8 de Septiembre de 2020 Dra. Victoria Ibáñez González

Identificación inequívoca de variedades comerciales de cítricos

Dra. Victoria Ibáñez GonzálezTécnico Producción y Desarrollo- ANECOOPE-mail: [email protected]

8 de Septiembre de 2020

Identificación inequívoca de variedades comerciales de cítricos.

1. Identificación varietal actual y futura.

2. Objetivo 1 proyecto GOCITRUS

3. Protocolo de identificación generalizado por GOCITRUS.

4. Marcadores moleculares: tipos y usos.

5. Ejemplos aplicados:

- Nules-Arrufatina-Nero.

- 3 Clones comerciales

- W.Murcott-Tango

6. Coste de obtención y uso de marcadores.

7. Validez del protocolo

8. Review: antes y después de GOCITRUS.

9. Conclusiones

Bioquímico (sustancia medible: brix, acidez)

Morfológico (forma hoja, fruto…)

Molecular (secuencia de ADN)

1. Identificación varietal

Identificación(marcadores)

MOLECULARMENTE(ADN)

Cambios en la secuencia de ADN

AMBIENTE

Actual

AMBIENTE

Corto plazo

AGRONÓMICAMENTE(DHE)

Brix, Acidez, forma hoja, fruto…

AGRONÓMICAMENTE(DHE)

Brix, Acidez, forma hoja, fruto…

CreaciónUnidad Identificación

Varietal Molecular

Sub-objetivo GOCITRUS

Determinan Si un material vegetal puede registrarse como variedad comercial

CPVO-TP/201/2 (Pomelo-pummelo)CPVO-TP/201/1 (Mandarinas)CPVO-TP/202/1 (Naranjas)CPVO-TP/203/1 (Limas-limones)

2. Objetivo 1 proyecto GOCITRUS

Objetivo 1 proyecto GOCITRUS: Generalización sistema identificación apoyado en base de datos Citruseq. R3: Secuenciación de variedades no incluidas en la base de datos Citruseq/Citrusgenn.

> 25% mandarinas comerciales españolas.

> 10% naranjas comerciales españolas.

R4 Obtención de marcadores moleculares de nuevas variedades seleccionadas

Al menos 1 marcador inequívoco de:

25% variedades de mandarinas

10% de naranjas dulces


ENFOCADO PRINCIPALMENTE A IDENTIFICAR VARIEDADES

PROCEDENTES DE MUTACIÓN

• MANDARINASClementinas Híbridos

Satsumas

• NARANJAS

ADMIXTURE, HIBRIDOS MUTACION

Images from López-García, Antonio

2018-Genomics of the origin and evolution of citrus. Nature. 554,311-316.

• LIMONES

291 Variedades Comerciales España

https://www.mapa.gob.es/app/regVar/default.aspxhttps://cpvo.europa.eu/en/applications-and-

examinations/cpvo-varieties-database

MANDARINO52%

NARANJO24%

LIMONERO8%

POMELO3%

PUMMELO2%

PATRONES11%

> 50% son mutación !!!

https://www.mapa.gob.es/app/regVar/default.aspx

https://cpvo.europa.eu/en/applications-and-examinations/cpvo-varieties-database

4. Marcador molecular.

❑Marcador Molecular = Biomarcador Genético = Marcador Genético

FRAGMENTO DE ADN LOCALIZADO

❑ ADN

A T C G

El orden de las bases determina el mensaje.

Un cambio en una letra o un orden de palabras cambia el mensaje

4. Marcador molecular. USOS.

✓ EL ADN ES EL MISMO EN TODAS LAS CÉLULAS DE CADA SER VIVO

✓ EL ADN NO CAMBIA ENTRE TEJIDOS O EDAD. AMBIENTE

✓ Cualquier material vegetal: hoja, raíz, pulpa, zumo…

✓ Cualquier especie, variedad…

✓ Cualquier momento de desarrollo de la planta: plántula, adulto

❑Utilidad de los marcadores moleculares

Plantón Árbol Fruto Hoja

• Selección Asistida por Marcadores (SAM)• Identificación ➔ CERTIFICACIÓN VARIETAL, trazabilidad

- Distancia genética- Biomarcadores genéticos

- AFLPS, RAPDS…- SSR (microsatélites)- Variaciones estructurales- Indels- SNP

• Dos especies remotas• Híbridos inter e intraespecíficos.• Padre/Hijo

Requiere Secuenciación

POR CRUCE POR MUTACIÓN

• Espontánea• InducidaEjemplo: Clementina Fina y Clemenules

- Distancia genética- Biomarcadores genéticos

- AFLPS, RAPIDS…- SSR (microsatélites).- Variaciones estructurales- Indels- SNP

4. Marcador molecular. Tipos.

✓ VARIACIONES ESTRUCTURALES

Original T A A T T C T A C G A T G G T T T T C T T C A C C A A G

Delecion 5 pb T A A T T C T A C T T T T C T T C A C C A A G

Insercion 2 pb T A A T T C T A C G A G G T G G T T T T C T T C A C C A

Duplicacion 3 pb T A A T T C T A C G A T G G T A C G A T G G T T T T C T

✓ SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ✓ INDEL (INserción, DELeción)

Elegante

Elefante

La comida del perro se la comió el abuelo

El perro se comió la comida de la abuela

El perro se comió a la abuela

El perro se comió la comida del abuelo

4. Marcadores usados en el protocolo generalizado por GOCITRUS.

Cambia una letra Pérdida o ganancia de unas pocas letras.

Pérdida, Ganancia o reoganizaciones (Inversion, translocación) de fragmentos de cientos, miles o millones de letras.

1. Secuenciar genoma (variedad)

2. Alinear con referencia.

3. Comparar genomas

Base datos: CITRUSEQ-CITRUSGENN

ADN Fragmentos pair-end fragmentos

✓ SNPs: .vcf

✓ INDELs: .vcf

✓ VE (Dup/Del), (Trans/Inv):

Scripts; .bam, .tdf, LOH…etc

4. Selección, Interpretación y reconstrucción in

silico secuencia variedad A.

5. Verificación variantes en bancada por PCR.

Diseño oligonucleótidos. Sec Pto.

CATTCTGTAATGTTTATGTGTAGATTCTAGCTCAAAGGGTTTCGCTGTTTGATTATGAGCTTGTTGAGGGAAACCAAGGGAAGAGAAGGTTGATTGCTTTTGGAAAGTTTGCTGGTAGAGCTGCCATAATTGACTTGTTGAAAGGATTAGGCCAGCGTATTGTCACGGGATGAGTGTTTTGCGCAGCTAACCCGTGCGGCACTTAGACAACTTTGCCGAATGTTGCTAAGTAAGCCTAGAGATTCTCGGAATAGAGAAGAGAGCAATTGAGCCAAAGAAGAAACTTGTATTGCACAAAGAGAGATTACAATGCTTGTTGTAGTGTTTGTTGGATACAAATGCCTAATGCCATCCCATATTTATAGGGGAGGCTTGCCAAGCTCTAGAGATTCTAGAGAATTCTACCATGTTCCTAGAATTCTAGATATT

6. Verificación con muestras ciegas.

PERMITEN DISCRIMINAR ENTREEspecies Híbridos Mutaciones

SET DE MARCADORES MOLECULARES


5. Ejemplo IDENTIFICACIÓNvariedades procedentes de mutación

W.Murcott

Arrufatina Nero

Clemenules

TANGO

1 Cambio estructural = 1 Marcador de Identificación

Identificación

inequívoca

Clon 1 Clon 2 Clon 3

Parental

• > 95% genomas procedentes de mutación tienen variaciones estructurales.

Cromosomas clementina

1 2 3 4 5 6 7 8 9

5. Ejemplo Arrufatina y NeroIDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación

Parental(Clemenules)

Natural (Arrufatina)

Inducida (NERO)

Cromosoma 3

Cromosomas clementina

1 2 3 4 5 6 7 8 9

5. Ejemplo Arrufatina y NeroIDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación

Parental(Clemenules)

Natural (Arrufatina)

Inducida (NERO)

Cromosoma 3

5. Ejemplo IDENTIFICACIÓNvariedades procedentes de mutación. CLONES VARIETALES

W.Murcott

Arrufatina Nero

Clemenules

TANGO


Identificación

inequívoca



Parental

Cromosoma 1 Cromosoma 6




Cromosoma 5

5. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES: CLON 1

BAJADA DE COBERTURA EN CROMOSOMA 6

• CROMOPLEXIA entre los cromosomas 2 y el cromosoma 3.

Scripts SV…

CLON 1

PARENTAL

Chr2 Chr2 Chr3

3'

5'

5'

5'

3'

G F

D H

5'

C

2'-32-2'

3'

E 3'

5540 45 50

3'

30 3520 250 5 10 15

3-2'

5'

5'

5'

5'

50 5530 35 40 450 5 10 15

3'

3'

3'

3'C D

E F

20 25

G H

2'2

3'3

CL

ON

1P

ar

en

tal


ESTRUCTURA

UNICA

Identificación

inequívoca





Cromosoma 5


• DELECIÓN EN CROMOSOMA 3• DELECIÓN EN CROMOSOMA 8

• Deleción Cromosoma 3 (0,6 Mb) Deleción Cromosoma 8 (3,2 Mb)


• Translocación recíproca en los cromosomas 9• Nuevos cromosomas: de 56,2 Mb y 6,4 Mb

3'

5'

5'

5'

FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 55 60

F I 3'E G 5'

50

10

E F

G I

15 20

3'

3'

0 5 25 30 35 40 45 50 55

CL

ON

2P

ar

en

tal

ESTRUCTURAS

UNICAS

Identificación

inequívoca

5'

5'

5'

5'

C D 3'

3'

200 5 10 25

C D3'

3'

15

CLON 2

Parental

5'

5'

5'

5'

0 5 10 15 20

B

30 3525

3'

3'

5540

A

45 50

A B3'

3'





Cromosoma 5No Variaciones EstructuralesDELECION o DUPLICACION



Scripts SV…• CROMOPLEXIA entre los cromosomas 3, 4 y 5

• Chr 3/4 de 23.7 Mb• Chr 5/3 de 51.8 Mb• Chr 5/4 de 44.4 Mb

CLON 3

PARENTAL

5'

5'

3' BBBBBBBBBBBBBBBBBBBB 3'

5540

B F

45

3'

5030

E

35

D

20

5'

250 5

A C

10 15

4/5

3/5

3/4

5'

5'

5'

3'

55

3'

45 50

E

35

F

403025

3'C D

20

A B

10 150 5

4

5

3

ESTRUCTURAS

UNICAS

Identificación

inequívoca

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

3'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

BBBBBBBBBBBBBBBBBBBB

A

DE

F

C 5'

B

3'

3'

3'

3'

555040 4525 35300 5 10 15 20

9

4'4-5

5'3-5

3'3-4

7

8'8

9'

6'

7'

6

1'1

2'2

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

3'

5'

FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF

0 30

5'

F

3'

3'

2'2

3'

D

10 15 20 25

G

45 50 55

1'1

3'

3'

35 405

E

I

3

4'4

5'5

6'6

7'7

8'8

9'-99-9'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

C

3'

3'

3'

3'

3'

A B

5'

5'

3'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

3'

3'

3'

D

3'

B

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

5'

3'

C

3'

E

1

2'-32-2'

G

3'

3'

8

9'

6'

7'

6

1'

F

3'3-2'

7

A

H

8'

15 20

9

4'4

5'5

25 350 5 10 5030 40 45 55

CLON 1 CLON 2 CLON 3

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

3'

3'

55

3'

3'

45 5030

3'

3'

35

3'

3'

40

3'

3'

3'

3'

3'

20

3'

3'

25

3'

3'

3'

0 5 10 15

7'7

8'8

9'9

4'4

5'5

6'6

1'1

2'2

3'3

VARIEDAD

6. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES

6. Ejemplo IDENTIFICACIÓNvariedades procedentes de mutación

W.Murcott

Arrufatina Nero

Clemenules

TANGO


Identificación

inequívoca


Parental


6. Ejemplo TANGOIDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación

NO SE APRECIAN CAMBIOS COBERTURA➔

NO DELECIÓN NI DUPLICACIÓN GRANDES FRAGMENTOS





Cromosoma 5


Script SV…

W.M

urc

ott

Tan

go

• DELECION cromosoma 2 (6 Mb)+

• INSERCIÓN TANDEM cromosoma 2 homólogo

• INVERSION en cromosoma 4 (3.97 Mb)

W.M

urc

ott

Tan

go

Pare

nta

lIn

du

cia

5'

5'

5'

5'

D

D3'

3'

A

A

B C

B C

4530

3'

35 40

3'

2510

B C

15

D

200

A

A

5

B C

D5'

5'

5'

5'

3'

3'

3'

3'

3015 20 255 100

B A

A B

A B

A BESTRUCTURA

UNICA

Identificación

inequívoca


5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

A D

3'3

8

9'9

4'4

5'5

6'6

10

7'7

A

B A

0

8'

1'1

2'2

15 20

3'

5 35

3'

25

3'

B C B C D

3'

3'

3'

3'

3'

40

3'

3'

3'

3'

45 50

3'

3'

3'

55

3'A B

30

TANGOW.MURCOTT

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

5'

8

9'9

4'4

5'5

6'6

5 10

7'7

3'3

8'

1'1

2'2

3'

A D

A B C

15 20

3'

3'

3'

3'

25

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

3'

D

400 4535

3'

5550

3'

A B3'A B

B C

30

Usos:

Identificación de variantes estructurales presentes en la variedad de mandarina TANGO

certificación.cyberagropolis.com ➔ Certificación Variedad

Protegida Tang-Gold

6. Coste de OBTENCION y USO de marcadores moleculares

2. Coste de Uso de marcadores moleculares ➔ IDENTIFICACION.

1. COSTE de obtención de marcadores moleculares.

1. Extraer ADN: 2-6h

2. Realizar PCR: 2-4h

Aproximadamente:- 5-6 meses

- 1500-2000 € reactivos + personal =10 000 €/variedad

Aproximadamente:- 1-2 días

- 50-100 €/muestra

7. Validez del protocolo

• PREVIO A GOCITRUS

• Analizado más de 50 genomas procedentes de mutación


Tipología de variantes estructurales

> 150Número de variantes

estructurales por genoma

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7

Nu

me

ro

de

ge

no

ma

s

(%)

Número de variaciones estructurales por genoma

8. Antes y Después de GOCITRUS

GOCITRUS. BASE DE DATOS CITUSEQ-CITRUSGENNContiene > 350 genomas de cítricos. Ancestrales, réplicas…• 324 Registros comerciales de cítricos en España (291 variedades + 33 patrones).

• 83 secuenciadas• 24 en proceso de secuenciación

• 1/3 registro secuenciado a finales de 2020• 1 marcador inequívoco de variedades procedentes de mutación a mitad de 2021:

• 25% de variedades de mandarinas• 10% de naranjas dulces.

• Polémicas derivadas de la incertidumbre en la identificación varietal.

• Marcadores existentes ínfimamente eficientes para variedades derivadas (procedentes de mutación)

CONCLUSIONES

- El objetivo 1 del proyecto es la generalización de un protocolo de obtención de marcadores moleculares de tipo variación estructural, indel e SNP validado previamente.

- Protocolo dirigido principalmente a la identificación de variedades procedentes de mutación (> 50% variedades comerciales) dado que los anteriores marcadores empleados no resultaban eficaces en este grupo.

- Los MM pueden ser empleados en cualquier especie, en cualquier tipo de tejido y en cualquier estado de desarrollo de una planta.

- Trazabilidad (evitar errores):- Vivero: garantizar identidad del material adquirido por agricultores.- Distribuidores: garantizar identidad material comercializado. MARCA.- Consumidores: garantiza la identidad del producto adquirido.

- A finales de 2020, 1/3 de las variedades comerciales españolas estarán secuenciadas.

- A mitad de 2021 25% mandarinas y un 10% naranja dulce tendrá 1 marcador inequívoco.

¿PREGUNTAS?Identificación inequívoca de variedades

comerciales de cítricos

Dra. Victoria Ibáñez GonzálezTécnico Producción y Desarrollo- ANECOOPE-mail: [email protected]

8 de Septiembre de 2020

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8 de Septiembre de 2020 Dra. Victoria Ibáñez González