TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Khrismawan

PENDAHULUAN

Informasi keturunan diletakkan dalam urutan basa dari molekul-molekul DNA.

Fragmen-fragmen DNA yang informasinya diubah menjadi molekul-molekul yang

fungsional, dikenal sebagai gen. Urutan dari salah satu rantai DNA akan diterjemahkan

melalui suatu proses transkripsi menjadi suatu urutan RNA yang komplementer. Molekul

RNA yang terbentuk, berfungsi sebagai matriks untuk sintesa protein (mRNA) atau

menerima fungsi tersendiri (rRNA, tRNA atau snRNA). Pada eukariot, hanya fragmen-

fragmen gen tertentu yang yang mengandung sandi genetik. Fragmen-fragmen ini disebut

ekson. Diantara fragmen-fragmen ini terdapat fragmen yang tidak mengandung sandi

genetik, yaitu intron. Setelah transkripsi, intron akan dipisahkan dari hnRNA yang

pertama-tama terbentuk. Hal ini terjadi selama proses pematangan RNA yang

memodifikasi kedua ujung RNA. RNA yang matang akan meninggalkan inti sel dan di

dalam sitoplasma terikat dengan ribosom. Ditempat ini urutan RNA akan diterjemahkan

kedalam urutan asam amino (protein) yang sesuai melalui proses translasi. Pada proses

ini berperan tRNA yang mengenali urutan RNA tertentu. Sebelumnya, tRNA diberi

muatan asam amino yang sesuai melalui proses aktivasi asam amino.1, 2

Pada pembelahan sel, informasi genetik akan diteruskan ke sel-sel anak, yaitu

dengan cara membuat salinan dari keseluruhan DNA melalui proses replikasi. Jadi sel-sel

anak mengandung molekul DNA yang identik dengan sel induk.1, 2

KROMATIN

Didalam inti sel eukariotik, DNA berhubungan dengan protein-protein dan

molekul-molekul RNA. Kompleks nukleoprotein ini dikenal sebagai kromatin. Hanya

selama mitosis, kromatin berkondensasi menjadi kromosom yang terlihat dibawah

mikroskop cahaya. Selama interfase, kondensasi kromatin tersebut melonggar secara

menyeluruh. Secara morfologik dapat dibedakan eukromatin yang terbungkus rapat dan

1

heterokromatin yang terbungkus kurang rapat. Heterokromatin adalah tempat proses

transkripsi berlangsung sangat aktif. 1, 3

Protein kromatin terdiri atas protein histon dan bukan histon. Histon merupakan

suatu kelompok protein kecil yang bersifat basa kuat. Urutan asam amino histon pada

semua sel eukariotik adalah sangat serupa. Histon berhubungan langsung dengan DNA.

Protein ini turut membantu organisasi struktural kromatin. Selain itu, asam amino histon

yang bersifat asam dan memungkinkan pengemasan yang rapat dari DNA didalam inti

sel. Jadi 46 molekul DNA genom manusia yang diploid dapat ditempatkan di dalam inti

sel menjadi molekul dengan diameter hanya 10 μm. 1, 3

Setiap dua molekul histon dengan tipe H2A, H2B, H3 dan H4 membentuk suatu

kompleks oktamer yang dibalut oleh 146 pasangan basa DNA dalam kurang lebih 13/4

putaran. Partikel-parikel dengan diameter 7 nm semacam ini dikenal sebagai nukleosom.

DNA yang tidak langsung berhubungan dengan oktamer histon disebut DNA

penghubung. Pada DNA-linker berikatan suatu histon lain yaitu H1. Histon H1

mendukung pembentukan struktur yang berbentuk seperti serabut-serabut dengan

diameter 30 nm, yang dikenal sebagai kumparan. Kumparan sekali lagi membentuk pita

dengan panjang kira-kira 200 nm. Ujung akhir setiap pita semacam ini terikat pada suatu

struktur kerangka protein yang dikenal sebagai kerangka inti.1

Protein bukan histon sangat heterogen.Yang termasuk kelompok ini adalah

protein struktural, begitu juga enzim dan faktor transkripsi. 1

REPLIKASI

A. Cara kerja dari Polimerase DNA

Untuk meneruskan informasi genetika pada perbanyakan sel, sebelum

pembelahan sel harus dibuat satu salinan dari genom. Replikasi DNA dikatalisis

terutama oleh enzim polimerase DNA yang tergantung pada DNA. Enzim ini

memerlukan satu DNA untai tunggal yang disebut sebagai untai cetakan (matrix-

strand) dan mensintesis untuai kedua yang komplementer, sehingga kembali

dihasilkan suatu DNA heliks ganda yang lengkap. Substrat dari polimerase DNA

adalah keempat deoksinukleosida trifosfat yaitu dATP, dGTP, dCTP, dan dTTP.

Setiap basa pada untai cetakan akan berikatan dengan nukleotida yang komplementer

2

melalui pemasangan basa yang spesifik. Kemudian gugus 3’-OH dari nukleotida

terakhir pada untai DNA yang sedang terbentuk bereaksi secara nukleofilik dengan

residu α-fosfat dari nukleotida baru ditambahkan. Reaksi ini menghasilkan suatu

ikatan diester asam fosfat yang baru melalui pelepasan difosfat. Setelah enzim

polimerase DNA bergeser ke basa berikutnya pada untai DNA cetakan, maka

langkah-langkah tersebut akan terulang kembali. Mekanisme yang diterangkan ini

mengungkapkan dengan sendirinya bahwa untai DNA cetakan dibaca dengan arah

3’ 5’.1, 4

Sebagian besar sel mengandung lebih dari satu polimerase DNA. Selain enzim

yang mengkatalisis replikasi sesungguhnya, terdapat polimerase yang berperan pada

proses reparasi atau pada proses replikasi DNA mitokondria pada eukariot.1, 4

B. Replikasi pada E. Coli

Saat ini telah diketahui gambaran yang tepat mengenai proses replikasi pada

prokariot, sementara pada eukariot masih banyak rincian yang belum jelas. Akan

tetapi sudah dapat dipastikan bahwa pada prinsipnya berlangsungnya proses replikasi

pada sebagian besar sel adalah serupa. Disini ditunjukkan suatu skema yang

disederhanakan untuk bakteri Escherichia coli. 1

Pada bakteri, replikasi dimulai pada suatu tempat tertentu dari DNA yang

berbentuk cincin yaitu awal-mula replikasi dan dilanjutkan kedua arah. Hasilnya

terbentuk garpu replikasi yang berjalan berpencaran. Pada garpu replikasi, kedua

untaian direplikasikan secara bersamaan. DNA yang merupakan cetakan diberi warna

biru sedangkan untai yang baru terbentuk berwarna merah atau jingga. 1

Setiap garpu mengandung sedikitnya dua molekul polimerase DNA III dan

serangkaian enzim pembantu. Yang termask enzim pembantu adalah topoisomerase

DNA yang mengendurkan jalinan untaian ganda DNA yang erat, helikase yang

memisahkan untaian ganda DNA menjadi dua untaian tunggal dan protein-protein

yang terikat pada untai tunggal. Karena untai cetakan selalu dibaca dengan arah

3’ 5’ maka hanya satu dari kedua untaian tunggal tersebut yang dapat direplikasi

secara tak terputus (biru tua/merah). Untuk untaian yang kedua (biru muda), arah

pembacaan berlawanan dengan arah pergerakan garpu. Pada untai cetakan tersebut,

3

pertama-tama dibentuk untai yang baru dalam bentuk potongan DNA yang terpisah,

yang kemudian disebut berdasarkan nama dari penemunya yaitu fragmen Okazaki

(hijau/jingga). Setiap fragmen mulai dengan suatu urutan awal yang pendek (primer)

dari RNA (hijau) yang diperlukan agar polimerase DNA dapat berfungsi. Primer

RNA disintesis oleh suatu suatu polimerase RNA yang khusus (primase). Kemudian

primer tersebut akan diperpanjang sekitar 1000 – 2000 komponen deoksinukleotida

oleh enzim polimerase DNA III (jingga). Selanjutnya síntesis fragüen Okazaki

berhenti dan akan dimulai síntesis statu fragüen Okazaki baru pada statu primer RNA

lanilla yang sementara itu telah dibentuk tidak saling berhubungan satu dengan

lainnya dan masih mengandung RNA pada ujung 5’. Setelah garpu replikasi berjalan

dengan jarak tertentu, baru dimulai kerja enzim polimerase DNA I yaitu

menggantikan primer RNA dengan DNA. Akhirnya celah yang tertinggal di antara

dua fragmen Okazaki ditutup oleh suatu enzim ligase DNA. Pada statu heliks ganda

DNA yang terbentuk dengan cara tersebut, hanya satu untaian DNA yang disintesis

baru, artinya replikasi bersifat semikonservatif.1

TRANSKRIPSI

Agar informasi genetik yang disimpan di dalam DNA dapat digunakan, maka

harus disalin ulang dalam bentuk RNA (ditranskripsikan). Dalam hal ini DNA hanya

berfungsi sebagai pola, artinya DNA tidak akan mengalami perubahan melalui proses

transkripsi. Fragmen DNA yang dapat ditranskripsikan ialah yang mengandung sandi

genetik untuk suatu produk tertentu. Fragmen DNA tersebut dinamai gen. Diduga, genom

mamalia mengandung 20.000 hingga 50.000 gen, yang keseluruhannya kurang dari 10%

DNA pada mamalia. Kegunaan fragmen DNA yang bukan gen masih belum jelas.1, 2

A. Transkripsi dan pematangan RNA

Transkripsi dikatalisis oleh enzim polimerase RNA yang tergantung pada

DNA. Enzim ini bekerja serupa dengan polimerase DNA, akan tetapi yang

ditambahkan kedalam untaian yang baru disintesis adalah ribonukleotida bukan

deoksiribonukeotida. Sel eukariotik sekurang-kurangnya mengandung tiga polimerase

RNA. Polimerase RNA I mensintesis suatu RNA dengan koefisien sedimentasi

4

sebesar 45 S, yang berfungsi sebagai prekursor untuk tiga RNA ribosom. Produk

polimerase RNA II adalah hnRNA yang kemudian menjadi mRNA, dan juga

prekursor snRNA. Yang terakhir adalah polimerase RNA III, mentranskripsi gen yang

mengandung sandi genetik untuk tRNA, 5S-rRNA dan snRNA tertentu. Dari

prekursor-prekursor ini kemudian melalui proses pematangan RNA terbentuk

molekul RNA yang dapat berfungsi. Polimerase II dan III dapat dihambat oleh

α-Amanitin, suatu racun jamur. 1

Gambar 1. Mekanisme transkripsiDikutip dari Kopp2

B. Organisasi gen β-Globin

Organisasi gen eukariotik diterangkan dengan contoh gen yang mengandung

sandi genetik untuk rantai β hemoglobin (146 asam amino). Gen tersebut mencakup

hampir 2000 pasangan basa (pb), akan tetapi hanya sekitar 450 pb yang membawa

informasi untuk urutan protein. Tiga daerah yang mengandung sandi genetik atau

ekson (E1-E3, biru tua) dipisahkan satu sama lainnya oleh dua segmen yang tidak

mengandung sandi genetik (intron). Pada ujung 5’ gen terdapat daerah promotor

5

(merah muda) yaitu suatu fragmen sebesar Kira-kira 200 pb dan berfungsi dalam

regulasi transkripsi. Transkripsi mulai pada ujung 3’ daerah promotor dan dilanjutkan

hingga melampaui urutan poliadenilat. Pada gen β-globin transkrip primer yang

terbentuk mempunyai panjang sekitar 1600 basa. Selama proses pematangan RNA,

urutan-urutan intron yang tidak mengandung sandi genetik yang sesuai dilepaskan.

Selain itu, kedua ujung hnRNA dimodifikasi. mRNA dari β-globin masih

mengandung sekitar 40% hnRNA dan sebagai tambahan juga mengandung urutan

pada 3’-terminal yang terdiri atas kira-kira 200 residu AMP.1

C. Jalannya transkripsi

Seperti diketahui bahwa polimerase RNA II berikatan pada ujung 3’ daerah

promotor. Penting untuk pengikatan tersebut adalah suatu daerah promotor yang

dikenal sebagai kotak TATA, yaitu suatu potongan rangkaian basa pendek yang kaya

akan nukleotida A dan T. Kotak TATA bervariasi dari satu gen ke gen lainnya. Suatu

urutan basa yang khas untuk kotak TATA (urutan konsensus) ahíla ...TATAAA…

Untuk interaksi polimerase dengan daerah promotor tersebut mutlak diperlukan lebih

dari satu protein, yang dikenal sebagai faktor transkripsi basal. Factor tambahan

lainnya dapat menstimulasi atau menghambat proses (kontrol transkripsi). Setelah

inisiasi, polimerase RNA bergerak memisahkan satu bagian pendek heliksganda DNA

menjadi untaian tunggal. Nukleosida trifosfat yang komplementer akan berpasangan

dengan basa pada untaian DNA yang kodogenik dan tahap demi tahap diikatkan

pada RNA yang sedang terbentuk. Tak lama setelah proses perpanjangan dimulai,

ujung 5’ dari transkrip dilindungi dengan suatu topi penutup (cap). Setelah mencapai

urutan poliadenilat (urutan basa yang khas : ..AATAAA…), transkrip akan

dilepaskan. Tidak lama kemudian polimerase mengakhiri proses transkripsi dan

berdisosiasi dari DNA.1

PEMATANGAN RNA

A. Kontrol transkripsi

Walaupun setiap sel mengandung genom yang lengkap, Namur sel hanya

menggunakan sebagian kecil dari infromasi genetik yang dikandungnya. Yang selalu

6

ditranskripsikan adalah gen-gen yang mengandung sandi genetik untuk molekul

struktural atau untuk enzim pada metabolismo intermedier. Selain gen-gen yang

dipakai zaherí-hari tersebut, terdapat sejumlah besar gen lainnya yang hanya menjadi

aktif pada beberapa tipe sel tertentu, pada situasi metabolisme tertentu atau selama

diferensiasi. Gen-gen mana yang ditranskripsikan dan mana yang tidak, diatur oleh

suatu sistem regulasi yang unsur-unsurnya baru dikenal secara garis besar saja.1

Pada kontrol transkripsi bekerja sama dua jenis struktur. Daerah promotor

dari sebagian besar gen mengandung beberapa fragmen DNA yang pendek (elemen

kontrol). Pada fragmen tersebut berikatan faktor transkripsi dan dengan demikian

dapat mengatur transkripsi. 1

Karena elemen kontrol semacam ini hanya mempunyai pengaruh pada gen-

gen yang berada bersama-sama dengan elemen kontrol dalam satu DNA, maka

elemen tersebut dinamakan juga elemen cis-aktif. Faktor transkripsi adalah protein,

dengan demikian merupakan produk dari gen yang berlainan dan independen. Karena

itu dikenal juga sebagai faktor trans-aktif. 1

Transkripsi suatu gen hanya dapat berlangsung, bila selain enzim polimerase

RNA tersedia juga protein-protein lainnya yaitu faktor transkripsi basal. Faktor

transkripsi basal yang terpenting diberi tanda dengan huruf A-H. Pada eukariot, yang

pertama-tama terikat adalah faktor TF-IID pada kotak TATA. Faktor-faktor basal lain

dan juga polimerase RNA kemudian menempatkan dirinya pada kompleks tersebut.

Faktor transkripsi lain yang tidak bersifat basal dapat mempengaruhi inisiasi

transkripsi dengan cara mengikatkan diri dengan elemen kontrol yang terletak

berdampingan dengan kompleks dan melalui interaksi dengan kompleks yang basal

dapat mengaktifkan atau menghambat inisiasi kompleks transkripsi. Faktor yang

mengaktifkan misalnya adalah kompleks hormon steroid dengan reseptornya. 1

B. Proses putus Sambung

Setelah transkripsi, urutan-urutan hnRNA yang tidak mengandung sandi

genetik (intron) dilepaskan. Proses ini dinamakan proses putus sambung RNA dan

dikatalisis oleh kompleks RNA-protein yang dikenal sebagai small nuclear

ribonucleoprotein particles (snRNA). Intron pada hnRNA mempunyai urutan-urutan

7

yang khas pada kedua ujungnya. Pada proses putus-sambung, pertama-tama, dengan

bantuan suatu snRNP, gugus OH residu adenosin di dalam ekson menyerbu ikatan

diester asam fosfat pada ujung 5’ daerah intron dan memutuskan ikatan tersebut.

Bersamaan dengan itu terbentuk suatu ikatan baru didalam intron, sehingga intron

menyerupai suatu bentuk lasso. Pada langkah kedua, gugus OH terminal ekson yang

berada pada posisi 5’ menyerbu ikatan pada ujung 3’ intron. Dengan demikian kedua

ekson tersebut diikatkan dan intron dilepaskan.1

Lima jenis snRNP yang berbeda (U1, U2, U4, U5, dan U6) berperan pada

reaksi putus-sambung. Setiap jenis terdiri atas beberapa protein dan satu molekul

snRNA. Selama proses putus-sambung, kompleks yang terdiri atas hnRNA dan

snRNPs membentuk suatu spliceosom. Dianggap bahwa snRNAs didalam spliceosom

berpasangan basa satu dengan yang lainnya dan juga dengan hnRNA, sehingga

memfiksasi dan memberikan orientasi pada gugus yang bereaksi. Proses katalisis

yang berlangsung dengan sendirinya ini berasal dari bagian RNA. Jenis RNAs yang

bersifat katalisis ini dikenal sebagai ribozim.1

C. Modifikasi 5’ dan 3’ dari mRNA

Tak lama setelah dimulainya transkripsi pada eukariot, ujung 5’ RNA yang

sedang terbentuk ditutup oleh suatu struktur yang disebut Topi penutup (cap). Pada

mRNAs, topi penutup tersebut terdiri atas suatu residu 7-metil-GTP. Topi penutup ini

melindungi RNA dari pemecahan oleh enzim 5’-eksonuklease. Setelah berakhirnya

transkripsi, pada ujung 3’ hnRNA ditambahkan suatu ekor poliadenilat yang

terbentuk dari kurang lebih 200 residu AMP. Setelah itu baru mRNA yang matang

meninggalkan inti sel. 1

SANDI GENETIK, AKTIVASI ASAM AMINO

A. Sandi genetik

Sebagian besar informasi genetik yang terkandung di dalam DNA menyandikan

urutan asam amino dari protein-protein yang fungsional. Pada ekspresi protein-

protein tersebut, suatu teks bahasa asam nukleat harus diterjemahkan ke dalam bahasa

8

protein. Atas dasar tersebut maka dikenal istilah tranlasi untuk biosintesis protein.

Aturan yang berlaku untuk penerjemahan tersebut dinamai sandi genetik.1, 2

Karena terdapat 20 asam amino proteinogen, maka bahasa asam nukleat

sekurangnya mengandung kata-kata (kodon) yang sama banyaknya. Didalam abjad

asam nukleat hanya terdapat 4 huruf (A, G, C dan U atau T). Untuk dapat membentuk

20 kata-kata yang berlainan, maka setiap kata harus mempunyai sedikitnya tiga huruf.

Pada kenyataannya kodon terdiri atas masing-masing tiga basa yang berurutan

(triplet).1, 3

Gambar 2. Struktur untaian ganda DNA

Dikutip dari Kopp2

Karena sandi untuk 20 asam amino tersedia dalam 43 = 64 kodon, maka untuk

kebanyakan asam amino terdapat lebih dari satu kodon sinonim. Tiga triplet tidak

mengandung sandi untuk asam amino melainkan memberi sinyal untuk berakhirnya

translasi (kodon berhenti). Kodon khusus lainnya adalah kodon mulai yang menandai

dimulainya penerjemahan. Sandi yang ditunjukkan berlaku hampir universal, hanya

di dalam mitokondria dan pada beberapa mikroorganisme terdapat penyimpangan

dari sandi standar.1

9

B. RNA Transfer

RNAs transfer (tRNAs) berfungsi sebagai anggota penghubung antara tingkat

asam nukleat dan tingkat protein. tRNA adalah molekul RNA kecil, terdiri atas 70-90

basa dan mampu mengenali kodon mRNA tertentu melalui pemasangan pasangan

basa. Bersamaan dengan itu tRNA pada ujung 3’ (urutan: ..CCA) membawa asam

amino tertentu yang berhubungan dengan kodon mRNA yang bersangkutan sesuai

dengan sandi genetik. Penerjemahan yang sesungguhnya diurus oleh enzim-enzim

yang secara selektif memberi tRNA muatan asam amino yang tepat.1

Urutan basa dan struktur tersier Phe-tRNA yang berasal dari ragi adalah khas

untuk semua tRNA. Suatu bagian yang besar dari molekul tersebut mengandung basa

yang tidak lazim terdapat dan mengalami modifikasi.1, 5

C. Aktivasi Asam amino

Kurang lebih 20 ligase asam amino-tRNA yang berbeda didalam sitoplasma

menghubungkan masing-masing satu jenis asam amino dengan tRNA yang

dimilikinya. Aktivasi asam amino berlangsung dalam dua langkah. Pertama, asam

amino akan diikat dan direaksikan dengan ATP, membentuk suatu anhidrida asam

yang kaya energi. Kemudian, gugus 3’-OH terminal tRNA akan mengambil alih

residu amino asil. Jadi pada amino asil-tRNA gugus karboksi asam amino

membentuk ikatan ester dengan residu ribosa adenosin terminal.1, 5, 6

Ketepatan translasi terutama tergantung dari spesifisitas ligase asam amino –

tRNA. Residu asam amino yang salah dimasukkan, tidak dapat dikenali oleh ribosom.

Karena itu, suatu mekanisme koreksi pembacaan didalam pusat aktif ligase mengatur

agar residu amino asil yang salah dimasukkan segera dilepaskan kembali. 1, 6

RIBOSOM, INISIASI DARI TRANSLASI

Seperti halnya aktivasi asam amino, biosintesis protein (translasi) berlangsung

didalam sitoplasma. Proses translasi dikatalisis oleh partikel nukleoprotein yang

kompleks, yaitu ribosom. Ribosom terdiri atas dua subunit dengan besar yang berlainan.

Ribosom tersusun dari RNA ribosom (rRNA) dan banyak protein. Sebagai ganti berat

molekul ribosom dan komponennya, biasanya digunakan koefisien sedimentasinya.

10

Ribosom eukariotik mempunyai koefisien sedimentasi kira-kira sebesar 80 Svedberg

(80 S). Koefisien sedimentasi dari masing-masing subunit adalah 40 S dan 60 S (nilai S

bukan merupakan penjumlahan).1, 6

Ribosom prokariotik terbentuk dengan cara yang serupa, tetapi sedikit lebih kecil

(koefisien sedimentasi: 70 S untuk ribosom lengkap, 30 S dan 50 S untuk subunit-

subunit). Ribosom mitokondria dan kloroplas dapat dibandingkan dengan ribosom

prokariot.1, 6

PROSES PERPANJANGAN DAN PENGAKHIRAN

Setelah inisiasi translasi, rantai peptida yang sedang terbentuk diperpanjang lebih

lanjut dengan residu-residu asam amino (perpanjangan) hingga ribosom pada mRNA

mencapai kodon berhenti dan proses dihentikan (pengakhiran).1

Perpanjangan dapat dibagi menjadi tiga fase. Pertama-tama tempat peptidil (P)

ribosom diisi oleh statu tRNA yang pada ujung 3’ membawa keseluruhan rantai peptida

yang telah terbentuk sampai saat tersebut (kiri atas). Kemudian statu tRNA kedua, yang

bermuatan asam amino yang sesuai (dalam contoh yang ditunjukkan disini adalah

val-tRNAval) dengan antikodonnya yang bersifat komplementer, berikatan pada kodon

mRNA (dalam hal ini GUG) yang terdapat dalam tempat akseptor.1

Gambar 3. Molekul Hexokinase. Suatu enzim utama penghasil energi sel, terdiri 6000 atom. Dikutip dari Kopp2

11

KERJA ANTIBIOTIKA

Antibiótika adalah zat-zat yang dibentuk oleh mikroorganisme dan menghambat

pertumbuhan atau perbanyakan mikroorganisme lain. Diantara antibiótika yang

digunakan untuk terapi infeksi, terdapat substansi yang mempengaruhi transkripsi atau

translasi penyebab penyakit bakterial.1, 7

Yang termasuk penghambat transkripsi misalnya rifampisin yang bekerja terhadap

penyebab tuberculosis. Rifampicin merupakan suatu zat penghambat polimerase RNA

yang tergantung pada DNA. Aktinomisin D dan Daunomisin terikat pada DNA

sehingga mengganggu transkripsi. Antibiotika amino glikosida yaitu Streptomisin

mempengaruhi translasi pada segala tahap. Tetrasiklin mengganggu ikatan tRNA pada

ribosom, sementara kloramfenikol menghambat peptidiltransferase. Yang terakhir

adalah Puromisin menyebabkan pengakhiran biosintesis protein pada tahap yang sangat

dini.1, 7

MUTASI DAN REPARASI

Informasi genetik diletakkan didalam urutan basa DNA. Karena itu perubahan

basa DNA atau urutan-urutannya mempengaruhi secara genotip (bersifat mutagen).

Banyak substansi mutagenik yang juga membahayakan kontrol pertumbuhan sel.

Substansi-substansi tersebut adalah karsinogen. Perubahan gen (mutasi) merupakan salah

satu faktor yang menentukan evolusi biologi. Disamping itu suatu sel yang mempunyai

tingkat kemungkinan terjadinya mutasi yang tinggi diragukan kemampuan hidupnya.

Karena itu sel-sel mempunyai mekanisme reparasi yang memusnahkan kembali sebagian

besar perubahan-perubahan DNA yang terbentuk akibat mutasi.1

A. Bahan-bahan mutagenik

Mutasi dapat terbentuk karena pengaruh fisik dan kimia, tetapi juga oleh

kesalahan yang kebetulan terjadi pada replikasi atau rekombinan DNA.1

Diantara mutagen fisik, yang terutama perlu disebutkan adalah penyinaran

ionisasi. Penyinaran ionisasi menghasilkan radikal bebas (molekul-molekul dengan

elektron yang tidak berpasangan) didalam sel. Molekul-molekul tersebut mampu

12

bereaksi (reaktif) secara ekstrim dan dapat merusak DNA. Juga sinar ultraviolet (UV)

gelombang pendek mempunyai pengaruh mutagenik yang terutama menyerang sel-sel

kulit. Perubahan kimia yang paling sering terjadi akibat penyinaran UV adalah

pembentukan dimer timin. Dua basa timin yang berdampingan saling berikatan secara

kovalen membentuk anyaman seperti jala. Hal ini menyebabkan kesalahan dalam

pembacaan DNA pada replikasi dan transkripsi.1

Dari kelompok besar mutagen kimia, diantaranya asam nitrit (HNO2) dan

hidroksilamin (NH2OH) mendesaminasi basa; keduanya mengubah misalnya sitosin

didalam urasil dan adenin didalam inosin. Senyawa yang mengalkilasi membawa

gugus yang reaktif, yang dapat membentuk senyawa kovalen dengan basa DNA.

Metilnitrosamin membebaskan kation metil (CH3+) reaktif, yang memetilasi gugus

OH- dan NH2- didalam DNA. Zat karsinogenik yang terkenal yaitu benzo(a)piren,

suatu senyawa CH yang bersifat aromatik, pertama-tama didalam organisme akan

diubah kedalam bentuk yang efektif. Melalui hidroksilasi salah satu cincin berulang

kali terbentuk suatu epoksid reaktif, misalnya yang bereaksi dengan gugus amino

guanin.1

B. Pengaruh

Asam nitrit menyebabkan mutasi noktah. Bila misalnya C diubah menjadi U,

maka pada replikasi selanjutnya nukleotida U tersebut akan berpasangan dengan A,

bukan dengan G. Akibatnya perubahan tersebut akan bersifat permanen. Mutasi yang

membuat nukleotida yang dibaca dalam kodon bukan 3 buah, melainkan bergeser

sehingga melebihi (insersi) atau berkurang (delesi) dari jumlah tersebut,

menyebabkan kesalahan pembacaan untuk seluruh bagian DNA, karena bingkai

pembacaan kodon ikut bergeser (mutasi pergeseran bingkai). Penyisipan (insersi)

nukleotida C ke dalam DNA mengakibatkan mRNA yang terbentuk diinterpretasikan

berlainan sehingga dihasilkan suatu urutan protein yang benar-benar baru.1, 8

C. Mekanisme perbaikan

Suatu mekanisme penting untuk melenyapkan kerusakan-kerusakan DNA

adalah perbaikan secara eksisi (1). Pada proses ini suatu nuklease memotong

13

keseluruhan bagian yang mengalami kesalahan DNA pada kedua sisi. Dengan

bantuan urutan dari untai yang berlawanan, bagian yang terpotong tersebut akan

kembali diisi oleh suatu polimerase DNA. Ligase DNA kemudian menutup kembali

celah pada kedua sisi. Dimer Timin dapat dilepaskan dengan cara reaktivasi cahaya

(2). Suatu liase cahaya berikatan pada defek tersebut dan pada pemberian cahaya

enzim tersebut dapat memotong dimer menjadi dua basa tunggal. Mekanisme ketiga

ialah perbaikan melalui rekombinasi (3). Pada proses ini, ditempat terjadinya

kesalahan, DNA tidak direplikasikan. Celah tersebut akan ditutup dengan cara

menggeser segmen yang sesuai dari untaian DNA yang direplikasikan secara tepat.

Celah baru yang terbentuk tersebut akan diisi oleh polimerase dan ligase. Akhirnya

defek semula, dapat dihilangkan dengan cara eksisi.1

TEKNIK GEN

A. Kloning gen

Kemajuan pesat genetika molekuler sejak tahun 1970 terutama didasarkan

atas perkembangan dan peningkatan mutu metode analisis dan manipulasi DNA.

Terkenal sebagai Teknik Gen, mempunyai arti praktis pada berbagai bidang. Teknik

tersebut misalnya menyediakan metode baru untuk diagnosis dan terapi penyakit, dan

juga saat ini memungkinkan perubahan dari sifat-sifat tertentu yang diinginkan pada

suatu organisme. Karena pada teknik semacam ini kemungkinan terjadinya risiko

biologik tidak boleh diabaikan, maka penggunaannya memerlukan penanganan yang

dilakukan dengan penuh tanggung jawab.1, 8

1. Endonuklease Restriksi

Pada sebagian besar cara kerja teknik gen, fragmen-fragmen DNA tertentu

harus diisolasi dan dikombinasikan dengan bagian DNA lainnya. Dalam hal ini

digunakan enzim-enzim, yang juga memotong DNA di dalam sel dan

menyatukannya kembali. Yang sangat penting adalah enzim nuklease restriksi,

suatu kelompok enzim-enzim bakteri yang memotong untaian ganda DNA secara

spesifik di urutan basa tertentu. Sejumlah besar enzim restriksi yang sudah

dikenal, diberi nama dengan singkatan yang menunjukkan organisme asalnya.

14

Misalnya, sebagai contoh diamati disini EcoRI, suatu nuklease yang diisolasi dari

bakteri Escherichia coli. Seperti endonuklease restriksi lainnya, EcoRI memutus

DNA secara palindrom, artinya suatu potongan pendek untai ganda DNA yang

kedua untaiannya mempunyai urutan yang sama, bila masing-masing untaian

dibaca dengan arah 5’ 3’, dalam hal ini adalah urutan 5’-GAATTC-3. EcoRI

adalah suatu protein homodimer yang memutus ikatan diester asam fosfat dari

kedua rantai diantara G dan A. Akibatnya terbentuk ujung-ujung yang menjorok

keluar (AATT) yang bersifat komplementer. Ujung-ujung tersebut masih dijaga

keutuhannya dengan adanya pemasangan basa. Namun demikinan kedua untaian

tersebut dapat dengan mudah dipisahkan, misalnya melalui pemanasan. Bila

fragmen tersebut kemudian didinginkan, ujung-ujung yang menjorok keluar

tersebut dapat kembali berhibridisasi dengan penyusunan yang tepat. Kemudian

dengan bantuan suatu ligase DNA, tempat pemotongan tersebut dapat ditutup.1

2. Kloning DNA

Sebagian besar fragmen DNA, misalnya gen, terdapat didalam sel hanya

dalam jumlah yang sangat kecil. Agar dapat bekerja dengan fragmen-fragmen

tersebut secara eksperimental, maka pertama-tama harus dibuat banyak salinan-

salinannya yang identik (klon). Metode klasik untuk kloning DNA didalm

laboratorium, dengan menggunakan kemampuan bakteri untuk memasukkan dan

memperbanyak fragmen DNA pendek yang berbentuk cincin. Fragmen tersebut

dikenal sebagai plasmid. Pertama-tama fragmen yang akan di kloning dilepaskan

dari DNA asalnya oleh endonuklease restriksi. (Untuk mempermudah, disini

hanya ditunjukkan suatu pemotongan DNA hanya oleh EcoRI, namun pada

prakteknya kebanyakan digunakan dua enzim yang berbeda). Sebagai vektor

diperlukan suatu plasmid, yang hanya mengandung satu tempat pemotongan

EcoRI. Cincin plasmid dibuka melalui pemotongan oleh EcoRI dan digabungkan

dengan fragmen DNA yang telah diisolasi. Fragmen dan vektor mempunyai ujung

menjorok keluar yang sama. Karena itu sebagian molekul berhibridisasi sehingga

fragmen berintegrasi kedalam DNA vektor. Bila kemudian tempat pemotongan

ditutup kembali oleh ligase DNA, maka terbentuk suatu plasmid dengan

15

kombinasi baru (rekombinan). Melalui penanganan awal pada sejumlah besar sel-

sel inang, maka sebagian sel-sel tersebut dapat menerima dan memasukkan

plasmid (proses ini dinamai transformasi). Pada kebanyakan sel, plasmid dapat

bereplikasi bersama-sama dengan genomnya sendiri. Untuk memastikan, bahwa

yang diperbanyak hanyalah bakteri inang yang mengandung plasmid, maka

digunakan plasmid yang mempunyai resistensi terhadap suatu antibiotika tertentu.

Bila bakteri diinkubasi dalam keadaan adanya antibiotika ini, maka yang dapat

memperbanyak diri hanyalah sel-sel yang mengandung plasmid tersebut.

Selanjutnya plasmid tersedbut diisolasi dari sel-sel inang dan setelah pemotongan

dengan EcoRI menghasilkan fragmen DNA yang dikloning dalam jumlah yang

besar.1

B. Analisis urutan DNA

1. Pustaka gen

Pada teknik gen sering diperlukan isolasi fragmen DNA yang belum dikenal

secara rinci, misalnya untuk menentukan urutan nukleotidanya.1

Untuk keperluan tersebut digunakan suatu Pustaka gen. Suatu pustaka

DNA terdiri atas sejumlah besar molekul DNA vektor yang mengandung

fragmen-fragmen yang berbeda dari DNA asing. Misalnya, seluruh molekul

mRNA yang terdapat didalam suatu sel disalin ulang dalam bentuk DNA dan

kemudian fragmen DNA tersebut ( diberi nama copy-DNA atau cDNA)

dimasukkan kedalam molekul vektor. Suatu pustaka DNA genom dibuat dengan

cara DNA total suatu sel dipotong-potong dengan bantuan endonuklease restriksi

menjadi fragmen-fragmen DNA dan kemudian dimasukkan kedalam DNA vektor.

Yang cocok untuk menjadi vektor bagi pustaka gen adalah bakteriofaga (secara

singkat : faga). Faga adalah virus yang menyerang bakteri dan memperbanyak diri

didalam bakteri.1

Teknik ini dimulai dengan cara mengencerkan sejumlah kecil pustaka

DNA (105 hingga 106 faga) dan dicampur dengan bakteri inang, kemudian

dicoretkan secara merata diatas lapisan agar yang mengandung zat-zat makanan.

Bakteri tumbuh sebagai koloni-koloni yang dalam jumlah banyak saling

16

menempel sehingga membentuk suatu lapisan sel yang keruh. Bakteri yang

diserang oleh faga, tumbuh kurang begitu cepat. Karena itu bakteri-bakteri

tersebut membentuk zona bundar dan lebih jernih disekeliling koloninya, yang

dikenal sebagai bercak. Sel-sel didalam bercak hanya mengandung keturunan dari

suatu faga tersendiri yang berasal dari pustaka DNA asalnya. Kemudian dibuat

cetakan dari lempeng agar tersebut dengan cara menempelkan suatu lapisan

membran buatan diatas lempeng agar dan dipanaskan. Akibatnya DNA faga

menempel pada membran. Selanjutnya membran tersebut diinkubasi dengan suatu

fragmen DNA (suatu pelacak gen) yang dapatberhibridisasi dengan fragmen

DNA yang dicari. Pelacak gen akan berikatan pada tempat-tempat tertentu dimana

DNA yang diinginkan menempel pada membran. Ikatan pelacak gen dapat

dibuktikan bila sebelumnya pelacak gen diberi tanda dengan radioaktif atau

dengan cara lain. Selanjutnya dilakukan perbanyakan faga yang berasal dari

bercak positif lempeng asalnya. Melalui pemotongan secara restriksi akhirnya

diperoleh sejumlah besar DNA yang diinginkan.1

2. Analisis urutan DNA

Saat ini penentuan urutan nukleotida DNA kebanyakan dilakukan menurut

metode penghentian sintesis rantai. Pertama-tama dilakukan kloning fragmen

DNA kedalam DNA faga M13. Darai faga M13 dapat dengan mudah diisolasi

untaian tunggal DNA yang bersifat kodogenik berdasarkan sifat-sifat tertentu.

DNA untai tunggal tersebut dihibridisasi dengan suatu fragmen DNA pendek

yang disebut primer. Primer berikatan pada ujung 3’ untaian tunggal DNA

tersebut. Bertitik tolak dari hibrida semacam ini, kemudian untaian DNA kedua

yang masih belum lengkap, dapat dilengkapi didalam tabung reaksi, dengan cara

menambahkan deoksinukleosida trifosfat (dNTP, jadi maksudnya campuran

dGTP, dATP, dTTP dan dCTP) dan polimerase DNA. Selain dNTP ditambahkan

juga satu macam dideoksinukleosida trofosfat (ddNTP) dalam jumlah kecil.

Pemasangan ddNTP kedalam rantai DNA yang sedang terbentuk mengakibatkan

berhentinya sintesis untai DNA tersebut. Hal tersebut kemudian berulang

17

kembali, karena dNTP yang seharusnya dipasang kedalam rantai DNA digantikan

oleh ddNTP yang sesuai. 1

C. PCR, RFLP

1. Reaksi Rantai Polimerase (PCR=Polymerase Chain Reaction)

Reaksi rantai polimerase (PCR) memungkinkan perbanyakan (amplifikasi)

fragmen DNA yang diinginkan tanpa menggunakan enzim restriksi, vektor dan

sel inang. Untuk itu hanya diperlukan dua oligonukleotida (primer) yang masing-

masing berhibridisasi dengan salah satu untaian DNA yang akan diamplifikasi

pada sisi yang berbeda, dan juga keempat deoksinukleosida tifosfat dalam jumlah

yang cukup serta suatu polimerase DNA khusus yang tahan panas. 1

Pertama-tama, untaian ganda DNA dipisahkan menjadi untaian tunggal

melalui pemanasan. Kemudian dibiarkan agak sedikit dingin agar hibridisasi

primer dapat terjadi. Bertitik tolak dari sini, selanjutnya disintesis untaian DNA

komplementer dari awal dalam dua arah. Daur ini, akan diulangi 20-30 kali

dengan campuran reaksi yang sama. Setelah daur yang ketiga akan terbentuk

untaian berganda DNA yang mempunyai panjang yang sesuai dengan jarak antara

kedua primer. Pada setiap daur, jumlah DNA untai ganda tersebut meningkat

sebanyak kurang lebih dua kalinya, hingga akhirnya hampir seluruh fragmen yang

baru disintesis mempunyai panjang yang diinginkan. Pamanasan dan pendinginan

yang terus berulang secara siklik diatur oleh termostat dibawah pengawasan

komputer.1

2. Analisis RFLP

Endonuklease restriksi memotong DNA pada tempat-tempat yang sangat

khas dan sebagian besar merupakan palindrom. Bila suatu basa didalam suatu

tempat pengenalan semacam ini mengalami perubahan karena mutasi, maka

enzim restriksi yang bersangkutan tidak lagi dapat memotong DNA pada tempat

tersebut. Sebaliknya, melalui lutasi dapat terbentuk tempat restriksi yang baru.

Fragmen DNA yang sebanding dari dua individu berbeda yang secara genetik

tidak identik sering menghasilkan fragmen restriksi yang berbeda panjangnya.

18

Efek ini dikenal sebagai polimorfisme dari panjang fragmen restriksi (restriction

fragment length polymorphism, RFLP).1

3. Ekspresi berlebihan dari protein

Untuk terapi penyakit-penyakit tertentu diperlukan protein,misalnya

proteohormon yang terdapat pada organisme hewan dalam jumlah yang

sedemikian kecil sehingga sulit diisolasi. Protein semacam ini dapat dihasilkan

melalui ekspresi berlebihan didalam bakteri atau sel-sel eukariotik. Untuk itu

diisolasi gen yang bersangkutan dari DNA dan disisipkan kedalam suatu plasmid

ekspresi. Plasmid tersebut harus mengandung, selain gen itu sendiri, juga

potongan-potongan DNA lainnya yang dapat memungkinkan terjadi replikasi dan

transkripsi gen tersebut bila plasmid berada didalam sel inang. Setelah

transformasi dan perbanyakan sel inang yang cocok untuk plasmid tersebut,

dilakukan suatu transkripsi gen yang efisien melalui induksi yang terarah. Yang

terakhir, melalui translasi dari mRNA yang terbentuk dihasilkan protein yang

diinginkan dalam jumlah besar.1

19

DAFTAR PUSTAKA

[1] Koolman J, Rohm KH. Atlas Berwarna & Teks Biokimia. 1st ed. Stuttgart: Hipokrates 2001.[2] Kopp P. Genetics. Evidence-based Endocrinology. Second ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins:261-76.[3] Ganong WF. The Gonads:Development & Function of the Reproductive System. Review of Medical Physiology. 22 ed. San Francisco: McGraw Hill 2005:411-53.[4] Guyton CA, Hall JE. Textbook of medical physiology. Philadelphia: W.B. Saunders company 1996.[5] Ganong WF. Physiology of reproduction in women. In: DeChenney AH, Pernoll ML, eds. Curent obstetrics & Gynecologic. Connecticut: Appleton & Lange 1994:124-45.[6] Schumm DE. Core Concepts in Clinical Molecular Biology. First ed. Philadelphia - New York: Lippincott - Raven 1997.[7] Speroff L, Glass RH, Kase NG. Clinical Gynecologic Endocrinology and infertility. 7 ed. Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins 2005.[8] Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology. 6th edition ed. Philadelphia: Saunders elsevier 2007.

20