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Modificaciones de la cromatina, regulacin gnica y cncer

MARA DOLORES DELGADO VILLAR

RESUMEN

El DNA est empaquetado en la clula enrollado en un octmero de his-tonas formando la cromatina. La cromatina y sus modificaciones se consi-deran hoy da aspectos crticos de la regulacin de la expresin gnica. Lasmodificaciones que afectan a cmo el material gentico se empaqueta y uti-liza, sin cambiar la informacin gentica, se denominan modificaciones epi-genticas. Las ms importantes son: i) las modificaciones postraduccionalesde las histonas como acetilacin, metilacin y otras que afectan tanto a laestructura global de la cromatina como a la activacin o represin gnica,ii) el remodelado de la cromatina por factores dependientes de ATP, que cam-bian la estructura, composicin y posicin de los nucleosomas y iii) la me-tilacin del DNA en el dinucletido CpG como mecanismo silenciador de latranscripcin. El regulador transcripcional CTCF es un importante organi-zador de la cromatina y regulador epigentico de genes implicados en cn-cer. Las alteraciones en la informacin epigentica dan lugar a desregula-cin de la expresin, resultando en el desarrollo del cncer. Las clulascancerosas presentan hipometilacin global del DNA, hipermetilacin de is-las CpG de promotores y patrones alterados de modificacin de histonas. Es-tas alteraciones principalmente resultan en el silenciamiento de genes im-portantes para la regulacin de la proliferacin celular normal. Adems,numerosos genes que codifican protenas modificadoras de la cromatina sehan encontrado alterados en diversos tumores. La terapia con frmacos mo-dificadores de la cromatina tiene un enorme potencial en el tratamiento delcncer.

SUMMARY

DNA is packaged within the cell wrapped around an octamer of histones forming the chromatin. Chromatin modifications are considered nowadays criti-cal aspects of gene expression regulation. Modifications which affect at how thegenetic material is packaged and used without change the genetic information areknown as epigenetic modifications. The most important are: i) histones pos-translational modifications including acetylation, methylation and others, whichaffect both the global structure of the chromatin and the gene activation or re-pression, ii) chromatin remodelling by ATP dependent factors which change thestructure, composition and position of nucleosomes, and iii) DNA methylation inCpG dinucleotides as a mechanism for silencing transcription. The transcriptio-nal regulator CTCF is an important chromatin organizer and an epigenetic regu-lator of genes involved in cancer. Alterations in the epigenetic information giverise to expression deregulation leading to tumor development. Cancer cells arecharacterized by global DNA hypomethylation, hypermethylated CpG islands inpromoters and aberrant patterns of histone modifications. These alterationsmainly result in the silencing of genes important for the regulation of normal cellproliferation. Furthermore, several genes which codify chromatin modifying pro-teins have been found altered in different tumors. Treatments with drugs that mo-dify the chromatin have enormous potential for cancer therapy.

INTRODUCCIN

La regulacin de la expresin gnica constituye un proceso esencial en elmantenimiento de las diferencias estructurales y funcionales de las clulas. Eldesarrollo y mantenimiento de la especializacin celular es producto de un so-fisticado control gnico cuyos mecanismos se estn empezando a conocer y cuyacomprensin ser fundamental para el esclarecimiento de la base molecular denumerosas enfermedades. El empaquetamiento del DNA en la cromatina y susmodificaciones se consideran hoy da aspectos fundamentales de la regulacinde la expresin gnica. El trmino epigentica se define como cambios hereda-bles en la expresin gnica que no son debidos a alteraciones en la secuenciadel DNA. Los mecanismos epigenticos incluyen las modificaciones de las his-tonas, el remodelado de la cromatina y la metilacin del DNA y son importan-tes para el establecimiento de patrones correctos de expresin gnica. Las alte-raciones en la informacin epigentica dan lugar a desregulacin de la expresin,resultando en el desarrollo de diversas patologas, entre ellas el cncer. En este


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artculo se recogen las ltimas investigaciones sobre las modificaciones de lacromatina, su papel en la regulacin de la expresin gnica y las alteracionesepigenticas en cncer.

TRANSCRIPCIN GNICA Y ESTRUCTURA DE LA CROMATINA.EL NUCLEOSOMA

El punto de control de expresin gnica mejor conocido y ms importanteen eucariotas es el inicio de la transcripcin. Los mecanismos de control a ni-vel de transcripcin determinan si un gen particular ser transcrito y con qufrecuencia. La regulacin en esta primera etapa se consigue gracias a las accio-nes combinadas de factores de transcripcin que se unen a elementos regulado-res cercanos al sitio de iniciacin de la transcripcin. Los mecanismos de trans-cripcin del DNA desnudo son muy similares entre organismos eucariotas yprocariotas [revisado en (1, 2) y en otro captulo de este libro]. El inicio de latranscripcin de un gen comienza con la unin de factores de transcripcin ac-tivadores a secuencias reguladoras especficas situadas 5 del sitio de iniciacinde la transcripcin. Esto da lugar a la unin de protenas adaptadoras como Me-diator, que facilitan la unin de los factores generales de la transcripcin. LaRNA polimerasa II se sita en el promotor, junto con diversos factores genera-les (TFIID, TFIIA, TFIIB) formando el complejo de preiniciacin. El dominiocarboxi-terminal de la RNA polimerasa II es fosforilado por TFIIH y comienzala transcripcin y la subsiguiente elongacin y procesamiento del mRNA.

Sin embargo, el DNA no est desnudo en el ncleo, sino fuertemente em-paquetado formando la cromatina. Tanto la compactacin del DNA (unos 2 m deDNA en un ncleo de 10 m de dimetro) como el control de la transcripcin enlos eucariotas se consigue mediante la formacin de complejos del DNA con pro-tenas especficas, las histonas, para dar lugar a la cromatina. Esta compactacines el resultado de la superposicin de diversos niveles de plegamiento altamenteorganizados y afecta a todas las etapas de la transcripcin, desde la unin de losactivadores, formacin del complejo de preiniciacin, a la elongacin (1).

El nucleosoma constituye la unidad estructural de la cromatina. Fue des-crito por Roger Kornberg en 1974 [revisado en (3)] y est compuesto por unoctmero de cuatro histonas (H3, H4, H2A, H2B), protenas muy bsicas alre-dedor de las cuales se enrollan 147 pares de bases de DNA dando 1,65 vueltas(Figura 1A). Las histonas se estructuran en dos dominios: una regin centralplegada, que interacciona con el DNA, formada por una hlice- larga, flan-

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MODIFICACIONES DE LA CROMATINA, REGULACIN GNICA Y CNCER


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queada por dos hlices- cortas, y un dominio N-terminal poco estructurado, de15 a 30 residuos, denominado colas de histonas. El dominio N-terminal esflexible y sale fuera del ncleo central o core del nucleosoma (Figura 1A).Las colas de las histonas sufren diversas modificaciones postraduccionales (Fi-gura 1B) que afectan a la estructura de la cromatina y a su funcin.

Adems de las histonas cannicas, que son los componentes universales de losnucleosomas, existen formas variantes de histonas implicadas en regulacin de latranscripcin (1, 4-6). A diferencia de las cannicas, las variantes de histonas seexpresan fuera de la fase S del ciclo celular y se incorporan a la cromatina de for-ma independiente a la replicacin del DNA, para responder a distintas situacionesde la clula. Algunas de las variantes de histonas son: la H2A.Z que marca los ex-tremos 5 de los genes en la eucromatina (7, 8). Est localizada en los lmites dela heterocromatina, flanqueando la heterocromatina silente impidiendo que sta se

FIGURA 1. Modificaciones postraduccionales de las histonas. (A) Esquema de un nucleosoma, launidad estructural de la cromatina, compuesto por un octmero de histonas core alrededor delcual se enrolla el DNA. Se muestran los dominios desestructurados N-terminal o colas de lashistonas. (B) Las principales modificaciones postraduccionales de las colas de las histonas sonacetilacin (ac), metilacin (me) y fosforilacin (ph), en resduos especficos de lisina (K), arginina

(R) y serina (S) [figura modificada de (10)].

extienda (ver ms adelante). La variante H2AX est implicada en respuesta a daoal DNA. Contiene un residuo C-teminal conservado que se fosforila tras dao ge-notxico y tiene un papel represor de la transcripcin (1).

La estructura y modificaciones de la cromatina representan un nivel adicionalde regulacin para todos los procesos metablicos del DNA incluidos transcripcin,recombinacin, reparacin del DNA, replicacin, formacin del centrmero, etc. ac-tuando como una plataforma donde se integran las seales biolgicas y tienen lugarlas respuestas moleculares (1, 9, 10). La clula ha desarrollado diversos mecanis-mos para modificar de forma temporal/espacial la organizacin de la cromatina. Lasmodificaciones que afectan a cmo el material gentico es empaquetado y utiliza-do, sin que cambie la secuencia del DNA, se denominan modificaciones epigenti-cas. El epigenoma se refiere a la descripcin completa de estos cambios heredablesa lo largo del genoma (11). Las modificaciones epigenticas ms importantes, quese irn detallando a lo largo de este captulo, son: i) Modificaciones postraduccio-nales de las histonas que facilitan o impiden la asociacin de protenas reguladorasy factores del transcripcin con el DNA (1, 10, 12-14), ii) Remodelado de la cro-matina por factores dependientes de ATP, que desplazan o desestabilizan los nucle-osomas, exponiendo u ocultando el DNA a las interacciones con factores de trans-cripcin (15), iii) Metilacin del DNA en la posicin C-5 de residuos de citosinapresentes en el dinucletido CpG por las DNA metil-transferasas. La metilacin delDNA de las clulas eucariotas acta como silenciador de la transcripcin. Existe portanto una estrecha correlacin entre metilacin e inactivacin transcripcional.

MODIFICACIONES DE LA CROMATINA Y REGULACIN GNICA

Modificaciones postraduccionales de histonas

Se han encontrado al menos ocho tipos de modificaciones postraduccionalesen las histonas (tabla 1). Las ms conocidas son acetilacin, metilacin y fosfo-rilacin (Figura 1B). La metilacin puede ser mono-, di- o tri-metil lisina, o mono-di-metil arginina (16). Esta gran variedad de modificaciones, y la combinacin en-tre ellas, proporciona un enorme potencial de respuestas funcionales. Lasmodificaciones en histonas son dinmicas y cambian rpidamente en respuesta aestmulos celulares. Se han identificado las enzimas responsables de estas modi-ficaciones (algunos ejemplos se muestran en la tabla 1), as como muchos de losenzimas que eliminan las modificaciones. Con la excepcin de la metilacin, lasmodificaciones de las histonas resultan en un cambio en la carga neta de los nu-cleosomas, lo que afecta a las interacciones DNA-histona (1).

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TABLA 1. Modificaciones postraduccionales de histonas. Tipos de modificaciones, residuos deaminocidos que se modifican, funciones reguladas y ejemplos de enzimas implicadas en lamodificacin (1, 12) [una lista ms detallada de las enzimas y la nueva nomenclatura apareceen (17)]. ac, acetilacin; me, metilacin; ph, fosforilacin; ub, ubiquitilacin; su, sumoilacin;

ar, ADP-ribosilacin.

Modificaciones Residuos modificados Funcin Enzimas

Acetilacin K-ac Transcripcin (activacin), Lisina acetil transferasas (KATs) ej. reparacin, replicacin PCAF, CBP, p300, TIP60

Metilacin (lisinas) K-me1, K-me2, K-me3 Transcripcin (activacin o Lisina metil transferasas (KMTs) ej. represin), reparacin MLL1, SET1

Metilacin (argininas) R-me1, R-me2 Transcripcin (activacin o Arginina metil transferasas ej. PRMT, represin) CARM1

Fosforilacin S-ph, T-ph Transcripcin (activacin), Serin/treonin quinasas ej. MSK1,reparacin, condensacin Mst1, CKII

Ubiquitilacin K-ub Transcripcin (activacin o represin) Ubiquitilasas ej. UbcH6

Sumoilacin K-su Transcripcin (represin)ADP-ribosilacin E-ar Transcripcin (?) PARPs (poli ADP Ribosa Polimerasas)Deiminacin (arginina>citrulina) R>Cit Transcripcin (represin) PAD14

Isomerizacin de prolina P-cis>P-trans Transcripcin (represin) Prolil-isomerasas

Las modificaciones de las histonas funcionan mediante dos mecanismos: in-terfieren en los contactos entre nucleosomas, por ejemplo para abrir la cromati-na en el caso de la acetilacin, o interaccionan con protenas o complejos protei-cos efectores o transductores. Estos se unen va dominios especficos, como losbromo-dominios que reconocen residuos acetilados o los cromo-dominios que re-conocen residuos metilados (Figura 2A) (12, 14). Las distintas modificaciones dehistonas actan de forma combinada para formar el denominado cdigo de lashistonas, que es ledo por protenas que contienen dichos dominios especficos deinteraccin (10, 14, 18, 19). Estas protenas son los efectores que inician respues-tas biolgicas como activacin o represin de la transcripcin, condensacin cro-mosmica, etc. El cmo este cdigo se establece, se lee y se hereda es objeto deintensa investigacin y existen excelentes revisiones sobre el cdigo de las histo-nas (6, 10, 12, 16). Las consecuencias funcionales de las modificaciones de histo-nas se pueden dividir, en dos categoras: el establecimiento del estado global de la


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cromatina y la regulacin de procesos especficos como transcripcin, reparacino replicacin del DNA. A continuacin se describen algunos de estos efectos.

Modificaciones de las histonas y estados de la cromatina

En funcin del grado de condensacin la cromatina puede dividirse en: he-terocromatina, regiones de la cromatina muy densamente empaquetadas siem-pre inactivas, que no se expresan, y eucromatina, regiones relativamente dis-persas poco condensadas que ocupan la mayor parte del ncleo.

La heterocromatina, abundante en telmeros y centrmeros, es importantepara la proteccin de los extremos de los cromosomas y la separacin de las cro-mtidas en mitosis. La heterocromatina tiende a ser rica en secuencias repetitivas,con bajo contenido en genes y transcripcionalmente silente. El estado de hetero-cromatina silente se asocia con niveles bajos de acetilacin y niveles elevados demetilacin en algunos residuos de las histonas como H3K9, H3K27 y H4K20 (12).La metilacin de la histona H3 en la lisina 9 (H3K9) est implicada en el silen-ciamiento de la heterocromatina (16). La represin implica la unin al promotor

FIGURA 2. Interaccin de protenas con histonas modificadas y efectos en la transcripcin. (A)Dominios utilizados por protenas efectoras para reconocer histonas metiladas, acetiladas ofosforiladas. (B) Resumen de los efectos que produce la metilacin o acetilacin de la histona

H3 sobre la activacin o represin de la expresin gnica.


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de los genes reprimidos de HP1, protena con un cromo-dominio que reconoce re-siduos H3K9 metilados (Figura 3A). El silenciamiento de la heterocromatina sepropaga por la accin de histona-metil-transferasas que metilan nuevos residuosde H3K9 con la subsiguiente unin de ms molculas de HP1 (16).

En las regiones de eucromatina el DNA presenta mayor flexibilidad funcio-nal: los genes pueden ser activados o permanecer inactivos y el DNA puede ser

FIGURA 3. CTCF es un factor multifuncional regulador de la cromatina. (A) CTCF se une asecuencias del DNA denominadas insulators (Ins) y acta como barrera impidiendo que laheterocromatina se extienda hacia la eucromatina. Se muestran marcas de metilacin deheterocromatina silente (histona H3 en la lisina 9, H3K9) que atraen a complejos corepresores(HP1 e histona deacetilasas HDAC) para reprimir la expresin gnica. Algunas marcas deeucromatina activa son acetilacin de histonas H3 y H4 y metilacin de la histona H3 en la lisina4 (H3K4). (B) CTCF regula la impronta gnica del locus IGF2/H19. En el alelo materno CTCFse une al DNA no metilado del ICR (Imprinting Control Region) impidiendo la expresin de IGF2.Este solo se expresa a partir del alelo paterno, cuyo ICR est metilado y CTCF no se puede unir,permitiendo la activacin de IGF2 por los enhancers. En ciertos tumores se produce prdida de

impronta gnica (LOI, Lost of Genomic Imprinting) de este locus.

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desempaquetado para la replicacin o la reparacin. En general, los genes trans-cripcionalmente inactivos presentan bajos niveles de acetilacin, metilacin y fos-forilacin, mientras que la eucromatina transcripcionalmente activa tiene niveleselevados de acetilacin. La acetilacin de las histonas H3 y H4 y la di- o tri-me-tilacin de H3K4 y la presencia de la variante de histona H2AZ son modifica-ciones tpicas de eucromatina (1, 7). Algunas de estas modificaciones alteran di-rectamente la estructura de alto orden de la cromatina. Por ejemplo, la acetilacinde H4K16 inhibe la formacin de fibras compactas de 30 nm (20, 21).

En mamferos, la demarcacin entre estos diferentes estados de la cromati-na viene delimitada por elementos barrera (22). El regulador transcripcionalCTCF, cuyas funciones se detallarn ms adelante, se une a elementos aislantesdel DNA o insulators e impide que la heterocromatina se extienda hacia regio-nes de eucromatina (Figura 3A) [revisado en (23, 24)].

Modificaciones de histonas y transcripcin gnica

El empaquetamiento del genoma eucaritico en la cromatina tiene gran influen-cia en la transcripcin gnica. La regulacin de la expresin gnica requiere de fac-tores de transcripcin que, una vez unidos a las secuencias reguladoras de los genes,inicien una cascada de modificaciones que resulten en la expresin o silenciamientodel gen. Algunas modificaciones de la cromatina a nivel local se han asociado a ac-tivacin y otras a represin gnica (Figura 2B), sin embargo los efectos parecen de-pender del contexto (12). La mayora de las modificaciones se distribuyen de formaespecfica en la regin reguladora 5 del gen, el promotor proximal, el extremo 5 delORF (Open Reading Frame) y el extremo 3 del ORF (Figura 4) (1, 25).

La localizacin de una modificacin est altamente regulada y es crucial parasus efectos en la transcripcin. Algunas de las modificaciones ms conocidas son:

Acetilacin y deacetilacin de las histonas. Se han identificado y caracterizadoprotenas con actividad lisina acetil transferasas, con un importante papel en la re-gulacin gnica (26). Las histonas son ricas en lisinas y son dianas de acetilacin (Fi-gura 1B) (10). Las colas de las histonas son acetiladas en el grupo epsilon-amino delos residuos de lisina. La acetilacin tiene un efecto activador de la transcripcin yaque reduce fuertemente la afinidad de las histonas por el DNA, al neutralizar la car-ga positiva de las lisinas. As, los nucleosomas se empaquetan menos eficientemen-te, permitiendo que DNA sea ms accesible a protenas reguladoras. Adems, las mar-cas de acetilacin de lisinas pueden ser interpretadas va protenas efectoras conbromo-dominios (Figura 2A). Los bromo-dominios son mdulos proteicos frecuen-


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temente encontradas en protenas asociadas a cromatina, especialmente en histonaacetil-transferasas (HAT) (14). La acetilacin de histonas tiene lugar en mltiples re-siduos de lisina y es llevada a cabo por varias HATs. La mayora de las HATs for-man parte de grandes complejos multiproteicos (27) y se agrupan en distintas fami-lias como GNAT, MYST, CBP/p300, etc. [ver la lista completa de las familias dehistona acetil-transferasas y sus sustratos en (10, 17)]. Los miembros de la familiaGcn5/PCAF (GNAT) funcionan como coactivadores de distintos activadores de latranscripcin. Contienen un dominio acetil-transferasa y un bromo-dominio, por elque se unen a los residuos de acetil-lisinas. Este fue el primer dominio de unin ahistonas caracterizado estructuralmente [revisado en (14)]. La familia p300/CBP tam-

FIGURA 4. Distribucin de modificaciones de histonas y tasa de transcripcin. Patrones dedistribucin de las distintas modificaciones de histonas a lo largo de un gen arbitrario donde semuestra la regin reguladora 5, el ORF y el extremo 3 final. Las curvas representan los patronesque han sido determinados a partir de estudios globales del genoma. Figura tomada de (1).

bin ha sido extensamente estudiada. Los miembros de esta familia son reguladoresms globales de la transcripcin. Contienen un gran dominio HAT, un bromo-domi-nio y otras regiones que median interacciones protena-protena. Varios miembros deesta familia se han visto alterados por translocaciones cromosmicas en diversos pro-cesos malignos (ver ms adelante, tabla 3).

La deacetilacin de histonas se correlaciona con compactacin de la cromatinay represin transcripcional. Hay varias familias de histonas deacetilasas (HDAC):clase I (HDAC 1, 2, 3 y 8), clase II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9 y 10), clase IV (HDAC11) y la clase III NAD-dependiente de la familia SIRT (sir-tuinas) (10, 28, 29). LasHDAC de clase I, las histona-deacetilasas ms conocidas, son ubicuas y presentanlocalizacin nuclear. Tienen una elevada homologa estructural y contienen zinc enel sitio activo, esencial para su actividad. Estn presentes en numerosos complejosde represin junto con co-represores como NcoR, SMRT, MEF, MeCP2, Sin3A, etc.que son atrados a regiones especficas de la cromatina para reprimir la expresingnica. Los niveles relativos de acetilacin de histonas estarn determinados por lasactividades enzimticas contrapuestas HAT y HDAC y el equilibrio controlado deambas actividades es esencial para la proliferacin celular normal.

Metilacin de histonas. Las modificaciones postraduccionales por metila-cin en el nitrgeno en las cadenas laterales de lisinas y argininas de las prote-nas son muy estables. En contraste con la acetilacin, la metilacin suele estarcatalizada por enzimas especficos para residuos especficos de las histonas (30).Se han identificado algunas de las enzimas responsables de la metilacin de lashistonas. Estas se agrupan en varias clases: a) histona metil-transferasas espec-ficas de lisina conteniendo el dominio SET. Son las responsables de las metila-ciones en las histonas H3 (residuos K4, K9, K27, K36) y H4 (K20); b) lisinametil-transferasas sin dominio SET, que metilan a H3K79 y c) arginina metil-transferasas que metilan distintos residuos de arginina en las histonas H3 y H4(16) [para una relacin completa y la nueva nomenclatura, ver (10, 17)].

La metilacin en residuos de lisina tiene lugar por enzimas con actividad lisina-histona-metil-transferasa (KHMTasa) (16) principalmente en las histonas H3 y H4.Las lisinas pueden aceptar uno, dos o tres grupos metilo y los diferentes estados demetilacin de un residuo dado darn lugar a respuestas diferentes. La metilacin dehistonas puede tener un efecto activador o represor de la expresin (resumido en laFigura 2B). Hay tres sitios implicados en activacin: H3K4, H3K36 y H3K79. Lametilacin de H3K4 crea un sitio de unin de protenas con cromo-dominios que, asu vez, atraen a acetil-transferasas para activar la transcripcin (31). Adems la H3K4metilada media la asociacin de complejos remodeladores de la cromatina que pro-ducen cambios en los nucleosomas para la activacin de la transcripcin (32). Igual-

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mente, la metilacin en H3K36 y H3K79 se correlacionan con activacin transcrip-cional (10). Recientemente se han predicho e identificado regiones promotoras (mar-cadas por la trimetilacin de H3K4) e intensificadoras en base estudios de alta reso-lucin de los estados de modificacin de la cromatina (33). Por otra parte, lametilacin de tres residuos de histona: H3K9, H3K27 y H4K20 se ha relacionadoscon represin transcripcional (12). La metilacin en H3K9 (principalmente trimeti-lacin) est implicada en el silenciamiento de la heterocromatina, como se mencio-n anteriormente. La metilacin en H3K27 se ha encontrado en el silenciamiento dela expresin de genes HOX, en la inactivacin del cromosoma X y durante el im-printing genmico (12). Un estudio de alta resolucin del genoma completo correla-ciona la metilacin de histonas H3 y H4, los sitios de unin de CTCF y la presen-cia de la variante de histonas H2AZ con los perfiles de expresin gnica (34).

Remodelado de la cromatina

Los complejos de remodelado de la cromatina son complejos multiprotei-cos que requieren de la hidrlisis del ATP para alterar los contactos histona-DNA (15). Los mecanismos del remodelado incluyen el desenrollamiento tran-sitorio del DNA del octmero de histonas, la formacin de lazos de DNA, o eldeslizamiento de los nucleosomas a diferentes posiciones. Como consecuenciase produce un cambio en la accesibilidad del DNA nucleosomal a los factoresde transcripcin. Existen al menos cinco familias de complejos de remodeladode la cromatina, con diversas funciones biolgicas (15, 35). Las mas estudiadasson las familias SWI/SNF y ISW1, con un papel en cncer (36-38).

Metilacin del DNA

La metilacin del DNA est catalizada por distintas familias de DNA metil-transferasas (DNMTs) formando 5-metil-citosina [revisado en (39, 40)]. Durantela fase S, las DNMTs copian el patrn de metilacin de la hebra parental a la he-bra hija del DNA, de forma que la metilacin se hereda tras la divisin celular(41). En el genoma de mamferos esta modificacin tiene lugar en resduos de ci-tosina que preceden a guaninas, es decir, en dinucletidos CpG. La mayor partedel genoma no contiene el dinucletido CpG, sin embargo ste se concentra enlas denominadas islas CpG situadas en las regiones reguladoras 5 de los ge-nes. Se estima que alrededor del 90% de las islas CpG se encuentran no-metila-das en clulas somticas normales (42) (Figura 5A). La metilacin del DNA es


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un mecanismo normal de silenciamiento gnico con un papel en la represin trans-cripcional de regiones repetidas y centromricas, y durante el desarrollo.

Existe una relacin funcional entre metilacin del DNA y modificaciones delas histonas, ya que hay protenas de unin al DNA metilado (Methyl-CpG-bindingdomain proteins, MBD) que atraen a complejos histona deacetilasa e histona metil-transferasas hacia la cromatina (40). La familia de protenas MBD consta de cincomiembros (MeCP2, MBD 1, MBD 2, MBD 3 y MBD 4) y estn asociadas a re-giones silenciadas por hipermetilacin del DNA (43). Estas regiones suelen estarhipo-acetiladas e hiper-metiladas en resduos especficos de histonas como H3K9 yH3K27 mientras que los promotores de genes activos, no metilados, presentan hi-peracetilacin de H3 y H4 y metilacin de H3K4 (33, 41). La metilacin del DNAy las modificaciones de histonas estn tambin relacionadas con el remodelado dela cromatina. Las islas CpG no metiladas de los promotores son hipersensibles aDNAsas y estn relativamente libres de nucleosomas, mientras que las metiladascontienen nucleosomas y son resistentes a las nucleasas (41) (Figura 5).

La metilacin del DNA es tambin la base de la inactivacin del cromosomaX y de la impronta gnica, modificacin epigentica que permite que solo el ale-

FIGURA 5. Patrones de metilacin del DNA y de configuracin de la cromatina en clulasnormales y tumorales. (A) Los promotores de los genes supresores de tumores activos en clulasnormales presentan islas CpG no metiladas, marcas de acetilacin y metilacin de histonaspropias de cromatina activa y configuracin de cromatina descondensada relativamente libre denucleosomas. (B) Los genes supresores de tumores silenciados en cncer presentan promotorescon islas CpG hipermetiladas, marcas represivas de metilacin de histonas y elevado gado de

condensacin de la cromatina.

lo materno o paterno de un gen se exprese. En ambos procesos est implicado elregulador transcripcional CTCF anteriormente mencionado. CTCF regula la im-pronta gnica del locus IGF2/H19 mediante su unin a la regin ICR (ImprintingControl Region), no metilada en el alelo materno, impidiendo la expresin del genIGF2 (Insulin-like Growth Factor). CTCF no se une al alelo paterno, por estar hi-permetilada la regin ICR, e IGF2 se expresa (Figura 3B). CTCF es una prote-na con mltiples funciones como regulador transcripcional, organizador de la cro-matina y posible supresor tumoral (44, 45). En clulas de leucemia CTCF inhibeel crecimiento, induce diferenciacin eritroide (46) y regula la transcripcin ribo-somal (47) mediante su unin a genes ribosomales (Rosa M. et al, no publicado).CTCF aparece desregulado en algunos tumores y participa en la regulacin epi-gentica de genes implicados en cncer como el supresor de tumores RB (48).

MODIFICACIONES DE LA CROMATINA Y CNCER

La desregulacin de la expresin gnica es una de las caractersticas principalesde las clulas cancerosas. En estos ltimos aos se ha puesto de manifiesto que lasalteraciones epigenticas adquiridas, junto con las alteraciones genticas, participanen todas las etapas del desarrollo de un tumor. Las alteraciones epigenticas en cn-cer incluyen: i) hipometilacin global del DNA, ii) hipermetilacin de islas CpG depromotores y iii) patrones alterados de modificacin de histonas. Estas alteracionesprincipalmente resultan en el silenciamiento de genes reguladores clave para la pro-liferacin celular normal. Las modificaciones epigenticas y su posible aplicacin enel diagnstico y tratamiento del cncer son temas de investigacin muy activos yexisten excelente revisiones recientes sobre los mismos (10, 41, 49-54).

Metilacin del DNA y cncer

Las clulas cancerosas en general presentan un bajo contenido en 5-metilcitosinas. Esta hipometilacin tiene lugar principalmente en elementos repetiti-vos del DNA lo que puede dar lugar a inestabilidad genmica y a deleccioneso translocaciones cromosmicas (52, 55). Mediante estudios globales de meti-lacin del DNA y microarrays genmicos se han descrito grandes reas de DNAhipometilado en regiones pobres en genes en clulas transformadas (56). Du-rante el desarrollo de un tumor, el grado de hipometilacin del DNA va au-mentando segn la lesin progresa desde la proliferacin celular benigna al cn-cer invasivo (50). La prdida de impronta gnica (LOI, Lost Of GenomicImprinting) tambin est asociada a la hipometilacin del DNA en cncer.


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En paralelo a esta hipometilacin global, en las clulas tumorales se pro-duce la hipermetilacin de islas CpG, que normalmente no estn metiladas. Lahipermetilacin de los promotores de genes supresores de tumores es un meca-nismo muy frecuente de silenciamiento gnico en muchos tipos de cncer (Fi-gura 5B). Algunos ejemplos de supresores tumorales tpicos que son inactiva-dos por este mecanismo son el gen del retinoblastoma (RB), p16INK4a, MLH1, oBRCA1. La hipermetilacin de islas CpG de promotores afecta a genes impli-cados en diferentes procesos celulares: regulacin del ciclo celular, reparacindel DNA, metabolismo de carcingenos, interacciones clula-clula, apoptosis,etc, todos ellos implicados en el desarrollo tumoral (52, 57). Ver en la tabla 2una lista de genes inactivados por hipermetilacin, sus funciones y tipos de tu-mores donde aparecen.

TABLA 2. Algunos genes silenciados en cncer por hipermetilacin del promotor [ver un catlogo ms exahustivo en Esteller 2007 (51)].

Gen Funcin Tipo de cncer

MLH1 Reparacin del DNA Colon, estmago, endometrio

BRCA1 Reparacin del DNA, transcripcin Mama, ovario

p16INK4a Inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas (regulacin del ciclo celular) Mltiples tipos

p14ARF Inhibidor de MDM2 (regulacin de p53) Colon, estmago, rinp15INK4b Inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas

(regulacin del ciclo celular) LeucemiaGSTP1 Conjugacin al glutation Prstata, mama, rinp73 Homlogo de p53 Linfoma

ER / PR Receptores de estrgenos / de progesterona Mama

AR Receptor de andrgenos Prstata

RASSF1A Homlogo a efector de ras Diversos tipos

RB Inhibidor del ciclo celular Retinoblastoma, mltiples tipos

APC Inhibidor de beta-catenina Tracto digestivo

RIZ1 Histona metil-transferasa Mama, hgado, diversos tipos

DAPK Proapottica Linfoma, pulmn, colon

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CTCF regula la transcripcin de algunos de los genes cuyos promotores es-tn anormalmente hipermetilados en tumores, tales como p14, p16, BRCA1, oRB (44). En el caso de RB, se ha observado que la prdida de unin de CTCFa una isla CpG del promotor se correlaciona con la incorporacin de protenasde unin al DNA metilado y de componentes represores de la cromatina, indu-cindose su silenciamiento epigentico (58). Se ha propuesto que CTCF prote-ge de la hipermetilacin aberrante del promotor de RB y, posiblemente, de otrosgenes supresores tumorales (48).

Los distintos tipos de cncer presentan alteraciones epigenticas especfi-cas: inactivacin de genes supresores tumorales como BRCA1 en cncer demama o p15INK4b en leucemia, translocaciones cromosmicas que afectan a mo-dificadores de histonas como CBP o MLL1 en leucemia, prdida de improntagnica del gen IGF2 en cncer colorectal, etc (50). Se han definido perfiles es-pecficos de hipermetilacin de genes en distintos tumores o metilomas (51,57). Estas firmas de metilacin diferencial pueden servir para diferenciar entretumores del mismo tipo (11, 41). Los patrones de metilacin del DNA asocia-dos con el desarrollo y progresin de tumores tienen un uso potencial en clni-ca. Hay marcadores de DNA hipermetilado que se estn investigando como he-rramientas complementarias de diagnstico, como factores pronstico ypredictores de la respuesta al tratamiento (50). As, la detecin de islas CpG hi-permetiladas en fluidos biolgicos y suero se pueden utilizar para el diagnsti-co precoz en cncer (ej. GSTP1 en orina de posibles pacientes de cncer de pn-creas) o para el posterior seguimiento (ej. metilacin de p15 en leucemiamieloide aguda). La hipermetilacin de genes especficos y los perfiles del me-tiloma global del DNA se pueden aplicar al pronstico una vez detectado el tu-mor, y la hipermetilacin de islas CpG, como predictor de la respuesta a qui-mioterapia y hormonoterapia (50).

Modificaciones de histonas y cncer

Los promotores silenciados por hipermetilacin estn generalmente asocia-dos a otras modificaciones de histonas como son la hipoacetilacin de residuosde lisina en histonas H3 y H4 y la hipermetilacin de H3K9 o H3K27, que me-dian la formacin de una estructura de cromatina represiva (Figura 5B) (41).Tambien son tpicas en cncer modificaciones globales de histonas como la pr-dida de acetilacin de lisina 16 y trimetilacin de lisina 20 de la histona H4(59). Algunas marcas de acetilacin y metilacin de histonas tambien puede te-ner valor pronstico en ciertos tumores (60).


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El silenciamiento de un tpico gen supresor de tumores supone la unin decomplejos represores transcripcionales al promotor hipermetilado, tales comoDNA metil-transferasas (DNMT), protenas de unin a DNA metilado (MBD),histona metil-transferasas para H3K9 e histona deacetilasas (HDAC) (52). Porotro lado, la expresin de oncogenes en cncer requiere la actividad de prote-nas coactivadoras de la transcripcin como histona acetil-transferasas (HAT),histona metil-transferasas para H3K4 y complejos de remodelado de la croma-tina como SWI/SNF (49). No es de extraar que numerosos genes con funcio-nes en la regulacin epigentica se encuentren alterados en muchos tipos de cn-cer (10). Algunos de estos genes se recogen en la tabla 3.

TABLA 3. Algunos genes modificadores de la cromatina alterados en cncer [ver una lista ms detallada en (49, 51)].

Gen Alteracin Tipo de cncerMLH1 Reparacin del DNA Colon, estmago, endometrioDNA metil transferasasDNMT1, DNMT3b Sobreexpresin Diversos tiposProtenas de unin a metil-CpGMeCP2, MBD1, MBD3 Sobreexpresin. Mutacin (rara) Diversos tiposHistona acetil transferasasp300 Mutacin Colon, estmago, endometrio

CBP Mutacin, translocacin, deleccin Colon, estmago, endometrio, pulmn, leucemiaMOZ, MORF Translocacin Neoplasias hematolgicasHistona deacetilasasHDAC1, HDAC2 Expresin desregulada Diversos tiposHistona metil transferasasMLL1 Translocacin Neoplasias hematolgicasMLL2 Amplificacin gnica Glioma, pncreasRIZ1 Hipermetilacin islasCpG Diversos tiposFactores de remodelado de la cromatinaMTA1, MTA3 Sobreexpresin Mama, Neoplasias hematolgicasEMSY Amplificacin, sobreexpresin MamaHLTF (familia SWI/SNF) Hipermetilacin islasCpG Diversos tiposPASG/LSH (familia SWI/SNF) Mutacin Neoplasias hematolgicas

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Terapia epigentica del cncer

En contraste con las alteraciones genticas, el silenciamiento gnico por mo-dificaciones epigenticas es potencialmente reversible (10). La metilacin delDNA y las modificaciones de histonas son dianas atractivas para el desarrollode nuevos agentes teraputicos, ya que el tratamiento con drogas que inhiben lametilacin en citosina y la deacetilacin de histonas pueden reestablecer la trans-cripcin gnica (52). Los inhibidores de histona deacetilasa (HDACi) tienen unenorme potencial como agentes anticancerosos (28, 29, 41, 54). Los HDACi in-ducen diferenciacin celular, parada de ciclo celular y apoptosis, inhiben mi-gracin, invasin y angiognesis en lneas tumorales y muestran actividad anti-tumoral en animales. Hay numerosos ensayos clnicos en curso con HDACi.Asimismo se estn ensayando inhibidores de metilacin del DNA (DNMTi) (61).HDACi y DNMTi muestran efectos sinrgicos en la activacin transcripcionaly existen ensayos clnicos que combinan ambos agentes epigenticos (41, 61).Recientemente se ha aprobado el uso de estos inhibidores para el tratamiento desndrome mielodisplsico y linfoma cutneo de clulas T.

En conclusin, recientemente se est acumulando gran cantidad de conoci-mientos en relacin con la regulacin de la expresin por mecanismos epigenti-cos y surgiendo numerosas dianas potenciales para tratamiento del cncer. Existeel proyecto de caracterizar el epigenoma humano completo con objeto de catalo-gar los perfiles de las marcas epigenticas de todo el genoma, en clulas normalesy patolgicas. Ello tendr importantes implicaciones en el desarrollo de nuevosmarcadores tumorales y el diseo de nuevas drogas para la terapia anticancerosa.

Agradecimientos

Agradezco a Javier Len y a Vernica Torrano por la lectura crtica del ma-nuscrito. El trabajo en el laboratorio de la autora est financiado por el Fondode Investigaciones Sanitarias, Instituto de Salud Carlos III.

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La va de Hedgehog: embriognesis y enfermedad

MARA NGELES ROS LASIERRA

RESUMEN

En este trabajo pretendemos dar una ampla visin de las funciones biolgi-cas de las protenas Hedgehog y de su participacin en el complejo e intricado sis-tema de sealizacin intercelular. Aunque la va de sealizacin de Hedgehog (Hh)se descubri y estudi primeramente debido al importante papel que desempeadurante el desarrollo embrionario, ms recientemente se ha puesto de manifiestosu implicacin en una gran variedad de tumores y en el mantenimiento de las clulas madre de algunos tejidos. Esto hace que el comprender y dominar en lo posible la sealizacin Hh sea de tremenda importancia para la salud humana.

SUMMARY

Our goal is to present a wide view of the biological functions of Hedgehog pro-teins and their participation in the complex and intricate system of intercellular sig-naling. Hedgehog signaling cascade was first discovered and studied in the contextof embryonic development where it plays an essential role. More recently, the in-volvement of Hedgehog (Hh) signaling in the development of a variety of tumorsand in the homeostasis of adult tissues was also unraveled. Therefore, understan-ding and controlling Hh signaling is of tremendous importance for human health.

INTRODUCCIN

Los mamferos presentan tres genes de la familia Hedgehog que reciben elnombre de: Sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) y Desert hedgehog

(Dhh). Son homlogos del gen Hedgehog (Hh) de Drosophila (la mosca de lafruta) que fue el primer miembro de la familia en ser identificado (1). Hh debesu nombre al aspecto externo de la larva de la mosca mutante que, debido a ladisposicin de los dentculos, recuerda a un erizo. Aunque Hh se identific enun screening mutagnico realizado en 1980, su clonacin no ocurri hasta 1992(2, 3) siendo seguida rpidamente por la clonacin de sus homlogos en verte-brados (4, 5, 6). Hh presenta una mayor homologa con Dhh, mientras que Shhe Ihh estn ms prximos entre s, lo que se supone ha sido el resultado de unaduplicacin gnica ms reciente (7).

La familia de protenas Hh desempea funciones esenciales principalmen-te durante el desarrollo embrionario, pero tambin en el mantenimiento y regu-lacin de algunas clulas madre en el organismo adulto y en el desarrollo demuchos tumores humanos (8, 9, 10). Son molculas de sealizacin intercelu-lar que tienen la capacidad de sealizar a larga distancia (mltiples dimetroscelulares) y de una manera dependiente de concentracin (7).

Las protenas Hh se sintetizan en forma de un precursor que requiere de unimportante procesamiento post-traducional para generar el ligando activo. Esteprocesamiento incluye su digestin autocataltica y una doble modificacin lip-dica. Aunque nuestros mayores conocimientos sobre la va de sealizacin de Hhderivan de los estudios llevados a cabo en Drosophila, los componentes princi-pales de los procesos de produccin, secrecin, difusin, recepcin y transduccinde la seal de ests protenas estn muy conservados evolutivamente (revisado en7, 11, 12). Por ello y en aras de simplificar la descripcin, en este trabajo usare-mos el trmino Hh para referirnos a cualquier miembro de la familia en todosaquellos aspectos en los que no existan particularidades importantes entre ellos.

SNTESIS, PROCESAMIENTO Y DIFUSIN DE HEDGEHOG

La protena Hh se sintetiza como un precursor de 45 kD que sufre una hi-drlisis intramolecular catalizada por su porcin C-terminal lo que origina dosfragmentos peptdicos. El pptido C-terminal es de 25 kD y carece de actividadbiolgica siendo el fragmento N-terminal, de 19 kD, el que posee toda la acti-vidad biolgica conocida de Hh (Fig. 1). A este fragmento se le suele denomi-nar HhN. Asociado a la hidrlisis del precursor, se produce la unin covalentede una molcula de colesterol al extremo C-terminal de HhN que pasa a deno-minarse HhNp (p de procesado; 13). La actividad colesterol-transferasa necesa-ria para este proceso reside en el extremo C-terminal del precursor. Adems, el


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LA VA DE HEDGEHOG: EMBRIOGNESIS Y ENFERMEDAD

fragmento HhNp adquiere otra molcula lipdica, el cido palmtico, que se unecovalentemente a su extremo N-terminal (Fig. 1) (14, 15, 16). Esta ltima re-accin est catalizada por una enzima O-aciltransferasa codificada por el genSkinny hedgehog (Ski) (Fig. 2). La adicin de estos dos residuos lipdicos re-percute enormemente en multitud de aspectos como la localizacin, secrecin,difusin y actividad de las protenas Hh.

Conviene resaltar que las protenas Hh son las nicas que se modifican me-diante enlace covalente con colesterol. La importancia del colesterol en la se-alizacin por Hh se pone de manifiesto por el hecho de que algunos sndro-mes humanos con fenotipo de falta de funcin de Shh (holoprosencefalia, verms adelante) son causados por mutaciones en los enzimas que sintetizan el co-lesterol (17, 18). Adems, se saba desde hace tiempo que la interferencia far-macolgica con la sntesis del colesterol tena efecto teratolgico (19) siendolos fenotipos resultantes coincidentes con los de falta de funcin de Shh.

Hay suficiente evidencia de que en el tejido receptor Hh se localiza extra-celularmente, tanto en Drosophila como en vertebrados (20, 21). Por ejemplo,en el esbozo temprano de extremidad de ratn, se ha podido detectar que la pro-tena Shh, difunde en un gradiente de aproximadamente 300 micras de exten-

FIGURA 1. Esquema que muestra el procesamiento de las protenas Hh. Primero se sintetiza unprecursor de 45 kDa que sufre una autocatlisis dependiente del fragmento C-terminal para

generar el pptido activo que es el fragmento N-terminal de 19 kDa al que se le aadencolesterol y cido palmtico. Abreviaturas: PS, pptido seal.


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sin desde las clulas productoras (21, 22). Sin embargo, la presencia de los dosresiduos lipdicos debera suponer el anclaje de HhNp a la membrana plasm-tica. Efectivamente, diversos estudios han confirmado que tanto la adicin delcolesterol como la del cido palmtico reduce la difusin de la molcula pero almismo tiempo facilita la obtencin de concentraciones ms elevadas cerca de lafuente de sntesis (23). Se sabe tambin que, tanto en Drosophila como en ma-mferos, la secrecin de Hh necesita Dispatched (Disp; Dispatched 1 y Dispat-ched 2 en vertebrados). Disp es una protena integral de membrana con docedominios transmembrana que facilita la salida de Hh al espacio extracelular fun-cionando como un transportador especfico de Hh (Fig. 2). Por lo menos en Dro-sophila, Disp es indispensable para que las clulas que expresan Hh puedan li-berarlo al medio extracelular (12).

Las modificaciones lipdicas de las protenas Hh y su modo de sealizacina larga distancia y de una manera dependiente de concentracin (ver ms ade-lante), implica la existencia de mecanismos activos que faciliten y controlen su

FIGURA 2. Esquema que muestra la sealizacin de Hh. La clula secretora (central) necesita deDisp para liberarlo al medio extracelular. En la clula receptora (izquierda) Hh se une con sureceptor Ptc lo cual libera a Smo e impide el procesamiento proteoltico de Ci, el transductortranscripcional de Hh. La protena completa Ci es un activador transcripcional que activa losgenes diana. En ausencia de sealizacin (derecha) Ptc bloquea a Smo lo que permite laprotelisis de Ci y la generacin de su forma truncada que es un fuerte represor transcripcional

de las dianas de la va.

difusin. Aunque estos mecanismos no son completamente conocidos, se sabeque en el movimiento de HhNp en el medio extracelular participan macromo-lculas de la matriz extracelular como por ejemplo el heparan sulfato proteo-glicano. En Drosophila, la difusin de Hh necesita de tout-velu una glicosami-noglicano-transferasa cuyos homlogos en vertebrados son miembros de lafamilia de glicotransferasas Exostosins (EXT). En humanos, mutaciones en losgenes EXT1 y EXT2 son la causa de la exostosis mltiple hereditaria, una en-fermedad asociada con el crecimiento en exceso del hueso (24) y que parece es-tar causada por alteraciones en el transporte de Ihh (25).

Otros factores que podran facilitar la difusin de HhNp son la formacinde complejos multimricos y la asociacin con lipoprotenas. Se ha sugerido quelas molculas de HhNp podran formar complejos multimricos en los que losresiduos hidrofbicos se dispondran en el interior formando especies de mice-las. La formacin de estos complejos, para lo que las molculas de Hh tienenque tener las dos modificaciones lipdicas, facilitara la solubilidad y difusinHh en el medio acuoso extracelular (26, 27, 28). Adems, estudios recientes enDrosophila indican que las lipoproteinas tambin participan en el transporte deHhNp a largas distancias (29, 30, 31).

RECEPCIN Y TRANSDUCCIN DE LA SEAL

La sealizacin por Hh se ha caracterizado en varios procesos de desarro-llo y aunque se conocen algunas particularidades propias de tejido o de especie,en general es un proceso muy conservado.

El receptor de Hh en Drosophila es Patched (Ptc) del que hay dos hom-logos en vertebrados Ptc1 y Ptc2 siendo Ptc1 el que presenta una expresin yfuncin similar a Ptc (32, 33, 34). Ptc es una protena integral de membrana condoce dominios transmembrana (Fig. 2). El primer paso en el proceso de seali-zacin por Hh es su unin fsica con Ptc lo que, adems de activar la va, cau-sa la internalizacin por endocitosis del complejo Hh-Ptc y su posterior degra-dacin lisosomal (35, 36). La internalizacin de Hh mediada por Ptc esfundamental para eliminar el morfgeno del medio extracelular y contribuye no-tablemente al establecimiento y mantenimiento del gradiente de concentracin(ver ms adelante). La regulacin de este gradiente es de gran importancia yaque se admite que la diferenciacin de las clulas depende de su posicin den-tro del gradiente. Recientemente se ha demostrado que en Drosophila Ptc actatambin como un receptor de lipoproteinas (31).

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En vertebrados se han identificado reguladores tanto positivos como negati-vos de la sealizacin por Shh. Un modulador negativo de la seal es Hip (Hed-gehog interacting protein; 37) que se une a las tres protenas Hh con la mismaafinidad que Ptc y contribuye tambin a atenuar la seal secuestrando a Hh enla superficie celular, aunque no induce su internalizacin como hace Ptc. Es im-portante sealar que tanto Ptc como Hip son dianas de Hh de manera que es elpropio Hh el que modula su concentracin en el medio al controlar la produc-cin de sus moduladores negativos. Un modulador positivo de la seal es Gas1(growth-arrest specific gene), una protena de superficie con anclaje glicosilfos-fatidilinositol, que se supone acta aumentando la afinidad de Hh por Ptc (38).Finalmente, Megalin, que es un miembro de la familia de receptores lipoprote-cos de baja densidad (39) tambin se une a Hh con alta afinidad y participa, deuna manera desconocida por el momento, en su internalizacin y sealizacin.

En Drosophila ihog (interferente hedgehog) y boi (brother of ihog) son gli-coprotenas de membrana que funcionan como moduladores positivos de la sea-lizacin ya que se unen y secuestran a Hh aumentando su sealizacin localmen-te (40). Sus homlogos en vertebrados, llamados respectivamente cdo y boc, hansido identificados recientemente y parecen conservar la misma funcin (41, 42).

El sistema de transduccin de la seal de Hh implica a Smoothened (Smo),una protena con siete dominios transmembrana emparentada con la familia delos receptors Frizzled de Wnt (Fig. 2). En mamferos solo hay un gen Smo (43).En ausencia de Hh, Ptc reprime la actividad de Smo por un mecanismo todavano completamente conocido pero que no implica unin fsica. La unin de Hha Ptc inicia su internalizacin y libera a Smo que a partir de vesculas intrace-lulares se desplaza y acumula en la superficie celular donde se transloca a loscilios e inicia la cascada de sealizacin.

Ptc y Smo actan mediante una cascada de transduccin de la seal que cul-mina con la modulacin de la actividad de los factores de transcripcin Ci/Gli.En Drosophila, la transduccin de la seal a partir de Smo, aunque no es com-pletamente conocida, se sabe que implica a un complejo de protenas de unina microtbulos que incluyen Fused (fu), Suppressor of Fused [Su(fu)], costal2(Cos2), protein kinase A (PKA) y slimb. Este complejo retiene a Cubitus inte-rruptus (Ci; 7, 44, 45) que es el mediador transcripcional de la sealizacin porHh en Drosophila (Fig. 2).

En ausencia de Hh, Ptc reprime la actividad de Smo lo que se traduce en lafosforilacin de Ci (Fig. 2) (46) y su subsecuente procesamiento proteoltico ori-ginando una forma corta de 75kD, que corresponde con su extremo N-terminal


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y que se transloca al ncleo donde reprime la transcripcin de los genes dianade Hh. La unin de Hh a Ptc libera a Smo (Fig. 2) lo que resulta en la inhibi-cin de la protelisis de Ci. La protena completa Ci (155kD) se transloca al n-cleo donde acta como un activador transcripcional de los genes diana de Hh.

Los homlogos de Ci en vertebrados son los genes Gli, de los que se hanidentificado tres: Gli1, Gli2 y Gli3. Las protenas Gli son factores de transcrip-cin multifuncionales que pueden actuar como activadores o represores de latranscripcin. Estudios genticos y bioqumicos indican que Gli1 funciona comoun activador transcripcional de los genes diana de Shh mientras que Gli2 y Gli3pueden actuar como activadores o represores segn el contexto. Gli2 y Gli3 sonlos mediadores primarios de la va de Shh mientras que Gli1, cuya expresin estranscripcionalmente regulada por Gli2 y Gli3, acta secundariamente para po-tenciar dicha va (47).

Se ha demostrado que Gli3 y tambin Gli2 pero no Gli1, sufren un proce-samiento proteoltico similar al sealado anteriormente para Ci (48, 49, 50). Lapresencia de Shh evita el procesamiento de la protena Gli3 de 190kD a una for-ma corta de 83 kD que corresponde con el extremo N-terminal y que es un po-tente represor transcripcional. Por lo tanto, dentro de los dominios de expresinde Gli3, los mayores niveles de la forma represora corresponden con los nive-les ms bajos de Shh. Es interesante notar que las diferentes funciones regula-doras de Ci en Drosophila se reparten en mamferos entre las tres protenas Gli.

Recientemente, un estudio mutagnico en ratn permiti identificar que mu-taciones de los genes homlogos de las protenas de transporte intraflagelar (IFT,de su nombre en ingles Intraflagellar Transport) (51) presentaban fenotipos ca-ractersticos de prdida de funcin de Shh (52). Estudios subsecuentes pudierondemostrar que las protenas IFT juegan un papel importante en la va de Shhdownstream de Ptc y Smo pero upstream de Gli y que en su ausencia tanto lasactividades represoras como activadoras de Gli3 se hallan afectadas (53, 54, 55).Estos estudios sugieren que los cilios son organelas celulares esenciales para latransducin de la sealizacin de Shh y, en este sentido, conviene destacar quevarios componentes de la va de sealizacin se localizan en los cilios inclu-yendo Smo y las tres protenas Gli (53, 56, 57).

En resumen, la activacin de la va de Hh conduce a la produccin de fac-tores de transcripcin activadores pero tambin inhibe la formacin de factoresde transcripcin represores. Es la proporcin entre las formas activadoras y re-presoras de Ci/Gli en el ncleo, lo que se ha dado en llamar el cdigo Gli (47),lo que controla la expresin de los genes dianas de Shh mediante una combi-nacin de activacin y derepresin.

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Las dianas reguladas por la va de Hh varan segn especie y tipo celular yslo se conocen parcialmente. Algunas de las dianas mejor establecidas y ms uni-versales son componentes importantes de la misma va de sealizacin como Ptc,Hip y Gli1. La expresin de estos genes, particularmente de Gli1 y Ptc se utilizacomo marcador de clulas que estn activamente transduciendo la seal de Hh.

El hecho de que la funcin de los factores de transcripcin Ci/Gli sea es-pecfico de tejido, estadio y especie puede depender de su capacidad de formarcomplejos entre ellos y con otros factores de transcripcin que modifican su ac-tividad (47). En este sentido debe mencionarse que se sabe que las protenas Gliinteraccionan fsicamente con las protenas Zic1 y Zic 2 y con los productos delos genes Hoxd. Como dianas del cdigo Gli relativamente generalizadas se pue-den citar Ciclina D1, N-myc, Bcl2, Bmi y Snail (47).

HH EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO

La va de sealizacin de Hh es esencial en embriognesis ya que est im-plicada en el desarrollo de mltiples rganos donde controla aspectos tan im-portantes como la especificacin de los distintos tipos celulares, la proliferacino la supervivencia celular.

El desarrollo de muchos rganos depende de las interacciones intercelula-res que se establecen entre sus componentes. Los estudios clsicos de embrio-loga experimental llevados a cabo a mediados del pasado siglo proporcionaronmucha informacin acerca de la localizacin y modo de accin de los centrossealizadores y de las interacciones celulares ms importantes en el desarrollode los vertebrados. Estos estudios permitieron la rpida interpretacin y inte-gracin de los estudios moleculares posteriores. Una observacin sorprendentefue la constatacin de que son unas pocas vas de sealizacin las que se usande manera repetitiva en diferentes momentos y lugares del desarrollo y ademsque estas seales estn evolutivamente muy conservadas. Sin embargo, es im-portante destacar que el resultado de una misma va de sealizacin no es siem-pre el mismo sino que depende del contexto en el que se est utilizando y delestado de las clulas (historia celular) que reciben est sealizacin.

La va de Hh es una de las vas de sealizacin ms importantes durante eldesarrollo embrionario. Cuando se clonaron los homlogos de Hh en vertebra-dos (4, 5, 6) llam poderosamente la atencin el hecho de que los dominios deexpresin de uno de sus miembros, Shh, coincidan exactamente con la locali-zacin de algunos de los centros de sealizacin mejor caracterizados del


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desarrollo como la notocorda y la zona de actividad polarizadora de la extre-midad (Fig. 3). Esto sugera que Shh poda ser la molcula responsable de lasfunciones de estos centros sealizadores y cuya identificacin haba sido obje-to del estudio de los embrilogos durante mucho tiempo (9).

FIGURA 3. (A) Patrn de expresin de Shh en un embrin de pollo de aproximadamente 4 dasde incubacin. La expresin de Shh en la ZPA del ala y pata est indicada por cabezas de flecha.(B) La expresin normal de Shh en la ZPA de un ala de embrin de pollo se acompaa del esquemadel modelo de su difusin en gradiente a lo largo del eje antero-posterior y del patrn esquelticonormal del ala de pollo. El ala de los pjaros presenta solamente 3 dedos que se consideran dedo2 (d2), 3 (d3) y 4 (d4). El tipo de dedo que se forma depende del nivel de morfgeno al que hayanestado sometidas sus clulas precursoras durante el desarrollo. (C) Cuando por causas naturaleso experimentales surge otra fuente de Shh a nivel anterior, en el esbozo de extremidad se generandos gradientes que, dependiendo de su geometra, pueden llegar a superponerse en la zona centralde la extremidad como est representado en el esquema. Esta configuracin da lugar a

duplicaciones especulares de los dedos como el caso que se muestra (d4-d3-d2-d3-d4).

Uno de los modelos ms usados para explicar la formacin de patrn du-rante el desarrollo de los rganos es el del gradiente de morfgeno (literalmen-te molcula generadora de forma; 58). El morfgeno es una molcula que ema-nando de su fuente productora, los llamados centros sealizadores, es capaz dedifundir y establecer un gradiente de concentracin a travs de un campo mor-fogentico (agrupacin de los precursores de un rgano). El modelo proponeque la concentracin del morfgeno proporciona a las clulas un valor posicio-nal acorde con su situacin en el gradiente. El valor posicional determina el des-tino celular de manera que la generacin de un patrn o morfologa apropiadodepende del establecimiento de un gradiente correcto del morfgeno. Puede con-siderarse que el gradiente del morfgeno prefigura el patrn final del rgano otejido. En varios sistemas de desarrollo, como el desarrollo de la extremidad ydel sistema nervioso central, se considera que las protenas Hh actan comomorfgenos (7, 9, 59). A continuacin vamos a considerar brevemente estos dossistemas sin dejar de resaltar que la sealizacin por Shh interviene tambin demanera relevante en el desarrollo de multitud de otros rganos entre los que seencuentra el corazn, los vasos sanguneos, las gnadas, el intestino y el rin.En Drosophila, adems del papel de la sealizacin de Hh en la segmentacindel embrin, que fue la causa de su descubrimiento, tambin interviene en lamorfognesis de los discos imaginales de ala, pata, ojo y disco genital. Duran-te el desarrollo las protenas Hh son tambin importantes mitgenos y factoresde supervivencia celular.

Hh y el desarrollo de la extremidad

En el desarrollo de las extremidades Shh juega un papel fundamental con-trolando el nmero y la identidad de los dedos. La parte distal de las extremi-dades de los amniotas se caracteriza por la presencia de los dedos que son ele-mentos esenciales para su funcin. Los dedos pueden considerarse comoestructuras en serie a lo largo del eje antero-posterior (pulgar-meique) de lamano aunque cada uno de ellos presenta una clara identidad (Fig. 3). Los mo-delos actuales proponen que Shh es el responsable de la polaridad anteroposte-rior de la extremidad, es decir, de la diferente morfologa de los dedos.

La primera informacin sobre cmo se generaba la asimetra anteroposte-rior de la extremidad la proporcion el descubrimiento de la zona de actividadpolarizadora (ZPA), un pequeo agrupamiento de clulas mesodrmicas situadoen el borde posterior de la extremidad en desarrollo (Fig. 3). Esta regin fueidentificada y definida gracias a las asombrosas duplicaciones especulares de


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los dedos que causaba cuando se transplantaba al borde anterior de otra extre-midad (Fig. 3). Estos y otros muchos experimentos demostraron que la ZPAera la responsable del patrn anteroposterior de la extremidad (9). Se interpre-t que las clulas de la ZPA producan un morfgeno capaz de difundir y esta-blecer un gradiente de concentracin en el eje antero-posterior de la extremidad(58). Niveles altos del morfgeno daran lugar a dedos con identidad posterior(meique) mientras que niveles bajos produciran dedos con identidad anterior(ndice) siendo el parmetro ms relevante en este modelo la concentracin delmorfgeno (Fig. 3). El descubrimiento de que Shh era la molcula secretada porlas clulas de la ZPA centr la atencin en ella como el presunto morfgeno res-ponsable de las capacidades organizativas de largo alcance mostradas por la ZPAlo que no tard en demostrarse (6, 60, 61). Recientemente los resultados de mul-titud de experimentos modificando tanto gentica como farmacolgicamente laduracin y concentracin del gradiente de Shh en la extremidad, han propicia-do la revisin del modelo principalmente para enfatizar el papel de Shh comomitgeno controlando el nmero de clulas precursoras de los dedos, adems dela especificacin antero-posterior (62).

Hh y el desarrollo del Sistema Nervioso Central

Durante el desarrollo del sistema nervioso central, Shh se expresa en la pla-ca precordal, en la notocorda y en la placa del suelo donde juega un papel fun-damental en la especificacin de los distintos tipos celulares ventrales. Su fun-cin ha sido profundamente estudiada en la mdula espinal utilizando embrionesde pollo y de ratn (63). En el tubo neural, que es el precursor de la mdula es-pinal, las diferentes poblaciones de precursores neuronales se especifican segnsu posicin y cada poblacin viene definida por la expresin de una combina-cin especfica de reguladores transcripcionales. Por ejemplo, los precursores delas motoneuronas se sitan en una posicin muy ventral y se caracterizan porla expresin de una combinacin especfica de factores de transcripcin (Islet1,Islet2 y HB9) (63, 64, 65).

Se ha podido constatar que Shh, secretado por las clulas de la notocorday de la placa del suelo, difunde y establece un gradiente de concentracin a tra-vs del eje dorso ventral del tubo neural con niveles mximos a nivel ventral(64, 65). La funcin de este gradiente de Shh es especificar de una manera di-recta y dependiente de concentracin los distintos tipos celulares de la reginventral del tubo neural del embrin y de esta manera conformar un patrn dor-soventral adecuado de diferenciacin celular. Se sabe que estos efectos estn fi-

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nalmente mediados por la actividad combinada de los tres factores de trans-cripcin Gli (66) lo que conduce a la activacin o represin de determinadosfactores de transcripcin en los progenitores ventrales del tubo neural que sonlos que al fin y al cabo dirigen la diferenciacin celular.

Como en el caso de la extremidad, en el tubo neural Shh no slo controlala especificacin sino que regula tambin la proliferacin y supervivencia celu-lar a travs de la regulacin del ciclo celular y de la expresin de genes antia-poptticos (67, 68). Adems, el crecimiento del neocortex, cerebelo y tectumdependen tambin de la actividad mitognica de Shh. Recientemente se le haatribuido un papel en la gua axonal (69, 70) y en el mantenimiento de nichosde clulas madre en el adulto (8, 71).

FENOTIPOS HUMANOS RELACIONADOS CON LA PRDIDADE FUNCIN DE SHH

Como corresponde a las importantes funciones de los genes Hh durante eldesarrollo, sus mutaciones, o bien mutaciones en genes implicados en regular omediar su actividad, producen importantes malformaciones todas ellas refleja-das en la patologa humanas (revisado en 9, 72).

En humanos la haploinsuficienca de Shh produce holoprosencefalia (OMIM142945; 18, 73, 74, 75). Se trata de una malformacin severa consecuencia dela divisin defectuosa del prosencfalo en los dos hemisferios cerebrales. Se pre-senta con muy diferentes grados de severidad nerviosa que se asocian con alte-raciones proporcionales del crneo y cara. Los casos ms severos son incom-patibles con la vida y se parecen mucho al fenotipo del ratn mutante para Shhque se caracteriza por un cerebro unilobulado, ciclopia y proboscide (Fig. 4; 16).

Adems, el ratn mutante de Shh presenta mltiples defectos en la lnea me-dia como corresponde con el alto nivel de expresin de Shh a este nivel (16).Estos defectos incluyen degeneracin de la notocorda, falta de formacin de laplaca del suelo y alteraciones en la simetra izquierda-derecha con isomerismopulmonar izquierdo (76, 77).

La extremidad que se forma en ausencia de Shh presenta graves dficits apartir del codo/rodilla con graves alteraciones del zeugopodio (antebrazo/pier-na) y formacin de un nico dedo, caracterizado como dedo 1, en la extremi-dad inferior (Fig. 4). Este hecho hace que el dedo 1 (pulgar/dedo gordo) se con-sidere que no requiere Shh para su formacin (Fig. 4).


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Como hemos indicado, Shh previene la formacin de la forma represora cor-ta de Gli3 y por tanto el gradiente extracelular de Shh se convierte en un gra-diente intracelular inverso de Gli3 que es lo que realmente controla la formacinde patrn de una manera que todava no es completamente conocida. En huma-nos mutaciones del gen Gli3 son responsables de varios sndromes autosmicosdominantes que asocian polidactilia (exceso en el nmero de dedos) con distin-tos fenotipos y son un claro reflejo de la complejidad de este factor de trans-cripcin (78). La cefalopolisindactilia de Greig (OMIM 175700; 79, 80, 81) in-cluye polidactilia preaxial, sindactilia y dedos anormalmente anchos adems deotras anomalas como hipertelorismo. El sndrome de Pallister-Hall (OMIM146510; 82) cursa con polidactilia postaxial o central y sindactilia as como ha-martoma hipotalmico, ano no perforado y ocasionalmente holoprosencefalia. Es-tas mutaciones causan truncamiento de la protena que podra actuar como la for-ma represora de Gli3 (83). La polidactilia es una de las malformaciones ms

FIGURA 4. (A) Patrn esqueltico de un feto de ratn casi a trmino. (B) y (C) muestra el patrnesqueltico de un feto de la misma camada mutante para Shh en una visin lateral (B) y anterior(C). Ntese las graves alteraciones de la cabeza con probscide y de las extremidades, entre otras.(D) Patrn esqueltico de la extremidad anterior de ratn para comparacin con la extremidaddel mutante de Shh (E) que carece de dedos y con la del mutante de Gli3 que presenta polidactilia

(F). Abreviaturas: h: hmero; r: radio; c: cbito; f: fmur; t/p: tibia/peron.

frecuentes en humanos y en su etiologa muchas veces est implicada la activa-cin anmala de Shh en el borde anterior de la extremidad (84).

Adems de Shh, los otros dos genes de la familia tambin desempean fun-ciones importantes en el desarrollo aunque mucho ms localizadas. Ihh es funda-mental en el proceso de osificacin endocondral ya que participa en la diferen-ciacin del cartlago (85, 86). En humanos, mutaciones en Ihh se han identificadocomo responsables de la braquidactilia tipo A-1, caracterizada por un acortamientode los huesos largos y acortamiento o ausencia de las falanges medias (87).

Dhh est implicado en la proliferacin de la clulas germinales y en lasinteracciones de las clulas de Schwann con las clulas nerviosas. Dhh inducela diferenciacin de las clulas de Sertoli durante el desarrollo testicular y jue-ga un papel esencial en la regulacin del desarrollo de las clulas de la lneagerminal (88, 89).

SHH Y LAS CLULAS MADRE EN EL ORGANISMO ADULTO

Shh es activo en algunos grupos de clulas en rganos maduros donde pareceparticipar en el mantenimiento del nmero de clulas madre. Esto ha sido estudia-do principalmente en el sistema nervioso central. En el telencfalo de los mamfe-ros se conocen dos reas de neurognesis postanatal que son el giro dentado delhipocampo y la zona subventricular de los ventrculos telenceflicos (90). Experi-mentos de ganancia y prdida de funcin en ratn han resaltado la importancia dela sealizacin de Shh en el comportamiento de las clulas madre de estos nichos(71, 91). Las clulas quiescentes expresan bajos niveles de Gli1, marcador de lasclulas que estn respondiendo a Shh, pero la va Shh/Gli se activa para regular lageneracin de nuevas neuronas. La cascada de sealizacin de Shh est tambinimplicada en el mantenimiento de otros tipos de clulas madre adultas como lashematopoyticas (92). Este campo de estudio se encuentra actualmente bajo inten-sa investigacin ya que surge la posibilidad de que la manipulacin experimentaldel cdigo Gli permita controlar el nmero de clulas madre adultas (47).

SHH Y CARCINOGNESIS

La sealizacin por Hh se ha implicado en el desarrollo de varios cncereshumanos incluyendo el carcinoma pulmonar de clulas pequeas, los medulo-blastomas, los carcinomas basocelulares y los tumores del tracto digestivo.


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Como hemos explicado, en ausencia de Shh, Ptc inhibe la va de sealiza-cin por lo que la prdida de su actividad causa activacin de la va de Shh, in-dependiente de la presencia del ligando. De acuerdo con ello, individuos con unalelo defectuoso de Ptc1 presentan el sndrome de Gorlin que cursa con poli-dactilia preaxial, metacarpianos cortos y anomalas dentales (OMIM 109400;93, 94, 95). Adems, los pacientes con sndrome de Gorlin presentan una altapredisposicin a ciertas formas de cncer como carcinomas mltiples de clu-las basales, meduloblastomas, fibromas ovricos y menos frecuentemente rab-domiosarcomas, meningiomas, fibrosarcomas y fibromas cardiacos (93, 96). Elcarcinoma de clulas basales es una de las formas ms comunes de cncer hu-mano, representando un tercio de todos los tumores diagnosticados (97). En estesentido Ptc se ha considerado como un gen supresor de tumores. Mutaciones enotros componentes de la va como por ejemplo mutaciones de Smo que conlle-van ganancia de funcin tambin se han encontrado en el carcinoma de clulasbasales (98).

Una sealizacin aberrante de Hh se asocia tambin con una variedad detumores del tracto gastrointestinal. La mayora de los adenocarcinomas ducta-les de pncreas presentan activacin de la va de Shh y actualmente se piensaque este hecho constituye un factor esencial en los estadios tempranos del des-arrollo del cncer de pncreas (47, 99, 100, 101).

Adems, un gran nmero de tumores, incluyendo todos los tumores cere-brales, de prstata y de piel, requieren de la va de Hh para su progresin (47).Independientemente de las mutaciones en oncogenes y supresores de tumoresespecficos de cada tipo de tumor, esta observacin sugiere que todos los fac-tores oncognicos pueden converger en la actividad Gli para promover la pro-gresin tumoral (103) y coloca a la cascada de sealizacin de Hh en el focode atencin de un posible tratamiento para muchos tipos diferentes de cncer(47, 102). Efectivamente, la va de Hh puede ser manipulada mediante diversoscompuestos qumicos. Uno de los ms importantes es un alcaloide esteroideonatural llamado ciclopamina al que debe su toxicidad la planta Veratrum cali-fornicum. La ciclopamina causa fetos cclopes y holoprosenceflicos en el ga-nado que ha consumido dichas plantas y su efecto se debe a que bloquea la fun-cin de Smo. Se ha demostrado que el tratamiento con ciclopamina puede inhibirel crecimiento y supervivencia tumoral en lneas celulares y cultivos primarios(102, 104). Smo aparece pues como una diana atractiva para el tratamiento an-titumoral puesto que regula muy eficientemente el cdigo Gli y en este sentidose est trabajando activamente en el desarrollo de pequeas molculas antago-nistas de su funcin que presenten buenas caractersticas farmacocinticas.

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AGRADECIMIENTOSMi agradecimiento a todas las personas que en algn momento han forma-

do parte de mi equipo, por su inestimable colaboracin. Financiado por el Mi-nisterio de Ciencia e Innovacin (BFU2005-09309-CO2-01).

ABREVIATURASBoi, brother of ihog; Ci, Cubitus interruptus; Dhh, Desert Hedhehog; Gas,Growth arrest; Hh, Hedgehog; HhNp, Forma activa de Hh; Ihh, Indian hedge-hog; Ihog, interferente hedgehog; Ptc, Patched; Shh, Sonic hedgehog; Ski,Skinny hedgehog; Smo, Smoothened; ZPA, Zona de actividad polarizadora.

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