8._Kromatografi_Kolom-libre.pdf

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA DAN ANALISIS PANGAN

KROMATOGRAFI KOLOM

NAMA : WAHYU ERWIN FIRMANSYAHNIM : 125100101111014KELOMPOK : J3KELAS : JASISTEN : ISMI

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGANJURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIANUNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG2014

Wahyu Erwin FirmansyahTHP-FTP-UB-2014

1

BAB VIIIKROMATOGRAFI KOLOM

A. Pre-lab1. Apa yang dimaksud kromatografi?

Kromatografi adalah metode pemisahan dengan memanipulasi sifat fisik penyusuncampuran dimana komponen-komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikandiantara dua fase, salah satu fase tersebut adalah suatu lapisan stasioner denganpermukaan yang luas, yang lainnya sebagai fase gerak atau mobile. Sifat fisik yangdimanipulasi yaitu partisi, adsorpsi, dan volatilisasi. Fase stasioner dalam kromatografidapat berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase gerak dapat berupa cairan maupungas. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fasediam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan fase diam akan cenderungbergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah (Sastrohamidjojo, 2004).

2. Jelaskan prinsip kromatografi adsorpsi?

Prinsip kromatografi adsorpsi yaitu memisahkan komponen secara selektifberdasarkan sifat fisik adsobrs dengan fase stationer berupa adsorben alumina yangmengisi kolom dan fase mobile PE-aseton dengan perbandingan 10:1. Kecepatanpergerakan suatu komponen tergantung pada kemampuannya untuk tertahan atau terhambatoleh penyerap di dalam kolom (Sastrohamidjojo, 2004).

3. Apa fungsi alumina pada penentuan beta karoten?

Fungsi alumina pada penentuan beta karoten yaitu sebagai adsorben polar (fasediam) yang dapat mengadsorpsi solut yang bersifat polar dan untuk memisahkan senyawayang bersifat basa karena alumina ini bersifat basa. yaitu senyawa karotenoid selain betakaroten yang akan diikat oleh alumina pada fase diam, dan betakaroten (non polar) akanlarut bersama fase gerak (Noviyanti, 2010).

4. Jelaskan pengertian fase stasioner dan fase mobil!

Fase stationer merupakan fase diam pada kromatografi untuk menahan komponencampuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Senyawatetap diam atau tidak berpindah dalam kromatografi yang berupa adsorben yang tidakboleh larut dalam fase gerak. Selain itu, ukuran fase diam harus seragam, contohnya:alumunium, silica gel, arang (Gritter dkk, 2004).


2

Sedangkan fase mobil merupakan fase bergerak yang melarutkan zat komponencampuran. Komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.Fase ini bisa berupa cairan, gas, atau cairan superkritis. Selain itu, fase ini dapat berupapelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut dengan komposisi tertentu. Pelarutmerupakan pelarut polar maupun pelarut nonpolar. Fase mobil terdiri dari sampel yangdipisahkan dan solven yang menggerakkan sampel sepanjang kolom misal. Pada kolomkromatografi misal, fase mobil bergerak sepanjang kolom dimana sampel berinteraksidengan fase stationer dan dipisahkan (Gritter dkk, 2004).

5. Apa yang dipisahkan pada proses kromatografi adsorbsi pada penentuan kadar betaKaroten?

Senyawa atau zat yang dipisahkan pada proses kromatografi adsorbsi padapenentuan kadar beta karoten yaitu pigmen beta karoten dan komponen lain yangmenyusun senyawa tersebut. Pemisahan beta karoten berdasarkan polaritasnya. Betakaroten bersifat non-polar, sehingga yang untuk memisahkan dari senyawa menggunakanpelarut heksana, karena heksana adalah pelarut non polar dan betakaroten terlarutdidalamnya (Khopkar, 2008).


3

Tinjauan Pustaka

1. Kromatografi KolomKromatografi Kolom merupakan Metode pemisahan yang di dasarkan pada

pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornyamaupun hasil isolasinya. Seberapa jauh komponen itu dapat diserap absorben tergantunpada sifat fisika komponen tersebut. Prinsip kerja kromatografi kolom perbedaan dayaserap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalamsedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zatmenyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebihlambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang diserap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit padakolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masing-masing zat akanbergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom(Sastrohamidjojo, 2004).

2. Beta KarotenBeta karoten merupakan pigmen atau zat kimia alami yang berwarna merah,

kuning, hingga jingga yang terdapat dalam buah-buahan dan sayuran. Beta karotenmerupakan senyawa organik, secara kimiawi diklasifikasikan sebagai hidrokarbon dansecara spesifik diklasifikasikan sebagai terpenoid. Beta karoten merupakan karotenoid,precursor vitamin A dan sebagai antioksidan. Beta karoten tidak larut dalam air tetapilarut dalam pelarut non polar. Beta karoten antara lain terdapat pada buah dan sayurseperti wortel, tomat, dll. Pigmen warna ini tergolong dalam karotenoid yang banyakmemberikan manfaat. Manfaat beta karoten ini antara lain menjamin kesehatan mata,memlihara kesehatan kulit, mempertahankan membran sel, berperan dalam sistemkekebalan tubuh dan kesehatan tulang, serta membantu pembentukan sel darah merahdan bekerjasama dengan vitamin C dalam menyembuhkan luka (Rachman & Histifarina,2010).

3. Tinjauan Sampela) Brokoli

Brokoli (Brasicca oleracea) merupakan tanaman sayuran sub tropik yang banyakdibudidayakan di Eropa dan Asia. Brokoli merupakan tanaman yang termasuk dalamtanaman dwimusim yaitu pertumbuhan vegetatif terjadi pada fase pertama danpertumbuhan generatif pada fase berikutnya. Brokoli mengandung air, protein, lemakkarbohidrat, serat, kalsium, zat besi, vitamin (A, C, E, tiamin, riboflavin, nikotinamid),beta karoten dan glutation (Kurniasih, 2011).


4

b) Labu KuningLabu kuning (Cucurbita moschata) merupakan sayuran yang berwarna kuning yang

banyak mengandung beta karoten dimana beta karoten ini berperan sebagai antioksidandisamping komponen nutrisi lain seperti karbbohidrat, protein, lemak, serat dan mineral.Di dalam tubuh beta karoten akan diubah menjadi vitamin A yang bermanfaat bagikesehatan tubuh untuk pertumbuhan, pemeliharaan jaringan tubuh dan penglihatan,reproduksi, perkembangan janin serta untuk mengurangi resiko timbulnya penyakitkanker dan hati. Kadar beta karoten pada labu kuning sebesar 1187,23 µg/g (Usmiatidkk, 2009).c) Wortel

Wortel (Daucus carrota) merupakan salah satu jenis sayuran yang bernilai gizicukup tinggi, terutama kandungan senyawa karoten yaitu alfa dan beta karoten. Keduasenyawa ini merupakan sumber provitamin A dan prekursor vitamin A. Dalam setiap 100gram wortel mengandung 2813 µg vitamin A. Adanya kandungan beta karoten yangcukup tinggi menjadikan wortel mempunyai prospek yang baik sebagai sumberprovitamin A untuk mencegah penyakit kekurangan vitamin A yang masih banyakdiderita oleh sebagian masyarakat Indonesia (Rachman & Histifarina, 2010).d) Jagung Manis

Jagung manis (Zea mays) merupakan sumber sayuran yang kaya vitamin A, B, E danbanyak mineral. Jagung manis merupakan salah satu komoditas pertanian yang disukaioleh masyarakat karena rasanya yang enak, mengandung karbohidrat, protein, rendahlemak, dan vitamin yang tinggi. Jagung manis memiliki kadar vitamun A yang lebih tinggidibanding dengan jagung biasa. Dalam 100 gr bahan kandungan vitamin A yaitu sebesar400 SI (Iskandar, 2007).


5

B. Diagram Alir Penentuan Kadar Kadar Beta Karoten Dengan KromatografiKolom Adsorbsi

1. Ekstraksi Sampel

lapisan bawah (air-aseton)fase eter dalam corong pemisah

Sampel

dihaluskan

ditimbang 3 g

dimasukkan dalam erlenmeyer

erlenmeyer ditutup alumunium foil

diaduk dengan shieve shaker selama 15 menit

disaring

filtrat dimasukkan dalam erlenmeyer

residu dalam erlenmeyer

diulangi proses ekstraksisebanyak 3 kali

filtrat diambildiencerkan dengan cara dikocok menggunakan shieve shaker 15 menit

filtrat diambil 25 ml

dimasukkan dalam corong pemisah25 ml aquades

dikocok

dibiarkan hingga terjadi pemisahan

20 ml petroleum eter-aseton (1:1)

100 ml petroleum eter-aseton (1:1)

dikocok

dibiarkan hingga terjadi pemisahan

dialirkan keluar dari corong pemisah

dibuang

25 ml aquades

lapisan bawah (air-aseton)Fase Eter

dialirkan keluar dari corong pemisah

dibuang


6

2. Penetapan Kadar Beta Karoten

Fase Eter

dimasukkan dalam gelas beker1 gram Na2SO4 tiap 20 ml fase eter

diaduk

filtrat dimasukkan dalam kolom kromatografi

beta karoten ditampung dalam labu ukur 25 ml

digojog

larutan petroleum eter 10:1hingga tanda batas

diukur absorbansi dengan panjang gelombang 450 nm

dihitung kadar beta karoten

Hasil

larutan petroleum eter 10:1


7

C. Hasil dan Pembahasan

Persamaan regresi kurva standar :No Konsentrasi Absorbansi1 0 0,0092 0,2 0,0233 0,4 0,0414 0,6 0,0845 0,8 0,1006 1 0,312

Kurva Standar

y = 0,255x ♠ 0,033

No Jenis Sampel BeratSampel Absorbansi V masuk

kolomV keluar

kolomKadar ß-karoten

mg/100g

1. Paprika Kuning 3,0134 gr 0,180 8 ml 25 ml 86,59

2. Wortel 3,0352 gr 1,172 9 ml 25 ml 432,43

3. Brokoli 3,0216 gr 0,129 9 ml 25 ml 58,42

4. Jagung Manis 3,0093 gr 0,103 10 ml 25 ml 44.28

y = 0.255x - 0.033R² = 0.728

-0.100-0.0500.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.350

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200

Abso

rban

si

Konsentrasi

Kurva Standar

Series1Linear (Series1)


8

Perhitungan kadar beta karoten dari sampel yang dianalisis :

y = 0,255x ♠ 0,033Kadar ß-karoten = ( ) FP =

1. Paprika Kuningy = 0,255x ♠ 0,0330,180 = 0,255x ♠ 0,0330,255x = 0,213x = 0,213/0,255 = 0,835FP = = = 3,125Kadar ß-karoten = ( )

Kadar ß-karoten = , ,, = 86,59 mg/100g

2. Wortely = 0,255x ♠ 0,033

1,172 = 0,255x ♠ 0,0330,255x = 1,205x = 1,205/0,255 = 4,725FP = = = 2,778

Kadar ß-karoten = ( )


3. Brokoliy = 0,255x ♠ 0,0330,129 = 0,255x ♠ 0,0330,255x = 0,162x = 0,162/0,255 = 0,635FP = = = 2,778Kadar ß-karoten = ( )



9

4. Jagung Manisy = 0,255x ♠ 0,0330,103 = 0,255x ♠ 0,0330,255x = 0,136x = 0,136/0,255 = 0,533FP = = = 2,5Kadar ß-karoten = ( )


Pertanyaan

1. Apa yang menjadi fase stasioner dan fase mobil pada analisis beta karoten dengankromatografi kolom?Fase stasioner pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom yaitu aluminadimana alumina sebagai fase diam berfungsi untuk mengikat senyawa yang polarseperti aseton dan air. Alumina juga akan memberikan gaya adsorbsi pada fraksicampuran sehingga fraksi-fraksi tersebut dapat memisah berdasarkan tingkatkepolarannya Sedangkan fase mobil pada analisis beta karoten dengan kromatografikolom yaitu PE-aseton (10:1) dan (1:1) dimana PE-aseton (10:1) berfungsi sebagai fasebergerak yang mengelusi senyawa nonpolar dan mengekstrak karoten dalam sampel.Secara bersamaan komponen campuran tersebut akan mengalami gaya adsorbsi danpartisi sehingga dapat terpisah.

2. Komponen apa yang terelusi pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom?Komponen yang terelusi pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom yaitukomponen beta karoten dalam sampel. Komponen beta karoten dalam sampel yangbersifat nonpolar akat terikat atau terelusi dengan fase mobil atau fase bergerak yaituPE-aseton (10:1). Beta karoten mengalami elusi atau gaya partisi paling besar karenabersifat paling nonpolar dari senyawa lainnya atau tingkat kepolarannya sama denganfase mobil sehingga ketika terjadi pemisahan, beta karoten akan berada paling bawahdan akan keluar terlebih dahulu dari kolom kromatografi.

3. Komponen apa yang teradsorbsi kuat pada adsorben?Komponen yang teradsobsi kuat pada adsorben yaitu komponen yang bersifat polardalam sampel. Komponen polar tersebut akan terikat kuat pada adsorben karenamempunyai afinitas yang lebih besar dari komponen lainnya sehingga secara selektifakan tertahan pada adsorben.


10

4. Apakah analisis tersebut dapat memisahkan beta karoten dengan karotenoid lainseperti alfa dan gama karoten?Tidak bisa, pada analisis tersebut tidak bisa untuk memisahkan beta karoten dengankarotenoid lain seperti alfa dan gama karoten. Hal tersebut disebabkan karenametode kromatografi kolom hanya dapat memisahkan total karotenoid dalam sampeldengan prinsip memisahkan komponen secara selektif berdasarkan sifat fisik adsobsdengan fase stationer, sehingga tidak dapat memisahkan jenis karotenoid secaraspesifik. Metode yang paling sesuai untuk memisahkan beta karoten dengankarotenoid lain seperti alfa dan gamma karoten yaitu dengan menggunakan HPLC.Karotenoid yang dipisahkan dengan HPLC akan terpisah secara spesifik.

5. Apa fungsi pengukuran kadar beta karoten dalam eluat dengan spektrofotometer?Fungsi pengukuran kadar beta karoten dalam eluat dengan spektrofotometer yaituuntuk mengukur absorbansi eluat beta karoten berdasarkan intensitas warnanyadengan panjang gelombang 450 nm. Dengan diketahuinya absorbansi maka dapatditentukan konsentrasi beta karoten dalam sampel menggunakan kurva standar betakaroten.

6. Apa fungsi ekstraksi dengan petroleum eter-aseton?Fungsi ekstraksi dengan PE-aseton yaitu untuk mengekstrak beta karoten dalamsampel. Beta karoten yang bersifat nonpolar akan larut dalam PE-aseton yang memilikikepolaran yang sama (nonpolar) sehingga dapat dipisahkan dari komponen senyawayang lain.

7. Fraksi apa saja yang terekstrak pada proses ekstraksi tersebut?Fraksi yang terekstak pada proses ekstraksi yaitu fraksi yang bersifat polar dannonpolar. Fraksi polar terekstraksi oleh adanya aseton, sedangkan fraksi nonpolar(beta karoten) terekstraksi oleh PE-aseton.

8. Apa fungsi penambahan akuades pada ekstrak petroleum eter-aseton?Fungsi penambahan akuades pada ekstrak petroleum eter-aseton yaitu untukmengikat fase polar. Dengan penambahan aquades ada pemisahan antara fase polardan nonpolar. Fase polar yang terikat dengan aquades selanjutnya dikeluarkan darikolom agar tidak mengganggu proses ekstraksi beta karoten.

9. Fraksi apa yang larut pada aseton-air dan petroleum eter?Fraksi yang larut pada aseton-air yaitu fraksi polar, sedangkan fraksi yang larut dalamPE yaitu fraksi nonpolar dimana pada percobaan ini fraksi yang bersifat nonpolar yaitubeta karoten.


11

PEMBAHASAN

1. Prinsip & Rumus Kromatografi KolomPrinsip kromatografi yang digunakan yaitu memisahkan komponen secara selektif

berdasarkan sifat fisik adsobs dengan fase stationer berupa adsorben alumina yangmengisi kolom dan fase mobil PE-aseton (10:1) untuk mengelusi atau mengikat senyawanonpolar.

Rumus yang digunakan dalam kromatografi yaitu:y = ax +b persamaan kurva standarKadar ß-karoten = ( )

FP =

Keterangan:Y = absorbansiX = konsentrasiKadar ß-karoten (mg/100g)FP = Faktor pengenceranBerat sampel (gr)Vol keluar kolom (ml)Vol masuk kolom (ml)

2. Analisis Prosedur Kromatografi Kolom

Pada percobaan kromatografi kolom, alat yang digunakan antara lain: mortar,spatula, timbangan analitik, pipet ukur, bulb, erlenmeyer, alumunium foil, shieve skaker,kertas saring, corong kaca, corong pemisah, kolom kromatografi, statif, labu ukur,beaker glass, spektrofotometer, dan kuvet. Bahan yang digunakan antara lain: wortel,jagung manis, PE-aseton (10:1) dan (1:1), kapas, Na2SO4, alumina, dan aquades. Ada tigatahap utama dalam kromatografi kolom yaitu pembuatan kolom, proses ekstraksi sampaifase eter, dan penentuan kadar beta karoten sampel.a) Pembuatan Kolom + Gambar

Pada pembuatan kolom terlebih dahulu dilakukan persiapan alat dan bahan.Sebelum diisi dipastikan terlebih dahulu bahwa kolom kromatografi yang digunakandalam keadaan bersih. Bahan pertama yang dimasukkan yaitu kapas. Kapas digulungatau dipilir kecil supaya lebih mudah dimasukkan sampai ke dasar kolom. Untukmempermudah memasukkan kapas maka digunakan spatula. Kapas yang dimasukkandalam kolom kromatografi setinggi 1,5 cm. Penggunaan kapas tersebut berfungsimembantu penyerapan senyawa yang akan dipisahkan, selain itu kapas berguna untuk


12

menjernihkan ekstrak beta karoten dari pengotor agar tidak terikut dalam ekstraksehingga nantinya akan terpisah dalam labu penampung. Kemudian ditambahkanalumina yang sebelumnya telah ditimbang 10 gram. Alumina ditambahkan sampaisetinggi 10 cm. Penambahan alumina tersebut berfungsi untuk mengikat senyawa yangpolar seperti aseton dan air. Setelah itu ditambahkan Na2SO4 ke dalam kolom sampaitinggi 2 cm. Penambahan Na2SO4 berfungsi untuk mengikat fase polar yang masih adaatau yang tersisa. Komponen terakhir yang dimasukkan dalam kolom kromatografi yaitukapas. Kapas kembali dimasukkan setinggi 1,5 cm. Pengisian harus dilakukan denganhati-hati dan padat agar sampel dapat terekstrak secara optimal.

Gambar kolom kromatografi yang digunakan yaitu:

b) Ekstraksi Sampel ♠ Fase EterPada tahap selanjutnya yaitu proses ekstaksi sampel sampai fase eter. Sebelumnya

dipersiapkan terlebih dahulu alat dan bahan yang akan digunakan. Sampel yangdigunakan dalam percobaan ini yaitu wortel dan jagung manis. Sampel dihaluskanterlebih dahulu untuk memperbesar lusa permukaan dan memperkecil partikel sehinggaproses ekstraksi diharapkan lebih maksimal karena semakin banyak bagian sampel yangterekstrak dengan reagen yang ditambahkan. Setelah itu masing-masing sampel yangsudah dihaluskan diambil dan ditimbang sebanyak 3 gram dengan timbangan analitik.Kemudian masing-masing sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml danditambahkan 20 ml PE-aseton (1:1) yang berfungsi untuk mengekstrak sampel.Selanjutnya erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil untuk mencegah penguapan PE-aseton (1:1) lalu diletakkan ke dalam shieve shaker selama 15 menit agar sampel danreagen homogen serta mempercepat ekstraksi sampel. Setelah itu filtrat disaring keerlenmeyer lainnya menggunakan kertas saring yang diletakkan di atas corong kaca.Dalam penyaringan tersebut didapatkan filtrat yang jernih bebas residu. Setelahpenyaringan tersebut, residu dalam erlenmeyer ditambah lagi dengan PE-aseton (1:1)

Kapas(1,5cm)

Kapas(1,5cm)

Alumina(10cm)

Na2SO4(2cm)


13

untuk mengekstrak lagi beta karoten yang masih tersisa pada residu. Proses ekstraksitersebut dilakukan sebanyak 3x agar proses ekstraksi yang didapatkan bisa maksimal.

Selanjutnya filtrat dalam erlenmeyer dicuci dengan PE-aseton (1:1) untukpengenceran sampai volume 100 ml dalam erlenmeyer. Setelah proses ekstraksi selesai,kemudian diambil 25 ml filtrat dan dimasukkan ke dalam corong pemisah. Laluditambahkan 25 ml aquades dalam corong pemisah tersebut lalu dikocok. Penambahanaquades tersebut berfungsi untuk mengikat fase polar, sedangkan pengocokandilakukan agar aquades dan filtrat bercampur. Pengocokan dilakukan sampai tidak adatekanan dalam corong pemisah yang ditandai dengan tidak ada bunyi ketika kran corongpemisah dibuka. Kemudian dibiarkan sampai terjadi pemisahan dimana senyawa polarakan terikat dengan aquades yang berada pada bagian bawah corong pemisah,sedangkan senyawa non-polar akan berada pada bagian atas corong pemisah. Lapisanpada bagian bawah yang berupa aseton dan air dialirkan keluar dari corong pemisahmelalui kran corong dan dibuang sehingga didapatkan lapisan berupa senyawa nonpolar(fase eter). Fase eter tersebut kemudian ditambah lagi dengan 25 ml aquades dandikocok kembali lalu dibiarkan sampai terjadi pemisahan kembali. Setelah terjadipemisahan, lapisah bawah berupa air dan aseton dialirkan keluar dari corong pemisahdan dibuang. Sementara lapisan atas berupa senyawa nonpolar diambil dan dimasukkanke dalam beaker glass lalu ditutup dengan alumunium foil yang selanjutnya dilakukanpenetapan kadar beta karoten dari masing-masing sampel.

c) Penentuan Kadar ß-karotenFase eter yang telah didapatkan dari proses ekstraksi sampel dalam erlenmeyer

kemudian ditambahkan 1 gram Na2SO4 yang berfungsi untuk mengikat fase polar(aquades) yang masih tersisa. Setelah itu diaduk dan dimasukkan dalam gelas ukursebagai volume masuk kolom. Kemudian dimasukkan dalam kolom kromatografi danditambahkan larutan PE-aseton (10:1). Penambahan larutan PE-aseton (10:1) tersebutberfungsi sebagai fase mobil yang mengelusi senyawa nonpolar dan mengekstrakkaroten dalam sampel. lalu ditunggu sampai terjadi pemisahan antara komponen polardan nonpolar dalam kolom kromatografi. Proses pemisahan dapat dipercepat denganmemberikan tekanan udara dari bagian atas kolom dengan cara menutup kolom denganplastik dan karet. Komponen non-polar berupa beta karoten akan terelusi sampai bagianbawah kolom lalu turun ke dalam tabung penampung atau labu ukur. Setelah semua betakaroten tertampung dalam labu ukur, selanjutnya labu ukur dipindahkan dan betakaroten yang didapatkan diencerkan dengan PE-aseton (10:1) untuk mengikat senyawanonpolar beta karoten. Setelah itu diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometerdengan panjang gelombang 450 nm. Lalu dibuat kurva standar yang sebelumnya telahdiketahui nilai absorbansi dan konsentrasi. Selanjutnya dihitung kadar beta karoten


14

menggunakan rumus yang telah tersedia sehingga didapatkan kadar beta karoten darimasing-masing sampel dalam mg/100g.

3. Analisis Hasil Kromatografi Kolom

Dari hasil percobaan dengan metode kromatografi kolom maka didapatkan kadarbeta karoten masing-masing sampel dari proses pemisahan. Selama proses kromatografikolom terjadi pemisahan beta karoten dari sampel dimana beta karoten yang didapatkantersebut diukur absorbansinya dengan spektrofotometer yang nantinya akan diketahuikonsentrasi. Sampel yang dilakukan dalam percobaan yaitu wortel dan jagung manis.Namun yang dibahas kali ini tidak hanya 2 sampel tersebut melainkan juga sampelbrokoli dan paprika kuning dimana data diperoleh dari praktikum kelas sebelumnya.

Pada sampel wortel didapatkan berat sampel sebanyak 3,0353 gram, volume yangmasuk kolom sebesar 9 ml, volume keluar kolom sebesar 25 ml, absorbansi yang terukursebesar 1,172, dan kadar beta karoten yang didapatkan dari sampel wortel sebesar432,43 mg/100g. Dari percobaan tersebut absorbansi yang terukur sangat besarsehingga kadar beta karoten pada sampel wortel yang terhitung juga tinggi. Jikadibandingkan dengan literatur maka hasil yang didapatkan sangat berbeda. MenurutPark (2007), kadar beta karoten pada wortel segar yaitu sebesar 989 µg/gr atau setaradengan 98,9 mg/100g. Kadar beta karoten yang didapatkan dari literatur jauh lebihrendah dibandingkan dengan kadar beta karoten dari percobaan yang dilakukan yaitusebesar 432,43 mg/100g.

Pada sampel jagung manis didapatkan berat sampel sebanyak 3,0093 gram, volumeyang masuk kolom sebesar 9 ml, volume keluar kolom sebesar 25 ml, absorbansi yangterukur sebesar 0,103, dan kadar beta karoten yang didapatkan dari sampel jagungmanis sebesar 44,28 mg/100g. Dari percobaan tersebut absorbansi yang terukur rendahsehingga kadar beta karoten pada sampel jagung manis yang terhitung juga rendah. Jikadibandingkan dengan literatur maka hasil yang didapatkan sangat berbeda. MenurutSafawo (2010), kadar beta karoten pada jagung manis yaitu sebesar 5,8 µg/gr atau setaradengan 0,58 mg/100g. Kadar beta karoten yang didapatkan dari literatur jauh lebihrendah dibandingkan dengan kadar beta karoten dari percobaan yang dilakukan yaitusebesar 44,28 mg/100g.

Pada sampel brokoli didapatkan berat sampel sebanyak 3,0216 gram, volume yangmasuk kolom sebesar 10 ml, volume keluar kolom sebesar 25 ml, absorbansi yangterukur sebesar 0,129, dan kadar beta karoten yang didapatkan dari sampel brokolisebesar 58,42 mg/100g. Dari percobaan tersebut absorbansi yang terukur rendahsehingga kadar beta karoten pada sampel brokoli yang terhitung juga rendah. Jikadibandingkan dengan literatur maka hasil yang didapatkan sangat berbeda. Menurut


15

Howard (2009), kadar beta karoten pada brokoli segar yaitu sebesar 361 µg/100gr atausetara dengan 0,361 mg/100g. Kadar beta karoten yang didapatkan dari literatur jauhlebih rendah dibandingkan dengan percobaan yang dilakukan yaitu sebesar 58,42mg/100g.

Pada sampel paprika kuning didapatkan berat sampel sebanyak 3,0134 gram,volume yang masuk kolom sebesar 8 ml, volume keluar kolom sebesar 25 ml, absorbansiyang terukur sebesar 0,180, dan kadar beta karoten yang didapatkan dari sampelpaprika kuning sebesar 86,59 mg/100g. Dari percobaan tersebut absorbansi yangterukur cukup rendah sehingga kadar beta karoten pada sampel paprika yang terhitungjuga cukup rendah. Jika dibandingkan dengan literatur maka hasil yang didapatkansangat berbeda. Menurut Kan et.al (2007), kadar beta karoten pada paprika kuning yangdisimpan pada suhu rendah (10oC) yaitu sebesar 43,9 µg/gr atau setara dengan 0,439mg/100g. Kadar beta karoten yang didapatkan dari literatur jauh lebih rendahdibandingkan dengan percobaan yang dilakukan yaitu sebesar 86,59 mg/100g.

Jika diurutkan kadar beta karoten masing-masing sampel dari yang tertinggisampai terendah yaitu (1) kadar beta karoten paling tinggi terdapat pada wortel denganbeta karoten sebesar 432,43 mg/100g, (2) kadar beta karoten pada paprika kuningsebesar 86,59 mg/100g, (3) kadar beta karoten pada brokoli sebesar 58,42 mg/100g, (4)dan yang terendah terdapat pada jagung manis dengan kadar beta karoten sebesar 44,38mg/100g. Dari keempat sampel tersebut kadar beta karoten yang paling tinggi yaitupada wortel yaitu sebesar 432,43 mg/100g. Hal tersebut juga telah sesuai denganbeberapa literatur pada masing-masing sampel yang menyatakan bahwa kadar tertinggidiantara keempat sampel yaitu pada wortel dengan kadar beta karoten sebesar 989µg/gr atau setara dengan 98,9 mg/100g (Park, 2007).

Menurut Rachman & Histifarina (2010), wortel merupakan salah satu jenis sayuranyang bernilai gizi cukup tinggi, terutama kandungan senyawa karoten yaitu alfa dan betakaroten. Kedua senyawa ini merupakan sumber provitamin A dan prekursor vitamin A.Adanya kandungan beta karoten yang cukup tinggi menjadikan wortel mempunyaiprospek yang baik sebagai sumber provitamin A untuk mencegah penyakit kekuranganvitamin A yang masih banyak diderita oleh sebagian masyarakat Indonesia. Di dalamtubuh beta karoten akan diubah menjadi vitamin A yang bermanfaat bagi kesehatantubuh untuk pertumbuhan, pemeliharaan jaringan tubuh terutama penglihatan (mata),reproduksi, perkembangan janin serta untuk mengurangi resiko timbulnya penyakitkanker dan hati.

Dari data percobaan yang telah diperoleh menunjukkan bahwa adanya perbedaankadar beta karoten yang sangat jauh dengan data dari literatur. Perbedaan yang paling


16

menonjol yaitu pada sampel wortel dimana pada percobaan sebesar 432,43 mg/100gsedang pada literatur sebesar 98,9 mg/100g. Perbedaan juga terjadi pada pengurutankadar beta karoten dari yang tertinggi sampai terendah dimana pada hasil percobaanjika diurutkan yaitu mulai dari wortel, paprika kuning, brokoli, dan jagung manis.Sedangkan menurut literatur urutan kadar beta karoten dari yang tertinggi sampaiterendah yaitu mulai dari wortel, jagung manis, paprika kuning, dan brokoli.

Perbedaan tersebut disebabkan karena beberapa faktor, salah satunya yaitu karenaperbedaan varietas sampel. Varietas yang berbeda antara sampel percobaan denganliteratur membuat perbedaan kandungan nilai gizi atau nutrisi di dalamnya termasukkandungan beta karoten. Hal tersebut dapat ditunjukkan pada literatur, menurut Safawo(2010), dengan sampel jagung dimana pada varietas jagung UMI 176 dengan warnakuning mempunyai kandungan beta karoten sebesar 5,8 µg/gr, sedangkan pada varietasUMI 69 yang berwarna orange mempunyai kadar beta karoten yang lebih rendah yaitusebesar 0,78 µg/gr. Selain itu perbedaan juga terjadi karena perbedaan suhupenyimpanan dan tingkat kematangan. Untuk faktor suhu penyimpanan dapatditunjukkan pada literatur, menurut Kan et.al (2007), dengan sampel paprika kuning yangdisimpan pada suhu rendah (10oC) mempunyai kadar beta karoten sebesar 43,9 µg/g,sedangkan pada paprika kuning yang disimpan pada suhu ruang (20oC) mempunyaikadar beta karoten yang lebih rendah yaitu sebesar 15,6 µg/g.

Perbedaan lain dapat disebabkan pada saat proses ekstraksi beta karoten masing-masing sampel dalam kolom kromatografi. Secara umum, faktor yang mempengaruhianalisis beta karoten dengan metode kromatografi kolom antara lain: jenis pelarut, jenissampel, jenis adsorben, dan jenis penyaringan. (1) Jenis Pelarut: pelarut yang digunakanharus sesuai dengan sampel yang akan dianalisis. Bila senyawa yang ingin dipisahkanuntuk analisis bersifat nonpolar, maka jenis pelarut yang digunakan juga pelarut yangbersifat nonpolar. (2) Jenis Sampel: sampel yang berbeda akan menyebabkanperbedaan kandungan nilai gizi terutama kadar beta karoten yang kan dianalisis denganteknik pemisahan kromatografi kolom. (3) Jenis Adsorben: jenis adsorben yangdigunakan juga harus sesuai denagn sampel yang akan dianalisis atau dipisahkan. Jenisadsorben sangat berpengaruh karena bertindak sebagai fase stationer atau fase diamdalam kromatografi kolom yang akan menahan atau mengadsobsi komponen senyawayang bersifat polar. (4) Jenis Penyaringan: penyaringan awal harus dilakukan dengancermat untuk mendapatkan filtrat yang bebas dari zat pengotor atau senyawa lain yangakan mengganggu proses pemisahan dalam kolom kromatografi.


17

4. Kurva Standar

Berdasarkan kurva standar tersebut didapatkan persamaan regresi linear y =0,255x -0,033 dengan R2 sebesar 0,728. Nilai R2 yang didapatkan kurang dari nilaiminimum R2 pada persamaan regresi linear, dimana nilai R2 minimal 0,9 yang akanmenunjukkan tingkat akurasi dan presisi data yang diperoleh, selain itu akanmenunjukkan garis yang semakin linear. Jika nilai R2 sebesar 0,728 maka data yangdiperoleh kurang linear dan kurang presisi dimana perbedaan yang jauh terjadi antaraabsorbansi pada konsentrasi 0,8 yaitu 0,1 dengan absorbansi pada konsentrasi 1,0 yaitu0,312, hal tersebut dapat ditunjukkan pada kurva yang meningkat secara tajam. Darikurva standar tersebut juga menunjukkan bahwa kurva yang didapatkan terusmeningkat. Dimana peningkatan konsentrasi beta karoten (x) berbanding lurus dengannilai absorbansi (y) yang diperoleh. Semakin tinggi konsentrasi larutan sampel makaakan semakin tinggi pula nilai absorbansi yang didapatkan. Menurut Kusmiati (2010),kurva standar beta karoten yang didapatkan yaitu dengan persamaan regresi linear y =0,177x - 0,003 dengan R2 sebesar 0,974. Kurva standar tersebut sudah bagus karenamemiliki nilai R2 lebih dari 0,9 yang menunjukkan bahwa data yang diperoleh akurat danpresisi sehingga membentuk kurva yang lebih linear.

y = 0.255x - 0.033R² = 0.728

-0.100-0.0500.0000.0500.1000.1500.2000.2500.3000.350

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200

Abso

rban

si

Konsentrasi

Kurva Standar

Series1Linear (Series1)


18

KESIMPULAN

Dari hasil percobaan Kromatografi yang telah dilakukan maka dapat disimpulkanbahwa prinsip dari kromatografi yaitu memisahkan komponen secara selektifberdasarkan sifat fisik adsobs dengan fase stationer berupa adsorben alumina yangmengisi kolom dan fase mobil PE-aseton (10:1) untuk mengelusi atau mengikat senyawanonpolar. Rumus yang digunakan yaitu y = ax +b; Kadar ß-karoten = ( ) ,

dimana FP = .

Data yang didapatkan yaitu dengan persamaan regresi y=0,255x-0,033. Kadar betakaroten yang didapatkan pada sampel paprika kuning yaitu 86,59 mg/100g, kadar betakaroten yang didapatkan pada sampel wortel yaitu 432,43 mg/100g, kadar beta karotenyang didapatkan pada sampel brokoli yaitu 58,42 mg/100g, kadar beta karoten yangdidapatkan pada sampel jagung manis yaitu 44,28 mg/100g. Faktor-faktor yangmempengaruhi dalam percobaan ini yaitu jenis sampel, jenis pelarut, jenis adsorben,dan jenis penyaringan.


19

DAFTAR PUSTAKA

Gritter, R., dkk. 2004. Pengantar Kromatografi Edisi kedua. Bandung: ITBHoward, L.A., et.al. 2009. ß-Carotene and Ascorbic Acid Retention in Fresh and Processed

Vegetables. Journal of Food Science, Volume 64, No.5 : 929-936Iskandar, A. 2007. Proses Pembuatan Tepung Jagung. http://eprints.undip.ac.id. Diakses

Tanggal 22 Mei 2014Kan, Elena,E.L., et.al. 2007. Changes in the Postharvest Quality of Datil Hot Peppers as

Affected by Storage Temperature. Proc Fla State Horticulture, 120 : 246-250Kurniasih, S. 2011. Pemanfaatan Brokoli sebagai Antioksidan. http://repository.usu.ac.id.

Diakses Tanggal 22 Mei 2014Kusmiati, dkk. 2010. Ekstraksi dan Purifikasi Senyawa Lutein dari Mikroalga Chlorella

pyrenoidosa Galur Lokal Ink. Jurnal Kimia Indonesia, Vol.5 (1) Hal.30-34Rachman, A. & Histifarina, D. 2010. Potensi Sayuran Wortel dan Produk Olahannya

sebagai Pangan Fungsional. http://journal.unnes.ac.id. Diakses Tanggal 22 Mei2014

Usmiati, dkk. 2009. Pengembangan produk Pangan Berbahan Baku Labu Kuning. Jakarta:Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Balai Pengkajian TeknologiPertanian

Khopkar, SM. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-PressNoviyanti, l. 2010. Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom Untuk Pemisahan Trigliserida dari

Ekstrak Buah Merah. Surakart: Universitas Sebelas MaretPark, Y. W. 2007. Effect of Freezing, Thawing, Drying, and Cooking on Carotene Retention

in Carrots, Broccoli, and Spinach. Journal of Food Science, Volume 52, No.4 : 1022-1025

Safawo, T., et.al. 2010. Exploitation of Natural Variability in Maize for ß-Carotene ContentUsing HPLC and Gene Spesific Markers. Electronic Journal of Plant Breeding, 1 (4) :548-555

Sastrohamidjojo, Hardjono. 2004. Teknik Pemisahan Kromatografi. Yogyakarta: UGM Press

Documents

8._Kromatografi_Kolom-libre.pdf