Dr. sc. Dragana Mutavdžić Pavlović, doc.

Zavod za analitičku kemiju

Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije

Sveučilišta u Zagrebu

Ak. g. 2011./2012.

PROCESNA I

INSTRUMENTALNA

ANALIZA

Kromatografski sustav čine analizirani uzorak te pokretna i nepokretna faza

Kromatografija normalnih faza - nepokretna je faza polarna (silikagel,

aluminijev oksid), a pokretna nepolarna

Kromatografija obrnutih faza - nepokretna faza nepolarna (C18-modificirani

silikagel), a pokretna polarna

KROMATOGRAFSKI SUSTAV

kromatografsko razdvajanje normalnih faza

kromatografsko razdvajanje obrnutih faza

Redoslijed opadanja polarnosti komponenti

Žuta

Crvena

plava

nepokretna faza

nepokretna faza

pokretna faza

pokretna faza

Nepokretna faza je čvrsta tvar ili kapljevina na inertnom nosaču.

Obzirom na kemijsku strukturu i polarnost, sorbensi se dijele na:

polarne anorganske (hidrofilne) sorbense, čiji su predstavnici

silikagel, aluminijev oksid i magnezijev silikat

nepolarne anorganske sorbense, kao što su aktivni ugljen i grafit

polarne vezane faze, npr. aminopropil, cijanopropil, diol

nepolarne vezane faze poput alkana, C8 i C18 ugljikovodika i

polarne organske sorbense koje predstavljaju celuloza, hitin,

poliamid

Izbor nepokretne faze uvjetovan je prirodom ispitivanog spoja,

prirodom ravnoteže kromatografskog procesa i vrstom veze koja

nastaje između ispitivanog spoja i kromatografske podloge. Stoga

je izbor sorbensa jedan od najvažnijih čimbenika u

kromatografskom procesu.

NEPOKRETNA FAZA

silikagel je jedan od najviše upotrebljavanih nepokretnih faza

opća mu je formula SiO2·xH2O, a strukturno predstavlja nepravilnu

prostornu rešetku SiO4-tetraedra

Kemijski vezane faze dobivaju se uvođenjem pogodnih funkcionalnih skupina

na površinu polarnog silikagela, čime se može bitno utjecati na promjenu

njegovih adsorpcijskih svojstava. Svojstva kemijski vezanih faza ovise o:

vrsti i duljini vezanih lanaca ugljikovodika,

pokrivenosti površine vezanom skupinom,

vrsti intermolekularnih interakcija organskog otapala i funkcionalne skupine

na površini adsorbensa

Shematski prikaz modificiranih silikagelnih podloga

Površina silikagela modificira se djelomično zamjenom hidroksilnih skupina

polarnim funkcionalnim skupinama (cijanopropil, diol, aminopropil) ili

nepolarnim (C8-C

18).

Kemijskim vezanjem zamjenjuje se najviše do 50% silanolnih skupina.

Uvođenjem nepolarnih skupina smanjuje se broj aktivnih mjesta na površini

silikagela, čime se uvelike smanjuje njegova polarnost, a uvedene polarne

skupine i same postaju sorpcijski centri.

Fizikalno impregnirani slojevi

U tankoslojnoj se kromatografiji silikagelni sloj može impregnirati različitim

dodacima sa svrhom poboljšanja njegovih svojstava za željenu separaciju. To

se provodi prilikom priprave sloja, a može se obaviti i naknadno uranjanjem ili

prskanjem već pripremljenog sloja sredstvom za impregniranje.

Izbor sredstva ovisi o cilju kromatografskog razdvajanja i mora voditi

poboljšanju postojećeg kromatografskog sustava.

Dodaci koji utječu na kromatografski proces mogu se klasificirati na:

Tvari koje mijenjaju pH-vrijednost kromatografskog sustava

Tvari koje mijenjaju ravnotežno stanje kromatografskog sustava

Tvari koje pojačaju selektivnu adsorpciju

Specifični dodaci kromatografskoj podlozi

da bi se s obzirom na izbor nepokretne faze omogućio optimalan

kromatografski sustav za razdvajanje željene smjese treba izabrati pogodan

sustav otapala koji čini pokretnu fazu

priroda veze koja se ostvaruje između ispitivanog spoja te nepokretne i

pokretne faze važan je čimbenik realnog kromatografskog procesa

intermolekularne interakcije van der Waalsovim silama, veze dipol-inducirani

dipol, dipol-dipol te vodikova veza najčešće su u kromatografiji normalnih i

obratnih faza

izbor pogodnog otapala, odnosno smjese otapala, provodi se s obzirom na

sposobnost otapala da stvaraju vodikove veze (odjeljivanje hidrofilnih, odnosno

hidrofobnih spojeva)

otapala moraju biti kromatografski čista, što znači da ne sadržavaju nikakvu

nečistoću koja bi mogla smetati tijekom kromatografskog određivanja

POKRETNA FAZA

S obzirom na sposobnost tvorbe vodikove veze otapala su podijeljena

u pet skupina:

1. tekućine kojima su molekule međusobno povezane višestrukim

vodikovim vezama (voda, glicerin, aminoalkoholi, etilenglikol i sl.)

2. tekućine kojima su molekule povezane vodikovom vezom i koje

mogu tvoriti vodikovu vezu s molekulama ispitivanog spoja

(alkoholi, fenoli, amini)

3. tekućine kojima molekule sadrže atome kisika, koji mogu imati

udjela u vodikovoj vezi, ali ne sadrže atome vodika (ketoni, eteri,

esteri, aldehidi)

4. tekućine kojima molekule sadrže atom vodika, koji može tvoriti

vodikovu vezu, ali ne sadrže odgovarajuće atome koji bi mogli

imati udjela u vezi (kloroform, diklormetan)

5. ostale tekućine kojima molekule mogu tvoriti vodikovu vezu

Jakost otapala u kromatografiji normalnih faza povećava se s

porastom polarnosti pokretne faze, a u kromatografiji obrnutih faza se

smanjuje s njezinom polarnošću

1. alifatski eteri, trialkil amini, tetrametil gvanidin,

heksametil amidi fosforne kiseline

2. alifatski alkoholi

3. derivati piridina, tetrahidrofuran, amidi (osim

formamida), glikol eteri, sulfoksidi

4. glikoli, benzilalkohol, octena kiselina, formamid

5. metilen klorid, etilen klorid

6. (A) trikrezil fosfat, alifatski ketoni i esteri,

polieteri, dioksan,

(B) sulfoni, nitrili, propilen karbonat

7. aromatski ugljikovodici, halogen supstituirani

aromatski ugljikovodici, nitro spojevi, aromatski

eteri

8. fluoralkani, m-krezol, voda, kloroform

Snyderov trokut selektivnosti

Na temelju indeksa polarnosti, P, te parametara selektivnosti (Xe, Xd, Xn) otapala,

Snyder ih je podijelio u osam skupina što je grafički prikazao Snyderovim trokutom

selektivnosti.

Parametri selektivnosti ovise o proton-donorskim (Xd) , proton-akceptorskim (Xe) i

dipolnim (Xn) svojstvima molekula otapala.

najjednostavniji način odjeljivanja tekućinskom kromatografijom je

izokratno eluiranje – pri kojoj analit kroz kolonu nosi jedno otapalo

odnosno ne mijenja se sastav pokretne faze tijekom cijele analize

ipak često bolje razdvajanje se postiže (veća djelotvornost)

primjenom gradijentnog eluiranja uz upotrebu dvaju ili više sustava

otapala znatno različitih polarnosti

pri gradijentnoj eluciji sastav pokretne faze se mijenja tijekom analize

kontinuirano ili skokovito

primjer gradijentnog eluiranja

Optimizacija polarnosti pokretne faze – promjena sastava

pokretne faze utječe na odjeljivanje

Pokretna faza: tekućina

Nepokretna faza: punila vrlo finih zrna

Tlak: nekoliko MPa (do 4 x 107 Pa = 400 bara)

Podjela HPLC (High Performance Liquid Chromatography):

(1) Razdjelna kromatografija

(2) Adsorpcijska kromatografija

(3) Ionsko-izmjenjivačka kromatografija

(4) Kromatografija isključenjem na osnovi veličine čestica

Doseg HPLC: najveći u separacijskim tehnikama,

proizvodnja > mld USD godišnje

Prednosti HPLC:

osjetljivost,

prilagodljivost,

analiza neisparljivih i termički osjetljivih spojeva,

široki spektar uzoraka (industrija, znanost: aminokiseline, nukleinske

kiseline, šećeri, lijekovi, pesticidi, organometalni spojevi, anorganske tvari i

dr.)

TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI

Shema tekućinskog kromatografa visoke djelotvornosti

1. Unošenje (injektiranje) analita

unošenje uzorka u pokretnu fazu

2. Razdvajanje analita u koloni

sastojci iz analita razdvajaju se u koloni na temelju različite raspodjele

između dviju faza

3. Eluacija (ispiranje) komponenti iz kolone

različiti sastojci izlaze iz kolone u različitim vremenima

4. Detekcija

eluirane komponente obično se analiziraju mjerenjem neke od

fizikalnih svojstava komponente (indeks refrakcije, UV apsorpcija,

električna vodljivost …)

Kromatografska analiza:

osnovni dijelovi uloga

spremnik (jedan ili više) izvor protoka pokretne faze

crpke (pumpe) za pokretanje pokretne faze

injektor ili sustav za unošenje

uzorka

za precizno odmjeravanje i

unošenje uzorka u kolonu

kolona za razdvajanje komponenata

smjese

termostat za održavanje konstantne

temperature

detektor detektira komponente smjese istim

redoslijedom kako one napuštaju

kolonu

sustav za registriranje signala iz

detektora

za dobivanje trajnog dokumenta o

pojavljivanju svake komponenti iz

ispitivane smjese

stakleni ili čelični spremnik

često se u sklopu tog sustava nalazi i oprema za uklanjanje plinova i čvrstih čestica iz tekućine

otplinjavanje je postupak kojime se otopljeni plinovi uklanjaju iz otapala nošeni mjehurićima inertnog, netopljivog plina

plinovi, zbog stvorenih mjehurića, mogu prouzročiti širenje kromatografske zone

mjehurići i čestice mogu ometati rad detektora

SPREMNIK POKRETNE FAZE

pumpa je jedan od najvažnijih dijelova kromatografskog sustava tekućinske kromatografije visoke djelotvornosti

pumpa održava kontinuirano konstantan protok pokretne faze kroz HPLC injektor, kolonu i detektor

pumpe se može podijeliti na pumpe s konstantnim tlakom i pumpe s konstantnim protokom

pumpe s konstantnim tlakom se koriste kod punjenja kolona sorbensom, tj. punilima

pumpe s konstantnim protokom su kolone koje se uobičajeno koriste u HPLC sustavima

za primjenu u tekućinskoj kromatografiji pogodne su dvije vrste mehaničkih pumpi: pumpe s vijčanim pogonom i recipročna pumpa

pumpe s vijčanim pogonom imaju mali kapacitet ( 250 mL) i nepogodne su za promjenu otapala

recipročne pumpe puno se više upotrebljavaju jer su pogodne za rad s gradijentom i daju konstantne protoke. Nedostatak im je taj što su skupe

zahtjevi kojima moraju udovoljiti pumpe vrlo su strogi:

tlakovi do 40 MPa

izlaz bez pulsiranja tlaka

brzine protoka od 0,01 do 10 mL/min

reproducibilnost protoka od 99,5% ili bolja

otpornost na koroziju izazvanu različitim otapalima Miješanje otapala kod niskog

tlaka

A i B - otapala; SC-nadzorni

sustav; P - pumpa, SV – solenoidni

ventil

M - komora za miješanje otapala

Miješanje otapala kod visokog tlaka

A i B –otapala; SC-nadzorni sustav; PA i

PB- pumpa za otapala A i pumpa za

otapalo B,

M-komora za miješanje otapala

Shematski prikaz recipročne pumpe

a- motor; b- regulator brzine; c- brtva; d- klip;

e- ulaz otopine; f- ventili; g- izlaz otopine

PUMPE ILI CRPKE

Protok je vrlo bitan za kromatografski proces

Veći protok kroz kolonu uzrokuje

jače širenje kromatografskih zona

slabije (lošije) razdvajanje pojedinih sastojaka uzorka

kraće vrijeme analize

Manji protok kroz kolonu

manje širenje kromatografskih zona

bolje razdvajanje pojedinih sastojaka uzorka

dulje vrijeme analize

uzorak se najčešće unosi kroz elastičnu membranu, tzv. septum

taj način nije osobito reproducibilan pa je ograničen na tlakove niže od 10 MPa

pri unošenju uzorka uz zaustavljanje protoka makne se matica na početku

kolone, a uzorak se injekcijskom štrcaljkom unese na početak punila

najčešće se unosi putem plinskog ventila

u sustavu za unošenje uzorka nalazi se i više izmjenjivih petlji kojima se u

kolonu mogu unositi količine uzorka od 5 do 500 L

SUSTAV ZA UNOŠENJE UZORKA

Sustav za ručno (a) i automatsko unošenje uzorka Varian ProStar 410 (b)

te

shematski prikazi petlje kojima se unose uzorci u kolonu

a) b)

od nehrđajućeg čelika ili od stakla (samo za niske tlakove <4MPa) punjene

granulama nepokretne faze

punilo najčešće silikagel

povijesni razvoj povećanja separacijske učinkovitosti HPLC kolona

duljina kolone najčešće 5 – 25 cm (danas postoje na tržištu i one od 3-7,5 cm)

unutarnjeg promjera: 2; 4,6 mm

promjer zrna punila: 2; 4; 5; 10 m

KOLONE

HPLC detektori mogu se podijeliti u dvije kategorije:

nespecifični (ili univerzalni) – mjeri se refrakcijski indeks (RI) ili dielektrična konstanta uzorka

specifični – fizikalna ili kemijska svojstva se mjere pod idealnim uvjetima,

npr. UV apsorpcija, spektrometrija masa (MS)

HPLC detektori:

= Refrakcijski detektor (RI) za mjerenje refrakcijskog indeksa

= UV/Vid detektori: -s fiksnom valnom duljinom

-s promjenjivom valnom duljinom

-s nizom dioda (DAD)

= Fluorescentni detektor (FLD)

= Konduktometrijski detektor

= Spektrometar masa (MS).

Treba naglasiti neke bitne parametre koje mora zadovoljavati jedan detektor:

mali pomak i šum kod snimanja bazne linije (izuzetno bitno kod analize u tragovima)

visoka osjetljivost

brzi odziv

široko linearno dinamičko područje rada (jer to pojednostavljuje kvantifikaciju)

mali „mrtvi“ volumen (što znači minimalno širenje kromatografske krivulje)

dizajn protočnih ćelija detektora koje će sprječavati ponovno miješanje razdvojenih analita

neosjetljivost na promjenu vrste otapala, protoka i temperature

da se njima jednostavno i pouzdano rukuje

podesivi tako da se mogu optimirati za različite spojeve

nedestruktivni obzirom na uzorak

DETEKTORI

• univerzalni HPLC detektor, a princip mu se temelji na mjerenju refrakcijskih indeksa otopina

koje prolaze kroz ćeliju

• što je veća razlika refrakcijskog indeksa između pokretne faze i uzorka, tim je veća

osjetljivost detektora.

• problem nastaje kod vrlo složenih uzoraka jer se često dešava da neki od analita imaju isti

indeks refrakcije kao i pokretna faza, pa te komponente postaju nevidljive za detektor

• kod ovih detektora predstavlja veliki problem rad s gradijentom pokretne faze, jer svaka

promjena u sastavu pokretne faze zahtjeva ponovno uravnoteženje detektora

• danas postoje dvije vrste RI detektora, i obje vrste zahtijevaju dvostruke ćelije, gdje kroz

jednu prolazi uzorak, a kroz drugu konstantno za usporedbu prolazi pokretna faza bez

uzorka.

• jedna vrsta RI detektora se naziva deflekcijskim detektorima (slika a), kojima ne smetaju

nečistoće i zrak u uzorku i pokretnoj fazi i mogu pokriti cijelo refrakcijsko područje od 1.000

do 1.750 s jednom ćelijom, no imaju malu osjetljivost

• druga vrsta RI detektora (slika b) su reflektivni detektori koji se temelje na Frensel principu i

u pravilu su vrlo rijetko u uporabi iako imaju visoku osjetljivost i kod viših koncentracija

uzoraka, te dobro rade i kod vrlo malih protoka pokretne faze. Glavni nedostatak im je česta

promjena prizmi.

• općenito RI detektori osjetljivi su na promjene koncentracije od 1 ppm, a na pomak bazne

linije značajno utječe promjena sastava pokretne faze, nepravilno miješanje, kao i promjena

temperature i tlaka

• preporuča se termostatiranje detektora

Refrakcijski detektor (RI)

a) Deflekcijski RI detektor

b) Refleksijski Fresnelov RI detektor

a) b)

svojstva: univerzalnost, jednostavnost, selektivnost, osjetljivost

vrlo su rašireni

načelo: apsorpcija elektromagnetskog zračenja u UV-(170 - 400 nm) i

VIS-području (400 - 750 nm)

Lambert-Beerov zakon (za kvantitativnu primjenu):

A = Ɛ × b × c

tipični UV/VIS-detektor: volumen 1-10 μl, duljina 2-10 mm,

tlak < 40 bar (potrebni reduktori)

UV/VIS-apsorpcijski detektori

s fiksnom valnom duljinom s promjenjivom valnom duljinom

Detektori s filterima

Izvor zračenja: Hg-lučnica iz koje filtar izdvaja λ = 254 nm (odnosno

250, 313, 334 nm) - primjena ograničena

Izvor zračenja: deuterijeva (D2) ili volframova (W) lampa s više filtera

(rotirajući) - za serijske analize uzoraka poznata sastava

Detektori s monokromatorima

Prizme ili optičke rešetke razdvajaju polikromatsko svjetlo na

komponente određenih valnih duljina koje se potom djelovanjem

pukotine odaberu prema uzorku da bi se snimio cijeli kromatogram

Alternativa: za svaku komponentu uzorka (ako su dovoljne razlike tR)

odabire se najpogodnija λ, uz moguću kompjutorsku podršku

izvor D2-lučnica (190-800 nm), uz izdvajanje putem rešetke snopova

širokih 2-4 nm (starije naprave 20-40 nm)

Detektor s nizom dioda

Načelo: osvjetljivanje uzorka polikromatskim svjetlom (“bijelim”) D2-

lučnice, a potom disperzija optičkom rešetkom na snopove 2 nm koji

istodobno padaju na niz od cca 316 dioda

cijeli snimak (scan): 0,1 sekunda (u praksi nekoliko sekundi) uz odličnu

reproducibilnost

dobiva se i pohranjuje cijeli spektar svake komponente

Fluorescencijski detektori

fluorescencija – neke tvari apsorbiraju elektromagnetsko zračenje i pri

relaksaciji (prelazak iz pobuđenog u osnovno stanje) emitiraju zračenje

više valne duljine λ (često u vidljivom dijelu spektra, VIS)

ograničeno na fluorescirajuće spojeve (farmacija, prirodni i klinički

spojevi,naftni derivati); moguća je pretvorba nefluorescirajućih u

fluorescirajuće spojeve!

izvori elektromagnetskog zračenja:

(1) Hg-lučnica (emitirano svjetlo izolira se s filtera)

(2) Xe-izvor (monokromatori su optičke rešetke)

emitirana svjetlost širi se u svim smjerovima pa je fotoelektrični

detektor pod 900 prema λ upadne zrake

Elektrokemijski detektori

npr. polarografski- komponente koje se mogu oksidirati ili reducirati;

potencijal DME se dovodi na vrijednost granične id svih komponenata i

registrira se I=f(t)

konduktometrijski – komponente koje se analiziraju mijenjaju

električnu provodnost pokretne faze

• podjela prema načinu ionizacije uzorka:

• ionizacija elektroraspršenjem (ESI)1,

• kemijska ionizacija pri atmosferskom tlaku (APCI)2,

• fotoionizacija pri atmosferskom tlaku (APPI)3

• kod LC/MS sustava kao analizatori masa mogu se koristiti:

• kvadrupolni analizator koji se sastoji od četiri štapa pod elektromagnetskim poljem (Q)4,

• analizator koji “zarobi” ion u šupljini ili ionska klopka (IT) ili linearna ionska klopka (LIT) 5,

• analizatori koji mjere vrijeme preleta iona kroz cijev nakon pobude elektrostatskom silom (TOF)6

• analizatori gdje ioni ulaze u ciklotron te nakon elektromagnetske pobude ovisno o masi izlaze iz komore do detektora (FT-ICR)7

• te njihove kombinacije (hibridni sustavi – različiti analizatori masa vezani u seriju) koje se mogu vezati jedna na drugu (ESI-MS/MS, Q-TOF, TOF-MS, IT-MS/MS, LIT-FT-ICR)

• ioni nakon analizatora masa dolaze na detektor, a u LC/MS sustavu kao detektori se koriste elektronsko pojačalo i mikrokanalna ploča

1 engl. Electrospray Ionization (ESI)

2 engl. Atmospheric Pressure Chemical Ionizatio (APCI)

3 engl. Atmospheric Pressure PhotoIonization (APPI)

4 engl. Quadrupole (Q)

5 engl. Ion Trap (IT)

6 engl. Time-of-Flight (TOF)

7 engl. Fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR)

Detektori spektrometra masa

Vrste različitih LC/MS ionizacijskih tehnika i njihova primjena

LC/MS ionizacijska tehnika Primjena

ESI

-za određivanje molekularne mase

i strukture spojeva velikih ionskih

molekula kao što su proteini,

peptidi i oligonukleotidi, no može

se primjeniti i za manje molekule

-ionizacija može dati i pozitivne i

negativne ione [ESI(+) i (-)]

APCI

-za određivanje molekularne mase

i strukture molekula <2000,

spojevi mogu biti i polarni i

nepolarni

-ionizacija može dati i pozitivne i

negativne ione [APCI(+) i (-)]

APPI

-za određivanje molekularne mase

manje polarnih spojeva

-ionizacija može dati i pozitivne i

negativne ione [APPI(+) i (-)]

Maseni analizatori u LC/MS sustavima

Maseni analizatori Karakteristike analizatora

Q

-lagan za rukovanje

-niske cijene

-visoke osjetljivosti kod analize izabranog

iona (SIM mode)

-izvrstan za kvantifikaciju

-nedostatak mu je što se ne mogu dobiti

točne mase

-manje brzine skeniranja ili snimanja od

TOF

IT

-mogućnost brzog skeniranja

-dobra rezolucija

-dobro definirani putovi fragmentacije

iona uz detaljnu interpretaciju

-nema informaciju o točnoj masi

-veće osjetljivosti od QQQ, ali manje

fragmentacije od QQQ

TOF

-dobiva se točna informacija o masi iona

-visoke rezolucije

-brzo skeniranje i dobra osjetljivost

skeniranja

-nema mogućnosti vezanja u MS/MS

sustav bez uporabe CID moda

FT-ICR

-može se vezati u više stupnjeva kao

MS/MS bez dodatnog masenog

analizatora, kao i IT

-pokriva širok spektar masa uz izvrsnu

rezoluciju

-najskuplji je od svih masenih analizatora

Izbor LC detektora prema njihovim karakteristikama

Detektor Osjetljivost Selektivnost Prednosti Primjena

UV/Vid + -

Niski troškovi

univerzalan

Organske kiseline,

masnoće nakon

derivatizacije,

anorganski ioni

UV/DAD + +

Mogućnost određivanja

čistoće kromatografske

krivulje

Antioksidansi,

konzervansi, mirisi,

boje, antiparazitici,

lijekovi, mikotoksini,

pesticidi, vitamini,

amini nakon

derivatizacije

FLD ++ +

Visoka osjetljivost Umjetna sladila,

mikotoksini, vitamini,

karbamati, glifosati

Elektrokemijski ++ + Visoka osjetljivost Vitamini, anorganski

ioni

MS scan - ++ Određivanje strukture

spojeva

Karbamati, lipidi

MS SIM ++ ++ Visoka osjetljivost Pesticidi, proteini

RI - - Univerzalan Ugljikohidrati,

nearomatske kiseline

omogućuje kvalitativno i kvantitativno određivanje kationa i aniona

odnosno iona ili nabijenih molekula

primjenom različitih ionsko izmjenjivačkih smola i eluensa ioni se

različito raspoređuju na ionsko izmjenjivačkoj smoli, a separacijskom

elucijom dolazi do odvojenog eluiranja ispitivanih iona

separacija se uglavnom temelji na razlici u afinitetu sastojaka uzorka

prema ionskoj izmjeni

nepokretna faza ima ionske funkcionalne grupe koje reagiraju s ionima

iz analizirane smjese suprotnog naboja

na osnovu toga metoda se dijeli na:

kromatografiju kationske izmjene – nepokretna faza ima

negativno nabijene funkcionalne grupe

kromatografiju anionske izmjene – nepokretna faza ima

pozitivno nabijene funkcionalne grupe

najčešće konduktometrijskom detekcijom mjerena vodljivost

omogućuje i kvantifikaciju pojedinih eluiranih iona

IONSKA KROMATOGRAFIJA (IONO-IZMJENJIVAČKA KROMATOGRAFIJA

Anionski izmjenjivač Funkcionalna skupina

Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Kvaterni aminoetil (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Kvaterni amonij (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3

Kationski izmjenjivač

Karboksimetil (CM) -O-CH2-COO-

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Metilsulfonat (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-

Funkcionalne skupine u ionskoj kromatografiji

nepokretna faza neki ionski izmjenjivač (umreženi sintetski polimeri koji

mogu izmjenjivati ione)

sastojci smjese moraju također biti sposobni da izmjenjuju ione,

odvajaju se na temelju svog različitog afiniteta prema ionsko-

izmjenjivačkoj nepokretnoj fazi

za svaki ion, proces je karakteriziran odgovarajućom ionsko-

izmjenjivačkom ravnotežom, koja određuje raspodjelu između pokretne

i nepokretne faze

za npr. anion A-

E-nepok + A-

pok A-nepok + E-

pok

pokretna faza je puferska otopina kojoj se sastav može kontinuirano

mijenjati (gradijentna analiza)

prikladna za spojeve s ioniziranim grupama (aminokiseline, nukleinska

kiselina)

nepok

-E x pok

-A

pok

-E x nepok

-A

AK

kao nepokretna faza služi mikroporozni neionski prirodni ili sintetski

polimer

u njegove pore mogu potpuno ili djelomično ući samo molekule manje

od neke određene veličine dok se veće molekule ne zadržavaju

sastojci se redom eluiraju iz kolone već prema veličini svojih molekula

pokretna faza je umreženi polimer

primjena u čišćenju i izolaciji supstancija iz prirodnih tvari, određivanje

raspodjele relativnih molekulskih težina prirodnih i sintetskih polimera

izraz kromatografija isključenjem po veličini također se može koristiti

kada je odvajanje temeljeno na veličini molekula

izrazi gel-filtracijska i gel-propusna kromatografija (GPC) su korišteni

za opis procesa kada je nepokretna faza nabubreni gel

izraz kromatografija isključenjem molekula specifično se koristi za

odvajanje iona u vodenoj fazi

KROMATOGRAFIJA NA GELU ILI KROMATOGRAFIJA ISKLJUČENJEM

Tiselius – začetnik kolonske kromatografije 1952.

a) punjene kolone

materijal: čelik, staklo, teflon

duljina: 2-3 m, unutarnji promjer: 2-4 mm

punjenje: čvrsti nosač (obično dijatomejska zemlja) na kojem je

nanesen tanki sloj nepokretne (tekuće) faze

b) kapilarne kolone

materijal: danas uglavnom kvarcno staklo

duljina: 10-100 m, unutarnji promjer: 0.1 - 0.5 mm

punjenje: unutarnje stjenke prevučene samo slojem tekuće

nepokretne faze ili nosačem na kojem se nalazi adsorbirana

nepokretna faza

KOLONSKA KROMATOGRAFIJA

plošna kromatografska metoda

za njeno razvijanje zaslužni Martin i R.L.M. Synge

nepokretna faza list ili traka kromatografskog papira, a pokretna faza je tekućina

uzorak se stavlja na papir u blizini njegova ruba i taj se rub papira uroni u

tekućinu (pokretnu fazu)

prolaskom tekućine kroz papir putuju zbog kapilarnih sila i razdvajaju se i

sastojci ispitivanog uzorka

prednosti: jednostavnost izvođenja, jednostavna i jeftina aparatura, velika moć

razdvajanja, laka detekcija i mala količina uzorka potrebna za analizu

nedostatak: manje pogodna za kvantitativna određivanja i za preparativne svrhe

kromatografski papir skoro je čista celuloza s vrlo malo nečistoća i mora:

imati određenu debljinu i poroznost i plošnu masu (g/m2)

biti jednolične strukture i debljine

omogućavati kapilarno širenje tekućine određenom brzinom

kao pokretna faza upotrebljavaju se različita organska otapala često u smjesi s

vodom, kiselinom ili lužinom, moraju biti vrlo čista (pro chromatographia)

prolaskom pokretne faze kroz područje papira na kojem se nalazi ispitivana tvar

raspodijelit će se ta tvar između dviju faza tj. između otapala i papira

kao aparatura služe stakleni cilindri ili komore različitih izvedbi koje se mogu

hermetički zatvoriti

PAPIRNA KROMATOGRAFIJA

Primjena papirne kromatografije:

identifikacija supstancija

ispitivanje čistoće tvari

Osobine papirne kromatografije:

relativno brza metoda

potrebna mala količina materijala

plošna kromatografska metoda, vrlo slična papirnoj

nepokretna faza tanki sloj finozrnatog (praškastog) materijala koji ima

svojstvo sorpcije

prednosti isti kao kod papirne, no tu je i vrijeme razvijanja kraće,

razdvajanje oštrije, veća je mogućnost detekcije, a zbog mogućnosti

upotrebe različitih materijala za tanki sloj postoji veći izbor povoljnih

uvjeta za razdvajanje različitih vrsta spojeva

kao tanki slojevi primjenjuju se različiti sorbensi

anorganski ( silikagel, aluminijev-oksid, dijatomejska zemlja )

organski ( celuloza, poliamidi, smole za izmjenu iona)

sorbensi su karakterizirani svojom strukturom, veličinom čestica,

stupnjem čvrstoće i prisutnim vezivom

mehanizam je najčešće adsorpcijski, no može biti i razdjelnim

ionskoizmjenjivački ili mehanizam na principu molekularnih sila

prilikom priprave tankog sloja treba najprije pripraviti suspenziju

sorbensa u vodi ili nekom organskom otapalu

suspenzija homogenizirana mućkanjem nanosi se na ploče koje služe

kao nosioci (podloge) sloja sorbensa, ploče su staklene potpuno čiste

danas se najčešće kupuju gotove kromatografske podloge

TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA

kapilarnost - kapilarni protok fenomen je koji se javlja uglavnom u

plošnoj kromatografiji kao glavna vučna sila

neželjena posljedica kapilarnoga protoka je smanjenje brzine

pokretne faze s povećanjem puta otapala, što utječe na vrijeme

separacije i smanjenje razlučivosti

Za praktičnu izvedbu kromatografskoga postupka potrebna je sljedeća oprema:

kromatografske ploče,

uređaj za nanošenje uzorka na kromatografsku podlogu,

UV-lampa za tankoslojnu kromatografiju,

komore za razvijanje kromatograma,

prskalice za vizualizaciju kromatograma,

sušilo,

termostatirani sušionik ili topla ploča s regulatorom temperature,

instrument za kvantifikaciju.

nanošenje uzorka na tanki sloj može biti u obliku točke ili u obliku linije

(vrpce)

Otapalo za uzorak:

uzorak mora biti dobro topljiv

male viskoznosti

lako hlapljivo nakon nanašanja

treba imati moć prodiranja u sloj sorbensa (zbog boljeg raspoređivanja uzorka)

ne bi smjelo biti kromatografski pogodno za taj uzorak (RF < 0,1)

43

Oprema za tankoslojnu kromatografiju

pojedinačni uzorci smjesa

nepokretna faza

pokretna faza

prva je detekcija obično vizualna: promatranje kromatograma uz

obično svjetlo ili pod UV-lampom

pored vizualnog detektiranja mrlje se na kromatogramu mogu

detektirati i instrumentima

neki od načina vizualizacije:

djelovanjem reagensa na razdvojeni spoj u mrlji pojavljuje se novi,

obojeni spoj ili spoj koji fluorescira djelovanjem UV-zračenja

primjenom indikatora koji mijenja boju u prisutnosti ispitivanog

spoja, odnosno postaje fluorescentan ili gubi fluorescenciju

djelovanjem topline ili svjetla razdvojeni spoj daje karakteristično

obojenje ili fluorescira pod UV-zračenjem

primjenjuje se za analizu višekomponentnih plinskih i organskih

smjesa

pokretna faza je u plinovitom stanju, a nepokretna u čvrstom ili

tekućem

ako se odjeljivanje provodi pomoću krutog adsorbensa postupak se

naziva plinska adsorpcijska kromatografija

ako se primjeni tekući adsorbens govori se o plinsko-tekućinskoj

razdjelnoj kromatografiji

plinsku kromatografiju možemo primijeniti za odjeljivanje i analizu

svake smjese u kojoj pojedine komponente smjese imaju kod radne

temperature od -70oC do +400oC napon para veći od 133,322 Pa

mogu se analizirati i čvrste tvari koje se razgrađuju pa se ispitivanje

njihovih hlapivih produkata provodi tako da ona služi kao nepokretna

faza, taj tip kromatografije se naziva «obratna kromatografija»

PLINSKA KROMATOGRAFIJA

Pokretna faza:

inertni plin koji eluira komponente smjese u koloni napunjenoj

nepokretnom fazom

za razliku od tekućinske kromatografije u plinskoj kromatografiji analit

ne reagira s pokretnom fazom te zbog toga njegova brzina kretanja

kroz kolonu ne ovisi o kemijskoj strukturi pokretne faze

Nepokretna faza:

za odjeljivanje komponenti male molekulske mase: stacionarna faza je čvrsta tvar velike specifične površine na koju se adsorbiraju analizirane komponente = plinska adsorpcijska kromatografija

za odjeljivanje komponenti velike molekulske mase: stacionarna faza je tekuća faza nanesena na površinu čvrstog nosača adsorpcijom ili kemijskim vezanjem = plinsko-tekućinskoj razdjelnoj kromatografiji

Nepokretna faza max temp., °C primjena

polidimetilsiloksan 350 Nepolarna faza općenite

namjene: ugljikovodici,

polinuklearni aromati

5% fenilpolidimetilsiloksan 350 Metilni esteri masnih

kiselina; alkaloidi, droge;

halogeni spojevi

50% fenilpolidimetilsiloksan

250 Droge; steroidi; pesticidi;

glikoli

50% trifluoropropilpolidimetilsiloksan

200 Klorirani aromati;

nitroaromati; alkil-

supstituirani benzeni

polietilenglikol 250 Slobodne kiseline; alkoholi;

eteri; esencijalna ulja;

glikoli

50% cijanpropilpolidimetilsiloksan 240 Nezasićene masne

kiseline; kisele smole;

slobodne kiseline; alkoholi

Nekoliko uobičajenih nepokretnih faza za plinsko-tekućinsku

kromatografiju

razdvajanje smjese koja mora biti u plinovitom stanju izvodi se u

kromatografskoj koloni različitom adsorpcijom pojedinih sastojaka na

krutom adsorbensu ili selektivnim otapanjem u tekućini

pri postupku eluiranja određena količina ispitivane smjese se unosi

strujom inertnog plina (plin nosioc) u kromatografsku kolonu

prolaženjem kroz kolonu smjesa se razdvaja između nepokretne faze

i struje plina nosioca

sastojci smjese po izlasku iz kolone pomiješani su samo s plinom

nosiocem

ako je razlika u adsorpciji pojedinih komponenata dovoljno velika

onda je i brzina putovanja toliko različita da se u koloni stvaraju

odvojeni slojevi sastojaka (odvojeni čistim plinom nosiocem) ili vrpce

odijeljeni sastojci smjese nakon izlaska iz kolone određuju se u

uređaju koji registrira prisutnost izeluiranog sastojka u struji plina

nosioca kao funkciju vremena (detektor)

odziv detektora registrira se kao kromatogram

primjena metode unutarnjeg standarda!

Shema plinskog kromatografa

regulator protoka

plina nosioca

uzorak

sustav za uštrcavanje

uzorka

signal procesor

detektor

termostat

kromatografska kolona boca s plinom nosiocem

osnovni dijelovi uloga

boca za komprimirane plinove izvor plina nosioca

sustav za uštrcavanje uzorka za unošenje uzorka u kolonu

kromatografska kolona za razdvajanje komponenata

ispitivane smjese

termostat za održavanje konstantne

temperature (sobne < T < 400°C)

detektor detektira komponente smjese istim

redoslijedom kako one napuštaju

kolonu

pisač ili kompjuter za dobivanje trajnog dokumenta o

pojavljivanju svake komponenti iz

ispitivane smjese

mora biti inertan prema punilu u koloni i prema analiziranom uzorku

viskoznost plina ne smije biti prevelika zbog povećanog tlaka u koloni i

povećane molekulske difuzije

izbor plina ovisi o načinu detekcije

ako je detektor na osnovu plinske vodljivosti, plin mora imati različitu

toplinsku vodljivost od sastojaka; koriste se H2 ili He

za ostale načine detekcije sastojaka koriste se N2 , Ar , CO2

PLIN NOSILAC

treba brzo unijeti malu količinu uzorka (do 20 L), kako bi se smanjilo

širenje zone eluiranog sastojka

tekući uzorci se unose najčešće kroz gumenu ili silikonsku membranu

(septum) u zagrijani dio uređaja smješten na vrhu kolone pomoću

mikrolitarske štrcaljke

mjesto unosa uzorka uglavnom je zagrijano 50°C iznad temperature

vrelišta najmanje hlapljivog sastojka kako bi uzorak tijekom unošenja

trenutno ispario

plinoviti uzorci se unose pomoću plinskih (dozirnih) ventila

čvrste uzorke unosimo nakon otapanja

SUSTAV ZA UŠTRCAVANJE UZORKA

u obliku spirale, kruga, ili slova U

punjene kolone su duljine 2-3 m, unutarnjeg promjera 2-4 nm; savijene u svitak

promjera cca 15 cm

punjene su metalne, staklene ili teflonske cijevi ispunjene odgovarajućim

selektivnim adsorbensom (silikagel, zeolit, Al-oksid, aktivni ugljen, …) ili čvrstim

nosačem (diatomejska zemlja) na koji je nanesen tanki sloj nepokretne tekuće

faze

kapilarne kolone mogu biti duljine i do 2000 m, unutarnjeg promjera do 0,3 mm

(svjetski rekord za duljinu kapilarne kolone 1987.godine)

kapilarne kolone su u početku bile isto od metala ili teflona, ali danas se

preferiraju one od izvučenog kvarca

razdvajanje ovisi o dužini i širini kolone (što je kolona duža to je razdvajanje

bolje)

kolona je uvijek termostatirana jer temperatura u njoj mora biti stalna i dovoljno

visoka kako bi odjeljivane komponenate imale potreban napon para

Kod plinske kromatografije vrlo je bitna temperatura te temperaturno

programiranje koje ovisi o ispitivanoj smjesi

KOLONE

kapilarne ili punjenje

uređaji za indikaciju i mjerenje odvojenih frakcija u plinskom

kromatografu

može služiti svaki uređaj koji na osnovu nekog fizikalnog ili kemijskog

svojstva analita registrira njegovu prisutnost u plinu nosiocu

komponente analiziranog uzorka određuju se odmah po izlasku iz

kolone, mjeri se promjena koncentracije komponenata u plinu kao

funkcija vremena eluiranja

poželjna svojstva detektora:

treba biti što osjetljiviji na sve plinove i pare

stabilan prema promjenama p, T i protoka plina nosioca

mora imati brz odziv

jednolik odziv za mnoge kemijske spojeve ili bar predvidljiv i selektivan odziv za jednu

vrstu ili više spojeva

linearno reagirati na promjenu koncentracije sastojaka u plinu nosiocu

stabilnost detektora se očituje na osnovnoj liniji (signal dobiven u

prisutnosti čistog plina nosioca) koja ne smije pokazivati porast ili

oscilacije uz konstantne uvjete rada

možemo ih podijeliti s obzirom na selektivnost prema određenom tipu

spojeva na univerzalne ili neselektivne i selektivne

DETEKTORI

detektor toplinske vodljivosti (katarometar)

neselektivan, izdržljiv u radu, jednostavne izvedbe i niske cijene

temelji se na promjenama toplinske vodljivosti struje plina nosioca koja nastaje

zbog prisutnosti analita

osjetljivost ovisi o razlici toplinske vodljivosti analita i plina nosioca

sastoje se od dva žarena žičana otpornika, niti (platina ili volfram) pod strujom

stalne jakosti smještene u ćelijama kroz koje protječe plin konstantnog protoka

niti ćelije spojene su u Wheatstoneov most

kroz dvije ćelije, smještene u mostu dijagonalno, protječe čisti plin nosioc

(referentna ćelija), a kroz druge dvije plin iz kromatografske kolone (mjerna

ćelija)

kada kroz sve četiri ćelije prolazi samo plin nosioc, most je u ravnoteži; ulaskom

jednog od analita u ćeliju ravnoteža se poremeti = dobiveni signal se registrira

temperatura i otpor užarene žice ovise o toplinskoj vodljivosti okolnog plina

osjetljivost 10-8 g/mL

osjetljivost detektora na toplinsku vodljivost može se povećati upotrebom

poluvodiča

stabilan prema promjenama protoka i temperaturi

osjetljivost 10-15 g/mL

veliko područje linearnosti odziva

detektor se sastoji od malog plamenika u kojem izgara vodik

radi na principu ionizacije u vodikovom plamenu

efluent s kolone miješa se s vodikom i zrakom i spaljuje

organski sastojci sagorijevaju u plamenu stvarajući ione i elektrone koji mogu

provoditi elektricitet kroz plamen

na vrh plamenika dovodi se visoki električni potencijal, a iznad plamena postavljena

je kolektorska elektroda

mjeri se električna struja izazvana pirolizom organskih sastojaka

plameno-ionizacijski detektor osjetljiv je samo na

spojeve koji imaju organski vezani C, dok na ostale

spojeve nije osjetljiv

zato se smatra selektivnim detektorom (osjetljiv je

samo na određenu vrstu spojeva)

zbog toga se može izravno koristiti za određivanje

onečišćenja zraka organskim tvarima

plameno-ionizacijski detektor

plin prelazi preko beta emitera (radioaktivni spoj koji emitira elektrone)

kao što je 63Ni ili tricij adsorbiran na platinskoj ili titanovoj foliji

emitirani elektroni ioniziraju plin nosioc (često N2), čime nastaje snop

elektrona

kad u plinu nosiocu nisu prisutni organski spojevi, između elektroda se

pojavljuje stalna struja koja rezultira iz spomenute ionizacije

odziv detektora apsorpcije elektrona selektivan je i osjetljiv na

elektronegativne funkcionalne skupine kao što su halogeni, peroksidi,

kinoni i nitro skupine

neosjetljiv je na amine, alkohole i ugljikovodike

pogodan je za detekciju i kvantitativno

određivanje kloriranih pesticida

ne razara uzorak (za razliku od

plamenoionizacijskog detektora)

detektor apsorpcije elektrona

Preporučena literatura

1. M. Kaštelan-Macan, Kemijska analiza u sustavu

kvalitete, Školska knjiga, Zagreb 2003.

2. M. Kaštelan-Macan, M. Medić-Šarić, S. Turina, Plošna

kromatografija, Farmaceutsko-biokemijski fakultet

Sveučilišta u Zagrebu, Zagreb, 2006.

3. D. Skoog, D. A. West, F. J. Holler, Osnove analitičke

kemije, Školska knjiga, Zagreb 1999.