GENETIKA BAKTERIJA

• Na temelju stanične organizacije žive organizme dijelimo u prokariote i eukariote

• Eukarioti imaju pravu jezgru obavijenu jezgrinomovojnicom, a u citoplazmi stanice brojni organeli sa vlastitom membranom; u jezgri se nalazi nekoliko parova kromosoma koji su građeni od DNA i proteina, a jezgra se dijeli mitozom i/ili mejozom

• Prokarioti (pro-prije, karyon-jezgra) su organizmi (stanice) bez prave jezgre; cijanobakterije, bakterije i mikoplazme

• Prokarioti imaju samo jedan “kromosom”, a to je gola, dvolančana, prstenasta molekula DNA; dijele se binarnom diobom nakon replikacije DNA

• Sve do 1950. malo se znalo o genetici bakterija, jer je bilo velikih poteškoća u eksperimentalnom radu (uzgoj, križanje, prepoznavanje na temelju fenotipa)

Biljna stanica

Mikoplazme

• Nakon što su tehničke poteškoće oko uzgoja prevladane, prokarioti su postali neizostavni eksperimentalni objekti u genetici, posebno u molekularnoj genetici (preteča je biokemijska genetika): otkrivanje strukture i funkcije gena, regulacija i mutacije gena; razjašnjavanje genetičkog koda ...

• Danas mikroorganizmi (bakterije i virusi) imaju ključnu ulogu u kloniranju gena i genetičkom inženjerstvu

• Bakterije su mali jednostanični organizmi koje je moguće vidjeti pomoću svjetlosnog i elektronskog mikroskopa

• U prirodi ih ima u velikom broju, a pokazuju veliku raznolikost oblika

• Stanična struktura je vrlo jednostavna; prstenasta DNA (nukleoid), ribosomi, plazma membrana, stanična stijenka (ali ne celulozna kao u biljaka) i u nekih polisaharidna kapsula

• Vrlo su pogodni za genetička istraživanja: jednostavna građa, kratak životni ciklus (dijele se svakih 30-40 minuta), jednostavan uzgoj u laboratoriju, raznolikost fenotipa (u smislu funkcije)

• Najpopularniji objekt genetičkih istraživanja bakteriju E. coli otkrio je 1885. Theodor Escherich

BAKTERIJSKA SVOJSTVA (FENOTIP)

• Oblik bakterijske stanice može biti sferičan (koki), štapićast (bacili) ili spiralan (spirili)

• Oblik bakterijske kolonije je važno svojstvo koje je vidljivo na krutoj hranjivoj podlozi (agarskoj ploči)

• Kolonija na agarskoj ploči predstavlja mnoštvo genetički istovjetnih stanica (klon) koje su nastale iz jedne stanice binarnom diobom

• U nekih vrsta bakterija stanice su obavijene polisaharidnom kapsulom što kolonije čini glatkima (S) za razliku od hrapavih (R) kolonija koje stvaraju bakterije bez polisaharidne kapsule

• Drugo vidljivo fenotipsko svojstvo je prisutnost ili odsutnost bičeva na površini stanice (ako su stanice pokretne, kolonije na agarskojploči izgledaju razmazano; ako su nepokretne stanice kolonije su točkaste)

• Najčešća svojstva koja istražuju bakterijski genetičari uključuju biokemijske mutacije (mutacije gena čiji produkti enzimi kontroliraju biosintetske putove)

• Otpornost na antibiotike (Penr), fage, faktore iz okoliša ...

• Bakterije su s obzirom na prehrambene potrebe PROTOTROFI ili AUKSOTROFI

• PROTOTROFI – divlji tip bakterija koji može rasti na MINIMALNOJ PODLOZI (MP): voda, izvor ugljika; glukoza ili saharoza, mješavina anorganskih soli

• Genske mutacije uzrokuju zastoj u biokemijskim putovima -biokemijske mutante

• Biokemijske mutante ne mogu sintetizirati određene supstance kaoaminokiseline, nukleotide ili vitamine i stoga se te supstance moraju dodavati u podlogu kako bi bakterije mogle rasti

• Mutante koje zahtijevaju različite dodatke minimalnoj podlozi nazivamo AKSOTROFNIM MUTANTAMA (npr. auksotrofna mutanta za metionin zahtijeva metionin u podlozi: Met-)

• Auksotrofne mutante mogu rasti na kompletnoj podlozi koja sadrži sve supstance potrebne za rast

• Auksotrofi mogu rasti na selektivnim podlogama: MP uz dodatak određenih supstanci koje bakterija ne može sintetizirati

• Tehnika uz pomoć koje se može brzo utvrditi da li je određeni soj bakterije auksotrofan za određeni metabolit je tehnika otiska ili “replica-plating” tehnika (Joshua Lederberg)

KROMOSOMSKA ORGANIZACIJA

• Geni bakterije organizirani su u jednu grupu vezanih gena (haploidniorganizmi)

• “Kromosom” bakterija je prstenasta, gola, dvolančana molekula DNA – nazivamo ga nukleoid (koristi se još termin GENOFOR = genetički materijal prokariota i virusa)

• U E. coli koja živi u probavnom traktu čovjeka, kromosom je dugačak više od 1 mm, a pakiran je u nukleoid čija je dužina manja od 1 μm (gustoća pakiranja 1000:1); kromosom čini 4x106 pb, oko 3000 gena

• Uz bakterijski kromosom u stanici se mogu nalaziti PLAZMIDI, male kružne molekule DNA

• Plazmid je nezavisna samoreplicirajuća čestica (Lederberg)• Plazmidi se repliciraju neovisno o bakterijskom kromosomu, a svaki

plazmid ima mali broj gena

• Bakterijska stanica dijeli se binarnom diobom nakon replikacije DNA

• U povoljnim uvjetima bakterije se vrlo brzo razmnožavaju, primjerice E. coli se u optimalnim uvjetima dijeli svakih 20 minuta; tijekom kultiviranja preko noći (12 sati) iz jedne stanice nastane kolonija od 107 do 108 stanica

• U prirodnom staništu (debelo crijevo sisavaca) to ide još brže• Zbog nespolnog razmnožavanja sve bakterije u jednoj koloniji

nastale iz jedne stanice su genetički istovjetne• Ipak neke se stanice razlikuju zbog mutacija; za određeni gen u

E. coli vjerojatnost mutacije je oko 1x10-7 po staničnoj diobi; budući da se u crijevu svakodnevno stvara 2x1010 novih stanica E. coli broj mutanata bit će 2000 (2x1010/1x10-7)

• Mutacije su dakle jedini izvor genetičke varijabilnosti u bakterija

• Uz mutacije i genetička rekombinacija pridonosi varijabilnosti, ali na razini populacije

Binarna dioba

REKOMBINACIJA U BAKTERIJA

• Rekombinacija je ujedinjavanje (kombiniranje) genetičkog materijala dviju jedinki u genom jedne jedinke

• Nasljedna tvar jedne bakterije može se ugraditi u nasljednu tvar druge bakterije čime nastaju rekombinantni potomci

• Genetičku rekombinaciju u bakteriji E. coli prvi su uočili i objasnili Lederberg i Tatum 1946.

• Mehanizmi rekombinacije u bakterija su: transformacija, konjugacija i transdukcija

TRANSFORMACIJA

• Izmjena genetičke informacije između gole DNA i DNA stanice recipijenta

• Transformirajući princip otkrio je Griffith 1928.• Gola DNA je kompetentna za transformaciju ako je dvolančana i

relativno velika• Stanice kompetentne za transformaciju moraju na površini imati

protein – faktor kompeticije koji se veže za stranu DNA (vezanje zahtijeva energiju)

• Bakterije koje nisu prirodno kompetentne možemo tretirati npr. CaCl2; tada stanica postaje kompetentna

• Prilikom transformacije u stanicu recipijenta ulazi samo jedan lanac dvolančane DNA, te se ugrađuje u genom domaćina uz pomoć dva krosing-overa

• Preostala jednolančana DNA (dio originalnog bakterijskog kromosoma) razgradit će enzimi egzonukleaze

Griffith-ov eksperiment

KONJUGACIJA

• Konjugacija je indirektni prijenos genetičkog materijala iz stanice DONORA u stanicu RECIPIJENTA tijekom spolnog razmnožavanja

• Stanice koje konjugiraju moraju biti različitih tipova parenja što ovisi o prisustvu F plazmida ili spolnog faktora u citoplazmi

• F plazmid nosi gene za stvaranje F pilusa (sex pili) i gene za prijenos DNA iz donora u recipijenta (najmanje 22 gena)

• Stanica koja ima slobodan F plazmid je F+ stanica ili DONOR, a stanica koja ga nema je F- stanica ili RECIPIJENT

• Uvijek konjugiraju F+ i F- stanice i prilikom toga se F faktor donora replicira i njegova kopija prelazi u F- stanicu preko konjugacijskog mostića

• F plazmid se, osim što može biti slobodan u citoplazmi, može ugraditi u bakterijski kromosom i pri tom nastaje Hfr soj (“high frequency of recombination”)

• F plazmid ugrađuje se u bakterijski kromosom jednim krosing-overom

• Hfr soj konjugira s F- sojem i pri tome Hfr je donor koji daje kopiju svog kromosoma F- stanici (recipijent)

• Prijenos ide uvijek u jednom smjeru preko konjugacijskog mostića

• Bakterijski kromosom se prenosi kao linearna molekula nakon pucanja na određenom mjestu unutar integriranog F plazmida; stoga preko mostića prvo prelazi jedan dio F plazmida koji za sobom “vuče bakterijski kromosom”

• Vrlo rijetko uspije prijeći čitav bakterijski kromosom; u tom slučaju posljednji ulazi dio plazmida

• Najčešće prijeđe samo dio bakterijskog kromosoma, jer je konjugacijski mostić vrlo nestabilna struktura koja lagano puca

• U rekombinaciju je uključen samo dio kromosoma donora koji je ušao u stanicu recipijenta; takva stanica je parcijalni diploid ili merozigota

• Rekombinante se mogu detektirati pomoću selektivnih podloga

Konjugacija

SEKSDUKCIJA (F’ DUKCIJA)

• To je prijenos F’ plazmida koji nastaje izrezivanjem F plazmida iz bakterijskog kromosoma Hfr soja; pri tome dolazi do izrezivanja i susjednih bakterijskih gena

• Prilikom prijenosa F’ u stanicu recipijenta, može ponovno doći do ugradnje u bakterijski kromosom, a pri tome i do ugradnje (rekombinacije) bakterijskih gena donora

• F’ plazmid ima visoku stopu spontane integracije za razliku od F+, a najčešće se integrira na isto mjesto kao u originalnom Hfr soju

• F’ dukcija je značajna u istraživanju ekspresije gena zbog stvaranja stabilnih merozigota

MAPIRANJE (KARTIRANJE) BAKTERIJSKIH GENA

• Za mapiranje se mogu koristiti svi mehanizmi rekombinacije: transformacija, konjugacija, seksdukcija i transdukcija

Konjugacija i mapiranje• Jacob i Wollman - razvili tehniku prekinutog parenja

(konjugacije) kojom su dokazali da je prijenos genetičkog materijala donora u recipijenta za vrijeme konjugacije linearan proces

• Pomiješali soj F- i Hfr u mikseru; svakih nekoliko minuta uključivali mikser kako bi razdvojili stanice u konjugaciji; stanice se nacijepljuju na podlogu koja sadrži antibiotik koji ubija Hfr stanice koje su prirodno osjetljive na njega

• Zatim se preostale stanice nacijepe na minimalne podloge s različitim dodacima (npr. na podlozi bez leucina može rasti samo prototrofna rekombinanta koja nastaje prijenosom gena za Leu iz Hfr u F- i njegovom ugradnjom u genom F- soja)

• Poredak gena određuje se na osnovu vremena koje je potrebno da određeni gen prijeđe iz donora u recipijenta (prekinuta konjugacija –minute) te na osnovu broja prototrofnih rekombinanata koje nastaju prijenosom gena i njihovom ugradnjom u kromosom recipijenta

• Karta bakterijskog kromosoma je kružna karta, a jedinice karte su minute koje dobivamo tehnikom prekinute konjugacije

Kružna karta bakterijskog “kromosoma”

TRANSDUKCIJA

• Prijenos nasljedne tvari iz jedne bakterije u drugu pomoću bakterijskih virusa

• Otkrili su je Lederberg i Zinder 1951.• U-cijev čije su strane odvojene filterom sa veličinom

pora manjom od veličine bakterijske stanice; 2 različita auksotrofna soja bakterije Salmonella typhimurium

• Iako je između sojeva barijera (filter) došlo je do rekombinacijei pri tome je nastao prototrofan soj koji raste na minimalnoj podlozi

• Mogućnost transformacije je isključena jer su podlozi dodali enzime koji razgrađuju golu DNA

• U podlozi su našli čestice virusa P22 koji je dovoljno malen da prođe kroz pore bakterijskog filtra

SAŽETAK

• Prokarioti su jednostavni, jednostanični organizmi bez prave jezgre; nasljedna uputa je u nukleoidu –prstenastoj dvolančanoj molekuli DNA (haploidniorganizmi!)

• U prokariota ubrajamo bakterije, cijanobakterije i mikoplazme

• Bakterije se razmnožavaju binarnom diobom nakon replikacije DNA pri čemu nastaju genetički identični produkti

• u bakterija dolazi do genetičke rekombinacijekonjugacijom, transformacijom i transdukcijom