητα σύνθεσηςτης νέας αλυσίδας είναι της τάξης των 1000 bp ανά λεπτό

Τα παραπάνω στάδια επαναλαμβάνονται από 25 έως 35 φορές Η PCR εκτελείται στον θερμικόκυκλοποιητή (Thermal cycler) συσκευή που φέρει θερμαινόμενη πλάκα που μπορεί να εναλλάσσειθερμοκρασίες με ταχύτητα και ακρίβεια Ο θερμικός κυκλοποιητής είναι μια προγραμματιζόμενησυσκευή στην οποία μπορούμε να ρυθμίσουμε την επιθυμητή θερμοκρασία και τη διάρκεια κάθεσταδίου αλλά και τη διαδοχή τους Ένα τυπικό πρόγραμμα PCR στον θερμικό κυκλοποιητή για τονπολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA μεγέθους 500 bp φαίνεται στoν πίνακα 71

Τα συστατικά της PCR

Τα βασικά συστατικά για τη διενέργεια της αντίδρασης PCR είναι

1 DNA πολυμεράση

2 Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές

3 Γενετικό υλικό ndash αλληλουχία στόχος

4 Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης και Mg2+

5 Νουκλεοτίδια (dNTPs)

130

ii


ii

ii

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Εικόνα 72 ndash Θερμικός κυκλοποιητής όπου πραγματοποιείται η κλασική αντίδραση PCR Στην οθόνη τουμηχανήματος απεικονίζεται το πρόγραμμα των διαδοχικών κύκλων για τη διενέργεια της αντίδρασης Φω-τογραφία laquoΘερμικός κυκλοποιητήςraquo Αιματολογικό Εργαστήριο Αrsquo Προπαιδευτικής Παθολογικής Κλινι-κής Ιατρική Σχολή ΕΚΠΑ Διανέμεται με άδεια CC-BY-SA 30

Στάδια της PCR Θερμοκρασία (deg C) Χρόνος

1Αρχική αποδιάταξη 95 2-5 min2Αποδιάταξη 95 30-45 sec3Υβριδισμός εκκινητών 55-65 30-45 sec4Επιμήκυνση (1 kbmin) 72 45 sec

Επανάληψη σταδίων 2-4 για 30-35 φορές

5Τελική επιμήκυνση 72 5 min

Πίνακας 71 ndash Tυπικό πρόγραμα PCR για τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA μεγέθους 500 bp

131

ii


ii

ii


DNA πολυμεράση

Η DNA πολυμεράση είναι ένζυμο που υπάρχει σε όλους τους οργανισμούς (ευκαρυωτικοί προ-καρυωτικοί και ιοί) και συμμετέχει στην αντιγραφή του DNA Δεν μπορεί να συνθέσει ένα νέο μόριοDNA μπορεί όμως να αντιγράψει ένα υπάρχον που χρησιμοποιείται ως εκμαγείο Η πολυμεράση πουχρησιμοποιείται στην PCR έχει απομονωθεί από το βακτήριο Thermus aquaticus (Taq) το οποίο έχειως φυσικό περιβάλλον τις θερμές πηγές Η Taq πολυμεράση έχει τη βασική ιδιότητα να παραμένειδραστική σε υψηλές θερμοκρασίες Η βέλτιστη θερμοκρασία δράσης της είναι 72deg C ενώ δεν κατα-στρέφεται από τη θέρμανση ακόμη και στους 95deg C για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα (εικόνα 73)

Εικόνα 73 ndash Tο βακτήριο Thermus aquaticus ανακαλύφθηκε στις θερμές πηγές στην περιοχήGreat Fountain του Lower Geyser Basin στο Εθνικό Πάρκο Yellowstone των ΗΠΑ ΕικόναlaquoSteamboat Geyser in Yellowstoneraquo από Brocken Inaglory με άδεια CC-BY-SA 30 Πηγή httpscommonswikimediaorgwikiFileSteamboat_Geyser_in_YellowstonejpgmediaFileSteamboat_Geyser_in_Yellowstonejpg

H DNA πολυμεράση μπορεί να συνθέσει μια συμπληρωματική αλυσίδα DNA χρησιμοποιώνταςένα μονόκλωνο μόριο ως αρχικό εκμαγείο και έναν εκκινητή ως σημείο εκκίνησης Η κατεύθυνση τηςσύνθεσης της νέας αλυσίδας είναι 5rsquo-3rsquo Με την πάροδο των κύκλων της PCR η λειτουργικότητα καιη πιστότητα της αντιγραφής φθίνουν και αντίστοιχα αυξάνεται ο αριθμός των λανθασμένων βάσεωνπου εισάγονται στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα του DNA Η απλή DNA πολυμεράση κάνει περίπου έναλάθος στις 100000 βάσεις Οι πολυμεράσες υψηλής πιστότητας (Proofreading polymerase) οι οποίεςέχουν δραστικότητα 3rsquo-5rsquo εξωνουκλεάσης μπορούν να διορθώσουν τα λάθη που δημιουργούν κατάτη σύνθεση του μορίου DNA Έτσι επιτυγχάνουν μικρότερα ποσοστά λαθών της τάξης του 10-6

Εκκινητές

Οι εκκινητές (Primers) είναι ολιγονουκλεοτίδια που οριοθετούν το τμήμα DNA που πρόκειταινα πολλαπλασιαστεί Ο σωστός σχεδιασμός των εκκινητών επηρεάζει σημαντικά το αποτέλεσμα τηςPCR Υπάρχουν στο διαδίκτυο ειδικά λογισμικά που μας βοηθούν να σχεδιάσουμε εκκινητές όπωςτο πρόγραμμα primer3 (httpprimer3sourceforgenet) που θα χρησιμοποιήσουμε στο πρακτικό μέ-

132

ii


ii

ii


ρος της άσκησης Ο σχεδιασμός των εκκινητών ακολουθεί συγκεκριμένες αρχές που περιγράφονταιπαρακάτω

Μέγεθος των εκκινητών Οι εκκινητές είναι συνήθως ολιγονουλεοτίδια 18-30 βάσεων Μικρότε-ροι εκκινητές οδηγούν σε μη ειδικό υβριδισμό ενώ μεγαλύτεροι εκκινητές έχουν μεγαλύτερη ειδι-κότητα αλλά αυξάνεται η πιθανότητα δημιουργίας δευτερογενών δομών που μειώνουν την αποτελε-σματικότητα του υβριδισμού

Αλληλουχία των εκκινητών Οι εκκινητές πρέπει να έχουν απόλυτη συμπληρωματικότητα προςτην αληλουχία στόχο αλλά ελάχιστη έως καθόλου συμπληρωματικότητα μεταξύ τους Ο υβριδισμόςμεταξύ των εκκινητών οδηγεί στο σχηματισμό διμερών εκκινητών (Primer dimers) που έχουν μέγεθος30-50 bp και μειώνουν την αποτελεσματικότητα της PCR Επίσης η ύπαρξη περιοχών συμπληρωματι-κότητας μέσα στον εκκινητή αυξάνει την πιθανότητα δημιουργίας δευτερογενών δομών που μειώνουντην αποτελεσματικότητα του υβριδισμού στην αλληλουχία στόχο

Η θερμοκρασία αποδιάταξης των εκκινητών Η θερμοκρασία αποδιάταξης Melting temperature(Tm) είναι η θερμοκρασία στην οποία το 50 των μορίων DNA βρίσκεται σε μονόκλωνη μορφή HTm εξαρτάται από το μέγεθος της αλληλουχίας και τη σύσταση των βάσεων της αλληλουχίας Υψηλόποσοστό σε βάσεις G και C αυξάνει την Tm καθώς οι βάσεις G και C ενώνονται με τις συμπληρω-ματικές τους στο δίκλωνο DNA με τρεις δεσμούς υδρογόνου σε αντίθεση με τις βάσεις Α και Τ πουενώνονται με δύο δεσμούς υδρογόνου

Εικόνα 74 ndash Kαμπύλη αποδιάταξης μορίων δίκλωνου DNA

Στην αντίδραση PCR η Tm των εκκινητών κυμαίνεται τυπικά στους 58-68 deg C Οι δύο εκκινη-τές δεν πρέπει να έχουν πολύ διαφορετικές Tm μεταξύ τους με μια διαφορά lt3-5 deg C να θεωρείταιαποδεκτή

Υπάρχουν πολλοί τύποι για τον υπολογισμό της Tm των ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών Έναςαπό τους ευρύτερα χρησιμοποιούμενους είναι ο ακόλουθος

Tm = 2(A+ T ) + 4(G+ C)

133

ii


ii

ii


Αν και ο παραπάνω τύπος ισχύει με ακρίβεια για ολιγονουκλεοτίδια μέχρι 7 βάσεων στην πράξηχρησιμοποιείται για τον αδρό υπολογισμό της Tm εκκινητών μέχρι και 20-22 νουκλεοτιδίων H Tmτων εκκινητών επηρεάζει άμεσα τη θερμοκρασία υβριδισμού τους στην αλληλουχία στόχο Αν και ηβέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού πρέπει να προσδιοριστεί πειραματικά ένα καλό σημείο εκκίνησηςείναι 3 deg C λιγότεροι από τη χαμηλότερη Tm των δύο εκκινητών

Γενετικό υλικό (αλληλουχία στόχος)

Ως αρχικό υλικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί DNAήRNA το οποίο θα έχει μεταγραφεί στην πιο στα-θερή μορφή του το συμπληρωματικό DNA (Complementary DNA cDNA) Πολύ μικρές ποσότητεςDNA (της τάξης των 25-100 ng ανά αντίδραση τελικού όγκου 50 μl) είναι επαρκείς για τις περισσότε-ρες αντιδράσεις PCR Μεγάλη ποσότητα DNA μπορεί να αναστείλει την αντίδραση Για τη βέλτιστηαπόδοση της PCR τo DNA πρέπει να είναι μακρομοριακό και υψηλής καθαρότητας απαλλαγμένοαπό υπολείμματα αιθανόλης ή αλάτων που μπορούν να αναστείλουν την αντίδραση

Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης και συγκέντρωση Mg2+

Το διάλυμα της αντίδρασης διατηρεί το pH και τη συγκέντρωση αλάτων στις βέλτιστες συνθήκεςδιεξαγωγής της αντίδρασης Περιέχει επίσης ιόντα Mg2+ που είναι απαραίτητος συμπαράγοντας τηςDNA πολυμεράσης

Τα ιόντα Mg2+ σχηματίζουν διαλυτά σύμπλοκα με τα dNTPs το DNA εκμαγείο και τους εκκι-νητές Περίσσεια Mg2+ οδηγεί σε μη ειδική σύνδεση των εκκινητών με το DNA αυξάνοντας τα μηειδικά προϊόντα στην αντίδραση Επίσης μειώνει την πιστότητα αντιγραφής της Taq πολυμεράσηςΧαμηλές συγκεντρώσεις Mg2+ οδηγούν σε μείωση της ποσότητας του παραγόμενου προϊόντος Ηβέλτιστη συγκέντρωσηMg2+ για κάθε αντίδραση PCR πρέπει να προσδιορίζεται εμπειρικά με δοκιμήδιαδοχικών συγκεντρώσεων από 1 έως 4 mM

Νουκλεοτίδια

Τα δομικά μόρια που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση της νέας αλυσίδας είναι τα τριφωσφο-ρικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (deoxynucleotide triphosphates dNTPs) Τα dNTPs χρησιμοποιούνταιως ισομοριακό μίγμα των τεσσάρων νουκλεοτιδίων (ATP TTP CTP και GTP) σε συγκεντρώσεις πουκυμαίνονται στα 80-800 μΜ

Κινητική της αντίδρασης PCR

Στη θεωρία η αύξηση των προϊόντων της PCR είναι εκθετική γιατί κάθε μόριο DNA που παρά-γεται μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα στον επόμενο κύκλο (εικόνα 75)

Στην πραγματικότητα όμως η PCR χωρίζεται σε τρεις φάσεις (εικόνα 76)

1 Εκθετική φάση Μόλις έχει αρχίσει ο πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας στόχου Όλα τα αντι-δραστήρια βρίσκονται σε επάρκεια και η αντίδραση είναι πολύ αποτελεσματικήΣε κάθε κύκλοδιπλασιάζονται τα μόρια της αλληλουχίας στόχου

2 Γραμμική φάση Παρατηρείται μειωμένη παραγωγή αντιγράφων της αλληλουχίας στόχου εξαι-τίας της μείωσης της ποσότητας των αντιδραστηρίων

3 Φάση πλατώ Δεν συντίθενται νέα μόρια DNA εξαιτίας της εξάντλησης ενός ή περισσοτέρωναντιδραστηρίων

134

ii


ii

ii


Εικόνα 75 ndash Η κινητική της αντίδρασης PCR Η αύξηση των προϊόντων της PCR είναι εκθετική γιατίκάθε μόριο DNA που παράγεται μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως υπόστρωμα στον επόμενο κύκλο της PCR

Βελτιστοποίηση της αντίδρασης PCR

Τα βασικά χαρακτηριστικά μιας αντίδρασης PCR είναι η ειδικότητα (Specificity) και η απόδοση(Efficiency) Για να επιτύχουμε τη βέλτιστη ειδικότητα (δηλαδή να λαμβάνουμε ένα μοναδικό προϊόν)και τη μέγιστη απόδοση (την παραγωγή πολλών μορίων των PCR προϊόντων) μπορούμε να τροποποι-ήσουμε πολλούς παράγοντες όπως τη συγκέντρωση των ιόντων Mg2+ των εκκινητών των dNTPsτης πολυμεράσης και τη θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών Οι παράγοντες που τροποποιούνταισυχνότερα είναι η συγκέντρωση των ιόντων Mg2+ και η θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών

Βελτιστοποίηση της PCR με τροποποίηση της συγκέντρωσης Mg2+

Τα ιόνταMg2+ σχηματίζουν διαλυτά σύμπλοκα με τα dNTPs το DNA εκμαγείο και τους εκκινητέςκαι είναι απαραίτητος συμπαράγοντας της DNA πολυμεράσης Υψηλή συγκέντρωση Mg2+ οδηγείσε μη ειδικό υβριδισμό των εκκινητών στο DNA οδηγώντας σε παραγωγή μη ειδικών προϊόντωνΧαμηλές συγκεντρώσεις Mg2+ οδηγούν σε μείωση της ποσότητας του παραγόμενου προϊόντος Ηβέλτιστη συγκέντρωσηMg2+ για κάθε αντίδραση PCR πρέπει να προσδιορίζεται εμπειρικά με δοκιμήδιαδοχικών συγκεντρώσεων 1-4 mM

Βελτιστοποίηση της PCR με τροποποίηση της θερμοκρασίας υβριδισμού των εκκινητών

Η θερμοκρασία υβριδισμού των εκκινητών είναι καθοριστικής σημασίας για την ειδικότητα τηςαντίδρασης Χαμηλή θερμοκρασία μειώνει την ειδικότητα του υβριδισμού δηλαδή οι εκκινητές μπο-ρούν να προσδεθούν σε αλληλουχίες DNA που δεν είναι απόλυτα συμπληρωματικές προς τη δικήτους Σε αυτή την περίπτωση παράγονται μη επιθυμητά παραπροϊόντα στην αντίδραση PCR (εικόνα718) Σε υψηλές θερμοκρασίες λιγότερα μόρια εκκινητών υβριδίζονται στο DNA με αποτέλεσμα τημείωση της απόδοσης της αντίδρασης

Η βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού συνήθως προσδιορίζεται πειραματικά Ως σημείο εκκίνησης

135

ii


ii

ii


Εικόνα 76 ndashΟι φάσεις της αντίδρασης PCR Η αντίδραση χωρίζεται σε τρεις φάσεις στην αρχική εκθετικήφάση τα προϊόντα της PCR σχηματίζονται με εκθετικό ρυθμό κατά τη γραμμική φάση ο ρυθμός σύνθεσηςεπιβραδύνεται και στη φάση του πλατώ δεν συντίθενται πλέον νέα προϊόντα PCR

χρησιμοποιείται μια θερμοκρασία περίπου 3deg C κάτω από τη χαμηλότερη Tm των δύο εκκινητών Γιrsquoαυτό είναι επιθυμητό οι Tm των δύο εκκινητών να μη διαφέρουν πάνω από 3-5deg C

712 Αντίστροφη μεταγραφήΑντίστροφη μεταγραφή Reverse Transcription (RT) ονομάζεται η σύνθεση μιας συμπληρωμα-

τικής (complementary) αλυσίδας DNA (cDNA) έχοντας ως εκμαγείο ένα μόριο RNA Η αντίδρασηαυτή καταλύεται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (ή αντίστροφη τρανσκριπτάση) το οποίοστη φύση βρίσκεται σε RNA-ιούς (ρετροϊούς) όπως ο ιός HIV Το ένζυμο μετατρέπει το γενετικόυλικό του ιού από τη μορφή του μονόκλωνου RNA σε δίκλωνο DNA έτσι ώστε να μπορεί να ενσω-ματωθεί στο γενετικό υλικό των κυττάρων ξενιστών

Η αντίστροφη μεταγραφάση ανακαλύφθηκε ταυτόχρονα και ανεξάρτητα το 1970 από τους HTemin και D Baltimore Η ανακάλυψη του ενζύμου οδήγησε στη διαμόρφωση του κεντρικού δόγ-ματος της βιολογίας στη σημερινή του μορφή και χάρισε στους δύο ερευνητές το Νόμπελ ιατρικήςτο 1975 Έδωσε σημαντική ώθηση στη μοριακή βιολογία και στην έρευνα καθώς επέτρεψε τη μετα-τροπή των ευαίσθητων μορίων RNA σε σταθερά συμπληρωματικά μόρια DNA τα οποία μπορούννα υποστούν χειρισμούς και να μελετηθούν όπως τα υπόλοιπα μόρια DNA (PCR κλωνοποίηση αλ-ληλούχηση κλπ) Επίσης έδωσε νέες δυνατότητες στη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης ενώνονταςτην αντίστροφη μεταγραφή με την κλασική ή την ποσοτική PCR Με αυτόν τον τρόπο σταδιακάεγκαταλείφθηκε για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης η χρονοβόρος και επικίνδυνη λόγω χρήσηςραδιενέργειας μέθοδος του στυπώματος κατά Northern

Σύνθεση της πρώτης αλυσίδας του cDNA

Η αντίδραση σύνθεσης της πρώτης αλυσίδας του cDNA (First strand cDNA synthesis) πραγμα-τοποιείται στον θερμικό κυκλοποιητή και τα απαραίτητα αντιδραστήρια είναι η αντίστροφη μεταγρα-φάση το αρχικό υλικό RNA τα dNTPs και οι κατάλληλοι εκκινητές Οι ευρύτερα χρησιμοποιούμενεςμεταγραφάσες είναι η μεταγραφάση του ιού μυελοβλαστώματος των πτηνών Αvian MyeloblastosisVirus transcriptase (AMV) και η μεταγραφάση του ιούMoloney της λευχαιμίας των ποντικώνMoloneyMurine Leukemia Virus transcriptase (M-MLV))

Για τη σύνθεση cDNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν τρία είδη εκκινητών (εικόνα 77)

136

ii


ii

ii


Εικόνα 77 ndash Διαφορετικοί εκκινητές για τη σύνθεση του cDNA Για τη σύνθεση του cDNA μπορούννα χρησιμοποιηθούν τρία είδη εκκινητών οι oligo-dT εκκινητές εκκινητές ειδικοί για κάθε γονίδιο καιτυχαίοι εξανουκλεοτιδικοί εκκινητές

1 Oligo-dT Οι εκκινητές αυτοί είναι ολιγονουκλεοτίδια θυμίνης που υβριδίζονται στην πολυ-Aουρά των mRNAs Με τη χρήση τους μπορούν να συντεθούν ακέραια (ολόκληρα) τα μόριαmRNA η χρήση τους όμως δεν συνιστάται σε περιπτώσεις μεγάλων μορίων mRNA gt4 Kb (το5rsquo άκρο τους δεν θα αντιπροσωπεύεται επαρκώς) ή όταν τα μόρια του RNA στόχου δεν έχουνπολυ-Α ουρά (RNA προκαρυωτικών οργανισμών)

2 Μίγμα τυχαίων εξανουκλεοτιδικών εκκινητών Οι εκκινητές αυτοί απαρτίζονται από ένα μίγμαολιγονουκλεοτιδίων μήκους 6 βάσεων που έχουν τυχαία νουκλεοτιδική σύσταση Θεωρείταιότι με τη χρήση του μίγματος των τυχαίων εξανουκλεοτιδικών εκκινητών επιτυγχάνεται πληρέ-στερη κάλυψη όλων των μορίων RNA (ανεξαρτήτως πολυ-Α ουράς και σε όλο το μήκος τους)Στην πράξη χρησμοποιείται συνήθως ένα μίγμα oligo-dT και εξανουκλεοτιδικών εκκινητών

3 Εκκινητές ειδικοί για το γονίδιο στόχο Όταν το ζητούμενο είναι η αυξημένη ευαισθησία καιο έλεγχος ενός μόνο ή μικρού αριθμού γονιδίων μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκκινητές ει-δικοί για τα επιθυμητά γονίδια Στην πράξη αυτή η μέθοδος δεν έχει ευρεία εφαρμογή γιατίαπαιτείται προτύπωση των συνθηκών της αντίδρασης για κάθε ξεχωριστό εκκινητή

Η σύνθεση cDNA εκτελείται τυπικά στους 45-55deg C ανάλογα με το ένζυμο που χρησιμοποιείταιγια χρονικό διάστημα από 15 min έως 1 h Μετά το πέρας της αντίδρασης σχηματίζεται ένα δίκλωνουβριδικό μόριο που περιέχει μια αλυσίδα RNA και μια αλυσίδα DNA Στη συνέχεια με θέρμανση σευψηλή θερμοκρασία (85deg C) καταστρέφονται η αντίστροφη μεταγραφάση και η αλυσίδα του RNAΤο νεοσυντεθέν cDNA είναι συμπληρωματικό του αρχικού RNA και η ουρακίλη έχει αντικατασταθείαπό τη θυμίνη Το cDNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αρχικό υλικό στην κλασική αντίδραση PCRόπως έχει περιγραφεί στις προηγούμενες ενότητες (εικόνα 78)

713 Ποσοτική PCRΗ κλασική PCR όπως την έχουμε περιγράψει έως τώρα χρησιμοποιείται για τον πολλαπλασιασμό

του επιθυμητού τμήματος DNA To προϊόν της μπορεί να υποβληθεί σε αλληλούχηση σε κλωνοποί-ηση σε πλασμιδισκούς φορείς σε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης ή ακρυλαμίδης ή σε πέψη μεπεριοριστικές ενδονουκλεάσες και επακόλουθη ηλεκτροφόρηση Σε όλες τις περιπτώσεις ηλεκτροφό-ρησης το αποτέλεσμα που παίρνουμε είναι ποιοτικό της μορφής laquoναι ή όχιraquo ή αλλιώς laquoυπάρχει ή δεν

137

ii


ii

ii


Εικόνα 78 ndash Τα στάδια σύνθεσης του cDNA Στο μόριο RNA υβριδίζονται οι εκκινητές και η αντίστροφημεταγραφάση συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα DNA Με αποδιάταξη σε υψηλή θερμοκρασία απο-μακρύνεται το RNA και προκύπτει η πρώτη μονή αλυσίδα του cDNA

υπάρχειraquo όπως για παράδειγμα laquoυπάρχει η μετάλλαξη που δημιουργεί ή καταργεί θέση αναγνώρισηςαπό ένζυμα περιορισμούraquo laquoυπάρχει η σημειακή μετάλλαξη που αναγνωρίζει ο ειδικός εκκινητήςraquoκλπ

Πολύ σύντομα μετά την ευρεία εφαρμογή της λοιπόν έγινε προφανές ότι η κλασική PCR δενμπορούσε να απαντήσει σε ένα άλλο βασικό ερώτημα των ερευνητών που ήταν το laquoπόσοraquo Το κενόαυτό ήρθε να καλύψει η ποσοτική PCR που ανακαλύφθηκε το 1993 από τον Russel Higuchi και τουςσυνεργάτες του οι οποίοι πρόσθεσαν βρωμιούχο αιθίδιο στο διάλυμα της αντίδρασης και εφάρμοσανμια κάμερα κλειστού κυκλώματος πάνω στον θερμικό κυκλοποιητή

Βασικές αρχές της ποσοτικής PCR

Η ποσοτική PCR έχει εξελιχθεί πολύ από το 1993 μέχρι σήμερα και πλέον αποτελεί μια γρήγορηευαίσθητη και αξιόπιστη μέθοδο ποσοτικοποίησης μορίων DNA και cDNA

Εκτελείται σε εξειδικευμένα μηχανήματα (θερμικοί κυκλοποιητές πραγματικού χρόνου) εξοπλι-σμένα με ένα πολύπλοκο σύστημα κατόπτρων και φίλτρων που laquoδιαβάζουνraquo τον φθορισμό που εκπέ-μπεται από διάφορες φθορίζουσες χρωστικές καθώς αυτές ενσωματώνονται στα προϊόντα της PCRΣήμερα είναι δυνατή η ταυτόχρονη χρήση μέχρι και 21 διαφορετικών χρωστικών σε μια αντίδρασηPCR

Η βασική διαφορά ανάμεσα στην ποσοτική και την κλασική PCR είναι η φάση της αντίδρασηςστην οποία συλλέγονται τα δεδομένα και εξάγονται τα αποτελέσματα (εικόνα 79)

bull Στην κλασική PCR πρέπει πρώτα να ολοκληρωθούν όλοι οι κύκλοι της αντίδρασης (25-35)και η αντίδραση να φτάσει στη φάση κορεσμού (πλατώ) Στη συνέχεια τα δείγματα υφίστανταιπεραιτέρω χειρισμό όπως για παράδειγμα ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης και αξιολογείταιτο αποτέλεσμα της PCR

138

ii


ii

ii


bull Αντίθετα στην ποσοτική PCR τα δεδομένα συλλέγονται όταν η αντίδραση είναι ακόμη στηφάση της εκθετικής αύξησης Η σημαντικότερη παράμετρος για την ποσοτικοποίηση είναι ητιμή Cp που αντιστοιχεί στον κύκλο κατά τον οποίο ο φθορισμός των προϊόντων της PCRξεπερνά το βασικό επίπεδο (baseline)

Εικόνα 79 ndash Γραφική παράσταση της καμπύλης της αντίδρασης της ποσοτικής PCR Η οριζόντια γραμμήδείχνει το κατώφλι (threshold) στο οποίο ο φθορισμός των προϊόντων της PCR αρχίζει να ξεχωρίζει από τοβασικό επίπεδο (baseline) Ο κύκλος στον οποίο συμβαίνει αυτό αποδίδεται με την τιμήCt που αντιστοιχείστον κύκλο κατά τον οποίο ο φθορισμός ξεπερνά το κατώφλι ανίχνευσης Το σημείο αυτό είναι αλλιώςγνωστό ως σημείο διασταύρωσηςCp (Crossing Point) Η τιμήCp είναι απαραίτητη για την ποσοτικοποίησητου δείγματος Δείγματα με πολλά αντίγραφα του γονιδίου στόχου έχουν μικρότερο Cp από δείγματα μελιγότερα αντίγραφα του γονιδίου στόχου

Το Cp αντιστοιχεί στον κύκλο της αντίδρασης στον οποίο η ένταση του φθορισμού θα ξεπερά-σει το βασικό επίπεδο και θα φτάσει έναν συγκεκριμένο ουδό (κατώφλι) καταγραφής Το όριο αυτόυπολογίζεται αυτόματα από το μηχάνημα ανάλογα με τη διακύμανση των τιμών του βασικού επιπέ-δου Εάν θεωρήσουμε ότι στο σημείο του Cp η αντίδραση είναι ακόμη στην εκθετική φάση δηλαδήσε κάθε κύκλο τα προϊόντα της PCR διπλασιάζονται τότε η απόδοση της αντίδρασης είναι ίση με 2Επομένως σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο μπορούν να υπολογιστούν τα αντίγραφα του γονιδίουστόχου σε κάθε δείγμα με μοναδικές άγνωστες παραμέτρους το Cp και τα αντίγραφα του γονιδίουστόχου στο Cp (εικόνα 710)

No = Nt(E + 1)Cp

όπου No είναι τα αντίγραφα του γονιδίου στόχου στο αρχικό δείγμα Nt είναι τα αντίγραφα του γο-νιδίου στόχου στο Cp E (Efficiency) είναι η απόδοση της αντίδρασης (στην εκθετική φάση E = 2)και Cp το σημείο διασταύρωσης δηλαδή ο κύκλος της αντίδρασης κατά τον οποίο η ένταση τουφθορισμού ξεπερνά τον ουδό του βασικού επιπέδου

ΤοCp υπολογίζεται αυτόματα από το μηχάνημα Τα αντίγραφα του γονιδίου στόχου στοCp υπολο-γίζονται από την πρότυπη καμπύλη Αντίστοιχα υπάρχουν και άλλοι μαθηματικοί τύποι υπολογισμού

139

ii


ii

ii


που περιλαμβάνουν διόρθωση για τη μείωση της αποτελεσματικότητας της αντίδρασης που παρατη-ρείται με το πέρασμα των κύκλων πολλαπλασιασμού

O ποσοτικός προσδιορισμός βασίζεται στο ότι όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των μορίων DNAή cDNAστο αρχικό δείγμα τόσο μικρότερος είναι ο αριθμός των κύκλων πολλαπλασιασμού που χρειά-ζονται για να παραχθεί ικανός αριθμός προϊόντων ώστε ο φθορισμός του δείγματος να ξεπεράσει τοεπίπεδο ανίχνευσης Επομένως δείγματα με πολλά αντίγραφα του γονιδίου στόχου έχουν μικρότεροCp από δείγματα με λιγότερα αντίγραφα Επίσης είναι καλό να σημειωθεί ότι η παραγωγή του προϊό-ντος της PCR έχει γραμμική συσχέτιση με τον παραγόμενο φθορισμό

Απόλυτη ποσοτικοποίηση πρότυπη καμπύλη και γονίδιο αναφοράς

Η απόλυτη ποσοτικοποίηση στην ποσοτική PCR πραγματοποιείται βάσει μια πρότυπης καμπύ-λης η οποία δημιουργείται από δείγματα με γνωστή συγκέντρωση ή καλύτερα με γνωστό αριθμόαντιγράφων του γονιδίου που πρόκειται να ποσοτικοποιηθεί (standards)

Εικόνα 710 ndash Απόλυτη ποσοτικοποίηση των αντιγράφων ενός γονιδίου με χρήση πρότυπης καμπύληςΗ πρότυπη καμπύλη δημιουργείται υποβάλλοντας σε PCR δείγματα που έχουν γνωστό αριθμό αντιγρά-φων του γονιδίου που πρόκειται να ποσοτικοποιηθεί (standards) και συνήθως έχουν 1 log διαφορά μεταξύτους Η συσχέτιση των σημείων διασταύρωσης (Cp) των standards και του λογαρίθμου της συγκέντρωσήςτους μας δίνει την πρότυπη καμπύλη Στη συνέχεια γνωρίζοντας μόνο το σημείo διασταύρωσης (Cp) ενόςάγνωστου δείγματος μπορούμε να υπολογίζουμε τον αριθμό των αντιγράφων του υπό μελέτη γονιδίου

Για παράδειγμα η πρότυπη καμπύλη για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου ABL1

140

ii


ii

ii


κατασκευάζεται από δείγματα αναφοράς (standards) που περιέχουν 10minus1 10minus2 10minus3 10minus4 και 10minus5

αντίγραφα του γονιδίουABL1 Συνήθως χρησιμοποιούνται τουλάχιστον τέσσερα standards που έχουν1 log διαφορά μεταξύ τους Η πρότυπη καμπύλη ιδανικά πρέπει να καλύπτει όλο το εύρος των συ-γκεντρώσεων που μπορεί να ανιχνευθούν πειραματικά Για κάθε γονίδιο κατασκευάζεται διαφορετικήπρότυπη καμπύλη γιατί κάθε αντίδραση PCR ndash ζεύγους εκκινητών έχει διαφορετική απόδοση Συνε-πώς κάθε αντίδραση ποσοτικής PCR περιλαμβάνει τα δείγματα που πρόκειται να ποσοτικοποιηθούνκαι τα standards της πρότυπης καμπύλης Ο αριθμός αντιγράφων του κάθε γονιδίου στο Cp υπολογί-ζεται με βάση την πρότυπη καμπύλη όπως φαίνεται στην εικόνα 710 Χρησιμοποιώντας τη μέθοδοτης απόλυτης ποσοτικοποίησης το αποτέλεσμα για την έκφραση ενός γονιδίου δίνεται ως αριθμόςανά μονάδα αρχικού δείγματος πχ 130 αντίγραφα του κυτταρομεγαλοϊού (CMV) ανά ml αίματοςανά κύτταρο ανά mg ιστού Με αυτόν τον τρόπο πραγματοποιείται η ποσοτικοποίηση αντιγράφωνγονιδίων που είναι εξωγενή ως προς το ανθρώπινο γονιδίωμα όπως οι ιοί CMV HIV HCV κά

Στην περίπτωση που γίνεται ποσοτικοποίηση γονιδίων που εκφράζονται ενδογενώς στον άνθρωπο(ή στο εκάστοτε πειραματικό σύστημα) είναι απαραίτητη η χρήση ενός γονιδίου αναφοράς Το γονί-διο αναφοράς πρέπει να έχει σταθερή έκφραση στις δεδομένες πειραματικές συνθήκες και χρησιμο-ποιείται για να εξομαλύνει τις διαφορές που υπάρχουν ανάμεσα στα δείγματα είτε λόγω αποκλίσεωνστην απόδοση της σύνθεσης του cDNA είτε λόγω μικροδιαφορών στο πιπεττάρισμα κατά την προ-σθήκη γενετικού υλικού στην αντίδραση Τα πιο συνηθισμένα γονίδια αναφοράς είναι το Abelsonmurine Leukemia viral oncogene homolog 1 (ABL1) και η ακτίνη-β (ACTB) Το αποτέλεσμα έχειπλέον μόνο αριθμητική μορφή και είναι του τύπου

Αριθμός αντιγράφων δείγματος =αριθμός αντιγράφων γονιδίου στόχουαριθμός αντιγράφων γονιδίου αναφοράς

Εκτός από την απόλυτη μπορεί να πραγματοποιηθεί και σχετική ποσοτικοποίηση της γονιδιακήςέκφρασης Σε αυτή την περίπτωση συγκρίνονται τα Cp του γονιδίου στόχου και του γονιδίου αναφο-ράς ανάμεσα σε δύο δείγματα και το αποτέλεσμα είναι του τύπου laquox φορές υψηλότερη ή χαμηλότερηέκφραση του γονιδίου στο δείγμα 1 σε σχέση με το δείγμα 2raquo Έχουν αναπτυχθεί πολλά μαθηματικάμοντέλα που περιγράφουν αυτή τη μορφή σχετικής ποσοτικοποίησης Το απλούστερο και ευρύτεραχρησιμοποιούμενο είναι το ακόλουθο [1]

R = 2minus[∆Cp δείγματοςminus∆Cp γονιδίου αναφοράς]

R = 2minus[∆∆Cp]

Φθορίζουσες χρωστικές

Οι φθορίζουσες χρωστικές που χρησιμοποιούνται σήμερα στην ποσοτική PCR διακρίνονται σεειδικές και μη ειδικές

Οι μη εδικές φθορίζουσες χρωστικές όπως το SYBR Green I (εικόνα ) παρουσιάζουν ελάχι-στο ή μηδενικό φθορισμό όταν είναι ελεύθερες στο διάλυμα (Α) και φθορίζουν όταν ενσωματώνονταιστη μικρή αύλακα των δίκλωνων μορίων DNA (Β και Γ) Κατά την ποσοτική PCR πραγματοποιείταιμέτρηση φθορισμού σε κάθε κύκλο μετά το τέλος της επιμήκυνσης των μορίων DNA Όσο περισσό-τερα PCR προϊόντα παράγονται τόσο περισσότερο αυξάνει ο φθορισμός που καταγράφεται από τομηχάνημα

Οι ειδικές χρωστικές δεν είναι ελεύθερες στο διάλυμα αλλά είναι προσδεδεμένες πάνω σε μικράμόρια DNA (25-30 βάσεις) και υβριδίζονται στο γονίδιο στόχο ανάμεσα στους δύο εκκινητές Οι πιοσυχνά χρησιμοποιούμενες χρωστικές είναι οι ιχνηθέτες τύπου Taqman (Taqman Probes) (εικόνα 712)Στο 5rsquo άκρο του ιχνηθέτη υπάρχει ένα φθοριοφόρο μόριο και στο 3rsquo άκρο ένα μόριο παρεμπόδισης

141

ii


ii

ii


Εικόνα 711 ndash Μη ειδικές φθορίζουσες χρωστικές Οι μη ειδικές φθορίζουσες χρωστικές με γνωστότερητο SYBRGreen I ενσωματώνονται στο δίκλωνο μόριο dsDNA καθώς αυτό συντίθεται και φθορίζουν μόνοόταν είναι συνδεδεμένες

φθορισμού (α) Στο στάδιο του υβριδισμού ο ιχνηθέτης υβριδίζεται στο γονίδιο στόχο (β) Υδρόλυσητου ιχνηθέτη Taqman μέσω της 5rsquo-3rsquo εξωνουκλεολυτικής δράσης της Taq πολυμεράσης διαχωρίζειτο φθοριοφόρο από τον καταστολέα με αποτέλεσμα την εκπομπή φθορισμού από το πρώτο (γ) Ημέτρηση του φθορισμού πραγματοποιείται σε κάθε κύκλο μετά το τέλος της επιμήκυνσης των μορίωνDNA και η αύξηση του φθορισμού συνάδει με αύξηση των παραγόμενων μορίων DNA (δ)

Εικόνα 712 ndash Ειδικές φθορίζουσες χρωστικές Οι ειδικές φθορίζουσες χρωστικές (στην εικόνα περιγράφο-νται οι ιχνηθέτες τύπου Taqman) είναι συνδεδεμένες πάνω σε μικρά μόρια DNA Υβριδίζονται στο γονίδιοστόχο και κατά την επιμήκυνση της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας η Taq πολυμεράση διασπά τον ιχνηθέτηδιαχωρίζοντας έτσι το φθοριοφόρο από τον καταστολέα με αποτέλεσμα την εκπομπή φθορισμού από τοπρώτο

Το σαφές πλεονέκτημα των ιχνηθετών Taqman είναι ότι καθιστούν δυνατή τη μέτρηση και πο-σοτικοποίηση μόνο του επιθυμητού προϊόντος της PCR Τα διμερή εκκινητών ή άλλα παραπροϊόνταπου τυχόν παράγονται κατά την αντίδραση δεν μετέχουν στην ποσοτικοποίηση καθώς ο ιχνηθέτηςδεν υβριδίζεται πάνω τους και κατά συνέπεια δεν δημιουργείται σήμα φθορισμού Βέβαια οι ιχνηθέ-τες αυτοί έχουν σχετικά υψηλό κόστος αγοράς και για κάθε PCR πρέπει να σχεδιαστεί ο κατάλληλοςιχνηθέτης Αντίθετα οι μη ειδικές χρωστικές (όπως το SYBR Green I) είναι φθηνές και κοινές γιαόλα τα ζεύγη εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην ποσοτική PCR Για να χρησιμοποιηθούν σωστάόμως πρέπει η αντίδραση να σχηματίζει ένα και μοναδικό προϊόν και όχι διμερή εκκινητών ή άλλαπαραπροϊόντα Αυτό μπορεί να επιβεβαιωθεί με μελέτη της καμπύλης τήξης των προϊόντων της PCRμετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης της ποσοτικής PCR

142

ii


ii

ii


72 Πρακτικό μέρος

721 Σχεδιασμός εκκινητών για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίουTAS2R38Στο πρακτικό μέρος της άσκησης θα ξεκινήσουμε από τον σχεδιασμό των ολιγονουκλεοτιδικών εκ-

κινητών για την ενίσχυση του τμήματος του γονιδίου TAS2R38 που φέρει τον πολυμορφισμό rs1726866τον οποίο θα μελετήσουμε σε επόμενη άσκηση με εκτέλεση PCR και πέψη του προϊόντος της PCR μεχρήση κατάλληλης περιοριστικής ενδονουκλεάσης Στόχος είναι να ανιχνεύσουμε το γονότυπο τηςπολυμορφικής θέσης rs1726866 στα δείγματα που θα εξετάσουμε Για να πραγματοποιήσουμε τηνάσκηση θα χρειαστούμε τη νουκλεοτιδική αλληλουχία του γονιδίου που ανακτήσαμε στο πλαίσιο τουπρακτικού μέρους του κεφαλαίου 2 του παρόντος οδηγού

Θυμηθείτε ότι η αλληλουχία που ανακτήσαμε προέρχεται από την εγγραφή NM_176817 τηςRefSeq Εξετάζοντας τον πολυμορφισμό rs1726866 στην dbSNP διαπιστώνουμε ότι αφορά την αλ-λαγή μιας θυμίνης (Τ) σε κυτοσίνη (C) στη θέση 869 (g869CgtT) της αλληλουχίας της εγγραφήςNM_1768174 της RefSeq που έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του αμινοξέως βαλίνη (V) σε αλα-νίνη (A) στην κωδικοποιούσα αλληλουχία της πρωτεΐνης (pV262A) Το πολυμορφικό νουκλεοτίδιο Τεμφανίζεται σε άτομα που δεν αντιλαμβάνονται την πικρή γεύση του φαινυλοθειοκαρβαμιδίου (PTC)ενώ το πολυμορφικό νουκλεοτίδιο C στα άτομα που την αντιλαμβάνονται

Προκειμένου να γονοτυπήσουμε τον πολυμορφισμό rs1726866 θα χρειαστεί να ενισχύσουμε ένατμήμα του γονιδίου TAS2R38 το οποίο απαραίτητα θα πρέπει να περιέχει τη θέση 869 (ξεκινώνταςτην αρίθμηση από το πρώτο νουκλεοτίδιο της αλληλουχίας της εγγραφής NM_1768174) Επειδήπερίπου 70 βάσεις καθοδικά της θέσης 869 βρίσκεται μία επιπλέον θέση αναγνώρισης της περιοριστι-κής ενδονουκλεάσης που θα χρησιμοποιήσουμε επιδιώκουμε η θέση αυτή να μη συμπεριλαμβάνεταιστην αλληλουχία που θα ενισχύσουμε (την επιλογή αυτή θα την επανεξετάσουμε τεκμηριωμένα στιςεργασίες του κεφαλαίου 9 όταν θα κληθούμε να επανασχεδιάσουμε την αντίδραση) Η ενίσχυση ενόςτμήματος 300-350 βάσεων είναι επαρκής για να πραγματοποιήσουμε την ενζυμική πέψη του προϊό-ντος της PCR Έτσι στοχεύουμε στην ενίσχυση ενός τμήματος περίπου μεταξύ των νουκλεοτιδίων550 και 940 της αλληλουχίας μας

1 Ακολουθώντας τις οδηγίες της σελίδας 40 ανακτούμε την κωδικοποιούσα αλληλουχία του γο-νιδίου και τις 5rsquo και 3rsquo αμετάφραστες περιοχές (Untranslated Region UTRs) Αποθηκεύουμετην αλληλουχία μας σε ένα αρχείο τύπου FASTA με το όνομα TAS2R38fnn

2 Μεταβαίνουμε στη διεύθυνση httpbioinfouteeprimer3 προκειμένου να χρησιμο-ποιήσουμε τη διαδικτυακή έκδοση του προγράμματος primer3 (Primer3web version 400) [2][3]

3 Επικολλούμε την αλληλουχία του TAS2R38 στο αντίστοιχο πεδίο και επιλέγουμε τη χρησιμο-ποίηση των βιβλιοθηκών που περιέχουν τα πρότυπα των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών τουανθρώπινου γονιδιώματος προκειμένου να αποφύγουμε τον σχεδιασμό εκκινητών σε περιοχέςεπαναλαμβανόμενων αλληλουχιών (επιλογή Mispriming Librayrarr HUMAN) (εικόνα 713)

4 Υπάρχουν πολλές ρυθμίσεις που μπορούν να γίνουν κατά την αναζήτηση κατάλληλων εκκι-νητών όπως για παράδειγμα το επιθυμητό μήκος τους το εύρος των Tm τους το μέγεθος τηςαλληλουχίας που επιθυμούμε να ενισχύσουμε και πολλές άλλες που δεν θα μας απασχολήσουνκαθώς οι προεπιλογές του προγράμματος καλύπτουν τις ανάγκες μας

5 Προκειμένου να οριοθετήσουμε την περιοχή της αλληλουχίας που επιθυμούμε να ενισχυθείτην τοποθετούμε σε αγκύλες (πχ [ΑΤΤΑΤΤΤGCT]) στο πεδίο που την έχουμε επικολλή-

143

ii


ii

ii


Εικόνα 713 ndash Το περιβάλλον της εφαρμογής Primer3web Στα πεδία φαίνονται οι ρυθμίσεις που περιγρά-φονται στο κείμενο

σει Εναλλακτικά ορίζουμε την αλληλουχία στόχο στο πεδίο laquoTargetsraquo συμπληρώνοντας τοναριθμό του νουκλεοτιδίου εκκίνησης και διαχωρισμένο με κόμμα το μήκος της αλληλουχίαςσε βάσεις Για παράδειγμα στην περίπτωσή μας γράφουμε laquo600300raquo υποδεικνύοντας ότι θαπρέπει να ενισχυθεί η αλληλουχία από το νουκλεοτίδιο 600 έως το νουκλεοτίδιο 900 (600+300)(εικόνα 713)

6 Μπορούμε να εξαιρέσουμε περιοχές στις οποίες δεν επιθυμούμε να δημιουργηθούν εκκινητέςσυμπληρώνοντας το πεδίο laquoExcluded Regionsraquo Επειδή δεν επιθυμούμε την συμπερίληψη τηςδεύτερης θέσης αναγνώρισης της περιοριστικής ενδονουκλεάσης στην ενισχυόμενη αλληλου-χία περιορίζουμε το όριο της αλληλουχίας όπου θα αναζητηθεί ο ανάστροφος (reverse ή right)εκκινητής Στην περίπτωσή μας μπορούμε να αποκλείσουμε την αναζήτηση εκκινητή πέραν τουνουκλεοτιδίου 940 βάζοντας τιμές 940200 που σημαίνει ότι αποκλείσαμε την περίπτωση νααναζητήσει το πρόγραμμα εκκινητή από το νουκλεοτίδιο 940 μέχρι το τέλος του γονιδίου συ-νολικού μήκους 1141 νουκλεοτιδίων Το ίδιο μπορεί να επιτευχθεί τοποθετώντας το αντίστοιχοτμήμα της αλληλουχίας ανάμεσα στα σύμβολα lt gt (εικόνα 713)

7 Μπορούμε να ορίσουμε το επιθυμητό εύρος του μεγέθους του προϊόντος στην επιλογή laquoProductSize Rangesraquo Στην περίπτωσή μας μια επιλογή 300-500 νουκλεοτιδίων είναι μέσα στο εύροςπου μας ικανοποιεί

144

ii


ii

ii


8 Υπάρχουν διαφορετικές προσεγγίσεις που μπορούμε να ακολουθήσουμε για να ορίσουμε τιςπροϋποθέσεις και τις περιοχές που επιθυμούμε να ενισχυθούν και εκείνες όπου επιθυμούμε νααναζητήσουμε τους εκκινητές Αφιερώστε λίγο χρόνο να κοιτάξετε τις διάφορες ρυθμίσεις χω-ρίς να χρειάζεται να αλλάξει κάτι άλλο στις προεπιλογές για τις ανάγκες της παρούσας εργασίας

9 Πατώντας το κουμπί Pick Primers λαμβάνουμε στην οθόνη μας μια αναφορά που έχει τρίακυρίως τμήματα (εικόνες 714 και 715)

bull Στο άνω μέρος βρίσκεται το προτεινόμενο ζεύγος των εκκινητών με ορισμένες πληροφο-ρίες που τους αφορούν όπως το νουκλεοτίδιο έναρξης το μήκος η Tm η περιεκτικότητασε GC το μέγεθος της ενισχυόμενης αλληλουχίας κά (εικόνα 714)

bull Στο μεσαίο τμήμα της αναφοράς δίνεται αναλυτικά η αλληλουχία στην οποία πραγματο-ποιήσαμε αναζήτηση και σημειώνονται οι θέσεις των εκκινητών πάνω σrsquo αυτή Επίσηςσημειώνονται οι διάφορες ρυθμίσεις που κάναμε σε σχέση με την αλληλουχία στόχο τιςπεριοχές που πρέπει να εξαιρεθούν από την αναζήτηση εκκινητών κλπ (εικόνα 715)

bull Στο κατώτερο τμήμα δίνονται εναλλακτικά ζεύγη εκκινητών σε περίπτωση που για κά-ποιο λόγο δεν επιθυμούμε να χρησιμοποιήσουμε το πρώτο προτεινόμενο ζεύγος

Εικόνα 714 ndash Αρχικό τμήμα της αναφοράς του προγράμματος Primer3 Δίνονται οι αλληλουχίες τουπρώτου ζεύγους εκκινητών μαζί με πληροφορίες που τους αφορούν όπως η θέση τους στην αλληλουχίαη Tm η σύστασή τους σε βάσεις CG και το μέγεθος της αλληλουχίας που ενισχύουν σε ζεύγη βάσεων

10 Αποθηκεύστε την αναφορά σας σε ένα αρχείο απλού κειμένου για μελλοντική χρήση

Παρατηρήστε την εικόνα 714 Με το σύμβολο gt επισημαίνονται τα νουκλεοτίδια όπου εντοπί-ζεται η θέση των εκκινητών Εξετάζοντας τις αλληλουχίες των εκκινητών παρατηρήστε ότι μόνο ηαλληλουχία του αριστερού εκκινητή είναι αναγνωρίσιμη στην αλληλουχία σας του δεξιού όμως όχιΗ εξήγηση είναι απλή H αλληλουχία μας (όπως άλλωστε όλες οι αλληλουχίες) είναι γραμμένη σεκατεύθυνση 5rsquorarr3rsquo Κατά συνθήκη η αλληλουχία της συμπληρωματικής αλυσίδας παραλείπεται Οαριστερός forward εκκινητής πρόκειται να υβριδιστεί όχι στην αλληλουχία που βλέπουμε αλλά στησυμπληρωματική της αλυσίδα έτσι ώστε να ξεκινήσει η σύνθεση μιας αλυσίδας όμοιας με την 5rsquorarr3rsquoαλληλουχία Είναι ευνόητο λοιπόν ότι ο forward εκκινητής έχει αλληλουχία όμοια με αυτή της αλ-ληλουχίας που βλέπουμε και μπορούμε εύκολα να τον αναγνωρίσουμε Ο δεξιός (reverse) εκκινητής

145

ii


ii

ii


του οποίου η αλληλουχία δεν μπορεί να αναγνωριστεί άμεσα πρόκειται να υβριδιστεί στην αλυσίδατης οποίας την αλληλουχία εξετάζουμε άρα θα πρέπει να είναι συμπληρωματικός προς αυτή Επι-πλέον πρέπει να είναι και ανάστροφος εφόσον η κατεύθυνση της αντιγραφής της συμπληρωματικήςαλυσίδας από την DNA πολυμεράση είναι 5rsquorarr3rsquo Το σημείο αυτό αξίζει την προσοχή σας καθώςγεννά συχνά απορίες και δημιουργεί σύγχυση Κατά την παραγγελία των ολιγονουκλεοτιδικών αλλη-λουχιών των εκκινητών από το εργαστήριο που θα τους συνθέσει αναγράφουμε τις αλληλουχίες μεκατεύθυνση 5rsquorarr3rsquo

Εικόνα 715 ndash Μέρος της αναφοράς του προγράμματος Primer3 στην οποία σημειώνονται η θέση τωνεκκινητών (gt) η αλληλουχία στόχος της ενίσχυσης () και οι περιοχές που εξαιρέθηκαν από την αναζήτησηεκκινητών (Χ) σύμφωνα με τις ρυθμίσεις που αναφέρονται στο κείμενο

146

ii


ii

ii


722 In silico PCRΓνωρίζοντας τις αλληλουχίες ενός ζεύγους εκκινητών μπορούμε να πραγματοποιήσουμε μια ει-

κονική αντίδραση PCR στον υπολογιστή (in silico PCR) Διαθέτοντας το σύνολο του ανθρώπινουγονιδιώματος μπορούμε να εξακριβώσουμε εάν οι εκκινητές μας ενισχύουν μία ή περισσότερες περιο-χές στο ανθρώπινο γονιδίωμα αν δηλαδή η ενίσχυση είναι ειδική Το ανθρώπινο γονιδίωμα εμφανίζειπεριοχές που επαναλαμβάνονται και περιοχές με τα λεγόμενα ψευδογονίδια Ένας τέτοιος απλός έλεγ-χος μας βοηθά να εξασφαλίσουμε την ειδικότητα της σχεδιαζόμενης αντίδρασης πριν προχωρήσουμεστην παραγγελία των εκκινητών

Στον περιηγητή γονιδιωμάτων UCSC η αναζήτηση αυτή είναι απλή και μπορεί να γίνει με το ερ-γαλείο laquoIn Silico PCRraquo που είναι διαθέσιμο επιλέγοντας τον αντίστοιχο υπερσύνδεσμο στην αρχικήσελίδα του περιηγητή Για να πραγματοποιήσουμε In Silico PCR με το ζεύγος των εκκινητών πουσχεδιάσαμε με τη βοήθεια του προγράμματος Primer3web ακολουθούμε τα παρακάτω βήματα

1 Μεταβαίνουμε στην αρχική σελίδα του περιηγητή γονιδιωμάτων UCSC και επιλέγουμε τονυπερσύνδεσμο laquoIn Silico PCRraquo στην αριστερή στήλη της ιστοσελίδας

2 Επικολλούμε τις αλληλουχίες των εκκινητών που σχεδιάσαμε στα πεδία Forward και Reverseprimer αντίστοιχα Επιλέγουμε το κουμπί υποβολής (εικόνα 716)

Εικόνα 716 ndash Το περιβάλλον της εφαρμογής laquoIn Silico PCRraquo του περιηγητή UCSC

3 Εξετάζουμε τα αποτελέσματα της αναζήτησης Αν παρουσιαστεί μία και μοναδική εγγραφήτότε το ζεύγος των εκκινητών μας ενισχύει θεωρητικά μία μοναδική αλληλουχία στο ανθρώ-πινο γονιδίωμα Σε αντίθετη περίπτωση περισσότερες από μία αλληλουχίες εμφανίζονται στααποτελέσματα της αναζήτησης μαζί με τις χρωμοσωμικές συντεταγμένες των περιοχών πουενισχύθηκαν (εικόνα 717)

4 Αποθηκεύουμε την αλληλουχία μας σε ένα απλό αρχείο κειμένου προκειμένου να τη χρησιμο-ποιήσουμε αργότερα

Υπάρχουν διάφορες ρυθμίσεις που μπορούμε να κάνουμε στην εφαρμογή όπως την έκταση της μησυμπληρωματικότητας των εκκινητών με την αλληλουχία στόχο ή την αναζήτηση μόνο σε μεταγρα-φόμενες περιοχές του γονιδιώματος αν αυτό είναι απαραίτητο Προς το παρόν οι προεπιλογές τηςεφαρμογής επαρκούν για τις ανάγκες της εργασίας μας

723 Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου TAS2R38Σκοπός της πειραματικής διαδικασίας είναι να ενισχύσουμε στο εργαστήριο τμήμα της αλληλου-

χίας του γονιδίου TAS2R38 που περιέχει τον πολυμορφισμό rs1726866 Το προϊόν της αντίδρασης θαυποστεί στη συνέχεια πέψη με περιοριστική ενδονουκλεάση προκειμένου να διαπιστωθεί ο γονότυ-πος Στην αντίδραση θα χρησιμοποιηθούν οι ακόλουθοι ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές [4]

147

ii


ii

ii


Εικόνα 717 ndash Αποτελέσματα της In Silico PCR Στο άνω μέρος της αλληλουχίας αναγράφονται οι χρωμο-σωμικές συντεταγμένες στο χρωμόσωμα 7 το μέγεθος της ενισχυόμενης αλληλουχίας (376 bp) και οι εκκι-νητές που χρησιμοποιήθηκαν Παρατηρούμε ότι οι εκκινητές αναγράφονται με κεφαλαία στην αλληλουχίαπου ακολουθεί Οι δύο εκκινητές προβλέπεται ότι θα ενισχύσουν μόνο την περιοχή του χρωμοσώματος 7που μας ενδιαφέρει και το προϊόν της PCR έχει το προβλεπόμενο μέγεθος

bull Forward 5rsquo-AACTGGCAGAATAAAGATCTCAATTTAT-3rsquo

bull Reverse 5rsquo-AACACAAACCATCACCCCTATTTT-3rsquo

Το τμήμα του γονιδίου TAS2R38 που πρόκειται να ενισχυθεί έχει μέγεθος 303 ζεύγη βάσεωνΤα αντιδραστήρια που θα χρησιμοποιηθούν για την αντίδραση PCR είναι τα ακόλουθα

bull Εκκινητές Forward και Reverse

bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)

bull 5 Χ Taq buffer (ελεύθερο μαγνησίου)

bull Taq Polymerase (5 unitsμl)

Η αντίδραση θα πραγματοποιηθεί σε τελικό όγκο διαλύματος 25 μl Η ποσότητα του αρχικού DNAθα είναι 125 ng δηλαδή 5 μl από το διάλυμα εργασίας συγκέντρωσης 25 ngμl που παρασκευάσαμεστο πλαίσιο του πρακτικού μέρους του κεφαλαίου 6

Στον πίνακα 72 μπορούμε να δούμε αναλυτικά τους όγκους του κάθε αντιδραστηρίου που θαχρησιμοποιηθεί (μέχρι τελικού όγκου 25 μl) και την τελική τους συγκέντρωση στο διάλυμα της αντί-δρασης

148

ii


ii

ii


Αντιδραστήρια Όγκος (μl) Τελική συγκέντρωση

Primer F (10 μΜ) 05 02 μΜPrimer R (10 μΜ) 05 02 μΜdNTPs (10 mM) 05 02 mM κάθε dNTPMgCL2 (25 mM) 15 15 mM

5x Mg free Taq Buffer 5 1xTaq Polymerase (5 unitsμl) 03 15 units25 μl

DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117

Τελικός όγκος 25

Πίνακας 72 ndash Τα αντιδραστήρια και οι συγκεντρώσεις τους στον τελικό όγκο των 25 μl

Οι συνθήκες της αντίδρασης στο θερμικό κυκλοποιητή δίνονται στον πίνακα 73

Διαδικασία Τ (deg C) Χρόνος Κύκλοι

Αρχική αποδιάταξη 95 5 min 1Αποδιάταξη 95 1 min

30Σύνδεση εκκινητών 55 45 secΕπιμήκυνση 72 45 secΤελική επιμήκυνση 72 10 min 1

Πίνακας 73 ndash Συνθήκες διεξαγωγής της αντίδρασης στο θερμικό κυκλοποιητή

Για την προετοιμασία της αντίδρασης ακολουθούμε τα παρακάτω βήματα

1 Σημειώνουμε με ανεξίτηλο μαρκαδόρο τον αριθμό του δείγματός μας σε ένα σωληνάριο πολυ-προπυλενίου (τύπου eppendorf) 15 ml

2 Το προσωπικό του εργαστηρίου θα προσθέσει στο σωληνάριο 20 μl μίγματος (Master Mix) μετα απαραίτητα συστατικά για τη διενέργεια της αντίδρασης (εκτός από το DNA σας) όπωςπαρουσιάζονται στον πίνακα 72 Τα αντιδραστήρια για τη παρασκευή του μίγματος (MasterMix) διατηρούνται σε πάγο σε όλη την πορεία της προετοιμασίας των δειγμάτων

3 Προσθέτουμε στο σωληνάριο 5 μl από το διάλυμα DNA συγκέντρωσης 25 ngμl που παρα-σκευάσαμε μετά την αραίωση (δηλ συνολικά περίπου 125 ng DNA)

4 Ανακατεύουμε ελαφρά το περιεχόμενο του σωληναρίου με πιπεττάρισμα

5 Τοποθετoύμε το δείγμα μας στην κεφαλή του θερμικού κυκλοποιητή

6 Επιλέγουμε το αποθηκευμένο πρόγραμμα με τις επιθυμητές συνθήκες της PCR

149

ii


ii

ii


7 Μετά το τέλος της διαδικασίας καταστρέφουμε τα δείγματα DNA σύμφωνα με τις οδηγίες πουμας δόθηκαν

Ταυτόχρονα με τα δείγματα που περιέχουν DNA τοποθετούνται στον θερμικό κυκλοποιητή δείγματαπου αποτελούνται μόνο από μίγμα αντιδραστηρίων (τυφλά δείγματα) Τα τυφλά δείγματα λειτουργούνως μάρτυρες Αν διαπιστωθεί ενίσχυση γενετικού υλικού στα τυφλά δείγματα που κανονικά δεν πρέ-πει να περιέχουν DNA σημαίνει ότι υπάρχει επιμόλυνση με DNA και τα αποτελέσματα των αντιδρά-σεών μας δεν είναι αξιόπιστα Η επιμόλυνση αυτή μπορεί να οφείλεται είτε σε επιμόλυνση κάποιουαπό τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή του μίγματος είτε σε επιμόλυνσητων πλαστικών ρυγχών ή κάποιας από τις πιπέττες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή τουςΣε τέτοια περίπτωση η πηγή της επιμόλυνσης θα πρέπει να ανευρεθεί προκειμένου να επαναληφθεί ηαντίδραση χωρίς επιμολύνσεις

Μετά το πέρας της αντίδρασης το προσωπικό του εργαστηρίου θα ηλεκτροφορήσει τα δείγματασε πήκτωμα αγαρόζης προκειμένου να διαπιστωθεί αν η αντίδραση ήταν πετυχημένη

73 Ερωτήσεις - εργασίες1 Έχετε εκτελέσει μια αντίδραση PCR με στόχο τον πολλαπλασιασμό ενός τμήματος του γονιδίου

TAS2R38 Μετά το πέρας της αντίδρασης ηλεκτροφορείτε το προϊόν και διαπιστώνετε ότι δενυπάρχει ορατή ζώνη στο πήκτωμα αγαρόζης Δώστε μία ή περισσότερες εξηγήσεις για το τιμπορεί να έχει συμβεί

Απάντηση

bull Δεν έχει προστεθεί DNA στο σωληνάριο της PCR

bull Δεν έχει προστεθεί πολυμεράση ή κάποιο άλλο από τα συστατικά της αντίδρασης

bull Το DNA που προστέθηκε δεν ήταν καλής ποιότητας (ήταν κατακερματισμένο) ή περιείχεαναστολείς για παράδειγμα υπολείμματα αιθανόλης

bull Υπήρξε διακοπή ρεύματος κατά τη διάρκεια της PCR και η αντίδραση δεν ολοκληρώθηκε

bull Οι συνθήκες της αντίδρασης ήταν λάθος Μπορεί το αποθηκευμένο πρόγραμμα της PCRνα είχε τροποποιηθεί από άλλον χειριστή

bull Εάν στο πήκτωμα αγαρόζης δεν είναι ορατός ούτε ο μάρτυρας γνωστού μοριακού βάρους(ladder) τότε μπορεί να μην έχει προστεθεί η κατάλληλη φθορίζουσα χρωστική κατά τηνπαρασκευή του πηκτώματος

2 Ποιες αλλαγές θα προτείνατε (και γιατί) για να βελτιστοποιήσετε μια αντίδραση PCR στηνοποία εκτός από το βασικό προϊόν συντίθενται και παραπροϊόντα

Απάντηση

bull Αύξηση της θερμοκρασίας υβριδισμού των εκκινητών με σκοπό την αύξηση της ειδικό-τητας του υβριδισμού (οι εκκινητές θα υβριδιστούν μόνο στις περιοχές προς τις οποίεςέχουν απόλυτη συμπληρωματικότητα)

bull Μείωση της συγκέντρωσης των ιόντων μαγνησίου με σκοπό να αυξηθεί η ειδικότητα τηςαντίδρασης

bull Μείωση της ποσότητας της πολυμεράσης που προστίθεται στην αντίδραση

150

ii


ii

ii


bull Επανασχεδιασμός των εκκινητών με στόχο τη δημιουργία νέων εκκινητών που θα είναιειδικοί μόνο προς την περιοχή του DNA που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε

3 Ποιες αλλαγές θα προτείνατε (και γιατί) για να βελτιστοποιήσετε μια αντίδραση PCR η οποίαέχει χαμηλή απόδοση (δεν συντίθεται αρκετό προϊόν)

bull Σταδιακή αύξηση της συγκέντρωσης του μαγνησίου μέχρι το σημείο που αρχίζουν ναεμφανίζονται παραπροϊόντα

bull Προσθήκη περισσότερου ή καλύτερης ποιότητας γενετικού υλικούbull Προσθήκη περισσότερης πολυμεράσης στο διάλυμα της αντίδρασηςbull Αύξηση των κύκλων της αντίδρασης με ανώτερο όριο τους 35-40 κύκλους Τα νουκλεο-τίδια και οι εκκινητές συνήθως προστίθενται εξαρχής σε περίσσεια επομένως περαιτέρωαύξηση της συγκέντρωσής τους δεν έχει ουσιαστική επίδραση στην απόδοση της αντίδρα-σης

4 Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται η ηλεκτροφόρηση των προϊόντων μιας αντίδρασης PCR μεδιαβάθμιση θερμοκρασίας υβριδισμού (Gradient PCR) για ενίσχυση τμήματος 494 bp του γο-νιδίου Tas1R2 σε πήκτωμα αγαρόζης 2 Η συγκεκριμένη PCR επιτρέπει την επιλογή της κα-ταλληλότερης θερμοκρασίας ως θερμοκρασίας υβριδισμού των εκκινητών (primer annealingtemperature) για ένα συγκεκριμένο ζεύγος εκκινητώνΧρησιμοποιώντας έναν κυκλοποιητή με δυνατότητα κλίσης θερμοκρασιών μπορούμε να ταυ-τοποιήσουμε τη θερμοκρασία σύνδεσης των εκκινητών της αντίδρασης η οποία θα παρέχει απο-δοτική και ειδική ενίσχυση των προϊόντων εφόσον οι υπόλοιποι παράγοντες που καθορίζουντην απόδοση της αντίδρασης παραμένουν σταθεροί Στην περίπτωσή μας (εικόνα 718) έγινεPCR με κλίση θερμοκρασιών από 51 έως 64 deg C Με βάση τα παραπάνω επιλέξτε εσείς τηνκαταλληλότερη θερμοκρασία σύνδεσης των εκκινητών για τη συγκεκριμένη αντίδραση PCR

Εικόνα 718 ndash Hλεκτροφόρηση των προϊόντων αντίδρασης PCR για ενίσχυση τμήματος 494 bp του γονι-δίου Tas1R2 με διαβάθμιση θερμοκρασίας υβριδισμού (gradient PCR) σε πήκτωμα αγαρόζης 2

ΑπάντησηΣε θερμοκρασίες 51-588 deg C έχει γίνει ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων και έχουν σχηματιστείδιμερή εκκινητών (primer dimers) Επίσης η ζώνη στο αναμενόμενο μέγεθος (περίπου 500 bp)δεν είναι έντονη Κατάλληλη θερμοκρασία θεωρείται εκείνη στην οποία η ζώνη στο αναμενό-μενο μέγεθος είναι έντονη και με σαφή όρια (δεν παρουσιάζει smear) Για τη συγκεκριμένηPCR θα μπορούσε να επιλεγεί μια θερμοκρασία από 62 έως 64 deg C (εικόνα 719)

151

ii


ii

ii


Εικόνα 719 ndash Σε θερμοκρασίες υβριδισμού των εκκινητών 51-588deg C παρατηρούμε ενίσχυση μη ειδικώνπροϊόντων και σχηματισμό διμερών εκκινητών (primer dimers)

74 Βιβλιογραφία[1] J Winer C K Jung I Shackel et al ldquoDevelopment and validation of real-time quantitative

reverse transcriptase-polymerase chain reaction for monitoring gene expression in cardiac my-ocytes in vitrordquo Anal Biochem vol 270 no 1 pp 41ndash49 May 1999 doi 101006abio19994085

[2] A Untergasser I Cutcutache T Koressaar et al ldquoPrimer3ndashnew capabilities and interfacesrdquoNucleic Acids Res vol 40 no 15 e115 Aug 2012 doi 101093nargks596

[3] T Koressaar andMRemm ldquoEnhancements andmodifications of primer design programPrimer3rdquo Bioinformatics vol 23 no 10 pp 1289ndash1291 May 2007 doi 101093bioinformaticsbtm091

[4] R B Merritt L A Bierwert B Slatko et al ldquoTasting phenylthiocarbamide (ptc) a newintegrative genetics lab with an old flavorrdquo The American Biology Teacher vol 5 no 70 e23ndashe28 2008 [Online] Available httpwwwbiooneorgdoifull1016620002-7685(2008)70[23TPPANI]20CO2

Χρήσιμες ηλεκτρονικές διευθύνσεις

bull Εκπαιδευτικό βίντεο για την κλασική αντίδραση PCRhttpswwwyoutubecomwatchv=eEcy9k_KsDI

bull Σύνθεση cDNAhttpwwwbiodavidsonedugenomicsmethodcDNAproductionhtml

bull Pfaffl Michael W laquoQuantification strategies in real-time PCRraquo από το βιβλίο A-Z ofquantitative PCR International University Line La Jolla Ca 2004httpwwwgene-quantificationdechapter-3-pfafflpdf

bull Υπολογισμός παραμέτρων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητώνhttpwwwbasicnorthwesternedubiotoolsoligocalchtml

152

ii


ii

ii


ζεται μέχρι και ένα τρισεκατομμύριο φορές γεγονός που είναι απαραίτητο για μετέπειτα χειρισμούςόπως η ηλεκτροφόρηση η πέψη με ένζυμα περιορισμού η ανάγνωση της αλληλουχίας βάσεων κά

Τα στάδια της PCR

Η αντίδραση PCR πραγματοποιείται σε τρία στάδια τα οποία επαναλαμβάνονται διαδοχικά (ει-κόνα 71)

Εικόνα 71 ndash Τα στάδια της αντίδρασης PCR

1 Αποδιάταξη Οι δύο αλυσίδες του DNA διαχωρίζονται (αποδιατάσσονται) με θέρμανση σε θερ-μοκρασία 94-95deg C για περίπου 30 sec έως 1 min

2 Υβριδισμός εκκινητών Με μείωση της θερμοκρασίας στους 55-65deg C για περίπου 30 sec έως1 min οι εκκινητές υβριδίζονται στις συμπληρωματικές τους αλληλουχίες στο εκμαγείο DNA

3 Επιμήκυνση Για τη σύνθεση της νέας αλυσίδας αυξάνουμε τη θερμοκρασία στους 72deg C τηβέλτιστη θερμοκρασία δράσης της Taq πολυμεράσης Η πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινη-τές εισάγοντας τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (Deoxynucleotide triphosphates dNTPs)χρησιμοποιώντας τη συμπληρωματική αλληλουχία DNA ως εκμαγείο Η ταχύτητα σύνθεσηςτης νέας αλυσίδας είναι της τάξης των 1000 bp ανά λεπτό

Τα παραπάνω στάδια επαναλαμβάνονται από 25 έως 35 φορές Η PCR εκτελείται στον θερμικόκυκλοποιητή (Thermal cycler) συσκευή που φέρει θερμαινόμενη πλάκα που μπορεί να εναλλάσσειθερμοκρασίες με ταχύτητα και ακρίβεια Ο θερμικός κυκλοποιητής είναι μια προγραμματιζόμενησυσκευή στην οποία μπορούμε να ρυθμίσουμε την επιθυμητή θερμοκρασία και τη διάρκεια κάθεσταδίου αλλά και τη διαδοχή τους Ένα τυπικό πρόγραμμα PCR στον θερμικό κυκλοποιητή για τονπολλαπλασιασμό ενός τμήματος DNA μεγέθους 500 bp φαίνεται στoν πίνακα 71

Τα συστατικά της PCR

Τα βασικά συστατικά για τη διενέργεια της αντίδρασης PCR είναι

1 DNA πολυμεράση

2 Ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές

3 Γενετικό υλικό ndash αλληλουχία στόχος

4 Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης και Mg2+

5 Νουκλεοτίδια (dNTPs)

130

ii


ii

ii








131

ii


ii

ii






Εκκινητές


132

ii


ii

ii









Tm = 2(A+ T ) + 4(G+ C)

133

ii


ii

ii
















134

ii


ii

ii










135

ii


ii

ii










136

ii


ii

ii









137

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii








131

ii


ii

ii






Εκκινητές


132

ii


ii

ii









Tm = 2(A+ T ) + 4(G+ C)

133

ii


ii

ii
















134

ii


ii

ii










135

ii


ii

ii










136

ii


ii

ii









137

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii






Εκκινητές


132

ii


ii

ii









Tm = 2(A+ T ) + 4(G+ C)

133

ii


ii

ii
















134

ii


ii

ii










135

ii


ii

ii










136

ii


ii

ii









137

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii









Tm = 2(A+ T ) + 4(G+ C)

133

ii


ii

ii
















134

ii


ii

ii










135

ii


ii

ii










136

ii


ii

ii









137

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii
















134

ii


ii

ii










135

ii


ii

ii










136

ii


ii

ii









137

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii










135

ii


ii

ii










136

ii


ii

ii









137

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii










136

ii


ii

ii









137

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii









137

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii










138

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii





No = Nt(E + 1)Cp



139

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii








140

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii













141

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii






142

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii












143

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii






144

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii










145

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii




146

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii













147

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii







bull dNTPs (10 mM)

bull MgCl2 (25 mM)





148

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii





DNA (25 ngμl) 5 125 ng 25 μlH2O 117















149

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii







Απάντηση








Απάντηση




150

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii









151

ii


ii

ii













152

ii


ii

ii













152

Documents

Κεφάλαιο7 Αλυσιδωτήαντίδρασηπολυμεράσης · 2016-06-28 · i i “Papanikolaou” — 2015/12/13 — 22:20 — page 129 — #140 i i i i i i Κεφάλαιο7