8. Vorlesung WS 2004/05Softwarewerkzeuge1 V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das aktive Zentrum? (Docking

8. Vorlesung WS 2004/05

Softwarewerkzeuge 1

V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung

Beispiele für Protein-Liganden Komplexe

Wo ist das aktive Zentrum?

(Docking wird hier nicht behandelt – siehe Spezialvorlesungen von A. Kämper und

A. Hildebrandt/D. Neumann im SS05)

Wie stark binden Liganden an Proteine?

Wie kann man die Affinität des Liganden verbessern?

Wie gelangen Liganden zum Protein (elektrostatische Anziehung)?

Wie gelangen sie ins Proteininnere bzw. wieder hinaus?


Softwarewerkzeuge 2

beta-Trypsin:Benzamidin (3ptb)

www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

Enge, sehr polare Bindungstasche auf Proteinoberfläche.

Amidin-Gruppen des Liganden bilden 4 H-Bindungen mit Carboxylgruppen des Proteins (Trypsin) aus.

Benzolring passt optimal in hydro-phobe Tasche.


Softwarewerkzeuge 3

Cytochrome P450cam : Kampher (2cpp)


Weites, recht unpolares aktives Zentrum im Proteininneren.

Hämgruppe katalysiert Reaktion. Partielle Desolvatation.

Wie gelangt Substrat hinein?


Softwarewerkzeuge 4

Maus-Antikörper McPC-603:Phosphocholine (2mcp)


Bindungstasche auf Proteinoberfläche wird durch drei

hypervariable Loops geformt.


Softwarewerkzeuge 5

Streptavidin:Biotin (1stp)


Sehr polare, tiefe Bindungstasche.

Außerordentlich starke Affinität.


Softwarewerkzeuge 6

HIV-1 Protease:XK-263 Inhibitor (1hvr)


Inhibitor XK-263 stammt von Merck-Dupont. Er enthält eine 7-Ring

zyklische Urea-Einheit mit Phenyl- und Naphtyl-Ringen.

Die CO-Gruppe ahmt das ansonsten konservierte Wassermolekül 301 nach

und verdrängt es. Der tiefere Teil des zyklischen Urea-Rings enthält zwei

benachbarte Hydroxylgruppen, die H-Bindungen mit den katalytischen

Aspartat-Residuen bilden.


Softwarewerkzeuge 7

Identifikation von funktionellen Residuen

1 Funktionelle bzw. katalytische Residuen werden traditionell in (hoch)

konservierten Regionen von Multiple Sequence Alignments erwartet

evtl. Kopplung mit Information über 3D-Struktur

2: finde Residuen, die Proteinstruktur destabilisieren.

Grund: Funktionelle Residuen im Proteininneren sind oft energetisch ungünstig.

Funktionalität auf Kosten von Stabilität.

3: finde Löcher oder Einbuchtungen in Proteinstruktur.

Hier vorgestellt: integrierte Methode, die 1 -3 implementiert. Möglichkeit für

funktionelle Annotation von Proteinen mit unbekannter Funktion.


Softwarewerkzeuge 8

Wo ist das aktive Zentrum I?

Auswahl von 49 Enzymen. Kriterien:

- Auflösung 2.0 Å

- funktionelle Residuen sind bekannt (in Swissprot-Eintrag in ACT_SITE)

- enthalten nur eine Domäne (SCOP Datenbank)

- die SCOP-Einträge sind unterschiedlich

- es gibt 10 homologe Sequenzen mit Blast E-Wert < 10-10.

98 katalytische Residuen:

22 His

17 Asp, Glu

10 Cys

8 Ser 7 Arg, Lys Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

5 Tyr

3 Asn

2 Thr


Softwarewerkzeuge 9

Repräsentative EnzymePDB Protein Länge Auflösung EC Zahl Zahl und Namen der

SCOP Seq. katalytischen Residuen


Softwarewerkzeuge 10

Repräsentative Enzyme



Fitness-Funktion

- Bewertung der Seitenketten-Konformation entsprechend Rotamer-Bibliothek

- Seitenketten-Packung (wissensbasiert)

- Hydratation (wissensbasiert)

- Analyse der Proteinoberfläche (MSP-Programm): Zuordnung zu den einzelnen

Residuen

- elektrostatische Energie: AMBER-Partialladungen elektrostatisches

Potential (aus Poisson-Boltzmann-Rechnung)

Jeder Score(S), Rang (R) und Position (L) werden gegen den Mittelwert und die

Standardabweichung für jeden Aminosäuretyp normalisiert.

Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)



Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen

Beispiel: 3D-Profil für Lysozym aus Hühnereiweiss. D52 ist katal. Residue.

native Hydratations- lokale D52 hat sehr schlechten Rang. D.h.

Residue klasse Struktur es wäre günstig D52 zu ersetzen.

Katalytische Residuen sind stets un-

stabiler als nicht-katalytische.


Score Rang Score

native native beste

Residue Residue Residue




Flussdiagramm der Vorhersagemethode.

- Links oben Analyse der Konservierung.

- Rechts oben Analyse der Position in

3D-Struktur bzw. Stabilität der

Mutantenproteine

- untere Hälfte trifft für verschiedene

Aminosäuretypen (1-Letter-code)

die Entscheidung, ob katalytische

Residuen vorliegen.






Proteinstrukturen mit unbekannter Funktion. Die vorgeschlagenen

katalytischen Residuen sind markiert.



Wo ist das aktive Zentrum II

Analyse mit elektrostatischen

Kontinuumsrechnungen

Die Titrationszustände der meisten

Aminosäuren folgen der

Henderson-Hasselbalch-Gleichung.

Berechne Titrationskurven für 3

Enzyme mit UHBD.

TIM und AR haben eine sehr ähnliche

Strukturen, katalysieren aber ganz

unterschiedliche Reaktionen.

AR und PMI haben sehr verschiedene

Strukturen, katalysieren aber ähnliche

Reaktionen.

HA

ApKpH a log

Ondrechen, Clifton, Ringe,

PNAS 98, 12473 (2001)



Theoretische Titrationskurven

Titrationskurven aller His-Residuen

in TIM

Triosephosphat Isomerase (TIM) katalysiert die Isomerierung von D-Glyceraldehyd-

3-Phosphat zu Dihydroxyaceton-Phosphat.

Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:

His95, Glu165, Lys112, Tyr164.

Davon liegen H95, E165 und Y164 eng beieinander.Ondrechen, Clifton, Ringe,

PNAS 98, 12473 (2001)



Titrationskurven aller Tyr-Residuen

in AR


Aldose-Reduktase (AR) katalysiert die Reduktion einer Aldehydgruppe von

Aldose zu einem Alkohol.

Man findet 7 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:

Tyr48, Cys298, Glu185, Lys21, Lys77, Tyr107, Tyr209.

Tyr48, His110 und Cys298 bilden das aktive Zentrum. Die anderen Residuen

liegen in der Nähe.


PNAS 98, 12473 (2001)



Titrationskurven aller Lys-Residuen

in PMI


PMI katalysiert die Interkonversion von Mannose-6-Phosphat und Fructose-6-Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:His135, Lys100, Lys136, Tyr287.Alle liegen eng beieinander, die ersten 3 wohl im aktiven Zentrum und His135nahe bei Lys136.


PNAS 98, 12473 (2001)



Weitere BeispielePDB ID Name Chemie Residuen mit auffälligen Titrationskurven

1AMQ Aspartat [H189, Y225, K258, R266, C191, C192], aminotransferase Transamination [Y256], [Y295], [H301]

1CSE Subtilisin Peptidhydrolyse [D32, H64] Carlsberg (Serin-Protease)

1EA5 Acetylcholinesterase Ester Hydrolyse [Y130, E199, E327, H440, D392], [Y148], [H398], [H425]

1HKA 6-Hydroxymethyl- Kinase [D97, H115] 7,8-dihydropterin pyrophosphate kinase

1OPY 3-Keto-5-Steroid Isomerase [Y16, Y32, Y57], [C81] isomerase

1PIP Papain Peptidhydrolyse [C25, H159], (Cys Protease) [K17, K174, Y186], [R59], [R96]

1PSO Pepsin Peptidhydrolyse [D32, D215, D303], [D11] (Säure-Protease)

1WBA Winged bean Speicherung - keine keine albumin Enzymfunktion

Residue imzweiter Schale.Residue im

aktiven ZentrumOndrechen, Clifton, Ringe,

PNAS 98, 12473 (2001)



Fazit

Mittels elektrostatischer Kontinuumsrechnungen für bekannte Kristallstrukturen

von Proteinen wurde für verschiedene externe pH-Werte die energetisch

optimale Gesamtladung der Proteine berechnet.

Aktive Zentren von Enzymen enthalten oft mehrere polare bzw. geladene

Seitenketten um die chemische Umwandlung zu katalysieren.

Deren Titrationszustände sind eng aneinander gekoppelt und zeigen im

Vergleich zu isolierten Seitenketten sehr ungewöhnliche Titrationskurven.

Diese Methode erlaubt also die Position von aktiven Zentren allein aufgrund

der Proteinstruktur zu erkennen.


PNAS 98, 12473 (2001)



Wie stark binden Liganden an Proteine?

Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)



exp. Affinitäten von Protein:Liganden Komplexen# Atome Ligand Target Typ -log K1

1 Ca2+ Amino-transferase IM 6.70 IM: Metallionischer Inhibitor1 Hg2+ Uroporphy-synthase IM 6.00 1 Mn2+ Inositol-phosphatase IM 5.70 1 Fe3+ Hydroxylase IM 5.301 Ag+ Arylformamidase IM 5.00 1 F- Phosphotransferase IA 4.55 IA: kleiner anionischer Inhibitor1 S2- Peroxidase IA 4.281 Xe Myoglobin L 2.30 L: Ligand (Agonist oder Antagonist)1 NH3 Meamine glutamate transferase I 1.79 I: Inhibitor2 CO Myoglobin L 7.522 O2 Myoglobin L 6.182 Cyanide Methane oxygenase IA 6.00 2 Hydroxylamine Glycerol oxidase IC 5.92 IC: potentiell kovalente Wechselwirkung3 Azide Glycerol oxidase IA 5.703 Ethylamine Protease I I 3.004 Thioacetamide Methan monooxygenase I 5.004 NO3

- Carbonate deydratase IA 4.704 Vanadate Phytase IA 4.555 Thiosemicarbazide Methane monooxygen. I 6.00 5 SO4

2- Creatine kinase IA 5.225 Iodoacetamide Methyl transferase IC 5.00 6 Putrescine Spermine synthase I 8.776 Aminooxyacetic acid Aminotransferase I 7.19 6 Oxalat Lactate dehydrogenase IA 5.807 -Aminobutyid acid Neuromanidase transmitter L 8.00 7 L-Cysteine Serine acetyl transferase I 6.227 Aminomethiozolidine Methyl transferase I 5.40 8 Muscimol -aminobutylicacid agonist L 8.73 8 Bromopyrimidone Cytosine deaminase I 6.24 8 Phosphonoacetic acid DNA polymerase I 6.00 9 Acetopyruvate Acetoacetate decarboxylase I 7.009 Methyl iodotyrosine Tyrosine monooxygenase I 6.30 9 Nitrooxazolidinone Aldehyde dehydrogenase I 5.46 9 Benzamidine Trypsin I 4.77



experimentelle Protein-Liganden Affinitäten

10 Allopurinol Xanthine oxidase I 9.17 10 Acetylcholine Cholinergic receptor L 8.14 10 Cabachol Cholinergic receptor L 7.8511 Mercapto oxoglutaric Isocitrate dehydrogenase I 8.3011 Diethyl pyrocarbonate Ca2+ transmitter L 8.80 11 Dopamine , , -androgen receptor L 8.6512 Norepinephrine Adrenergic agonist L 8.8812 Nicotine Nicotinic receptor L 8.2212 Hydroxybenzyl-Me3NR4 Acetycholiesterase I I 7.6813 Tiamenidine -Adrenergic agonist L 8.6613 Serotonin 5-Hydroxy tryptamine receptor L 8.3013 Benzyl mercaptopropionate Carboxypeptidase I 7.9614 Guanabenz -Adrenergic receptor L 9.0214 Methylenpenicillanic -Lactamase I 8.8514 Captopril Carboxypeptidase I 8.7015 Aminoclonidine L 9.32 15 Guanfacine -Adrenergic agonist L 8.7315 Isatin derivative Rhino protease I 7.3016 Acetophenone derivative ACEsterase IC 14.8916 Biotin Streptavidin L 13.4316 Naphazoline Adrenergic L 8.73 17 Melatonin Melatonin receptor L 8.9617 Guanine derivative Purine nucleoside phosphorylase I 7.9617 piperoxan antihyper. receptor L 7.8518 Iodomelatonin Melanin receptor L 10.6818 Alprenolol -adrenergic receptor L 9.4718 Phosphoramidon Metalloproteinase I 7.5519 Vesamicol Vesamicol receptor L 9.4719 Propranolol -adrenergic receptor L 9.3919 Trimethopri der Dihydrofolate reductase I 8.5320 Estradiol Steroid receptor L 9.6920 Melatonin derivative Melatonin receptor L 9.6820 Vesamicol derivative Vesamicol receptor L 9.2021 2-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I 12.7221 4-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I 10.5521 Triprolidine Histamine antagonist L 9.9821 Trimethoprim dihydrofolate reductase I 8.44

# Atome Ligand Target Typ -log K1

Kuntz, Chen, Sharp, Kollman,

PNAS 96, 9997 (1999)



22 Amitriptylinoxide Antidepressant L 9.0222 Mazindol derivative Dopamine transporter L 8.8222 Indolyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L 8.4922 Isatin derivative Rhino protease I 8.0023 Vesamicol der. VR L 11.0523 Neuraminic acid der. Sialidase I 10.5223 Melatonin der. melamin receptor L 10.2423 Vesamicol der. VR L 10.1724 Vesamicol der. VR L 11.1924 Isatin der. Rhino protease I 8.7024 Methadone Narcotic L 8.6625 Melatonin der. Melamin receptor L 9.6225 Corticosterone Steroid receptor L 8.5125 Isatin der. Rhino protease I 8.4026 Aldosterone Steroid receptor L 9.3226 Haloperidol Antipsychotic L 9.0226 Yohimbine -2 adrenergic receptor L 8.7326 Isatin der. Rhino protease I 8.4027 Vesamicol der. VR L 9.7427 Dexetimide Anticholinergic L 8.8027 Dehydrosinefungin mRNA Me trans. I 8.7428 Vesamicol der. VR L 9.8228 Indoyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.7028 Prazosin 1-adrenergic agonist L 9.6229 Spiperone L 10.27 29 Ketanserin Serotonin antagonist L 9.3929 Dextromoramide Analgesic L 9.02 30 Peptide phosphonates Carboxy peptidase IM 12.0030 Domperidone Dopamine antagonist L 10.1330 Etorphine Narcotic L 9.91






31 Carboxamide derivative 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.5431 Benzodiazepine derivative Integrin antagonist L 8.6031 Budesonide Glucocorticoid receptor L 8.5431 Flavin mononucleotide Cytochrome b reductase I 8.1032 Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.3432 Cyclic urea HIV protease I 8.85 32 Hoechst 33258 DNA L 7.4133 Methotrexate Dihydrofolate reductase I 9.70 34 Cyclic-aza isostere HIV protease I 10.21 34 Buprenorphine narcotic L 9.83 34 Pimozide antipsychotic L 9.39 34 Hoechst 33342 DNA L 7.44 35 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 11.52 35 Argatroban Thrombin I 7.7235 Peptide derivative Thermolysin I 7.29 36 Cyclic-aza isostere HIV protease I 10.15 36 Benzodiazepines Integrin L 8.55 36 Cyclic urea HIV protease I 8.37 37 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 11.40 37 Cyclic-aza isostere HIV protease I 9.31 37 Benzodiazepines Integrin L 8.80 38 Hydroxypyrone HIV protease I 10.22 38 Cyclic urea HIV protease I 9.92 38 Benzodiazepines Integrin L 8.40 39 Cyclic sulfone HIV protease I 9.52 39 Benzodiazepines Integrin L 7.05 40 Cyclic-aza isostere HIV protease I 11.30

40 Hydroxy pyrone HIV protease I 11.16






41 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 12.00 41 Cyclic urea HIV protease I 9.48 41 Cyclic sulfone HIV protease I 9.22 42 Hydroxypyrone HIV protease I 11.10 42 Cyclic urea HIV protease I 9.85 43 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 13.96 43 Cyclic urea HIV protease I 9.4843 Cyclic sulfone HIV protease I 9.00 44 Cyclic urea HIV protease I 10.41 45 Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L 10.05 46 Cyclic urea HIV protease I 10.75 46 Cyclic urea HIV protease I 9.51 47 Zaragozic acid A Squalene synthase I 10.11 48 Cyclic urea HIV protease I 10.35 50 Cyclic urea HIV protease I 10.20 50 Hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 7.85 51 Zaragozic acid B Squalene synthase I 10.54 51 Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 8.0552 Cyclic urea HIV protease I 9.37 54 Cyclic urea HIV protease I 10.57 54 Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 7.23 55 Peptide-based Thrombin receptor L 7.40 56 Cyclic urea HIV protease I 10.37 56 Peptide-based Thrombin receptor L 7.92 58 Cyclic urea HIV protease I 10.96 60 Cyclic urea HIV protease I 10.80 62 Cyclic urea HIV protease I 10.62 64 Cyclic urea HIV protease I 10.07 64 Acetyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I 8.00 67 Peptide-based Thrombin receptor L 8.10 68 Stearyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I 8.89

# Atome Ligand Target Typ log K1





Bindungsaffinität

Metallionen oder Metalloenzyme

kleine Anionen

natürliche LigandenEnzyminhibitoren

linearer Anstieg der freien

Bindungsenthalpie zu Beginn

bis ca. 15 Nicht-H-Atome

Gbinding = - 60 kJ mol-1 maximal.

Dann wird Sättigung beobachtet.




Interpretation

Metallionen und Anionen binden

am stärksten.

Nanomolekulare Liganden können

bereits mit 7-10 Atomen erreicht werden.

Grössere Liganden

- besitzen üblicherweise nur eine

kleine Zahl polarer Atome pro Molekül

- die elektrostatischen Gruppen der

Bindungsstelle werden zunehmend

im Inneren begraben

- sind oft elektrisch neutral

- besitzen mehr entropische

Freiheitsgrade


-G pro Atom



Wie kann man die Bindungsaffinität verbessern?

Es gibt 2 Strategien zum Design von stark bindenden Inhibitoren:

(a) kombinatorische Strategien

(b) rationale Strategien.

Beide Strategien erlauben es in der Praxis

effizient Lead-Moleküle mit geringer Affinität zu finden;

beide sind ineffizient und unzuverlässig, Liganden mit hoher Affinität zu finden (nM).

Anwendung der kombinierten Strategie CombiSMoG um Ligand für menschliche

Carbonic Anhydrase II (HCA) zu finden.

Resultat: Es wurde der stärkste bisher bekannte Ligand für HCA gefunden

( Kd = 30 pM).

Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)



CombiSMoG

Analyse von 1000 Protein-Liganden Komplexe in PDB

entwickle statistisches Potential zwischen Atomen des Liganden und des

Proteins

Kontakt ja, wenn Distanz < 5 Å

Vorteile gegenüber Molekülmechanik-Kraftfeldern:

(1) sehr schnell auszuwerten

(2) Potentialwerte beinhalten implizit die Entropie für Wasserdesolvatation,

entsprechen freien Bindungsenthalpien

(3) Potential ist typisch für Protein-Liganden-Wechselwirkungen

Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)



CombiSMoG-Algorithmus

Dunkelgrünes Fragment wird in

Bindungstasche positioniert.

Weiteres Fragment aus einer Bibliothek

mit 100 organischen Substanzen (blau)

wird angefügt. Winkel wird in 60° Schritten

optimiert.

Fragment wird akzeptiert, wenn neuer

Gesamt-Score besser als der alte ist

bzw. entsprechend einer Monte-Carlo-

Zufallsentscheidung.

Die Suche nach weiteren Fragmenten

wird fortgesetzt bis Abbruchbedinung

erreicht wird (z.B. maximale Anzahl

an Nicht-H-Atomen erreicht, z.B. 30).

Methode kann 50.000 Strukturen

pro Tag generieren.



Strukturen der 5 Liganden mit

den besten Scores.

In Klammer die Bewertung nach

Optimierung mit dem CHARMM-

Kraftfeld.

Die lila und hellblauen Moleküle

wurden synthetisiert und ihre

Kristallstruktur mit HCA

bestimmt.

kombinatorisches Liganden-Design

Geeignetes Startfragment

mit KD = 120 nM um WW

mit Zink-Ion zu vermeiden.

(H2NO2S-Gruppe hat

Kontakt mit Zn2+).



Spektakulärer Erfolg für theoretisches Liganden-Design

Vorhergesagte Orientierung

der R- und S-Stereoisomere

In gelb ist jeweils die

Kristallstruktur gezeigt.

Oben und unten in B sind

zwei verschiedene

Ansichten gezeigt.



Korrelation von CombiSMoG Scores mit exp. Daten

Korrelation für Inhibitoren von HCA, 80 Liganden für für die Kristallstrukturen vorliegen asp: Aspartic Protease

met: Metalloproteinemisc:ser: Serin-Proteasensug: Zucker-bindende Proteine



Welche Aminosäuren bestimmen Substratspezifität?

Phosphorylierung ist zentraler Bestandteil vieler Signaltransduktionsketten.

Proteinkinasen katalysieren Phosphoryltransfer.

- ca. 2% von eukaryotischen Genomen kodieren für Proteinkinasen.

- Im Mensch gibt es wohl 518 verschiedene Proteinkinasen.

Wie kann hohe Substratspezifität erreicht werden?

(a) Lokalisation in unterschiedlichen Zellkompartments,

(b) selektive Aktivierung durch Kofaktoren (z.B. CDK)

(c) Spezifität des aktiven Zentrums bzw. von Substratbindungspositionen für

Bindung bestimmter Liganden

Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)



prokaryotisches Zweikomponentensystem

rot und cyan: 2 katalytische

Proteinkinase-Untereinheiten

Dimerisierung via Helices

PO4 –Gruppe wird zunächst von

ATP auf konserviertes His in

Dimerisierungs-Domäne übertragen

blau und magenta: Regulatorprotein.

Transfer der PO4 –Gruppe auf

Asp




Spezifizität bestimmende Residuen

MSA : Gruppierung nach Proteinfamilien HK1, HK2, HK3, die jeweils die

gleichen Substrate besitzen.

Welche Residuen machen die Unterschiede aus?

Das konservierte Arg (lila) ist keine spezifitätbestimmende Residue,

die roten und blauen Spalten sind dagegen gute Kandidaten.




Eukaryotische Proteinkinase

gelbes Substratpeptid

liegt zwischen den

beiden Domänen (rot

und blau) der Protein-

kinase.

In (b) – (d) sind

die möglichen

spezifitätsbestimmenden

Residuen als

raumfüllende

Modelle gezeigt.


Phospho-Thr197



Numerische Analyse

Definiere


20

1 1

,log,

x

Y

y i

iii yPxP

yxPyxPI

i Position im Alignmentx Aminosäuretypy Nummer der Familie in

einem Alignment

Pi(x,y) ist Wahrscheinlichkeit,

Aminosäure vom Typ x an Position i in

der Familie y zu finden.

Pi(x) ist die gleiche W’kt, wobei der Typ der

Famile egal ist

P(y) ist der Anteil aller Proteine, der zu

Familie y gehört.

I

Ii



Wie gelangen Liganden zum bzw. ins Protein?



Elektrostatische Ausrichtung

Manche Proteine müssen

Liganden mit starker Netto-

ladung bzw. Dipolmoment

anziehen.

Sie erzeugen (durch geladene

Aminosäuren auf ihrer Ober-

fläche) ein starkes anziehendes

elektrostatisches Potential.

Dann wird die kinetische

Zeitkonstante kon sehr schnell

und das Enzym arbeitet oft

am diffusions-limitierten

Optimum.



Electrostatic Steering

Wade et al. PNAS 95, 5942 (1998)

TIM Superoxid Dismutase beta-Lactamase

el. PotentialIsopotential-flächen

Ähnlichkeit des elektrostatischen Potentials bei verschiedenenMitgliedern derProteinfamilie

bei hinreichender Sequenzidentität ist daserzeugte elektrostatische Potential oft sehr ähnlich.



Transport zwischen 2 Bindungstaschen

Multiproteinkomplexe ermöglichen “substrate channeling” zwischen

mehreren aktiven Zentren. Ligand diffundiert auf Proteinoberfläche.

Dieser Transportmechanismus

ist besonders effizient, da

ungerichtete, freie Diffusion

vermieden wird.



Wie gelangen Liganden ins Proteininnere bzw. wieder heraus?

Die Bindung von Liganden im Proteininneren hat die Effekte,

- eine Umgebung mit unterschiedlicher (kleinerer) Dielektrizitätskonstante

zu schaffen, in der die Elektrostatik eine grössere Rolle spielt,

- den Liganden in ein polarisiertes Umfeld zu bringen, das den Übergangs-

zustand einer chemischen Reaktion stabilisiert (A. Warshel)

- die Reaktion von eventuell störenden Wassermolekülen zu separieren, die zu

chemischen Nebenreaktionen führen könnten.

Deshalb erfordern manche Proteine (Tryptophan Synthase,

Acetylcholinesterase, Cytochrom P450), dass die Liganden durch transient

offene Kanäle ins Proteininnere transportiert werden.

Zur Betrachtung der Ligandenaffinität gehört demnach auch die Analyse der

Pfade ins bzw. aus dem Protein heraus.



AchE: Konformationelle Kontrolle des Eintrittskanals



AchE: Konformationelle Kontrolle des Eintrittskanals

dynamische Kontrolle der

Grösse des Eintrittskanals

in Acetylcholinesterase

durch zwei aromatische

Residuen (lila)



Cytochrom P450: mögliche Austrittspfade der LigandenCytochrom P450cam BM-3 eryF

Substrat Kampher: negativ geladene 6-deoxyerythronolide Bkompakt, hydrophob Fettsäuren

Moleküldynamiksimulationen wurden von gebundenem Zustand gestartet,

zufällige „Kicks“ wirken auf den Liganden, damit der Austritt aus dem Protein

beschleunigt wird.

Winn et al. PNAS 99, 5361 (2002)



Cytochrom P450: mögliche Austrittspfade der Liganden

Kristallstrukturen

Konformation nach Ligandenaustritt (Simulation)

Ligandenaustritt erfordert grössere transiente dynamische Kontrollekleine Änderungen des Änderungen des der Kanalöffnung Rückgrats, Rotation von Proteinrückgrats durch Arg185aromatischen Seitenketten

Mechanismus der Protein-Öffnung ist an physikochemische Eigenschaften desjeweiligen Substrats angepasst.

Winn et al. PNAS 99, 5361 (2002)



Zusammenfassung

Die Protein:Liganden Wechselwirkung ist heutzutage relativ gut verstanden.

Wir haben Tools kennengelernt, mit denen man

- die Position des aktiven Zentrums lokalisieren kann

- Bindungsaffinitäten abschätzen bzw. verbessern kann

- die Assoziation bzw. Dissoziation des Liganden simulieren kann.

Für die Zukunft bleibt:

(1) korrelierte Analysen aus der umgekehrten Richtung: finde einen Liganden,

der selektiv an ein bestimmtes Protein bindet, jedoch nicht an andere

(2) Automatisierung + Verknüpfung der obigen Schritte

(3) Einbeziehung zusätzlicher Gesichtspunkte (ADMET)

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