9o

Υποδοχείς κινάσες τυροσίνης

1. Δομή και λειτουργία των υποδοχέων κινάσες τυροσίνης

Γενική δομή και ταξινόμηση Σύνδεση του προσδέτη και ολιγομερισμός του υποδοχέα Σχηματισμός ετεροδιμερών Η ενεργοποίηση του υποδοχέα μετά τη σύνδεση του προσδέτη Δομή της περιοχής κινάσης τυροσίνης στον υποδοχέα ινσουλίνης Ενεργοποίηση της περιοχής κινάσης τυροσίνης και πρωτεΐνες-τελεστές Ενεργοποίηση της Ras από τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων

2. Δομικές περιοχές των πρωτεϊνών που επιτρέπουν την αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεϊνών

Περιοχές SH2 PΤΒ, περιοχη σύνδεσης φωσφοτυροσινών Περιοχές SH3 Περιοχές ομόλογες της πλεξτρίνης Περιοχές PDZ Περιοχές WW

3. Πρωτεΐνες – προσαρμογείς στην ενδοκυτταρική διαβίβαση

4. Μεταγωγή μηνύματος μέσω του υποδοχέα ινσουλίνης Pόλος της ινσουλίνης στο κύτταρο Πορεία της σηματοδότησης Μεταφορέας Glut4 Το σηματοδοτικό μονοπάτι της ινσουλίνης που βρίσκεται στη μικροπεριοχή Σηματοδότηση της ινσουλίνης στο χρόνο

264

Οι πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης, όπως και οι πρωτεϊνικές κινάσες σερίνης/θρεονίνης χρησιμοποιούνται ευρύτατα στην ενδοκυτταρική μετάδοση μηνυμάτων. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης “πυροδοτείται” κυρίως από σήματα που ρυθμίζουν την κυτταρική αύξηση και διαφοροποίηση. Τα εξωκυτταρικά σήματα είναι συνήθως πρωτεϊνικές ορμόνες, οι οποίες αν ασκούν ρυθμιστική δράση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ταξινομούνται ως αυξητικοί παράγοντες. Ο Πίνακας 9.1 δείχνει ορισμένους αυξητικούς παράγοντες θηλαστικών με τους αντίστοιχους υποδοχείς τους, οι οποίοι συμμετέχουν στη μεταφορά του σήματος στο εσωτερικό του κυττάρου.

Η σύζευξη ενός εξωκυτταρικού μηνύματος στην φωσφορυλίωση της τυροσίνης στο εσωτερικό του κυττάρου μπορεί να πραγματοποιηθεί με δύο τρόπους, οι οποίοι περιλαμβάνουν δύο διαφορετικούς τύπους υποδοχέων:

Υποδοχείς με εσωτερική δράση κινάσης τυροσίνης Μερικοί διαμεμβρανικοί υποδοχείς έχουν εσωτερική δράση κινάσης τυροσίνης. Αυτοί οι

υποδοχείς είναι γνωστοί ως υποδοχείς κινάσες τυροσίνης. Η σύνδεση ενός προσδέτη στην εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα διεγείρει τη δράση μιας κινάσης τυροσίνης, η οποία εντοπίζεται στην ενδοκυτταρική του περιοχή. Χαρακτηριστικό αυτού του τύπου υποδοχέα αποτελεί το γεγονός ότι η περιοχή σύνδεσης του προσδέτη και η περιοχή της κινάσης τυροσίνης αποτελούν τμήματα της ίδιας πρωτεΐνης.

∆ιαμεμβρανικοί υποδοχείς συνδεδεμένοι με δραστικότητα κινάσης τυροσίνης Ένας άλλος τύπος διαμεμβρανικού υποδοχέα, είναι συνδεδεμένος στην ενδοκυτταρική

του περιοχή με μια κινάση τυροσίνης, η οποία ενεργοποιείται όταν ένας προσδέτης συνδέεται στην εξωκυτταρική του περιοχή. Η διαφορά είναι ότι η κινάση τυροσίνης και ο υποδοχέας δεν αποτελούν τμήματα της ίδιας πρωτεΐνης.

β. Υποδοχέας συνδεδεμένος με κινάση Tyr a. Υποδοχέας κινάση Tyr

Εικόνα 9.1 Σχηματική αναπαράσταση της μετάδοσης του μηνύματος από υποδοχείς με εσωτερική δράση κινάσης τυροσίνης και από υποδοχείς συνδεδεμένους με κινάση τυροσίνης. α) Οι υποδοχείς αυτοί εμφανίζουν στην κυτταροπλασματική τους περιοχή μια κινάση τυροσίνης, η οποία ενεργοποιείται με τη σύνδεση του προσδέτη στην εξωκυτταρική πλευρά του υποδοχέα και παράγει ένα σήμα που ενεργοποιεί άλλες πρωτεΐνες τελεστές (effector proteins). Στο σχήμα παρατηρούνται και οι ρυθμιστικές περιοχές της κινάσης. β) Οι υποδοχείς της κατηγορίας αυτής μεταφέρουν το σήμα σε μια κινάση τυροσίνης, η οποία δεν αποτελεί εσωτερικό τμήμα του υποδοχέα, αλλά είναι παροδικά ή μόνιμα συνδεδεμένη με την κυτταροπλασματική του περιοχή. Για απλούστευση απεικονίζεται η διμερής μορφή του υποδοχέα.

265

Πίνακας 9.1 : Αυξητικοί παράγοντες θηλαστικών και οι αντίστοιχοι υποδοχείς τους

Αυξητικός παράγοντας Χαρακτηριστικά Υποδοχείς PDGF (platelet derived growth factor): αυξητικός παράγοντας που παράγεται από τα αιμοπετάλια PDGF τύποι: AA, AB και ΒΒ

∆ιμερής, αποτελείται από δύο αλυσίδες την Α(17kD) και τη Β(16kD) η τελευταία εκ των οποίων αποτελεί παράγωγο ενός c-sis πρωτο-ογκογονιδίου

∆ύο τύποι του υποδοχέα κινάσης τυροσίνης, ο PDGF-Ra (170kD) και ο PDGF-Rβ (180KD)

EGF (epidermal growth factor): επιδερμικός αυξητικός παράγοντας TGF-a (transforming growth factor): μεταμορφωτικός αυξητικός παράγοντας- a

Περίπου 6kD, o EGF και ο TGF-a είναι κατά 40% ταυτόσημοι

Υποδοχέας με δράση κινάσης τυροσίνης. Ο EGF-R αποτελεί προϊόν του c-erbB πρωτο-ογκογονιδίου

TGF-β : μεταμορφωτικός αυξητικός παράγοντας- β TGF-β1, -β2, -β3

Ομοδιμερές των 25 kD Οι TGFβ-RI & ΙΙ περιέχουν μια ειδική δράση κινάσης Ser/Thr

IGF-1 και IGF-2 : Insulin-like αυξητικοί παράγοντες

7 kD, συγγενής με την προ-ινσουλίνη

IGF-R με δράση κινάσης τυροσίνης

FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4: αυξητικοί παράγοντες των ινοβλαστών

Συγγενείς πρωτεΐνες των 16-32 kD

Υποδοχέας με δράση κινάσης τυροσίνης

G-CSF : Granulocyte colony stimulating factor

24 kD

150 kD, G-CSF υποδοχέας σχετιζόμενος με μια κινάση τυροσίνης

GM-CSF : Granulocyte macrophage-colony stimulating factor

14 kD

51 kD, GM-CSF υποδοχέας συζευγμένος με μια κινάση τυροσίνης

Ιντερλευκίνες 1-7 (IL-1 – IL-7), 9, 12, 15 (IL-9, IL-12, IL-15)

Υποδοχείς των ιντερλευκινών (IL-R-1- IL-R-7) συζευγμένοι με μια κινάση τυροσίνης

Ιντερλευκίνη-8, IL-8

IL-R-8. Υποδοχέας συζευγμένος με μια G πρωτεΐνη

Ερυθροποιητίνη

Epo-R, υποδοχέας σχετιζόμενος με μια κινάση τυροσίνης

TNF: Tumor necrosis factor

TNF-R, υποδοχέας σχετιζόμενος με μια κινάση τυροσίνης

LIF: Ανασταλτικός παράγοντας της λευχαιμίας

LIF-R, υποδοχέας σχετιζόμενος με μια κινάση τυροσίνης

Ιντερφερόνες α,β,γ

INF-Ra, INF-Rβ, INF-Rγ, υποδοχείς σχετιζόμενοι με κινάση τυροσίνης

266

1. ∆ομή και λειτουργία των υποδοχέων κινάσες τυροσίνης

Οι υποδοχείς κινάσες τυροσίνης είναι διαμεμβρανικοί υποδοχείς, οι οποίοι εμφανίζουν στην εξωκυτταρική τους επιφάνεια θέσεις πρόσδεσης για εξωκυτταρικούς προσδέτες. Όταν αυτοί συνδέονται στον υποδοχέα ενεργοποιούν τη δράση μιας ειδικής κινάσης τυροσίνης που βρίσκεται στο ενδοκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την έναρξη της φωσφορυλίωσης καταλοίπων τυροσίνης στον ίδιο τον υποδοχέα αλλά και σε διάφορα πρωτεϊνικά υποστρώματα. Αυτά με τη σειρά τους “πυροδοτούν” τη βιολογική απόκριση του κυττάρου ενεργοποιώντας μια περαιτέρω αλληλουχία αντιδράσεων. Η απόκριση μπορεί να φθάσει μέχρι το επίπεδο του πυρήνα και να ενεργοποιήσει εκεί τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων. Επίσης μπορεί να επηρεάσει την αναδιοργάνωση του κυτταρικού σκελετού, τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων, και τις αντιδράσεις του ενδιάμεσου μεταβολισμού τους, επίσης την κυτταρική διαίρεση, διαφοροποίηση και μορφογένεση.

Γενική δομή και ταξινόμηση

Οι υποδοχείς κινάσες τυροσίνης αποτελούν αναπόσπαστες μεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες διαθέτουν στην εξωκυτταρική τους πλευρά μια περιοχή πρόσδεσης του προσδέτη ενώ στην ενδοκυτταρική τους μια περιοχή κινάσης τυροσίνης (Εικόνα 9.1). Το διαμεμβρανικό τμήμα των υποδοχέων αυτών διαπερνά τη μεμβράνη με τη μορφή α-έλικας. Το ενδοκυτταρικό τους τμήμα εκτός από τη συντηρημένη περιοχή της κινάσης τυροσίνης περιλαμβάνει και άλλα τμήματα ρυθμιστικών αλληλουχιών στα οποία λαμβάνουν μέρος αντιδράσεις αυτοφωσφορυλίωσης, φωσφορυλίωσης και αποφωσφορυλίωσης από άλλες πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφατάσες αντίστοιχα. Στα θηλαστικά υπάρχουν περισσότερες από 100 οικογένειες υποδοχέων κινασών τυροσίνης ανάλογα με τη φύση του προσδέτη με τον οποίο δεσμεύονται. Αυτές με τη σειρά τους υποδιαιρούνται σε υποοικογένειες ανάλογα με τα διαφοροποιημένα τμήματα των αλληλουχιών των εξωκυτταρικών περιοχών τους (Εικόνα 9.2 και 9.3).

Εικόνα 9.2 Παραδείγματα δομικών περιοχών υποδοχέων κινασών τυροσίνης στα θηλαστικά. Διακρίνονται 5 κατηγορίες υποδοχέων: 1. EGF-R (επιδερμικού αυξητικού παράγοντα)

2. Υποδοχέα της ινσουλίνης (διμερής)

3. PDGF-R (αιμοπεταλιακού αυξητικού παράγοντα)

4. FGFR-R (αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών)

5. TRKA (υποδοχέας των νευροτροφινών).

Ταξινόμηση με βάση τους Ullrich and Schlessinger (1990).

267

Εικόνα 9.3 Ταξινόμηση των υποδοχέων κινάσες τυροσίνης βάση της οργάνωσης των δομικών τους περιοχών. Από τον Hubbard SR and Hill JH., Protein tyrosine kinase structure and function, Annu. Rev. Biochem., 2000, 69, 373-398

Ως προς τη δομή τους, οι υποδοχείς-κινάσες τυροσίνης κατατάσσονται σε δύο

υποκατηγορίες: τους μονομερείς (υποδοχείς των EGF, NGF, PDGF κλπ) και τους πολυμερείς (υποδοχέας της ινσουλίνης).

α/ Μονερείς υποδοχείς Οι υποδοχείς αυτοί είναι μονομερείς πρωτεΐνες με μια εξωκυτταρική, μια ενδομεμβρανική και μια ενδοκυτταρική περιοχή. Η εξωκυτταρική περιοχή (αμινοτελικό άκρο) περιέχει τη θέση σύνδεσης του αυξητικού παράγοντα, η ενδομεμβρανική περιοχή συγκρατεί τον υποδοχέα στη μεμβράνη και η κυτταροπλασματική περιοχή (καρβοξυτελικό άκρο) περιέχει την κινάση της τυροσίνης. Πέρα από την κοινή δομή που εμφανίζουν οι υποδοχείς αυτής της κατηγορίας, έχουν ορισμένες δομικές ιδιαιτερότητες, οι οποίες τους κατατάσσουν σε διαφορετικές οικογένειες. H οικογένεια του υποδοχέα EGF. Το ιδιαίτερο δομικό χαρακτηριστικό αυτών των υποδοχέων είναι οι δύο πλούσιες σε κυστεΐνη περιοχές στο εξωκυτταρικό τμήμα, ο ρόλος των οποίων δεν είναι γνωστός H οικογένεια του υποδοχέα PDGF. Το χαρακτηριστικό αυτών των υποδοχέων είναι ότι η εξωκυτταρική τους περιοχή αποτελείται από 5 τμήματα (αλληλουχίες αμινοξέων) που συναντώνται στις ανοσοσφαιρίνες (immunoglobulin-like domains). Χαρακτηριστικό επίσης είναι ότι η κινάση της τυροσίνης που βρίσκεται στην κυτταροπλασματική περιοχή διακόπτεται από μια αλληλουχία αμινοξέων, η οποία ονομάζεται παρεμβαλλόμενη περιοχή της κινάσης (kinase insert region). Τα υπολείμματα τυροσίνης που βρίσκονται σ’ αυτή την περιοχή, όταν φωσφορυλιωθούν αποτελούν θέσεις σύνδεσης ορισμένων πρωτεϊνών-στόχων.

268

Εικόνα 9.4 Λεπτομέρεια της κυτταροπλασματικής περιοχής του υποδοχέα PDGF (αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από τα αιμοπετάλια). Με λευκό τετράγωνο συμβολίζεται η περιοχή της κινάσης. Ανάμεσα στα δύο λευκά τετράγωνα είναι η παρεμβαλλόμενη περιοχή στην κινάση. Με Υ-Ρ συμβολίζονται οι φωσφορυλιωμένες τυροσίνες, οι οποίες είναι θέσεις σύνδεσης ειδικών πρωτεϊνών-στόχων, όπως η πρωτεΐνη GAP (GTPase activating protein), η ΡΙ3-κινάση και η φωσφολιπάση C-γ (PLC-γ). Η Ρ85 είναι μια πρωτεΐνη που χρησιμεύει στη σύνδεση/προσαρμογή των πρωτεϊνών-στόχων στους υποδοχείς-κινάσες. Από W.J. Fantl et al, Annu. Rev. Biochem., 1993, 62, 453-481.

Η οικογένεια του υποδοχέα FGF (fibroblast growth factor: αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών). Το χαρακτηριστικό των υποδοχέων αυτών είναι ότι στο εξωκυτταρικό τους τμήμα περιέχουν 3 περιοχές όμοιες μ’ αυτές που συναντάμε στις ανοσοσφαιρίνες, και μια περιοχή πλούσια σε όξινα αμινοξέα (οκτώ συνεχή όξινα αμινοξέα). Στο κυτταροπλασματικό τους τμήμα περιέχουν και αυτοί μια παρεμβαλλόμενη στην κινάση περιοχή. Η οικογένεια του υποδοχέα NGF (nerve growth factor: αυξητικός παράγοντας των νεύρων). Ο NGF ανήκει στις νευροτροφίνες (neurotrophins) και η οικογένεια των υποδοχέων αυτών ονομάζεται και neurotrophin receptors family. Οι υποδοχείς αυτοί κωδικοποιούνται από το ογκογονίδιο trk, γι’ αυτό συμβολίζονται και ως trk ή trkA. Χαρακτηριστικό τους οι 2 περιοχές που είναι όμοιες με τις ανοσοσφαιρίνες (Ig-like domains) και οι 2 περιοχές που είναι πλούσιες σε κυστεΐνη. β/ Πολυμερείς υποδοχείς - Υποδοχέας της ινσουλίνης Ο καλύτερα μελετημένος υποδοχέας αυτής της κατηγορίας είναι ο υποδοχέας της ινσουλίνης. Αποτελείται από δύο α-υπομονάδες και δύο β-υπομονάδες, οι οποίες ενώνονται μεταξύ τους με δεσμούς S-S δημιουργώντας ένα τετραμερές α2β2. Οι υπομονάδες αυτές προέρχονται από ένα μονομερές γλυκοσυλιωμένο πολυπεπτίδιο (πρόδρομος-precursor), το οποίο μεταφέρεται από το ενδοπλασματικό δίκτυο στη συσκευή Golgi, όπου και γλυκοσυλιώνεται εκ νέου, κόβεται από μια πρωτεϊνάση στις υπομονάδες α και β, και κατόπιν μεταφέρεται στην κυτταρική μεμβράνη όπου και παίρνει την τελική του θέση.

Οι α-υπομονάδες βρίσκονται εξ ολοκλήρου στην εξωκυτταρική περιοχή, με το καρβοξυτελικό άκρο τους προς την πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης. Περιέχουν 15-20 θέσεις γλυκοσυλίωσης, καθώς και μια περιοχή πολύ πλούσια σε κυστεΐνη. Στις α-υπομονάδες βρίσκεται η θέση σύνδεσης της ινσουλίνης. Η ινσουλίνη με μορφή διμερούς μορίου ενώνεται ταυτόχρονα με τις δύο θέσεις σύνδεσής της, προκαλώντας μια αλλαγή στη διαμόρφωση των α-υπομονάδων, η οποία μεταδίδεται στις β-υπομονάδες που μ’ αυτόν τον τρόπο ενεργοποιούνται.

Οι β-υπομονάδες διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη έχοντας το αμινοτελικό άκρο στην εξωκυτταρική περιοχή, ενώ το καρβοξυτελικό στο κυτταρόπλασμα. Στο κυτταροπλασματικό τους τμήμα περιέχουν την κινάση.

269

Εικόνα 9.5 Σχηματική αναπαράσταση της δομής του υποδοχέα της ινσουλίνης.

περιοχές πλούσιες σε Cys

Διακρίνονται οι περιοχές που είναι πλούσιες σε κατάλοιπα κυστεΐνης και η περιοχή της τυροσίνης κινάσης. εξωκυτταρικά

πλασματική μεμβράνη

κυτταρόπλασμα περιοχές κινάσες

τυροσίνης

Σύνδεση του προσδέτη και ολιγομερισμός του υποδοχέα

Υπάρχουν τουλάχιστον δύο μηχανισμοί με τους οποίους η σύνδεση του προσδέτη μπορεί να αλλάξει την ολιγομερή κατάσταση του υποδοχέα (βλπ Εικόνα 9.12).

• Στην πρώτη περίπτωση, ο προσδέτης έχει δύο περιοχές σύνδεσης για το μόριο του υποδοχέα και προκαλεί διμερισμό του υποδοχέα. Απουσία του προσδέτη, ο υποδοχέας υπάρχει στη μονομερή του μορφή.

• Στη δεύτερη περίπτωση, η σύνδεση του προσδέτη μπορεί να σταθεροποιήσει μια προ-συναρμολογημένη διμερή μορφή υποδοχέα. Για παράδειγμα, ο υποδοχέας της ινσουλίνης είναι μια διμερής πρωτεΐνη αποτελούμενη από δύο αβ- υπομονάδες που ενώνονται μεταξύ τους με γέφυρες S-S. Πιθανολογείται ότι σ΄ αυτή τη περίπτωση, η ενεργοποίηση λαμβάνει χώρα με ένα αλλοστερικό μηχανισμό. Η σύνδεση του εξωκυτταρικού προσδέτη προκαλεί μια αλλαγή στη σχετική διαμόρφωση των δύο περιοχών της κινάσης τυροσίνης, κατά τέτοιο τρόπο ώστε να πραγματοποιείται αμοιβαία φωσφορυλίωση των υπολειμμάτων τυροσίνης.

Οι προσδέτες των υποδοχέων κινάσες τυροσίνης γενικά παρουσιάζουν πολλαπλές θέσεις σύνδεσης (multivalent), οι οποίες τους επιτρέπουν να προσαρμόσουν δύο (ή και περισσότερες) υπομονάδες του υποδοχέα με τέτοιον τρόπο ώστε ο υποδοχέας να διμεριστεί και να ενεργοποιηθεί η κινάση τυροσίνης που βρίσκεται στην κυτταροπλασματική περιοχή του.

270

Οι περισσότεροι προσδέτες, όπως ο EGF, η hGF και o FGF υπάρχουν ως μονομερείς πρωτεΐνες σε διαλύματα, με τη δυνατότητα να προκαλέσουν αλλαγή στην ολιγομερή μορφή του υποδοχέα. Αυτό αποδεικνύεται από την ανάλυση της κρυσταλλικής δομής της ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης (hGH), η οποία είναι μια μονομερής πρωτεΐνη 217 αμινοξέων που σχηματίζει δομή τεσσάρων ελίκων (Εικόνα 9.6). Ο υποδοχέας της αυξητικής ορμόνης αποτελείται από 638 αμινοξέα. Απουσία της δεσμευμένης ορμόνης ο υποδοχέας υφίσταται ως μονομερές. Η αυξητική ορμόνη δεσμεύεται στην εξωκυτταρική δομική περιοχή του υποδοχέα. Κάθε μόριο αυξητικής ορμόνης δεσμεύεται σε δυο μόρια του υποδοχέα της προάγοντας έτσι το σχηματισμό ενός διμερούς (Εικόνα 9.7).

Εικόνα 9.6 Αυξητική ορμόνη του ανθρώπου (hGH)

hGH

Εξωκυττάρια περιοχή του υποδοχέα της GH

Εικόνα 9.7 Το σύμπλοκο της ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης (hGH, Growth Hormone) με τη

περιοχή σύνδεσης της στον υποδοχέα της (GH-R). Η αυξητική ορμόνη αποτελείται από 4 α-έλικες, οι οποίες βρίσκονται σε μια πακεταρισμένη μορφή. Η hGH δεσμεύεται κατά μη ισοδύναμο τρόπο στα δύο μονομερή του υποδοχέα, GH-R, στην εξωκυτταρική περιοχή σύνδεσης του προσδέτη.

Εξωκυτταρική περιοχή

αυξητική ορμόνη

∆ιμερισμένος υποδοχέας (ενεργός)

Ενδοκυτταρική περιοχή

Εικόνα 9.8 Η σύνδεση της ανθρώπινης αυξητικής ορμόνης στην εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα της οδηγεί στο διμερισμό και ενεργοποίηση του υποδοχέα. Από Berg et al, Βιοχημεία, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2004.

271

Οι αυξητικοί παράγοντες των ινοβλαστών (FGFs) στα θηλαστικά σχηματίζουν μια οικογένεια 21 συγγενικών πρωτεϊνών (FGF1-21) που συνδέονται σε τουλάχιστον 4 τύπους υποδοχέων FGF (FGFR1-4) ρυθμίζοντας κρίσιμες βιολογικές διαδικασίες όπως η κυτταρική αύξηση και διαφοροποίηση. Οι FGFs είναι μονομερή πολυπεπτίδια, τα οποία διμερίζονται και συνδέονται σε δυο υποδοχείς, επάγοντας το διμερισμό τους. Για το διμερισμό και την ενεργοποίηση των υποδοχέων FGF-Rs απαιτείται και η πρόσδεση της ηπαρίνης στην εξωκυτταρική περιοχή των υποδοχέων.

Περιοχές όμοιες των ανοσοσφαιρινών

FGF(1-21)

ηπαρίνη(πρωτεογλυκάνη)

(α) (β)

Εικόνα 9.9 Ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (FGF) διμερίζεται και συνδέεται στην εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα τους. Η σύνδεση, παρουσία της πρωτεογλυκάνης ηπαρίνης, οδηγεί στο διμερισμό του υποδοχέα. (α) Δομή του FGFR. (β) Διακρίνονται τα δυο μόρια του FGF, το μόριο της ηπαρίνης και η εξωκυτταρική περιοχή του διμερισμένου υποδοχέα (οι δυο από τις τρεις περιοχές, όμοιες με ανοσοσφαιρίνες). Από Voet and Voet, Biochemistry, 2004.

Εικόνα 9.10 Σχηματική αναπαράσταση της διαμεμβρανικής και της εξωκυτταρικής περιοχής του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα. Η σύνδεση του EGF σε ένα μονομερή υποδοχέα, οδηγεί σε αλλαγή της διαμόρφωσής του και στο διμερισμό δυο όμοιων EGF-R.

Περιοχή σύνδεσης του EGF

Δηλαδή, για να ενεργοποιηθεί ο υποδοχέας πρέπει δυο μόρια EGF να συνδεθούν σε δύο μονομερείς υποδοχείς. Στη συνέχεια, οι δυο υποδοχείς διμερίζονται και ο υποδοχέας ενεργοποιείται. Από Molecular Cell Biology, Lodish et al, 2007.

272

Σε μερικές περιπτώσεις, ο προσδέτης υπάρχει σε διμερή μορφή και με τη δέσμευσή του επάγει το σχηματισμό διμερών του ενεργού υποδοχέα. Ο PDGF αποτελεί ένα τέτοιο παράγοντα, ο οποίος αποτελείται από δύο πρωτεϊνικές υπομονάδες ενωμένες με γέφυρα δισουλφιδικού δεσμού.

Εικόνα 9.11. Διμερής δομή του αυξητικού παράγοντα των

αιμοπεταλίων. Οι δυο υπομονάδες είναι συνδεδεμένες με δεσμούς θείου.

∆εσμός S-S

Σχηματισμός ετεροδιμερών Μια άλλη όψη του προσδετο-επαγόμενου ολιγομερισμού του υποδοχέα, που έχει

ρυθμιστική σημασία, είναι η δυνατότητα του υποδοχέα να σχηματίζει ετεροδιμερή. Έχουν αναγνωριστεί οικογένειες πρωτεϊνών με στενά συγγενικά μέλη, για ένα αριθμό αυξητικών παραγόντων καθώς και για τους αντίστοιχους υποδοχείς τους.

Ο ετερόλογος διμερισμός παρατηρείται ανάμεσα στα διαφορετικά μέλη μιας οικογένειας υποδοχέων. Με αυτόν τον τρόπο, ένας αυξητικός παράγοντας μπορεί να δεσμευτεί και να ενεργοποιήσει διαφορετικούς διμερείς συνδυασμούς μελών μιας οικογένειας υποδοχέων. Η Εικόνα 9.12 δείχνει τις δυνατότητες ετερόλογου διμερισμού των υποδοχέων χρησιμοποιώντας ως παράδειγμα τον υποδοχέα PDGF.

Ο ετεροδιμερισμός των υπομονάδων των υποδοχέων αποτελεί ένα μηχανισμό, ο οποίος μπορεί να αυξήσει την ποικιλία και τη ρύθμιση των μονοπατιών μετάδοσης του μηνύματος. Από τη στιγμή που διάφορα μέλη μιας οικογένειας υποδοχέα διαφέρουν στην ακριβή δομή των περιοχών αυτοφωσφορυλίωσης και των ρυθμιστικών αλληλουχιών, υποτίθεται ότι η ρύθμιση και η δραστικότητα είναι διαφορετικές για τους διάφορους συνδυασμούς των υποτύπων ενός υποδοχέα. Οι υπότυποι ενός υποδοχέα που εκφράζονται σε εξειδικευμένους ιστούς ενός οργανισμού του δίνουν τη δυνατότητα να επεξεργάζεται ορμονικά μηνύματα με διαφορετικό τρόπο.

273

Εικόνα 9.12 Ομο- και ετερο-διμερή του υποδοχέα PDGF. Υπάρχουν δυο υπότυποι του υποδοχέα PDGF, ο α- και ο β-υπότυπος, και σχηματίζονται τα διμερή αα, αβ και ββ. Ο αυξητικός παράγοντας που παράγεται από τα αιμοπετάλια (PDGF: platelet derived growth factor) είναι ένας διμερής αυξητικός παράγοντας, ο οποίος αποτελείται από δυο αλυσίδες, την Α και την Β και συναντάται στις εξείς διμερείς μορφές ΑΑ, ΑΒ και ΒΒ. Το ΑΑ διμερές συνδέεται στον υποδοχέα αα, το ΑΒ διμερές συνδέεται στον υποδοχέα αα και αβ, και το ΒΒ διμερές συνδέεται σε όλους τους τύπους των PDGF υποδοχέων.

Η ενεργοποίηση του υποδοχέα μετά τη σύνδεση του προσδέτη

Η σύνδεση του εξωκυτταρικού προσδέτη είδαμε ότι οδηγεί στην αλλαγή της ολιγομερούς κατάστασης του υποδοχέα. Ο διμερισμός του υποδοχέα είναι το έναυσμα για την ενεργοποίηση της ενδογενούς δραστικότητας κινάσης τυροσίνης. Ο διμερισμός ενός υποδοχέα μετά από σύνδεση του προσδέτη, αποτελεί μια γενική μέθοδο μετάδοσης του μηνύματος στο εσωτερικό του κυττάρου μέσω της μεμβράνης, με τη βοήθεια υποδοχέων κινασών τυροσίνης. Η διέγερση της κινάσης τυροσίνης μπορεί να προκαλέσει διπλό αποτέλεσμα:

Πρώτον, αυτοφωσφορυλίωση του υποδοχέα με ένα trans- μηχανισμό πχ. ανάμεσα στα δυο πρωτομερή (protomers) του υποδοχέα και

Δεύτερον, φωσφορυλίωση διαφόρων πρωτεϊνικών υποστρωμάτων σε κατάλοιπα τυροσίνης (Εικόνα 9.13).

274

προσδέτης α.

Εικόνα 9.13 Μηχανισμός ενεργοποίησης του υποδοχέα κινάση τυροσίνης μετά από σύνδεση του προσδέτη. Η ενεργοποίηση βασίζεται σ’ ένα προσδέτο-επαγόμενο ολιγομερισμό ή/και σε μια αλλαγή της διαμόρφωσης του υποδοχέα. α) Ένας μονομερής ή διμερής προσδέτης με δύο θέσεις πρόσδεσης (bivalent ligand) επάγει το διμερισμό ενός υποδοχέα, ο οποίος απουσία του προσδέτη υπάρχει σε μονομερή μορφή. β) Ένας διμερής υποδοχέας ενεργοποιείται με τη σύνδεση του προσδέτη μέσω ενός αλλοστερικού μηχανισμού.

Εικόνα 9.14 Αυτοφωσφορυλίωση επαγόμενη από τον προσδέτη (L, ligand) και φωσφορυλίωση

υποστρώματος από τις κινάσες τυροσίνης του υποδοχέα. Η περιοχή της κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα ενεργοποιείται με τη σύνδεση του προσδέτη. Επομένως μπορούν να πραγματοποιηθούν η αυτοφωσφορυλίωση και/ή φωσφορυλίωση των πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Τα πρωτεϊνικά υποστρώματα παρουσιάζουν ειδικές περιοχές σύνδεσης φωσφοτυροσινών (περιοχές SH2 και PTB), τις οποίες αναγνωρίζουν και στις οποίες συνδέονται οι φωσφορυλιωμένες τυροσίνες, που σχηματίζονται κατά τη διαδικασία της αυτοφωσφορυλίωσης.

β.

γ.

προσδέτης

ανενεργός ενεργός

σήμα

ενεργός

σήμα

ανενεργός

α. Αυτο-φωσφορυλίωση

ανενεργός ενεργός

ενεργός

υπόστρωμα β. Αυτο-φωσφορυλίωση και φωσφορυλίωση υποστρώματος

275

∆ομή της περιοχής της κινάσης τυροσίνης στον υποδοχέα της ινσουλίνης

Μετά το διμερισμό του υποδοχέα ενεργοποιείται η κινάση τυροσίνης της ενδοπλασματικής του περιοχής. Από τη μελέτη της κρυσταλλικής δομής της περιοχής της κινάσης τυροσίνης του ανθρώπινου υποδοχέα της ινσουλίνης αποκαλύφθηκε ο μηχανισμός με τον οποίο η αυτοφωσφορυλίωση ελέγχει τη δράση της κινάσης τυροσίνης (Hubbard et al., 1994). Ο υποδοχέας της ινσουλίνης έχει μια α2β2 δομή (βλπ Εικόνα 9.15). Η α-υπομονάδα βρίσκεται εξ’ ολοκλήρου στην εξωκυτταρική περιοχή και ενώνεται με τη β αλυσίδα μέσω δισουλφιδικών δεσμών. Η β αλυσίδα περιέχει ένα διαμεμβρανικό τμήμα, ενώ η κινάση τυροσίνης βρίσκεται στο κυτταροπλασματικό της τμήμα. Η σύνδεση της ινσουλίνης στο εξωκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα ενεργοποιεί την κινάση τυροσίνης της β-αλυσίδας η οποία φωσφορυλιώνει συνολικά 7 κατάλοιπα τυροσίνης στην κυτταροπλασματική περιοχή. Δύο απ’ αυτά βρίσκονται κοντά στο διαμεμβρανικό τμήμα, αλλά τρία στην περιοχή της κινάσης τυροσίνης και ακόμη δύο στην περιοχή του καρβοξυτελικού άκρου. Η αυτοφωσφορυλίωση ενεργοποιεί την κινάση του υποδοχέα. Στη συνέχεια, το πρωτεϊνικό υπόστρωμα του υποδοχέα της ινσουλίνης IRS (insulin receptor substrate), φωσφορυλιώνεται σε κατάλοιπα τυροσίνης, τα οποία λειτουργούν ως περιοχές πρόσδεσης άλλων πρωτεϊνών μέσω των SH2 περιοχών. Μεταλλάξεις στην περιοχή του καταλυτικού κέντρου του υποδοχέα της ινσουλίνης έδειξαν το σημαντικό ρόλο της δράσης της κινάσης στη μετάδοση του μηνύματος στο εσωτερικό του κυττάρου.

Η κρυσταλλική δομή ενός τμήματος 306 αμινοξέων της β αλυσίδας του υποδοχέα της ινσουλίνης δείχνει ότι η περιοχή της κινάσης έχει παρόμοια κατασκευή με την καταλυτική περιοχή των πρωτεϊνικών κινασών Ser/Thr. Η περιοχή της κινάσης τυροσίνης αποτελείται από δύο λοβούς: ένα μικρότερο αμινοτελικό και ένα μεγαλύτερο καρβοξυτελικό λοβό. Στο μεγαλύτερο λοβό βρίσκεται ένα κατάλοιπο Arg, στο οποίο αποδίδεται η βάση της καταλυτικής λειτουργίας κατά τη μεταφορά της φωσφορικής ομάδας. Η περιοχή ενεργοποίησης, που βρίσκεται σε μια θηλιά, έχει μεγάλη σημασία για τη ρύθμιση της κινάσης Tyr μέσω φωσφορυλίωσης. Σην περιοχή ενεργοποίησης, βρίσκεται ένα υπόλειμμα τυροσίνης (Tyr1162 στην Εικόνα 9.14), το οποίο αυτοφωσφορυλιώνεται με τη σύνδεση της ινσουλίνης στον υποδοχέα. Η αυτοφωσφορυλίωση αυτή προκαλεί ενεργοποίηση του υποδοχέα. Στην ανενεργή κατάσταση της περιοχής της κινάσης, η περιοχή ενεργοποίησης με τη Tyr1162 προσανατολίζεται προς το ενεργό κέντρο του ενζύμου και μπλοκάρει την περιοχή σύνδεσης του ATP. Κάτω απ΄ αυτές τις συνθήκες δεν καθίσταται δυνατή η αυτοφωσφορυλίωση.

Πιθανολογείται ότι η καταλυτική περιοχή του υποδοχέα μπορεί να υπάρξει σε δύο διαμορφώσεις. Στην ανενεργή διαμόρφωση, το τμήμα ενεργοποίησης βρίσκεται μέσα στο καταλυτικό κέντρο, ενώ στην ενεργή διαμόρφωση εξέρχεται από το ενεργό κέντρο, ώστε να απελευθερωθούν οι περιοχές σύνδεσης του ATP και των πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Σύμφωνα μ’ αυτό το μοντέλο, η ισορροπία ανάμεσα σε αυτές τις δύο διαμορφώσεις είναι μετατοπισμένη προς τη μεριά της μη ενεργής μορφής (μη φωσφορυλιωμένη κατάσταση). Η φωσφορυλίωση της Tyr1162 τη μετατοπίζει προς την ενεργοποιημένη μορφή.

Πιστεύεται ότι η σύνδεση της ινσουλίνης προκαλεί μια αλλαγή στη κοινή διαμόρφωση

των β αλυσίδων στην κυτταροπλασματικό τμήμα. Συνεπώς οι περιοχές φωσφορυλίωσης και τα ενεργά κέντρα των δύο β αλυσίδων προσανατολίζονται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να καθίσταται δυνατή η αμοιβαία φωσφορυλίωσή τους. Η αλλαγή στη διαμόρφωση επιτρέπει μια trans- φωσφορυλίωση και των δύο β-αλυσίδων, οι οποίες επίσης περιλαμβάνουν φωσφορυλίωση μιας τυροσίνης στη περιοχή ενεργοποίησης. Σύμφωνα με τη θεωρία αυτή η φωσφορυλίωση της Tyr1162 κατέχει μια θέση κλειδί στην ενεργοποίηση του υποδοχέα. Η

276

ερμηνεία αυτή υποστηρίζεται από τη διαπίστωση ότι όλοι οι γνωστοί υποδοχείς κινάσες τυροσίνης έχουν ένα κατάλοιπο τυροσίνης σε μια ισοδύναμη θέση μ’ αυτή της Tyr1162.

Ρ-θηλιά

Ρυθμιστική θηλιά Καταλυτική

θηλιά

Εικόνα 9.15 Δομή της καταλυτικής περιοχής του υποδοχέα της ινσουλίνης. Η κρυσταλλική δομή της περιοχής της κινάσης τυροσίνης του υποδοχέα της ινσουλίνης έχει μια δίλοβη δομή. Η P-θηλιά μεσολαβεί στη σύνδεση της φωσφορικής ομάδας του ATP. Η καταλυτική θηλιά περιέχει απαραίτητα για την κατάλυση υπολείμματα Asp και Asn, τα οποία βρέθηκαν σε ισοδύναμες θέσεις σαν συντηρημένα κατάλοιπα σε πολλές ειδικές πρωτεϊνικές κινάσες Tyr και Ser/Thr. Η πρόσβαση στο ενεργό κέντρο μπλοκάρεται από μια ρυθμιστική θηλιά που περιέχει τρία κατάλοιπα Tyr (Tyr1158, Tyr1162 και Tyr1163). Η φωσφορυλίωση των καταλοίπων αυτών ενεργοποιεί τον υποδοχέα.

Ενεργοποίηση της περιοχής κινάσης τυροσίνης και πρωτεΐνες-τελεστές

Η διέγερση της δράσης της κυτταροπλασματικής κινάσης τυροσίνης είναι αποτέλεσμα της σύνδεσης του προσδέτη με τον υποδοχέα.

Η προσδέτο-επαγόμενη φωσφορυλίωση των υπολειμμάτων τυροσίνης έχει ένα διπλό αποτέλεσμα: Η δραστηριότητα κινάσης τυροσίνης οδηγεί σε trans- φωσφορυλίωση των δύο διμερών (αυτο-ενεργοποίηση) μέσω φωσφορυλίωσης καταλοίπων Tyr, που βρίσκονται κοντά στο ενεργό κέντρο. Επιπλέον, φωσφορυλιώνονται και κατάλοιπα Tyr εκτός του ενεργού κέντρου. Αυτά τα φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα χρησιμοποιούνται ως θέσεις σύνδεσης για πρωτεϊνικά υποστρώματα, μέσω των SH2 ή των PTB περιοχών. Οι πρωτεΐνες (effector proteins: πρωτεΐνες τελεστές) μπορεί να είναι ένζυμα που ενεργοποιούνται με τη φωσφορυλίωση των τυροσινών ή απλώς να λειτουργούν ως μόρια-προσαρμογείς (adaptor molecules), να έχουν δηλαδή την ιδιότητα να συνδέουν άλλες πρωτεΐνες στον ενεργοποιημένο υποδοχέα μέσω πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων. Με τη βοήθεια των μορίων αυτών άλλες σηματοδοτικές πρωτεΐνες οδηγούνται στον ενεργοποιημένο υποδοχέα και στην κυτταρική μεμβράνη (Εικόνα 9.16).

Η αυτοφωσφορυλίωση και η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνικών υποστρωμάτων αποτελούν απαραίτητα συστατικά της μετάδοσης του μηνύματος μέσω των υποδοχέων κινάσες τυροσίνης.

277

Το είδος της πρωτεΐνης-τελεστή που θα συνδεθεί στον υποδοχέα εξαρτάται από τη φύση της SH2 δομικής περιοχής και τις αλληλουχίες του υποδοχέα που περιβάλλουν τις περιοχές των φωσφορυλιωμένων τυροσινών. Ο υποδοχέας κινάση τυροσίνης συχνά έχει διάφορες περιοχές αυτοφωσφορυλίωσης με διαφορετικές γειτονικές αλληλουχίες, μέσω των οποίων κάθε φωσφορυλιωμένη τυροσίνη του υποδοχέα μπορεί να λειτουργήσει ως σημείο πρόσδεσης για άλλη πρωτεΐνη. Η Εικόνα 9.16 δείχνει την ποικιλία των πρωτεϊνών-τελεστών που μπορούν να αλληλεπιδράσουν μ’ ένα τύπο υποδοχέα, χρησιμοποιώντας των PDGF υποδοχέα ως παράδειγμα.

- Φωσφολιπάση Cγ- Κινάσες Tyr: Src κινάση και άλλες- p120 GAP - Πρωτεΐνες προσαρμογ

σήμα Grb2 Shc ενεργοποίηση

Εικόνα 9.16 Η σύνδεση του αυξητικού παράγοντα και ο διμερισμός του υποδοχέα οδηγεί στην trans-

φωσφορυλίωση των δυο διμερών. Οι φωσφορυλιωμένες τυροσίνες του υποδοχέα λειτουργούν ως θέσεις πρόσδεσης για ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες, με ειδικές περιοχές SH2 και ΡΤΒ, οι οποίες αναγνωρίζουν φωσφορυλιωμένες τυροσίνες. Οι πρωτεΐνες αυτές ενεργοποιούνται κατά την πρόσδεση, και μεταφέρουν στη συνέχεια το φώσφορο σε άλλες πρωτεΐνες-στόχους.

Οι πρωτεΐνες που έχουν βρεθεί να αλληλεπιδρούν άμεσα με τις φωσφορυλιωμένες τυροσίνες είναι: η φωσφολιπάση Cγ, κινάσες τυροσίνης (src κ.α.), η p120 GAP (μια GTP activating protein), πρωτεΐνες-προσαρμογείς (Grb2, Shc, IRS), φωσφατάσες τυροσίνης (Syp κ.α) και η ΡΙ3-κινάση.

Μερικά σημαντικά μόρια-τελεστές των υποδοχέων κινάσες τυροσίνης είναι : - η p85 υπομονάδα της PI3-κινάσης - η φωσφολιπάση Cγ - οι κινάσες τυροσίνης της Src οικογένειας που δεν είναι υποδοχείς - η p120 GAP, ένα ένζυμο που ενεργοποιεί GTPase (GTPase activating enzyme), που

δρα στο μονοπάτι μετάδοσης του μηνύματος μέσω των Ras πρωτεϊνών - η Grb2 πρωτεΐνη, μια πρωτεΐνη-προσαρμογέας (adaptor protein) στο Ras-εξαρτώμενο

μονοπάτι μετάδοσης του μηνύματος - η SH2-PTP2 πρωτεϊνική φωσφατάση τυροσίνης.

Αυτά τα παραδείγματα δείχνουν την ποικιλομορφία των μεταγωγικών μονοπατιών που μπορούν να ενεργοποιήσουν οι υποδοχείς κινάσες τυροσίνης.

IRS - Φωσφατάσες Tyr: Syp και άλλες - ΡΙ-3-κινάση

278

Ξεκινώντας από τους υποδοχείς κινάσες τυροσίνης, ενεργοποιούνται μεταγωγικά μονοπάτια που περιλαμβάνουν ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μόρια, όπως η τριφωσφορική ινοσιτόλη (inositol-1,4,5-triphosphate, IP3), πολυφωσφοϊνοσιτίδια (PtdinsP3), Ca2+, και διακυλογλυκερόλη (diacylglycerol, DAG). Οι υποδοχείς κινάσες τυροσίνης είναι επίσης κύρια συστατικά σηματοδοτικών μονοπατιών που ελέγχουν την αύξηση και τη διαφοροποίηση του κυττάρου. Οι πρωτεΐνες-τελεστές που αναφέρθηκαν παραπάνω, είναι συστατικά-κλειδιά κεντρικών μεταγωγικών μονοπατιών, και ξεκινώντας από πολύ διαφορετικά εξωτερικά σήματα, ενεργοποιούνται μέσω υποδοχέων κινασών τυροσίνης και συνδέονται με τη μεταγωγή του σήματος

- P Src

Grb2- P

581

SOS

Εικόνα 9.17 Κατάλοιπα φωσφοτυροσινών του υποδοχέα του PDGF και η σύνδεση σηματοδοτικών πρωτεϊνών που περιέχουν SH2 περιοχές. Η εικόνα δείχνει την ποικιλία των τελεστών που μπορούν να αλληλεπιδράσουν με τον ενεργοποιημένο υποδοχέα. Τα κατάλοιπα τυροσίνης του PDGF υποδοχέα σχεδιάζονται με βάση τη θέση τους στην αλληλουχία του υποδοχέα. Ο υποδοχέας αυτός έχει τουλάχιστον 9 περιοχές φωσφορυλίωσης τυροσίνης στην κυτταροπλασματική του περιοχή. Τα φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα τυροσίνης αναγνωρίζονται από τις SH2 περιοχές των πρωτεϊνών: Src: κινάσες τυροσίνης. Grb2, p85: πρωτεΐνες προσαρμογείς, PI3-kinase: κινάση της 3-φωσφατιδυλ-ινοσιτόλης, GAP: GTPase activating protein, PL-Cγ : φωσφολιπάση Cγ.

Εικόνα 9.18 Φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα τυροσίνης του υποδοχέα PDGF και του υποδοχέα EGF στα οποία προσδένονται διάφορα σηματοδοτικά μόρια.

279

Ανάλογα με τη φύση των πρωτεϊνών τελεστών υπάρχουν διάφοροι μηχανισμοί ενεργοποίησής τους. Ορισμένοι απ’ αυτούς που θεωρούνται σημαντικοί είναι :

- φωσφορυλίωση σε κατάλοιπα τυροσινών του τελεστή, πχ. η φωσφολιπάση C-γ - επαγωγή μιας αλλαγής στη διαμόρφωση του τελεστή, πχ. η PI3 κινάση - μεταφορά του τελεστή στην πλασματική μεμβράνη πχ. Grb2-Sos, Shc-Grb2

Ενεργοποίηση της Ras από τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων

Πρωτεΐνη-κλειδί στη μεταγωγή μηνύματος μέσω πρωτεϊνών κινασών τυροσίνης είναι η πρωτεΐνη Ras, μια μονομερής G-πρωτεΐνη, που βρίσκεται στην εσωτερική πλευρά της πλασματικής μεμβράνης. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα κινάση τυροσίνης οδηγεί στη σύνδεση του μορίου-προσαρμογέα Grb2, μέσω της SH2 περιοχής του στις φωσφορυλιωμένες τυροσίνες του υποδοχέα. Η Grb2 ενεργοποιείται και στη συνέχεια συνδέεται μέσω της SH3 περιοχής της με μια περιοχή πλούσια σε προλίνη της Sos (ένα GEF, Guanine nucleotide exchange factor). Η Sos με τη σειρά της ενεργοποιεί την ανταλλαγή του GDP με GTP και ενεργοποιεί τη μικρή GTPαση Ras.

Πρωτεΐνη πλούσια σε Pro, ενεργοποιητής της Ras

TyrTyr

Tyr

TyrTyr

Tyr

Ras

Ras

GDP

Adaptor molecule

Σηματοδότηση Εικόνα 9.19 Μετά την ενεργοποίηση του RTK (Receptor Tyrosine Kinase), μια πρωτεΐνη-προσαρμογέας, η GRB2 συνδέεται μέσω της SH2 περιοχής της με τις φωσφορυλιωμένες Tyr του υποδοχέα και μέσω της SH3 περιοχής της με την πρωτεΐνη Sos, μια πρωτεΐνη πλούσια σε προλίνη, που μπορεί να ενεργοποιεί τη μικρή GTPαση Ras. Από Alberts et al, Essential Cell Biology, 1998.

2. ∆ομικές περιοχές των πρωτεϊνών που επιτρέπουν την αλληλεπίδραση

μεταξύ πρωτεϊνών Οι ειδικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών αποτελούν τη βάση για τη σύνδεση

των σηματοδοτικών πρωτεϊνών. Μέσω αυτών των αλληλεπιδράσεων, έρχονται κοντά τα σηματοδοτικά ένζυμα με τα υποστρώματά τους, οδηγώντας το πρωτεϊνικό υπόστρωμα προς το καταλυτικό κέντρο ή κατευθύνοντας ένα ένζυμο, που συνήθως εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, προς την κυτταρική μεμβράνη, ώστε να έχει άμεση πρόσβαση στα υποστρώματά του.

280

Το κύτταρο χρησιμοποιεί συγκεκριμένα δομικά στοιχεία για την επικοινωνία μεταξύ διάφορων πρωτεϊνών ενός σηματοδοτικού μονοπατιού. Αυτά είναι πρωτεϊνικές περιοχές (domains) 60-100 αμινοξέων, με μια κοινή βασική δομή παρ’ όλο που συναντώνται σε πολύ διαφορετικές πρωτεΐνες. Μεσολαβούν όχι μόνο στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών αλλά και μεταξύ αυτών και των λιπιδίων της πλασματικής μεμβράνης. Χρησιμοποιούνται για να συνδέσουν πρωτεΐνες ενός σηματοδοτικού μονοπατιού ή για να τις κατευθύνουν προς την πλασματική μεμβράνη.

Δύο σημεία, ιδιαίτερης σημασίας για την αλληλεπίδραση πρωτεϊνών είναι: α/ η ύπαρξη αρκετών παραλλαγών του βασικού μοτίβου των δομικών περιοχών με ελαφρώς τροποποιημένη ειδικότητα σύνδεσης και β/ η παρουσία αρκετών δομικών περιοχών σε μία πρωτεΐνη. Μεταβάλλεται μ΄ αυτόν τον τρόπο η ικανότητα σύνδεσης με διάφορα δομικά μοτίβα των πρωτεϊνών-στόχων. Αν μια σηματοδοτική πρωτεΐνη έχει πολλαπλές θέσεις σύνδεσης για διαφορετικές πρωτεΐνες-τελεστές (multivalence of signal proteins), μπορούν να δημιουργηθούν δίκτυα αλληλεπιδρώντων πρωτεϊνών που συμβάλλουν στην εξειδίκευση και στην ποικιλομορφία της μετάδοσης του μηνύματος, επιτρέποντας τη σύνδεση διαφορετικών σηματοδοτικών μονοπατιών.

Μέχρι σήμερα έχει περιγραφεί ένας μεγάλος αριθμός δομικών μοτίβων, με συγκεκριμένες και εξειδικευμένες δυνατότητες σύνδεσης, τα πιο σημαντικά από τα οποία είναι οι :

• Περιοχές SH2 και περιοχές PTP : αναγνωρίζουν φωσφορυλιωμένες τυροσίνες.

• Περιοχές SH3: αναγνωρίζουν περιοχές πλούσιες σε προλίνη. • Περιοχές PH (Pleckstrin Homology) : αναγνωρίζουν φωσφολιπίδια και

βοηθούν τη σύνδεση των πρωτεϊνών στην κυτταρική μεμβράνη. • Περιοχές PDZ : αναγνωρίζουν μικρές πεπτιδικές αλληλουχίες και βοηθούν

στη δημιουργία μακρομοριακών συμπλεγμάτων. • Περιοχές WW : αν και δεν είναι ακόμη γνωστός ο ακριβής τους στόχος

βοηθούν στην αλληλεπίδραση πρωτεϊνών κατά τη διαδικασία της ουβικουιτινίωσης.

Εικόνα 9.20 Σηματοδοτικές πρωτεΐνες στις οποίες διακρίνοντααλληλεπίδρασης με άλλες πρωτεΐνες.

ι οι περιοχές

Src/Lck: οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών Tyr Syp: πρωτεϊνικές φωσφατάσες τυροσίνης. p85/PI3K: ρυθμιστική υπομονάδα της ΡΙ3-κινάσης Grb2, Shc, IRS-1: πρωτεΐνες προσαρμογείς Stat: μεταγραφικός παράγοντας βARK: κινάση του β-αδρενεργικού υποδοχέα.

281

Εικόνα 9.21 Αλληλεπίδραση

διαφόρων πρωτεϊνών με τη βοήθεια των περιοχών αλληλεπίδρασης. Μια υποθετική πρωτεΐνη περιέχει περιοχές PH, SH2, SH3 και PTB. Μέσω των SH2 και PTB συνδέεται με φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα τυροσίνης των πρωτεϊνών 1 και 2. Μέσω της SH3 συνδέεται με μια περιοχή πλούσια σε προλίνη της πρωτεΐνης 3, ενώ μέσω της ΡΗ περιοχής συνδέεται με τα φωσφατυδυλο-ινοσιτίδια της μεμβράνης. Με τη σειρά της η πρωτεΐνη 3 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Χ δημιουργώντας ένα μακρομοριακό σύμπλεγμα.

Περιοχές SH2

Οι SH2 περιοχές αποτελούν τις καλύτερα μελετημένες δομικές πρωτεϊνικές περιοχές με μια ρυθμιστική λειτουργία. Ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά ως ένα μοτίβο αλληλουχίας που παρουσίαζε ομολογία με μια αλληλουχία της Src κινάσης τυροσίνης. Από εκεί πήραν και την ονομασία τους SH: Src homolog. Η Src (προφέρεται sarc) ήταν η πρώτη κινάση τυροσίνης που έγινε γνωστή. Το ένζυμο αυτό ανακαλύφθηκε στη μεταλλαγμένη του, ιδιοσύστατα ενεργή, μορφή (v-sarc) σε ρετροϊούς πτηνών που επάγουν σαρκώματα. Αργότερα βρέθηκε ότι υπάρχει και στα κύτταρα των θηλαστικών (c-sarc) όπου εμπλέκεται στη ρύθμιση της κυτταρικής αύξησης και διαφοροποίησης.

Εξειδίκευση σύνδεσης και δομή των περιοχών SH2 Οι περιοχές SH2 αναγνωρίζουν φωσφορυλιωμένες τυροσίνες σε πρωτεΐνες-στόχους και

συνδέονται σ’ αυτές. Πέρα από την ύπαρξη των φωσφορυλιωμένων τυροσινών κρίσιμο ρόλο παίζουν και οι αλληλουχίες που γειτονεύουν μ’ αυτές. Οι γειτονικές αλληλουχίες των φωσφοτυροσινών καθορίζουν ποιο υπόστρωμα που περιέχει περιοχές SH2 θα συνδεθεί στις φωσφορυλιωμένες τυροσίνες και διαφοροποιούν τη συνάφεια σύνδεσης για διαφορετικές περιοχές SH2. Η μεγάλη ποικιλία των περιοχών αυτών και των υποστρωμάτων τους τονίζεται από την παρατήρηση ότι πολλές σηματοδοτικές πρωτεΐνες περιέχουν δύο περιοχές SH2. Αυτές έχουν διαφορετική συγγένεια σύνδεσης για διάφορα υποστρώματα.

Έπειτα από πειράματα που χρησιμοποιούσαν βιβλιοθήκες πεπτιδίων και συστηματική διερεύνηση των περιοχών σύνδεσης για διαφορετικές περιοχές SH2, βρέθηκε ότι αυτές μπορούν να χωριστούν σε τουλάχιστον 5 τάξεις (1A, 1B, 2, 3, 4) που διαφέρουν στις απαιτήσεις τους για τις αλληλουχίες των υποστρωμάτων. Επιπλέον έχει βρεθεί ένα ακόμη μοτίβο σύνδεσης σε φωσφοτυροσίνες, γνωστό ως περιοχή σύνδεσης φωσφορυλιωμένων τυροσινών, PTB (phosphotyrosine binding domain).

Φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών που περιέχουν SH2 περιοχές Πολλές σηματοδοτικές πρωτεΐνες που περιέχουν περιοχές SH2 μεταφέρονται, μέσω

αλληλεπίδρασης της SH2 περιοχής με τη φωσφοτυροσίνη, κοντά στο καταλυτικό κέντρο της κινάσης τυροσίνης, και γίνονται οι ίδιες υποστρώματα που θα υποστούν φωσφορυλίωση των

282

τυροσινών τους. Μέσω αυτού του μηχανισμού, νέες θέσεις πρόσδεσης μπορούν να δημιουργηθούν για άλλες πρωτεΐνες που περιέχουν SH2 περιοχές. Έτσι πολλά στοιχεία ενός σηματοδοτικού μονοπατιού μπορούν να συνδεθούν μεταξύ τους. Για παράδειγμα, η φωσφατάση Syp, που περιέχει περιοχές SH2, μετά τη φωσφορυλίωσή της σε κατάλοιπα Tyr από τον υποδοχέα PDGF, δημιουργεί μια θέση σύνδεσης για την πρωτεΐνη-προσαρμογέα Grb2, η οποία περιέχει επίσης μια SH2 περιοχή.

Αλλοστερική ενεργοποίηση μιας πρωτεΐνης που περιέχει SH2 Έχουν περιγραφεί αρκετές περιπτώσεις, στις οποίες η σύνδεση ενός ενζύμου σ’ έναν

ενεργοποιημένο υποδοχέα κινάσης τυροσίνης (μέσω μιας SH2 περιοχής), οδηγεί στην αυξημένη καταλυτική δράση του ενζύμου. Τέτοια παραδείγματα αποτελούν η PI3-κινάση και η φωσφολιπάση Cγ. Ο μηχανισμός ενεργοποίησης δεν είναι ξεκάθαρος. Είναι πιθανόν ωστόσο, ότι κατά βάση είναι ένας αλλοστερικός μηχανισμός, όπως έχει προταθεί για την ενεργοποίηση της κινάσης τυροσίνης Src. Η κινάση Src μπορεί να φωσφορυλιωθεί σε κατάλοιπα τυροσίνης, και περιέχει μια SH2 περιοχή. Ένα καρβοξυ-τελικό κατάλοιπο τυροσίνης (Y527) παίζει έναν ειδικό ρόλο στη ρύθμιση της ενεργοποίησης της κινάσης Src, ελέγχοντας τη δραστικότητα της κινάσης με έναν αρνητικό τρόπο. Όταν η Tyr αυτή φωσφορυλιωθεί (pY527) συνδέεται ενδομοριακά στην SH2 περιοχή της κινάσης, εμποδίζοντας τη δραστηριότητα κινάσης. Εάν στην περιοχή SH2 συνδεθεί ένα κατάλοιπο φωσφοτυροσίνης ενός εξωγενούς προσδέτη, η αυτο-αναστολή της κινάσης Src άρεται.

Υ527

ΝΗ2

COOH

Εικόνα 9.22 Ρύθμισης της Src κινάσης με φωσφορυλίωση. Στο καρβοξυτελικό άκρο της κινάσης

βρίσκεται ένα κατάλοιπο τυροσίνης (Tyr527), το οποίο όταν φωσφορυλιώνεται από μια κινάση προκαλεί την απενεργοποίηση της Src κινάσης. Η φωσφορυλιωμένη Tyr527( P-Tyr527) συνδέεται ένδομοριακά στη SH2 περιοχή, μπλοκάροντας έτσι τη δράση της κινάσης Src. Η κινάση μπορεί να ενεργοποιηθεί με τρεις τρόπους: 1.Ένα υπόστρωμα με μεγαλύτερη συγγένεια για την SH2 περιοχή της Src, συνδέεται μαζί της απομακρύνοντας την Tyr527. Η ενεργοποίηση της Src κινάσης μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί και από μια πρωτεΐνη τελεστή που περιέχει μια SH2 περιοχή. Η SH2 περιοχή του τελεστή ανταγωνίζεται με τη SH2 περιοχή της Src κινάσης για τη σύνδεση στην P-Tyr527. 2.Ο φώσφορος της P-Tyr527 απομακρύνεται με τη βοήθεια μιας φωσφατάσης. 3. Η SΗ3 περιοχή μετατοπίζεται λόγω της σύνδεσής της με ένα υπόστρωμα.

283

Εικόνα 9.23 Δομή της φωσφορυλιωμένης c-Src κινάσης στην Τυροσίνη 527. Το παραπάνω διάγραμμα δείχνει τη δομή και την οργάνωση της “ κλειστής διαμόρφωσης” της Src κινάσης. Δύο σημεία της δομής της είναι σημαντικά για τη ρύθμισή της: i) Η φωσφορυλιωμένη Tyr 527 της καρβοξυτελικής ουράς βρίσκεται εγκλωβισμένη σε μια ενδομοριακή αλληλεπίδραση με τη SH2 περιοχή και ii) η SH3 περιοχή συνδέεται με τη περιοχή που ενώνει την SH2 περιοχή με την περιοχή της κινάσης. Και οι δύο παραπάνω αλληλεπιδράσεις θεωρείται ότι συμβάλλουν στην ανενεργή μορφή της κινάσης.

PTB, Περιοχή σύνδεσης φωσφοτυροσινών

Οι περιοχές αυτές παρουσιάζουν την ίδια λειτουργία με τις SH2 περιοχές και εντοπίζονται σε πρωτεΐνες που έχουν μια προσαρμοστική λειτουργία στρατολογώντας πρόσθετες σηματοδοτικές πρωτεΐνες στην περιοχή ενός ενεργοποιημένου υποδοχέα. Μια τέτοια πρωτεΐνη – προσαρμογέας είναι η Shc, η οποία εκτός από την περιοχή ΡΤΒ περιέχει και μια SH2, και το υπόστρωμα του υποδοχέα της ινσουλίνης IRS1 (insulin receptor substrate). Οι PTB περιοχές αναγνωρίζουν φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα τυροσίνης κοντά στο αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα. Παρά την κοινή προτίμησή τους να συνδέονται σε φωσφοτυροσίνες, οι SH2 και οι PTB έχουν πολύ διαφορετική δομή. Αντιθέτως οι PTB έχουν μια πολύ όμοια τοπολογία αναδίπλωσης με τις PH περιοχές.

Περιοχές SH3

Οι περιοχές αυτές βρίσκονται σε σηματοδοτικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε μονοπάτια όπου δρα μια κινάση τυροσίνης. Επίσης εντοπίζονται σε πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού και σε μια υπομονάδα της ουδετερόφιλης οξειδάσης του κυτοχρώματος. Η σύνδεση του προσδέτη στις SH3 περιοχές λαμβάνει χώρα μέσω αλληλουχιών πλούσιων σε προλίνη, περίπου 10 αμινοξέων. Πεπτίδια πλούσια σε προλίνη αποτελούν πολύ καλά υποστρώματα.

Δομή της περιοχής SH3 και σύνδεση του προσδέτη Ο προσδιορισμός της δομής των SH3 περιοχών που είναι συνδεδεμένες με πεπτίδια πλούσια σε προλίνη, έδειξε ότι η πλούσια σε προλίνη περιοχή του προσδέτη συνδέεται με τον ίδιο τρόπο όπως και μια αριστερόστροφη έλικα πολυπρολίνης τύπου II, με τρία αμινοξέα προλίνης ανά στροφή.

284

Η αλληλουχία X-P-p-X-P είναι μια συντηρημένη ακολουθία που αναγνωρίζεται από την περιοχή SH3. Στην αλληλουχία αυτή τα δύο κατάλοιπα προλίνης (P) είναι σταθερά, όπου X είναι κάποιο αλειφατικό κατάλοιπο αμινοξέος και p συνήθως είναι κάποιο κατάλοιπο προλίνης. Τα δύο κατάλοιπα προλίνης που είναι σταθερά, συνδέονται το καθένα σε κάποια υδρόφοβη θήκη (pocket) της SH3 περιοχής. Οι πεπτιδικοί προσδέτες μπορούν να συνδεθούν είτε με κατεύθυνση C→N είτε με κατεύθυνση N→C. Όπως και με τις SH2 περιοχές, έτσι υπάρχουν αρκετές διαφορετικές SH3 περιοχές, υποδηλώνοντας τη διαφορετική συγγένεια σύνδεσης για τις πλούσιες σε προλίνη περιοχές, εξειδίκευση η οποία καθορίζεται από τις γειτονικές αλληλουχίες των σταθερών καταλοίπων προλίνης.

Λειτουργίες της SH3 περιοχής Η σημασία της SH3 περιοχής έγινε φανερή από την παρατήρηση ότι διαγραφή των SH3

περιοχών των κυτταροπλασματικών κινασών τυροσίνης Abl και Src, οδηγεί σε σημαντική αύξηση του δυναμικού μεταμόρφωσης σε όγκους (tumor-transforming potential) και των δύο κινασών. Επιπλέον έχει χαρακτηριστεί ένας σημαντικός αριθμός κυτταρικών διαδικασιών στις οποίες οι SH3 περιοχές μεσολαβούν ανάμεσα σε λειτουργικά σημαντικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών. Στις SH3 περιοχές μπορούν να αποδοθούν οι ακόλουθες κύριες λειτουργίες :

1.Μεσολάβηση εξειδικευμένης υποκυτταρικής τοποθέτησης: Μια θεμελιώδης λειτουργία των SH3 περιοχών είναι να σχηματίζουν λειτουργικά ολιγομερή σύμπλοκα σε συγκεκριμένες υποκυτταρικές θέσεις, συχνά σε συνεργασία με άλλες πρωτεϊνικές περιοχές. Οι SH3 περιοχές εντοπίζονται σε πολλές πρωτεΐνες που συνδέονται με τον κυτταροσκελετό ή με την πλασματική μεμβράνη. Τέτοια παραδείγματα αποτελούν η α-σπεκτρίνη που συνδέεται με την ακτίνη και η μυοσίνη Ib. Επιπλέον οι SH3 αλληλεπιδράσεις εμπλέκονται στην μετάδοση του μηνύματος μέσω του Ras μονοπατιού.

2. Ρύθμιση της ενζυμικής δράσης: Ένα παράδειγμα ρύθμισης της ενζυμικής δράσης μέσω των SH3 περιοχών είναι η αρνητική ρύθμιση της δράσης της Src κινάσης τυροσίνης μέσω SH3 αλληλεπιδράσεων, όπως περιγράφηκε παραπάνω.

3. Συνεισφορά στην εξειδίκευση υποστρωμάτων των κινασών τυροσίνης: Οι κινάσες τυροσίνης έχουν ενδογενώς χαμηλή εξειδίκευση υποστρώματος και γι’ αυτό το λόγο είναι δύσκολο να σχηματοποιηθούν σταθερές αλληλουχίες ως θέσεις φωσφορυλίωσης στα υποστρώματα κινασών τυροσίνης. Ένας τρόπος αύξησης της εξειδίκευσης και της επιλεκτικότητας της φωσφορυλίωσης τυροσινών φαίνεται να είναι η χρήση των SH3 περιοχών για τη σύνδεση των υποστρωμάτων στις κινάσες τυροσίνης (Εικόνα 9.15). Οι πρωτεΐνες-προσαρμογείς Crk, Grb2 και Nck φωσφορυλιώνονται εξειδικευμένα από την Abl κινάση σε κατάλοιπα τυροσίνης. Αυτές οι τρεις πρωτεΐνες-προσαρμογείς έχουν SH3 περιοχές που μπορούν να συνδεθούν σε αλληλουχίες της Abl πλούσιες σε προλίνη. Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί σε μια ισχυρή σύνδεση του υποστρώματος στην κινάση τυροσίνης και προκαλεί μια αποτελεσματική φωσφορυλίωση τυροσινών. Άλλα πιθανά υποστρώματα που δεν έχουν SH3 περιοχές αποκλείονται από την φωσφορυλίωση καθώς δεν μπορούν να συνδεθούν ισχυρά με την κινάση τυροσίνης.

Η ειδική λειτουργία των SH3 περιοχών βασίζεται στην αυξημένη εξειδίκευση υποστρώματος που εμφανίζουν οι κινάσες τυροσίνης σε αυτήν την περίπτωση. Στα κλασικά ένζυμα, η θέση σύνδεσης του υποστρώματος και το καταλυτικό κέντρο του ενζύμου βρίσκονται πολύ κοντά, και η θέση σύνδεσης του υποστρώματος παρουσιάζει γενικά υψηλή εξειδίκευση για ένα συγκεκριμένο υπόστρωμα. Η κατάσταση διαφέρει στις κινάσες τυροσίνης. Εδώ, η περιοχή σύνδεσης κοντά στο καταλυτικό κέντρο, παρουσιάζει μέτρια εκλεκτικότητα. Η εξειδίκευση της αντίδρασης αυξάνεται ωστόσο, με τη μεσολάβηση των SH3 περιοχών. Η αλληλεπίδραση ανάμεσα στις περιοχές SH3 και τις πλούσιες σε προλίνη

285

αλληλουχίες, συνεισφέρουν στην αναγνώριση του υποστρώματος, προσφέροντας υψηλή εξειδίκευση σε μια, σε διαφορετική περίπτωση, μη εξειδικευμένη καταλυτική αντίδραση.

Pro riche SH3 domain

Εικόνα 9.24 Οι SH3 περιοχές και η εξειδίκευση των κινασών τυροσίνης. Η σύνδεση της SH3 περιοχής του πρωτεϊνικού υποστρώματος S1 σε πλούσιες σε προλίνη αλληλουχίες της κινάσης τυροσίνης αυξάνει τη συγγένεια του ενζύμου με το υπόστρωμά του και ευνοεί την φωσφορυλίωσή του. Οι πρωτεΐνες εκείνες (στο σχήμα η S2), οι οποίες παρουσιάζουν θέσεις φωσφορυλίωσης τυροσινών αλλά δεν περιέχουν SH3 περιοχές δεν φωσφορυλιώνονται καθόλου από την κινάση, ή φωσφορυλιώνονται αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό.

Περιοχές ομόλογες της πλεξτρίνης (Pleckstrin Homology Domains)

Η PH περιοχή είναι ένα δομικό μοτίβο περίπου 100 αμινοξέων που εντοπίζεται σε πολλά σηματοδοτικά μόρια, όπως σε πρωτεϊνικές κινάσες Ser/Thr, κινάσες τυροσίνης, ισομορφές της φωσφολιπάσης C (PL-Cβ, γ και δ), σε παράγοντες ανταλλαγής G νουκλεοτιδίων (G nucleotide exchange factors), πρωτεΐνες-προσαρμογείς, και σε πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού. Αρχικά η PH περιοχή εντοπίστηκε σε μια πρωτεΐνη 47 kDa, την πλεξτρίνη, η οποία είναι το κύριο υπόστρωμα της πρωτεϊνικής κινάσης C στα αιμοπετάλια.

Οι PH περιοχές δεσμεύουν παράγωγα της φωσφατιδυλ-ινοσιτόλης και λόγω αυτής της ιδιότητας είναι ικανές να μεσολαβήσουν στη σύνδεση σηματοδοτικών πρωτεϊνών με την πλασματική μεμβράνη. Η PH περιοχή της PLCδ1 συνδέεται με φωσφολιπίδια, όπως τα Ptd(Ins)P2, με υψηλή συγγένεια και εξειδίκευση. Η κρυσταλλική δομή της PLCδ1 με συνδεδεμένα Ptd(Ins)P2 παρουσιάζει απρόσμενα μια παρόμοια τοπολογία αναδίπλωσης με την PTB περιοχή που δεσμεύει πεπτίδια με φωσφοτυροσίνες. Η σημασία αυτής της ομοιότητας έχει μείνει αδιευκρίνιστη.

Εικόνα 9.25 Και οι τρεις τύποι της φωσφολιπάσης C περιέχουν μια ΡΗ περιοχή, με τη βοήθεια της οποίας συνδέονται στην κυτταρική μεμβράνη.

286

Γενικά, στις PH μπορούν να αποδοθούν ειδικές λειτουργίες αγκυροβόλησης (anchoring functions) στις μεμβράνες, με τα φωσφολιπίδια των μεμβρανών να λειτουργούν ως συνδεόμενα υποστρώματα. Εξαιτίας της μεγάλης δομικής ομοιότητας των ΡΗ και των ΡΤΒ περιοχών, προτάθηκε ότι οι περιοχές ΡΗ επίσης μεσολαβούν σε εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών.

Περιοχές PDZ

Οι περιοχές αυτές αναγνωρίστηκαν για πρώτη φορά σε πρωτεΐνες μετασυναπτικών κυττάρων και η ονομασία τους προέρχεται από την παρουσία τους στις πρωτεΐνες PSD-95, DlgA και ZO-1. Έχουν επίσης βρεθεί και σε πολλές άλλες πρωτεΐνες, ειδικότερα σ’ αυτές που σχηματίζουν δομές στην κυτταρική μεμβράνη (πχ. ιοντικά κανάλια) και σε σηματοδοτικές πρωτεΐνες. Οι PDZ περιοχές αναγνωρίζουν μικρές πεπτιδικές αλληλουχίες μ’ ένα καρβοξυτελικό υδρόφοβο αμινοξύ και μια ελεύθερη καρβοξυλική ομάδα, όπως το μοτίβο E(S/T)DV στο καρβοξυτελικό άκρο συγκεκριμένων υπομονάδων ιοντικών καναλιών.

Μια σημαντική λειτουργία των PDZ περιοχών εντοπίζεται στο σχηματισμό μακρομοριακών συμπλόκων στην πλασματική μεμβράνη. Οι PDZ πρωτεΐνες μπορούν επίσης να εξασφαλίσουν ένα πλαίσιο για συμπλέγματα πρωτεϊνών, όπως κανάλια ιόντων, της πλασματικής μεμβράνης και μπορούν να βοηθήσουν στη στρατολόγηση πρωτεϊνών προς μακρομοριακά σύμπλοκα συνδεδεμένα με την πλασματική μεμβράνη.

Πολλές πρωτεΐνες περιέχουν πολλαπλές PDZ περιοχές με ποικίλες αλληλουχίες που μπορούν να εμφανίζουν διαφορετική εξειδίκευση σύνδεσης. Μ’ αυτόν τον τρόπο, μια πρωτεΐνη με πολλές περιοχές PDZ μπορεί να συμμετέχει στην οργάνωση διαφορετικών πρωτεϊνών σε υπερμοριακά σύμπλοκα. Η πρωτεΐνη lnaD της Drosophila, είναι ένα τέτοιο παράδειγμα, αποτελείται αποκλειστικά και μόνο από 5 PDZ περιοχές με διαφορετική εξειδίκευση σύνδεσης και στις οποίες συνδέονται διαφορετικές πρωτεΐνες-στόχοι. Οι πρωτεΐνες-στόχοι είναι τρεις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη φωτοδιαβίβαση της Drosophila. Η φωσφολιπάση C-β, η οποία αποτελεί το στόχο των Gαq που ενεργοποιούνται από τη ροδοψίνη, το κανάλι ασβεστίου TRP και η πρωτεϊνική κινάση C. Τo σηματοδοτικό σύμπλοκο που σχηματίζεται επιτρέπει την ενεργοποίηση του καναλιού TRP από τη φωσφολιπάση C, ως απόκριση στη διέγερση της ροδοψίνης. Επιπλέον, η παρουσία της πρωτεϊνικής κινάσης C επιτρέπει την αποτελεσματική απενεργοποίηση, μέσω φωσφορυλίωσης, του TRP καναλιού. Θεωρείται ότι η lnaD λειτουργεί ως πρωτεΐνη-προσαρμογέας η οποία οργανώνει τα σηματοδοτικά γεγονότα που επάγονται από το φως, στα υπερμοριακά σύμπλοκα.

Εικόνα 9.26 Η InaD αποτελείται αποκλειστικά και μόνο από PDZ περιοχές (5 PDZ περιοχές) και

παίζει σημαντικό ρόλο στη φωτοδιαβίβαση, συνενώνοντας σε ένα μακρομοριακό σύμπλοκο τον υποδοχέα της ροδοψίνης, την τρανσδουσίνη, την PLC, την PKC και το κανάλι Trp.

287

Περιοχές WW

Οι περιοχές αυτές είναι μικρά πρωτεϊνικά τμήματα των 35-40 αμινοξέων, τα οποία μεσολαβούν στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών κατά την εξαρτώμενη από την ουβικουιτίνη αποικοδόμησή τους και στην αναγνώριση των πρωτεϊνικών υποστρωμάτων από τις πρωτεϊνικές κινάσες. Η εξειδίκευση σύνδεσης των WW περιοχών δεν έχει ακόμη ξεκαθαριστεί. Ωστόσο έχει αναφερθεί ειδική σύνδεση σε αλληλουχίες πλούσιες σε προλίνη. Έχει βρεθεί ότι λειτουργούν ως τμήματα που συνδέονται σε φωσφοσερίνες ή φωσφοθρεονίνες. H WW περιοχή της μιτωτικής πεπτιδυλο-προπυλο cis trans ισομεράσης Pin1 συνδέεται στα φυσιολογικά της υποστρώματα κατά ένα, από φωσφορυλίωση εξαρτώμενο, τρόπο και είναι απαραίτητη ώστε η Pin1 να μπορέσει να πραγματοποιήσει την απαραίτητη λειτουργία της κατά τη διάρκεια της μίτωσης in vivo.

3. Μόρια – προσαρμογείς στην ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος

Η διαδικασία μεταγωγής σήματος, η οποία ξεκινάει από τους ενεργοποιημένους διαμεμβρανικούς υποδοχείς, έχει συχνά ως σκοπό να φέρει συγκεκριμένα πρωτεϊνικά συστατικά του σηματοδοτικού μονοπατιού κοντά σε καθορισμένες θέσεις του κυττάρου, πχ να φέρει ένα ένζυμο κοντά στο υπόστρωμά του. Το κύτταρο χρησιμοποιεί τις επονομαζόμενες πρωτεΐνες-προσαρμογείς (adaptor proteins) για να φέρει κοντά σηματοδοτικά μόρια. Αυτά τα μόρια-προσαρμογείς βοηθούν να αποφασισθεί πού και πότε ένα ένζυμο, όπως μια πρωτεϊνική κινάση, θα ενεργοποιηθεί. Οι πρωτεΐνες προσαρμογείς δεν έχουν καμιά ενζυμική δράση οι ίδιες, αλλά λειτουργούν σαν συνδετικός κρίκος ανάμεσα σε διαφορετικές σηματοδοτικές πρωτεΐνες, μεσολαβώντας στην εξειδικευμένη χωρική γειτνίαση κατά τη μεταγωγή σήματος. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες-προσαρμογείς χρησιμεύουν στη στόχευση της υποκυτταρικής εντόπισης των σηματοδοτικών γεγονότων. Είναι ένα οργανωτικό στοιχείο στη διάδοση του μηνύματος, βοηθώντας στη δημιουργία πολυπρωτεϊνικών συμπλεγμάτων σε εξειδικευμένες υποκυτταρικές θέσεις. Η εξειδίκευση και η ρύθμιση της μεταφοράς του μηνύματος αυξάνεται, εφόσον μόνο ορισμένες σηματοδοτικές πρωτεΐνες μπορούν να συνδεθούν με την πρωτεΐνη-προσαρμογέα. Η ύπαρξη πολλών δομικών περιοχών, που επιτρέπουν την αλληλεπίδραση μεταξύ

πρωτεϊνών, είναι χαρακτηριστικό των πρωτεϊνών προσαρμογέων, επιτρέποντας το σχηματισμό πολυ-πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων.

c-Crk II

Grb2

IRS-1

Shc

Εικόνα 9.27 Δομικές περιοχές των πρωτεϊνών-προσαρμογέων. Οι πρωτεΐνες προσαρμογείς δεν

εμφανίζουν καμιά ενζυμική δραστηριότητα, ενώ περιέχουν δομικές περιοχές που τις βοηθούν να συνδέονται σε σηματοδοτικές πρωτεΐνες. IRS-1: υπόστρωμα του υποδοχέα της ινσουλίνης, ΡΤΒ: περιοχή δέσμευσης φωσφοτυροσίνης, ΡΗ: περιοχή ομόλογη της πλεξτρίνης, Ρ: θέση δέσμευσης SH2 και ΡΤΒ, που περιέχει φωσφοτυροσίνες.

Η λειτουργία πολλών πρωτεϊνών προσαρμογέων είναι στενά συνδεδεμένη με την κυτταρική

μεμβράνη ή με τον κυτταροσκελετό. Η ύπαρξη περιοχών ΡΗ και μυριστοϋλικών

288

τροποποιήσεων προτείνει ότι οι πρωτεΐνες αυτές εμπλέκονται στο συντονισμό και την ομαδοποίηση σηματοδοτικών συμπλεγμάτων στην εσωτερική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης. Οι πρωτεΐνες προσαρμογείς είναι, πάνω από όλα, σημαντικά στοιχεία για τον έλεγχο της

υποκυτταρικής οργάνωσης γεγονότων φωσφορυλίωσης σε Ser και Tyr. Γι’αυτό, πολλές πρωτεΐνες προσαρμογείς περιέχουν περιοχές ΡΤΒ ή SH2 που κατευθύνουν εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις με θέσεις αυτο-φωσφορυλίωσης ενός ενεργοποιημένου υποδοχέα.

Η πρωτεΐνη Grb2 (growth factor receptor binding protein) αναγνωρίστηκε ως ένα συστατικό της μεταγωγής σήματος των αυξητικών παραγόντων και του σηματοδοτικού μονοπατιού των Ras. Η πρωτεΐνη προσαρμογέας Shc, ο υποδοχέας EGF, ο υποδοχέας PDGF και η φωσφατάση Syp, περιγράφηκαν ως μόρια που συνδέονται στην SH2 περιοχή της πρωτεΐνης Grb2. Η πρωτεΐνη Grb2 είναι ισχυρά συνδεδεμένη, μέσω της SH3 περιοχής της, σε μια πλούσια σε προλίνη περιοχή του παράγοντα ενεργοποίησης GΤΡασών, Sos, ο οποίος μπορεί να περάσει το μήνυμα στην πρωτεΐνη Ras. Με τη μορφή του συμπλόκου Grb2-Sos, η πρωτεΐνη Grb2 δρα για να δημιουργήσει ένα δεσμό ανάμεσα στον ενεργοποιημένο υποδοχέα κινάση τυροσίνης και την πρωτεΐνη Ras. Η σύνδεση στη μεμβράνη της πρωτεΐνης Sos είναι απαραίτητη για να δράσει ως ενεργοποιητής στο σηματοδοτικό μονοπάτι των Ras.

Η πρωτεΐνη Crk πρωτο-ανακαλύφθηκε ως το μετασχηματίζων στοιχείο των ρετρο-ιών CT10 και ASV-1. Στην περιοχή SH3 της Crk συνδέεται η κινάση Alb, αλλά ο φυσιολογικός ρόλος της Crk παραμένει άγνωστος.

Το υπόστρωμα του υποδοχέα της ινσουλίνης, IRS (insulin receptor substrate) συνδέει τον υποδοχέα της ινσουλίνης με τις πρωτεΐνες-τελεστές της. Με τη σύνδεση της ινσουλίνης στον υποδοχέα της, ενεργοποιείται η δραστηριότητα κινάσης του υποδοχέα. Η πρωτεΐνη IRS φωσφορυλιώνεται σε πολλά κατάλοιπα τυροσίνης, τα οποία στη συνέχεια χρησιμεύουν ως θέσεις πρόσδεσης διαφόρων πρωτεϊνών τελεστών, πχ το σύμπλοκο Grb2-mSos, η ΡΙ3-κινάση, η πρωτεϊνική φωσφατάση τυροσίνης SHP-2. Η πρωτεΐνη IRS περιέχει επίσης μια περιοχή σύνδεσης φωσφοτυροσίνης ΡΤΒ, η οποία συνδέεται στις θέσεις αυτό-φωσφορυλίωσης του υποδοχέα της ινσουλίνης, και μια περιοχή ΡΗ, η οποία μεσολαβεί για τη σύνδεση της πρωτεΐνης στη μεμβράνη.

4. Μεταγωγή σήματος μέσω του υποδοχέα της ινσουλίνης

Παρά την πρόοδο στην έρευνα των σηματοδοτικών μονοπατιών που καθορίζουν τα μεταβολικά αποτελέσματα της ινσουλίνης, η μοριακή βάση που διακρίνει την ενδοκυτταρική δράση της ινσουλίνης από αυτή άλλων ορμονών δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή. Για να γίνει η διάκριση αυτή εξετάστηκε η σηματοδότηση της ινσουλίνης στο χώρο (τα σηματοδοτικά μόρια και μονοπάτια εντοπίζονται σε ειδικά διαμερίσματα μέσα στα κύτταρα, microdomains, με τη βοήθεια συγκεκριμένων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων) και στο χρόνο (η ισχύς των σηματοδοτικών μονοπατιών έχει μια συγκεκριμένη χρονική διάρκεια, πχ. επηρεάζεται από τη φωσφορυλίωση και την αποφωσφορυλίωση του υποδοχέα από κινάσες σερίνης ή φωσφατάσες αντίστοιχα).

Ρόλος της ινσουλίνης στο κύτταρο

Η ινσουλίνη είναι ο σημαντικότερος ρυθμιστής του μεταβολισμού οργανικών ενώσεων. Όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης στο αίμα είναι αυξημένη, η ινσουλίνη εκκρίνεται από τα β-κύτταρα του παγκρέατος και απελευθερώνεται στο πλάσμα του αίματος. Οι κύριες λειτουργίες της είναι: α) προωθεί την πρόσληψη γλυκόζης από τα κύτταρα και β) την αποθήκευσή της, από τους μυς και το συκώτι, ως γλυκογόνο καθώς και την αποθήκευση

289

αμινοξέων και λιπαρών οξέων. Μειωμένη έκκριση ινσουλίνης έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση διαβήτη (ασθένεια όπου ο πάσχων έχει μεγαλύτερη ποσότητα σακχάρου στο αίμα και τα ούρα από το φυσιολογικό λόγω ανεπάρκειας σε ινσουλίνη) ενώ συνδέεται και με την παχυσαρκία, την υπέρταση και την αρτηριοσκλήρωση.

Σε κυτταρικό επίπεδο, η δράση της ινσουλίνης χαρακτηρίζεται από διάφορα αποτελέσματα, όπως επαγωγή μεταφοράς κυστιδίων, ενεργοποίηση πρωτεϊνικών κινασών και φωσφατασών, ενεργοποίηση ή καταστολή μεταγραφής και επαγωγή κυτταρικής αύξησης και διαφοροποίησης. Αυτή η πολυπλοκότητα υποδηλώνει ότι η δράση της ινσουλίνης μπορεί να περιλαμβάνει πολλά μεταβολικά μονοπάτια που η λειτουργία τους εξαρτάται λίγο ή πολύ από την ενεργοποίηση υποδοχέων κινασών τυροσίνης.

Στοιχεία υποδεικνύουν ότι ο συντονισμός αυτών των μονοπατιών ελέγχεται από την υποκυτταρική διαμερισματοποίηση τους ή τη διάρκεια μεταφοράς του σήματος μέσω αυτών. Θα επικεντρωθούμε στο ότι το εναρκτήριο σήμα ξεκινά από τον υποδοχέα, ο οποίος βρίσκεται σε συγκεκριμένες περιοχές στην πλασματική μεμβράνη καθώς και στους μηχανισμούς που καθορίζουν τη διάρκεια των σηματοδοτικών μονοπατιών. Οι δύο αυτοί παράγοντες μαζί βοηθούν στο να γίνει διάκριση της ινσουλίνης από άλλες ορμόνες με τις οποίες μοιράζεται κοινές σηματοδοτικές ιδιότητες.

Εικόνα 9.28 Αυξημένη συγκέντρωση γλυκόζης στο αίμα προκαλεί την έκκριση ινσουλίνης από τα β-παγκρεατικά κύτταρα με αποτέλεσμα την αύξηση της πρόσληψης γλυκόζης από το κύτταρο και αποθήκευση της ως γλυκογόνο καθώς και την αποθήκευση αμινοξέων και λιπαρών οξέων. Σε περίοδο νηστείας (έλλειψη γλυκόζης) εκκρίνεται γλυκαγόνη με αποτέλεσμα την αύξηση αποικοδόμησης αμινοξέων και λιπαρών οξέων, γλυκονεογένεσης και γλυκογονόλυσης. Από Molecular Cell Biology, Lodish et al, 2000.

Πορεία της σηματοδότησης

Η σηματοδότηση ξεκινά με την πρόσδεση της ινσουλίνης στην εξωκυτταρική, πλούσια σε κατάλοιπα κυστεΐνης, περιοχή του υποδοχέα. Ο υποδοχέας της ινσουλίνης έχει ενσωματωμένη στο ενδοκυτταρικό του τμήμα μια κινάση τυροσίνης. Η ινσουλίνη προκαλεί την αυτοφωσφορυλίωση του υποδοχέα, ο οποίος με τη σειρά του καταλύει τη φωσφορυλίωση

290

διάφορων ενδοκυτταρικών πρωτεϊνικών υποστρωμάτων (IRS, APS, c-Cbl , Gab-1, Shc). Σε κάθε ένα από αυτά τα υποστρώματα συνδέεται ένα σύνολο σηματοδοτικών πρωτεϊνών που περιέχουν την αλληλουχία SH2, η οποία αναγνωρίζει περιοχές που περιβάλουν τα φωσφορυλιωμένα κατάλοιπα τυροσίνης.

Εικόνα 9.29 Σηματοδοτικά μονοπάτια και πρωτεϊνικά υποστρώματα του υποδοχέα της ινσουλίνης (IRS1-4, APS, Shc, Gab-1)

Από Trends in Cell Biology 2002, 12, 65-71.

Οι περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στο μονοπάτι της πρωτεΐνης IRS, το οποίο, αν και δεν ενεργοποιείται μόνο από την ινσουλίνη, μόνο η ινσουλίνη μπορεί να προκαλέσει μέσω αυτού τη μετακίνηση κυστιδίων υπεύθυνων για τη μεταφορά γλυκόζης. Μετά τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών IRS προσδένεται σε αυτές, μέσω της ΡΤΒ περιοχής της, και ενεργοποιείται η PI3-K (κινάση της 3΄φωσφατιδυλο-ινοσιτόλης). Η ΡΙ3-Κ αποτελείται από δύο κύριες υπομονάδες, τη ρυθμιστική υπομονάδα (p85) και την καταλυτική υπομονάδα (p110). Η p110 καταλύει τη φωσφορυλίωση της PIP2 (4,5 διφωσφορική φωσφατιδυλο-ινοσιτόλη) σε PIP3 (3,4,5 τριφωσφορική φωσφατ/τόλη). Η PIP3 δρα ως αλλοστερικός ρυθμιστής της φωσφοϊνοσίτιδιο-εξαρτώμενης κινάσης (PDK1), η οποία φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση Β (Akt) και την πρωτεϊνική κινάση C (PKC) προκαλώντας τη μετακίνηση τους στην πλασματική μεμβράνη, όπου προκαλούν με κάποιο μηχανισμό, ο οποίος παραμένει άγνωστος, τη μετακίνηση κυστιδίων υπεύθυνων για τη μεταφορά γλυκόζης. φιλοτιλίνη Εικόνα 9.30 Αριστερά το μοναδικό για την ινσουλίνη μεταβολικό μονοπάτι, το οποίο βρίσκεται μέσα σε μια μικροπεριοχή του κυττάρου. Δεξιά το μονοπάτι των IRS πρωτεϊνών.

291

Μεταφορέας Glut4

Στην ινσουλινο-υποκινούμενη πρόσληψη της γλυκόζης από τα κύτταρα μεσολαβεί ο μεταφορέας Glut4. Σε κανονικές συνθήκες, ο Glut4 ανακυκλώνεται αργά μεταξύ της πλασματικής μεμβράνης, του trans-Golgi και των ενδοσωματίων. Η ινσουλίνη επιταχύνει τη μεταφορά του Glut4 στην πλασματική μεμβράνη. Την ίδια στιγμή ο ρυθμός ενδοκύττωσης του Glut4 μειώνεται. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη δραματική συσσώρευση Glut4 στην πλασματική μεμβράνη (Εικόνα 9.30). Η μετακίνηση του Glut4 είναι υποχρεωτικό βήμα στην ινσουλινο-υποκινούμενη μεταφορά γλυκόζης. Ο ακριβής μηχανισμός ενεργοποίησης και δράσης του Glut4 δεν είναι ακόμα γνωστός. α. κύτταρο σε ηρεμία γλυκόζη

ινσουλίνη μεταφορέας Glut1

υποδοχέας ινσουλίνης

μεταφορέας

Glut4 ενδοκυτταρικά κυστίδια

β. κύτταρο ενεργοποιημένο από την ινσουλίνη σύνδεση ινσουλίνης

εξωκύττωση

εξωκύττωση των κυστιδίων που περιέχουν μεταφορείς γλυκόζης

γ. απομάκρυνση της ινσουλίνης

ενδοκύττωση με την απομάκρυνση της ινσουλίνης,

μέσω ενδοκύττωσης απομακρύνονται τα κυστίδια που περιέχουν μεταφορείς γλυκόζης, και απενεργοποιούνται οι εναπομείναντες μεταφορείς

Εικόνα 9.31 Η πορεία του μεταφορέα της γλυκόζης Glut4. (α) Απουσία γλυκόζης τα κυστίδια του Glut4 ανακυκλώνονται αργά από την ινσουλίνο-εξαρτώμενη μεταφορά γλυκόζης. (β) Παρουσία ινσουλίνης η συγκέντρωση των κυστιδίων στη μεμβράνη αυξάνεται και αρχίζει η πρόσληψη γλυκόζης. (γ) Η αποσύνδεση της ινσουλίνης από τον υποδοχέα τερματίζει την πρόσληψη γλυκόζης. Από Molecular Cell Biology, Lodish et al, 2000.

Το σηματοδοτικό μονοπάτι της ινσουλίνης που βρίσκεται στη μικροπεριοχή

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η άσκηση, η υποξία και παράγοντες που ενεργοποιούν GTP-δεσμευτικές πρωτεΐνες προκαλούν τη μετακίνηση του Glut4 προς τη μεμβράνη και την πρόσληψη γλυκόζης από σκελετικούς μυς ανεξαρτήτως της παρουσίας ή

292

όχι ενεργής PI3-κινάσης. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι εκτός από το μονοπάτι PI3K→ φωσφορυλίωση των PIP2 σε ΡΙΡ3 → ενεργοποίηση της PDK1→ ενεργοποίηση της PKC και της Akt → μετακίνηση των μεταφορέων Glut4 προς την πλασματική μεμβράνη, υπάρχει και ένα άλλο μονοπάτι, ανεξάρτητο από την PI3-κινάση. Στο μονοπάτι αυτό, ο υποδοχέας της ινσουλίνης βρίσκεται σε μια ειδική μικροπεριοχή της μεμβράνης (caveole), που αποτελείται από λιποπρωτεΐνες, χοληστερόλη και σφιγγολιπίδια. Όταν ο υποδοχέας ενεργοποιείται, φωσφορυλιώνει το πρωτεϊνικό υπόστρωμα APS (adaptor protein substrate) που μέσω των SH2 αλληλουχιών του αλληλεπιδρά με τη φωσφοπρωτεΐνη Cbl ενεργοποιώντας την. Ακολούθως η Cbl αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη CAP (Cbl associated protein), η οποία είναι συνδεδεμένη με την πρωτεΐνη φιλοτιλίνη, η οποία βρίσκεται στο εσωτερικό της μικροπεριοχής των λιπιδίων. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την είσοδο της Cbl στην περιοχή των λιπιδίων, γεγονός που προκαλεί την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης CrkII. Η CrkII ενεργοποιεί τον παράγοντα GEF C3G, ο οποίος ενεργοποιεί την μικρή GTPάση TC10, η οποία μέσω μηχανισμού που παραμένει άγνωστος προκαλεί τη μετακίνηση κυστιδίων υπεύθυνα για τη μεταφορά γλυκόζης (βλέπε το αριστερό τμήμα της Εικόνας 9.29).

Σηματοδότηση της ινσουλίνης στο χρόνο

Πέρα από τις χωρικές πτυχές της σηματοδότησης, τις οποίες προαναφέραμε, για να εξηγήσουμε τη διαφοροποίηση της ινσουλίνης από τις άλλες ορμόνες, εξετάζουμε και τις χρονικές πτυχές οι οποίες σχετίζονται κυρίως με τον τερματισμό της δράσης της ινσουλίνης. Ο τερματισμός αυτός λαμβάνει χώρα με διάφορους μηχανισμούς όπως η αποφωσφορυλίωση του υποδοχέα και των υποστρωμάτων από πρωτεϊνικές φωσφατάσες τυροσίνης, με κυριότερη την κυτταροπλασματική ΡΤΡ1Β καθώς και η φωσφορυλίωση του υποδοχέα από κινάσες σερίνης/θρεονίνης με κυριότερη την GSK3. Πέρα από τους μηχανισμούς τερματισμού δράσης της ινσουλίνης που έχουν να κάνουν με τον υποδοχέα, υπάρχουν και άλλοι που σχετίζονται με την PIP3 (3,4,5 τριφωσφορική φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη), οι οποίοι είτε μειώνουν τη συγκέντρωσή της εμποδίζοντας την ενεργοποίηση του Glut4 είτε την αποφωσφορυλιώνουν μπλοκάροντας την δράση της ινσουλίνης.

Βιβλιογραφία

Alberts A., D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter: Essential Cell Biology, 1998, 549-550

Berg JM., Tymoczko JL., Stryer L, Βιοχημεία (Kεφάλαιο 15), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2004

Fantl W.J., Johnson D.E., Williams L.T., Signalling by receptors tyrosine kinases, Annu. Rev. Biochem., 1993, 62, 453-481

Hubbard SR., Wei L., Ellis L., Hendrickson WA., Crustal structure of the tyrosine kinase domain of the human insulin receptor, Nature, 1994, 372, 746-754

Hubbard SR and Hill JH., Protein tyrosine kinase structure and function, Annu. Rev. Biochem., 2000, 69, 373-398

Saltiel Alan R. and Jeffrey E. Pessin: Insulin signaling pathways in time and space, Trends in Cell Biology, 2002, 12, 65-71

Krawss Gerhard, Biochemistry of Signal Transduction and Regulation, Wiley Eds Ullrich A. and Schlessinger J., Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity,

Cell, 1990, 61, 203-212