A AÇÃO DOS ADITIVOS NA MINIMIZAÇÃO DA ATIVIDADE … · O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a eficácia de cinco aditivos frente a culturas de bactérias patogênicas

CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES

CURSO DE QUÍMICA INDUSTRIAL

A AÇÃO DOS ADITIVOS NA MINIMIZAÇÃO DA ATIVIDADE

PATOGÊNICA DE MICRO-ORGANISMOS

Luise Huebner

Lajeado, dezembro de 2011

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Luise Huebner

A AÇÃO DOS ADITIVOS NA MINIMIZAÇÃO DA ATIVIDADE

PATOGÊNICA DE MICRO-ORGANISMOS

Monografia apresentada na disciplina de

Trabalho de Conclusão de Curso do

Curso de Química Industrial, do Centro

Universitário Univates, como parte da

exigência para a obtenção do título de

Bacharel em Química Industrial.

Orientadora: Prof ª. Msc. Rosângela Uhrig

Salvatori

Lajeado, dezembro de 2011

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3 RESUMO

Com o aumento no consumo de produtos cárneos e com a utilização excessiva de antimicrobianos, estudos e ensaios constantes foram transformados em rotina nos laboratórios de todo Mundo para averiguar as possibilidades de uso de diferentes aditivos, com o objetivo de diminuir o consumo constante e indiscriminado dos antimicrobianos. Neste contexto, a presente monografia de aspecto quantitativo avaliou as concentrações inibitórias mínimas (MICs) de cinco diferentes aditivos (amoxicilina, colistina, enrofloxacina, acidificante e Citrex) frente a duas cepas patógenas (Salmonella enteritidis ATCC 13076 e Listéria monocytogenes ATCC 7644), salientando aspectos em relação à resistência bacteriana e qualidade alimentar, sendo esta contemplada pela grande preocupação de resíduos contidos no animal. Cada bactéria foi exposta a nove diferentes concentrações de cada aditivo, onde a partir de uma concentração indicada, aumentou-se e diminuiu-se quatro vezes esta mesma concentração. Ensaios microbiológicos foram realizados onde averiguou-se que os antibióticos de modo geral foram eficientes frente as bactérias patógenas em questão. O aditivo Citrex também demonstrou grande efetividade sobre estas bactérias. Porém, a Salmonella e Listeria não foram inibidas pelo acidificante utilizado. Concluiu-se com o presente estudo que, apesar dos antimicrobianos ainda demonstrarem eficiência no combate às bactérias patógenas, resistências bacterianas já são observadas. Por este motivo, inovações em relação a aditivos estão cada vez mais presentes no cotidiano, contribuindo para maiores índices de qualidade de vida tanto dos animais quanto dos seres humanos. Palavras-chave: Aditivos. Antimicrobianos. Cepas patógenas. Produto de qualidade.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Concentrações utilizadas de amoxicilina no método de macrodiluição..... 24

Figura 2 - Concentrações utilizadas de colistina no método de macrodiluição ......... 25

Figura 3 - Concentrações utilizadas de enrofloxacina no método de macrodiluição . 25

Figura 4 - Concentrações utilizadas de acidificante no método de macrodiluição .... 25

Figura 5 - Concentrações utilizadas de Citrex (Listeria) no método de macrodiluição

.................................................................................................................................. 25

Figura 6 - Concentrações utilizadas de Citrex (Salmonella) no método de

macrodiluição ............................................................................................................ 26

Figura 7 - Diluição das bactérias imersas em salina ................................................. 28

Figura 8 - Diluição dos aditivos ................................................................................. 29

Figura 9 - Transferência de bactéria para tubo de ensaio ......................................... 30

Figura 10 - Incubação dos tubos de ensaio .............................................................. 31

Figura 11 - MIC do acidificante frente a Salmonella .................................................. 39

Figura 12 - MIC da colistina frente a Salmonella ....................................................... 40

Figura 13 - MIC Citrex frente a Salmonella ............................................................... 40

Figura 14 - MIC enrofloxacina frente a Listeria.......................................................... 41

Figura 15 - MIC acidificante frente a Listeria ............................................................. 41

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LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Concentrações preparadas para método de macrodiluição .................... 29

Gráfico 2- Dose recomendada X MIC ....................................................................... 31

Gráfico 3 - Dose recomendada X MIC ...................................................................... 34



Gráfico 6 - Concentração dos aditivos utilizados na técnica de macrodiluição ......... 42

Gráfico 7 - Resistência bacteriana em porcentagem ................................................. 43

Gráfico 8 - Resistência bacteriana X aditivo .............................................................. 44

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Princípio ativo e dose recomendada de cada aditivo .............................. 24

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 08

2 REFERENCIAL TEÓRICO ............................. ........................................................ 11

2.1 Bactérias patógenas ............................................................................................ 11

2.1.1 Listeria .............................................................................................................. 12

2.1.2 Salmonella ........................................................................................................ 13

2.2 Aditivos ................................................................................................................ 15

2.2.1 Antibióticos ....................................................................................................... 15

2.2.1.1 Amoxicilina .................................................................................................... 16

2.2.1.2 Colistina ......................................................................................................... 17

2.2.1.3 Enrofloxacina ................................................................................................. 17

2.2.2 Acidificante ....................................................................................................... 18

2.2.3 Ultrabiótico ....................................................................................................... 20

2.3 Concentração Inibitória Mínima (MIC) ................................................................. 21

3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................. ........................................................ 22

3.1 Preparação dos caldos ........................................................................................ 22

3.1.1 Caldo BHI ......................................................................................................... 22

3.1.2 Solução salina .................................................................................................. 22

3.1.3 Caldo Mueller Hinton ........................................................................................ 23

3.2 Cultivo / reativação das bactérias (overnight) ...................................................... 23

3.3 Diluição das bactérias ......................................................................................... 23

3.4 Preparação dos aditivos ...................................................................................... 24

3.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) ..................................... 26

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................... ................................................... 28

5 CONCLUSÃO ....................................... ................................................................. 45

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 46

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1 INTRODUÇÃO

Nos tempos atuais, a demanda no consumo de produtos alimentícios teve um

aumento significativo, sendo que na categoria de cárneos houve grande salto nas

vendas.

O alto índice de stress que é ocasionado no animal durante sua estada em

fazendas ou pequenas propriedades, devido a vários fatores como aglomeração,

ventilação ineficiente, mudança da ração, clima variável, manejo desumano, entre

outros, faz com que a microflora patógena existente no trato gastrointestinal

prevaleça, e assim, ocorra um declínio tanto no desempenho do animal quanto na

saúde do mesmo.

Segundo Grau apud Silva (1995) a área externa e interna da parte comestível

da carne são propicias a contaminação de bactérias, sendo que a primeira esta

coberta por pêlos, penas, pele ou lã e a segunda pertence ao trato gastrointestinal.

Alimentos ingeridos, apresentando contaminação por bactérias patógenas,

representam grande perigo à saúde pública. Entre elas, segundo Nottingham apud

Silva, Soares e Costa (2001), as que em maior prevalência provocam toxinfecções

alimentares são a Listeria monocytogenes e a Salmonella spp.

Segundo Lírio et al. (1998), dos mais de 2.000 sorotipos de Salmonella já

conhecidos, a incidência de salmonelose humana, principalmente por Salmonella

enteritidis têm aumentado consideravelmente.

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Conforme estatística de 2009, publicada pelo FDA (Food and Drug

Administration-EUA), foram relatados aproximadamente 82 milhões de casos de

intoxicação alimentar, acarretando em torno de 350 mil internações hospitalares e 8

mil mortes, provenientes de 800 tipos variados de produtos alimentares, sendo os

produtos cárneos derivados de frango apontados como predominantes (EUROPEAN

FOOD SAFETY AUTHORITY apud LONGO; SILVA; LANZARIN, 2010).

A demanda pelo consumo de produtos cárneos com plena qualidade e

segurança, tem aumentado nos últimos anos. A carne suína, de aves, entre outras,

deve ser ofertada a população com total segurança e qualidade.

Assim, produtores de animais vêem-se obrigados a utilizar meios químicos

para que não ocorra baixa na produção, prevalecendo no animal, uma microbiota

normal, livre de agentes maléficos, causadores de doenças.

Um dos aditivos utilizados há muitos anos e conhecido por todos é o

antibiótico. Contudo, com seu uso demasiado, o que prevalece é a resistência das

bactérias patógenas, causando danos à saúde do ser humano e outros animais.

A preocupação, no que diz respeito à ingestão de alimentos contaminados

com micro-organismos resistentes aos antibióticos, provoca provavelmente ao

homem, uma colonização da mucosa intestinal por esses patógenos, o que tem

levado a estudos químicos, farmacológicos e humanos para diminuir este agravante.

Devido a grande preocupação dos consumidores frente ao consumo de

alimentos mais saudáveis, livres de resíduos antimicrobianos, procurando uma maior

qualidade e segurança naquilo que consomem, novos aditivos estão sendo

pesquisados e ganhando o mercado, com o intuito de substituir o tão utilizado

antibiótico.

Entre os novos aditivos estão o acidificante e o ultrabiótico Citrex, sendo que

estes vêm conquistando cada vez mais o espaço entre produtores e consumidores,

como aditivos alternativos.

Para determinar a quantidade necessária de aditivo utilizado na inibição de

micro-organismos, o método de macrodiluição é indicado, obtendo-se a

Concentração Inibitória Mínima (MIC) necessária.

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O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a eficácia de cinco

aditivos frente a culturas de bactérias patogênicas em estudo, através de

experimentos e pesquisas, alternativas viáveis para um controle efetivo de bactérias

patógenas, sem provocar danos à população, visando o consumo de alimentos

seguros.

Com essa finalidade foram propostos os seguintes objetivos específicos:

• Realizar culturas das bactérias Salmonella e Listeria;

• Testar a eficiência de inibição dos aditivos ultrabiótico Citrex,

acidificante e os antibióticos amoxicilina, colistina e enrofloxacina, em concentração

conhecida, quando colocados em contato com semeadura de bactérias patógenas;

• Observar o comportamento das culturas frente aos aditivos;

• Verificar qual bactéria apresenta maior resistência aos aditivos

testados;

• Verificar o aditivo que inibe com maior eficácia as bactérias

patogênicas;

• Aprimorar os conhecimentos sobre os micro-organismos, a

microbiologia e suas diversas aplicações.

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2 REFERENCIAL TEÓRICO

2.1 Bactérias patógenas

As bactérias são unicelulares (constituídos por uma única célula), sendo

também procariontes devido ao seu material genético não se encontrar envolvido

“por uma membrana nuclear especial” (TORTORA; FUNKE; CASE, 2008, p. 2).

As bactérias gram-positivas são envolvidas por uma parede celular de

camada densa, sendo esta formada por peptidoglicanos. Já as bactérias gram-

negativas possuem camada dupla, sendo que a interna é formada por uma fina

camada de peptidoglicanos, e a externa é composta por carboidratos, proteínas e

fosfolipídios (SOUZA, 2010).

Peptidoglicanos são polímeros complexos, variando suas características de

acordo com a bactéria (AMATO NETO; LOPES; BALDY, 2000).

Booth apud Rodriguez-Palenzuela (2000) relatam que as bactérias possuem

autonomia em se proliferarem, pois estas têm um ótimo pH (meio extracelular),

sendo que o pH intracelular deve estar próximo da neutralidade, (MADIGAN et al.

apud RODRIGUEZ-PALENZUELA, 2000) constatando-se que a grande maioria dos

micro-organismos não conseguem se proliferar em pH abaixo de 5.

Micro-organismos patógenos (menos do que 1% dos micróbios) são

causadores de doenças (BLACK; TOROS, 2002), invadindo o corpo e se

colonizando neste, formando assim, uma infecção. A doença é resultante da

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infecção, demonstrando alterações no corpo do hospedeiro e prejudicando a

realização das funções vitais do organismo. É fundamental que haja um equilíbrio

entre os micróbios patogênicos e a microbiota normal para que uma doença não

seja desencadeada (TORTORA; FUNKE; CASE, 2008).

Para que haja patogenicidade (doença), é fundamental que o organismo

ingresse no hospedeiro, em seu interior se prolifere, tendo cuidado para não ser

atacado por nenhuma ameaça proveniente das defesas do organismo invadido

(BLACK; TOROS, 2002).

Os animais contêm no seu trato intestinal um grande número de micro-

organismos (PELCZAR JUNIOR; CHAN; KRIEG, 1997a), predominando as bactérias

anaeróbias estritas, anaeróbias estritas esporuladas e também facultativas (PORTO,

2006), porém ressalta-se que as infecções dos parasitas nos animais são

responsáveis por causarem enfraquecimento e morte nos mesmos, tornando assim,

difícil a criação dessa fonte alimentar (BLACK; TOROS, 2002), pois as bactérias

patógenas são extremamente indesejáveis e bastante difíceis de serem impedidas

(PORTO, 2006).

2.1.1 Listeria

A Listeria é uma bactéria patógena anaeróbia facultativa, bastonetes gram-

positivos, não é esporogênica e se prolifera numa temperatura excelente entre 30-37

°C. Essa bactéria patógena se encontra em sua maior ia nas fezes de aves,

mamíferos, entre outros (RYSER; DONNELLY apud SILVA et al., 2010), sendo que o

gênero Listeria monocytogenes provoca sérios riscos a saúde tanto dos animais

quanto dos seres humanos (ANTUNES et al. apud SANTOS; GIL-TURNES, 2005).

A Listeria consegue sobreviver em pH abaixo de 5,0 (ICMSF apud PORTO,

2006).

Em produtos como patês de carne, encontra-se contagem de Listeria

monocytogenes acima de 106/g (HARRIGAN apud MANTILLA et al., 2007).

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No estudo realizado por Antunes et al. apud Santos; Gil-Turnes, (2005) foi

detectado a bactéria patogênica Listeria em 100% das amostras de carcaças de

frango localizadas em um mercado de Portugal, sendo que 41% era do gênero

Listeria monocytogenes.

Apesar da grande diminuição na ocorrência de listeria no tempo decorrido de

1996 a 2004, ressalta-se a importância no continuo controle para evitar-se a

listeriose, doença esta proveniente da alimentação. O enfoque está direcionado para

a diminuição desta bactéria nos alimentos e inclusive nos animais, impedindo assim,

uma contaminação desnecessária nos produtos (CDC, 2004).

2.1.2 Salmonella

A Salmonella sp se prolifera com mais eficácia em pH próximo ao neutro no

intestino delgado (BRITO, 2010), sendo que sua perfeita temperatura de

multiplicação se encontra entre 35 e 43 °C e pH ent re 7,0 e 7,5 (ICMSF apud SILVA

et al., 2010), podendo este ser ampliado de 3,8 a 9,0, tendo-se os ácidos orgânicos

como alternativa para inibir a proliferação deste tipo de bactéria (QUARTENEY-

PAPAFIO et al. apud PORTO, 2006).

São bastonetes gram-negativos, anaeróbicos facultativos (TORTORA;

FUNKE; CASE, 2008), não esporulados (PORTO, 2006).

Dependendo do tipo de ácido e temperatura, a salmonela consegue

sobreviver por algum período nestas condições. A temperatura de refrigeração é a

favor do seu crescimento (CURTIS, 2007).

A Salmonella é conceituada por ser bastante resistente, dificultando a sua

eliminação, porém se este feito for alcançado, isto pode acarretar de maneira

positiva na eliminação de muitas outras bactérias assim classificadas

(SHIMOKOMAKI et al., 2006).

A Salmonella é encontrada em maior prevalência nas carnes suínas, bovinas,

entre outras (SHINOHARA et al., 2008), denominando-se de infecção zoonótica,

podendo ser transmitida dos animais aos seres humanos (CURTIS, 2007).

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Nos casos de incidência de salmonelose humana, em 10 de 12 variados

alimentos contaminados houve prevalência de Salmonella enteritidis, em estudo

realizado no período de janeiro de 1992 a dezembro de 1996, em São Paulo (LÍRIO

et al., 1998).

Segundo Nadvorny, Figueiredo e Schmidt (2004) no estado do Rio Grande do

Sul, em 2000, 74% dos 99 aparecimentos repentinos ocorridos por infecções foram

causados por Salmonella sp.

Produtos de origem animal (suína) têm aumentado a incidência de

contaminação por salmonela (FEDORKA-CRAY apud CASTAGNA, 2004), mas

ressalta-se que esta bactéria infecciona os animais de sangue quente,

principalmente aves domésticas e bovinos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2008),

sendo que 99% representa a salmonelose humana (SILVA et al., 2010), sendo esta

uma grandes vilãs das atividades avícolas (MARTINS, 2011).

Segundo Gutierrez-Cogco et al. (2000) a Salmonella enteritidis é a segunda

sorotipagem com maior incidência encontrada em humanos em pesquisa realizada

no México de 1972 a 1999.

O uso excessivo de antibióticos em alimentos comumente consumidos pelos

humanos, como carne de gado, aves e peixes, torna cada vez mais difícil o

tratamento dos seres humanos e até mesmo dos animais, pela grande resistência

das bactérias aos antibióticos utilizados (VELGE; CLOECKAERT; BARROW, 2005),

constatando-se que há ocorrência de resistência advinda de cepas de salmonela a

certos tipos de antibióticos (VÁZQUEZ; GONZÁLEZ; MURADO apud JATOBA,

2008).

Em estudo realizado na Coréia com frangos e ovos para determinar a

presença de Salmonella spp., constatou-se que todas as salmonelas isoladas em

questão, representaram 25,9% de frango cru e foram resistentes a alguns

antibióticos como a penicilina e vancomicina, sendo que a Salmonella enteritidis foi

resistente a 12 tipos de antimicrobianos (CHANG, 2000).

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2.2 Aditivos

Segundo a Instrução Normativa nº 13, de 30 de novembro de 2004 (BRASIL,

2004) aditivo é:

Substância, micro-organismo ou produto formulado, adicionado intencionalmente aos produtos, que não é utilizada normalmente como ingrediente, tenha ou não valor nutritivo e que melhore as características dos produtos destinados à alimentação animal ou dos produtos animais, melhore o desempenho dos animais sadios e atenda às necessidades nutricionais ou tenha efeito anticoccidiano.

2.2.1 Antibióticos

O nome antibiótico, do grego anti “contra” e bios “vida” é assim denominado

por ser qualquer composto químico, tendo a função de inibir ou eliminar o

crescimento de indivíduos infecciosos tanto em animais quanto em humanos. O

antibiótico pode ser constituído por uma substância derivada de um organismo vivo

(plantas, animais, fungos ou bactérias), sendo geralmente um micro-organismo que

têm a capacidade de destruir outros micro-organismos (CRUZ, 2004).

Quando um determinado antibiótico não mostra-se efetivo a uma determinada

bactéria, diz-se que esta é resistente ao determinado antibiótico (SANTANA, 2006).

Os organismos patógenos oportunistas podem ser da flora normal do

organismo, causando, porém, infecções por consequência do uso prolongado de

antibióticos (PELCZAR JUNIOR; CHAN; KRIEG, 1997b), sendo que Amato Neto,

Lopes e Baldy (2000) afirmam que as modificações na constituição da microbiota

intestinal e cepas de bactérias resistentes são advindas do longo uso deste tipo de

aditivo.

Fairbrother apud Pedroso et al (2005) salientam que esta utilização excessiva

de antimicrobianos refere-se ao controle ou até mesmo eliminação dos micro-

organismos que diminuem o desempenho do animal, sendo assim utilizados como

geradores de crescimento em suínos.

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Para diminuir o grande colapso na resistência de bactérias aos

antimicrobianos, a União Européia impediu a utilização destes, sendo seu uso

somente destinado a doenças específicas (SOUZA, 2010).

Segundo citado por Dias et al. (2010), a tendência da ingestão por alimentos

contaminados por bactérias, que apresentam resistência a uma grande gama de

antibióticos, e consequente amplitude de genes (COLLIGNON et al., 2005) torna-se

cada vez mais provável, sendo assim, é inevitável a colonização de bactérias

resistentes, se colonizando na mucosa intestinal dos humanos e dificultando o

tratamento de doenças, pela resistência já adquirida (DIAS et al., 2010).

O antibiótico pode ter efeito bactericida, quando destrói a bactéria e

bacteriostático, quando inibe a proliferação da mesma. Quando o antibiótico

denomina-se bactericida, ele é capaz de impedir a formação da parede celular da

bactéria e interferir na síntese de ácidos nucléicos, ocorrendo assim intervenção dos

antibióticos, na síntese do DNA e RNA. Na inibição da síntese protéica, as bactérias

que são resistentes ao determinado antibiótico, acabam por não se proliferar. Já os

antimicrobianos bacteriostáticos agem nas vias metabólicas da síntese protéica

(AMATO NETO; LOPES; BALDY, 2000).

Azevedo (2011) relata que a sanidade na avicultura pretende diminuir cada

vez mais o uso de antibióticos, conseguindo assim, acompanhar as novas

tendências do mercado.

Desde 1998 alguns aditivos alimentares para animais foram excluídos como

as sulfonamidas, tetraciclinas, nitrofurazona, entre outras. Porém antibióticos como o

sulfato de colistina, a flavomicina e a enramicina são comercializados livremente

(DELFINO, 2008).

2.2.1.1 Amoxicilina

A amoxicilina (triidrato de D-(-) 2 – amino p- hidroxibenzil penicilina), é uma

penicilina (aminopenicilina) semi-sintética, com boa capacidade de absorção, boa

inibição em relação as bactérias gram-positivas e gram-negativas, porém mostra-se

sensível as β-lactamases (AUTO; CONSTANT L.; CONSTANT C., 2008), sendo

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estas mais resistentes, mais vigorosas em suas aplicações (BARRETT T.; BARRETT

F., 2003).

As primeiras penicilinas eram inativadas por bactérias gram-negativas. A

amoxicilina é atacada por bactérias que são resistentes, sendo que as enzimas β-

lactamases, existentes neste tipo de micro-organismos, são capazes de clivar o anel

β-lactâmico, ressaltando-se que este deve estar intacto para a realização da

atividade antimicrobiana, ocorrendo como consequência, a inativação da amoxicilina

(LEVINSON, 2010).

Em estudo realizado na Nigéria de fevereiro a agosto de 2010, referente a

resistência aos antimicrobianos, foi comprovado que 80% das bactérias, entre elas a

Salmonella arizonae, envolvidas no experimento obtiveram resistência a amoxicilina

(ADELEKE; OMAFUVBE, 2011).

2.2.1.2 Colistina

A colistina é um antimicrobiano polipeptídico, indicado para inibir e combater

bactérias gram negativas como a Salmonella. É um antibiótico estável, atuando em

pH de 4 a 7. A colistina atua sobre a membrana da bactéria, onde um certo catiônico

peptídico, induz a ocorrência da permeabilidade da porção fosfolipídica e

peptídeoglicana, levando a morte da bactéria. Este contato na membrana celular

dificulta a aderência das bactérias nos ditos receptores da mucosa intestinal

(UNIQUÍMICA, 2011).

2.2.1.3 Enrofloxacina

As chamadas fluorquinolonas são utilizadas para uma variedade de

tratamentos infecciosos, sendo provindas da terceira geração das quinolonas,

(APPELBAUM; HUNTER, 2000).

O ataque deste tipo de antibiótico está relacionado com a inibição do DNA

girase (LEVINSON, 2010), enzima importante na replicação do DNA (SILVA, 2004),

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devido ao bloqueio da síntese do DNA bacteriano (LEVINSON, 2010), resultando

assim na morte da bactéria (SILVA, 2004).

2.2.2 Acidificante

Segundo a teoria de Lewis, ácido é qualquer substância que pode aceitar um

par de elétrons que não esteja compartilhado. Os ácidos têm poder contra as

bactérias por conseguir baixar o pH extracelular, e devido principalmente a forma do

ácido não dissociado. A força do ácido e sua concentração vão determinar qual será

o impacto na acidificação do meio, sendo que tanto os ácidos orgânicos como

inorgânicos terão o mesmo efeito (RODRIGUEZ-PALENZUELA, 2000).

O acidificante, formado por ácidos orgânicos, faz com que não ocorra a

proliferação das bactérias, aumentando assim, a possibilidade de melhorar o

desempenho dos animais, pois os micro-organismos patógenos vão ser eliminados,

sendo que estes não irão mais competir com a microflora normal pela aquisição de

nutrientes (RIBEIRO et al., 2009).

O ácido orgânico é composto por pelo menos um grupo carboxila (-COOH). A

quantidade dos ácidos orgânicos (fracos) será maior em comparação aos ácidos

inorgânicos (fortes) porém, o atingimento do abaixamento do pH será o mesmo.

Portanto, ocorre simultaneamente, o abaixamento do pH extracelular e intracelular.

Quando dissociam-se no interior da membrana interna da célula, os ácidos fracos

produzem íons H+, sendo estes responsáveis pela diminuição do pH encontrado na

célula (RODRIGUEZ-PALENZUELA, 2000).

Östling e Lindgren apud Rodriguez-Palenzuela (2000) comentam que a forma

não dissociada dos ácidos orgânicos consegue atravessar com grande facilidade a

membrana plasmática das bactérias, por ser um cátion e, estando inserido no

interior desta célula, consegue atacar, na forma dissociada, interferindo diretamente

no pH intracelular da bactéria em questão, e assim (BEARSON et al. apud

RODRIGUEZ-PALENZUELA, 2000) ocorre dificuldade no transporte de alimentos

que são fundamentais para o metabolismo da bactéria.

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Segundo Langhout apud Corneli (2004) os ácidos orgânicos apresentam uma

ação bacteriostática, modificam o DNA que está presente no núcleo da célula da

bactéria, ocorrendo a inibição de sua proliferação.

Vale ressaltar que o ácido inorgânico não tem este desempenho que é

apresentado pelo ácido orgânico, pois sempre encontra-se dissociado em dissolução

(ROMBOLA; FARIA, 2003).

Quando uma unidade de pH está acima do pka, grandeza que torna possível

saber a força de um ácido, significa que 90% do ácido se encontra não dissociado,

porém quando ocorre aparecimento de duas unidades de pH acima do pka, é

expresso que 99% do ácido em questão se encontra não dissociado (ADAMS, 1999

apud BELLAVER; SCHEUERMANN, 2004).

O trato gastrointestinal é rico em ácido lático. Portanto, todo aditivo que tiver

este composto vai ter mais eficácia na preservação da microflora benéfica. Vale

constar que, para obter um ambiente gastrointestinal normal, é necessário que se

tenha a combinação de um produto (aditivo) que seja tanto benéfico ao equilíbrio da

microflora quanto a adequada absorção dos nutrientes (SILVA JUNIOR, 2009).

Cudjoe (1988) relata que o ácido lático é natural e não tóxico, (SILVA, 2000)

sendo considerado um bom sanitizante, aumentando a acidez e diminuindo a

proliferação de bactérias patógenas.

O ácido fumárico, por exemplo, é um ácido carboxílico de cadeia curta, que

apresenta alguma atividade antifúngica (DIBNER; BUTTIN, 2002).

O ácido ascórbico, conhecido como vitamina C, é um antioxidante potente

(HALLIWELL; GUTTERIDGE apud SALVADOR; HENRIQUES, 2004), sendo que em

concentrações elevadas, pode prevenir a indução de mutações no DNA

(LUTSENKO et al. apud SALVADOR; HENRIQUES, 2004).

A vitamina C doa elétrons, sendo um agente redutor (PADAYATTY et al. apud

SALVADOR; HENRIQUES, 2004).

O acido cítrico tem sido utilizado como antioxidante e sinergista, sendo este

responsável pela melhor eficácia, dando à mistura, neste caso os ácidos, um maior

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potencial (SILVA, 2000). Ainda segundo Coultate e Frazzon (2004) este ácido ajuda

a manter o pH do meio, ácido.

2.2.3 Ultrabiótico

O ultrabiótico Citrex provém da reação física que ocorre com o ácido

ascórbico (vitamina C) e os ácidos cítrico e lático, além da glicerina. Este aditivo não

é um acidificante pelo fato de não diminuir o pH do trato gastrointestinal, e sim atuar

na superfície da membrana da parede celular, que ao tocá-la, vai ampliar sua

penetração (permeabilidade), conseguindo eliminar as bactérias patógenas, de

forma “seletiva”. As bactérias patógenas atraem o Citrex pelo fato de possuírem

receptores químicos, e assim, este aditivo acaba não matando a microflora benéfica

mas a prejudicial, pois os micro-organismos da flora normal não possuem os

mesmos receptores químicos. A concentração necessária para inibir as bactérias

maléficas é de 12 a 100 ppm de Citrex. Concentrações de 100 a 200 ppm (0,01 a

0,02%) são consideradas suficientes para matar a grande maioria das bactérias

patógenas (CITREX, 2011).

O Citrex inibe tanto bactérias gram-positivas quanto negativas, tendo um

grande conteúdo amorfo. Uma quantidade acima de 500 ppm vai ser prejudicial para

a microflora benéfica. Este ultrabiótico veio para substituir o uso de antibióticos, na

verdade a resistência aos antibióticos, mantendo a sanidade dos animais, sendo um

produto medicamentoso que visa o controle dos micro-organismos. O Citrex melhora

a eficiência dos antibióticos, probióticos, acidificantes, entre outros, sendo um

produto que não deixa residuos nos animais, nem na carne a ser consumida

(ZAVIEZO, 2009).

O Citrex é um ingrediente ativo, um composto orgânico ultrabiótico

(bactericida, viricida e fungicida) sem possuir aditivos tóxicos e nem cancerígenos.

Este aditivo inibe a contaminação por várias bactérias patógenas, entre ela a

Salmonella e a Listeria, sendo que não agride o DNA das mesmas e assim, é

extremamente difícil desenvolver a resistência de bactérias (TAMAMES, 2010).

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Atacando essas bactérias patógenas, o Citrex atua propiciamente na

microflora gastrointestinal. O Citrex é um ácido fraco, ficando com pH entre 1,5 a 3

(não é corrosivo), mas este ultrabiocida não é dependente do pH, podendo

tranquilamente trabalhar tanto em pH ácido quanto básico (CITREX, 2011).

2.3 Concentração Inibitória Mínima (MIC)

A técnica de diluição em caldo (macrodiluição) é umas das formas de avaliar

a sensibilidade de bactérias frente aos aditivos, onde mede-se quantitativamente a

atividade in vitro de um aditivo em relação a um determinado isolado bacteriano

(NCCLS, 2003). A visualização é determinada a partir da turvação do meio em que

se encontra a bactéria, demonstrando a ineficiência do aditivo em questão frente a

bactéria (LEVINSON, 2010).

Na determinação da concentração inibitória mínima, são preparados diversos

tubos de ensaio com meio caldo, sendo adicionadas várias concentrações de

aditivos, em diluições na base 2. Posteriormente, os tubos são incubados a 35 °C,

com um tubo contendo uma suspensão padrão do micro-organismo a ser testado.

Após, passadas às 16-18 horas de incubação, observam-se os testes, determinando

a MIC. Para interpretação dos resultados obtidos neste teste, surgem os resultados

sensíveis (eficiência do aditivo perante a bactéria patógena); os intermediários

(bactéria patógena passa a ser tratada por um aditivo concentrado ou uma possível

dosagem maior de aditivo); ou ainda os resistentes (bactérias patógenas não são

inibidas pelos aditivos) (NCCLS, 2003).

Dosagens acima do recomendado em MIC fazem com que as bactérias se

tornem cada vez mais resistentes aos antimicrobianos, pois aumenta a “frequencia

de cepas de micro-organismos que carregam genes de resistência aos antibióticos”

(SOUZA, 2010).

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3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Preparação dos caldos

3.1.1 Caldo BHI

Pesou-se em uma balança analítica 0,74 g de infusão de cérebro e coração

(BHI) e colocou-se em um frasco reagente graduado de 500 mL. Adicionou-se 20 mL

de água destilada, agitando-se até a completa dissolução.

Autoclavou-se a 121 °C por 15 minutos e após, deixo u-se atingir temperatura

ambiente.

3.1.2 Solução salina

Pesou-se em uma balança analítica 2,125 g de salina e colocou-se em um

frasco reagente graduado de 500 mL. Adicionou-se 250 mL de água destilada,

agitando-se até a completa dissolução.

Adicionou-se 9 mL de solução salina em cada tubo de ensaio, num total de 24

tubos, fechou-se os mesmos, autoclavando-os a 121 °C por 15 minutos e após,

deixou-se atingir temperatura ambiente.

Guardou-se os tubos de ensaio na geladeira a temperatura de 2 a 8 °C.

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3.1.3 Caldo Mueller Hinton

Pesou-se em uma balança analítica 10,5 g de caldo Mueller Hinton e colocou-

se em um frasco reagente graduado de 500 mL. Adicionou-se 500 mL de água

destilada e agitou-se até a completa dissolução.

Autoclavou-se a 121 °C por 15 minutos e após, deixo u-se atingir temperatura

ambiente. Guardou-se na geladeira a temperatura de 2 a 8 °C.

3.2 Cultivo / reativação das bactérias ( overnight)

Pipetou-se 10 mL de caldo BHI preparado anteriormente e colocou-se em um

tubo de ensaio com tampa rosca previamente esterilizado, adicionando-se uma

alçada da linhagem Salmonella enteritidis ATCC 13076.

Procedeu-se da mesma maneira com a linhagem Listeria monocytogenes

ATCC 7644.

Após, incubou-se as duas linhagens em estufa a 36 °C por 24 horas.

3.3 Diluição das bactérias

A partir do crescimento overnight, após as 24 horas, transferiu-se 1 mL da

solução que continha salmonela para um tubo de ensaio contendo somente solução

salina, ficando esta numa concentração de 109 (9.000.000 bactérias/mL). Realizou-

se este procedimento mais duas vezes e descartou-se a ponteira.

Diluições progressivas foram realizadas em séries de três repetições,

transferindo-se 1 mL da solução mais concentrada (109) para a um tubo contendo

somente a solução salina, ficando assim, com uma concentração de 108. A ponteira

foi descartada. Realizou-se mais duas diluições, obtendo-se assim, uma

concentração de 106. Sempre anteriormente a transferência de 1 mL, agitava-se a

solução contida no tubo de ensaio, com o auxilio de um agitador de tubos.

Procedeu-se da mesma maneira para a diluição da bactéria listeria.

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1 g 1000 mg ↔ 1000 mg

0,5 g ↔ X

X = 500 mg

3.4 Preparação dos aditivos

Cada um dos cinco aditivos utilizados no método de macrodiluição

(amoxicilina, colistina, enrofloxacina, acidificante e Citrex) foram diluídos de acordo

com o princípio ativo e dose recomendada de cada aditivo mencionado, como

demonstrado na Tabela 1.

Tabela 1 – Princípio ativo e dose recomendada de cada aditivo

Aditivo Princípio Ativo (g) Dose Recomendada (mg)

Amoxicilina 50 20

Colistina 30 10

Enrofloxacina 10 10

Acidificante 55 120

Citrex (Listeria) 100 100

Citrex (Salmonella) 200 100

Fonte: Da autora

De acordo com a composição da amoxicilina, de cada 100 g de produto, há

50 g de amoxicilina (princípio ativo). Assim:

Conforme a Figura 1, a partir da dose recomendada, dose intermediária,

multiplicou-se por 2 as doses à esquerda e dividiu-se por 2 as doses à direita,

obtendo-se assim, as concentrações utilizadas no método de macrodiluição para o

aditivo amoxicilina.

Figura 1 – Concentrações utilizadas de amoxicilina no método de macrodiluição

Fonte: Da autora

em 100 g do produto 50 g de princípio ativo↔ 50 g de princípio ativo

em 1 g de produto ↔

X = 0,5 g de principio ativo em 1 g de aditivo

X

x2 x2 x2 x2 /2 /2 /2 /2

0,32 ← 0,16 ← 0,08 ← 0,04 ← 0,02 → 0,01 → 0,005 → 0,0025 → 0,00125

em 1000 g de peso vivo 20 mg de dose recomendada↔

↔

X = 0,02 mg de dose recomendada

20 mg de dose recomendada

em 1 g de peso vivo X

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Pesou-se em uma balança analítica 0,1 g de amoxicilina e diluiu-se em

156,25 mL de água destilada num frasco reagente graduado de 250 mL. Agitou-se

até completa dissolução.

Para os quatro aditivos restantes foram realizadas as mesmas etapas para

conhecer a concentração utilizada no método de macrodiluição.

Conforme as Figuras 2 a 6, obteve-se as seguintes concentrações para

colistina, enrofloxacina, acidificante e Citrex, respectivamente:

Figura 2 – Concentrações utilizadas de colistina no método de macrodiluição

Fonte: Da autora

Figura 3 – Concentrações utilizadas de enrofloxacina no método de macrodiluição

Fonte: Da autora

Figura 4 – Concentrações utilizadas de acidificante no método de macrodiluição

Fonte: Da autora

Figura 5 – Concentrações utilizadas de Citrex (Listeria) no método de macrodiluição

Fonte: Da autora

/ 0,32 mg (maior concentração analisada)

X = 1562,5 mL de água destilada em que 1 g do aditivo contém 0,32 mg de

princípio ativo

500 mg de princípio ativo

X = 1562,5 mL de água destilada em que 1 g do aditivo contém 0,32 mg de

princípio ativo

em 1 g de aditivo ↔ 1562,5 mL de água destilada

em 0,1 g de aditivo ↔

X = 156,25 mL de água destilada

X

x2 x2 x2 x2 /2 /2 /2 /2

0,16 ← 0,08 ← 0,04 ← 0,02 ← 0,01 → 0,005 → 0,0025 → 0,00125 → 0,000625

x2 x2 x2 x2 /2 /2 /2 /2

0,16 ← 0,08 ← 0,04 ← 0,02 ← 0,01 → 0,005 → 0,0025 → 0,00125 → 0,000625

x2 x2 x2 x2 /2 /2 /2 /2

1,92 ← 0,96 ← 0,48 ← 0,24 ← 0,12 → 0,06 → 0,03 → 0,015 → 0,0075

x2 x2 x2 x2 /2 /2 /2 /2

1,6 ← 0,8 ← 0,4 ← 0,2 ← 0,1 → 0,05 → 0,025 → 0,0125 → 0,00625

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Figura 6 – Concentrações utilizadas de Citrex (Salmonella) no método de macrodiluição

Fonte: Da autora

onde, para colistina foi pesado 0,1 g e diluído em 187,5 mL de água destilada; para

enrofloxacina foi pesado 0,1 g e diluído em 62,5 mL de água destilada; para o

acidificante foi pesado 0,1 g e diluído em 28,65 mL de água destilada e para o Citrex

foi medido 1 mL e 2 mL e diluídos em 625 mL e 312,5 mL de água destilada

respectivamente, sendo o primeiro para a verificação da atuação sobre a listeria e o

segundo para a verificação da atuação sobre a salmonela.

3.5 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC)

Após conhecidas as concentrações e diluídos os aditivos, dispuseram-se

onze tubos de ensaio com tampa, enfileirados, na mesma sequencia demonstrada

anteriormente, da esquerda para a direita (da maior para a menor concentração),

para cada um dos cinco aditivos, sendo que cada tubo de ensaio foi identificado com

o valor a ser diluído.

Em cada um dos tubos de ensaio foi adicionado 1 mL de caldo Mueller

Hinton, salientando que o penúltimo tubo (da esquerda para direita) foi representado

pelo controle negativo, contendo somente o caldo em questão, e no último tubo,

utilizou-se um controle positivo, contendo o caldo juntamente com a bactéria (1 mL

da bactéria na concentração 106).

Posteriormente, adicionou-se nos nove tubos de ensaio, 1 mL do aditivo em

questão (amoxicilina), sendo que esta quantidade acrescentada foi no tubo de maior

concentração (esquerda). A partir deste ponto deu-se continuidade as diluições,

transferindo-se sempre 1 mL da última diluição preparada para preparar as demais

diluições, sendo que sempre foi trocada as ponteiras. No último tubo de ensaio

(menor concentração) foi descartado 1 mL.

Dando continuidade ao procedimento, adicionou-se 1 mL da bactéria listeria

(concentração 106) em cada um dos 10 tubos de ensaio dispostos.

x2 x 2 x2 x2 /2 /2 /2 /2

3,2 ← 1,6 ← 0,8 ← 0,4 ← 0,2 → 0,1 → 0,05 → 0,025 → 0,0125

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Tampou-se e agitou-se os onze tubos de ensaio, com o auxilio de um agitador

de tubos, e após, incubou-se os mesmos numa estufa a 35 °C de 16-18 horas.

A determinação de MIC foi feita em duplicata para cada aditivo testado

(amoxicilina, colistina, enrofloxacina, acidificante e Citrex).

O mesmo procedimento de MIC foi realizado com a bactéria salmonela.

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Durante todo o procedimento realizado neste estudo, houve um cuidado

apurado para que não ocorresse contaminação no decorrer das etapas.

A Figura 7 mostra as diluições progressivas realizadas para cada bactéria,

imersas em solução salina.

Figura 7 – Diluição das bactérias imersas em salina

Fonte: Da autora

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A Figura 8 contempla

dos aditivos utilizados neste teste de macrodiluição.

Figura 8 – Diluição dos aditivos

Fonte: Da autora

Observa-se no Gráfico 1 as

estudados.

Gráfico 1 – Concentrações preparadas para método de macrodiluição

Fonte: Da autora

contempla o modo de procedimento para realização das diluições

dos aditivos utilizados neste teste de macrodiluição.

Diluição dos aditivos

se no Gráfico 1 as concentrações preparadas dos cinco aditivos

Concentrações preparadas para método de macrodiluição

29

o modo de procedimento para realização das diluições

concentrações preparadas dos cinco aditivos

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As concentrações dos cinco aditivos são contempladas no Gráfico 1.

Observa-se que as concentrações dos aditivos antimicrobianos são menores do que

os aditivos Citrex e acidificante, mesmo nas maiores concentrações utilizadas.

A Figura 9 demonstra a adição de 1 mL da bactéria listeria (concentração 106)

em cada um dos 10 tubos de ensaio ordenados para a prática, sendo realizado o

mesmo procedimento posteriormente para a bactéria salmonela.

Figura 9 – Transferência de bactéria para tubo de ensaio

Fonte: Da autora

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Observa-se na Figura 10

de 16-18 horas a 35 °C.

Figura 10 – Incubação dos tubos

Fonte: Da autora

Os resultados encontrados no método de macrodiluição

concentração inibitória mínima (MIC)

bactérias em estudo, salmonela e l

Gráfico 2 – Dose recomendada X MIC

Fonte: Da autora

Os resultados encontrados na concentração inibitória mínima da enrofloxacina

frente a salmonela foi de 0,00125 mg/Kg, sendo que

0,01 mg/Kg. Assim torna

Salmonella enteritidis.

se na Figura 10, os tubos de ensaio prontos para serem incubado

Incubação dos tubos de ensaio

Os resultados encontrados no método de macrodiluição

concentração inibitória mínima (MIC) de aditivo, inibindo assim a prolife

s em estudo, salmonela e listeria, são demonstrados nos Gráficos 2

Dose recomendada X MIC


frente a salmonela foi de 0,00125 mg/Kg, sendo que sua dose

Assim torna-se nítida a eficiência deste antimicrobiano frente a

. Basic, Pulga e Pantoja (2003) também afimam que a

31

, os tubos de ensaio prontos para serem incubados

Os resultados encontrados no método de macrodiluição para averiguar a

de aditivo, inibindo assim a proliferação das

nos Gráficos 2 a 5.


sua dose recomendada é de

se nítida a eficiência deste antimicrobiano frente a

) também afimam que a

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enrofloxacina mostra-se bastante ativa contra a grande maioria das bactérias gram-

negativas como a Salmonella spp.

As fluoroquinolonas, neste caso a enrofloxacina, são eficientes frente ao

tratamento das salmoneloses (INFOSAN, 2005).

A eficiência da enrofloxacina também foi comprovada em um estudo para

verificar a sensibilidade de determinados antibióticos, realizado de janeiro de 2004 a

dezembro de 2006, onde num total de 220 amostras de Salmonella spp.,

provenientes de órgãos isolados de frangos de corte, poedeiras, farinha de carne,

entre outros, 153 amostras eram do gênero enteritidis, onde destas, 105 amostras

mostraram-se sensíveis a enrofloxacina e 16 amostras foram resistentes a este

antibiótico (LIMA et al., 2009).

Diante da resistência citada acima, segundo Otero, Mestorino e Errecalde

(2001) algumas concentrações inibitórias mínimas de enrofloxacina para alguns

micro-organismos como a Salmonella spp. são maiores ou iguais a 0,1 µg/mL (0,001

mg/Kg).

No estudo realizado por Lima et al. (2009) foi constatado a sensibilidade de

amostras de Salmonella enteretidis isoladas de aves (15 amostras) poedeiras,

reprodutoras e frangos de corte frente a antibióticos, onde constatou-se que o

antimicrobiano enrofloxacina, utilizado em uma concentração de 0,005 mg/Kg (5 µg)

teve 66,7% (14 amostras) de efetividade em relação as 15 amostras que continham

esta bactéria patógena.

Verificou-se em 60 amostras de produtos nacionais avícolas, obtidos em uma

cafeteria e dois açougues da cidade do Porto, em Portugal, 60% estavam

contaminados com salmonela, sendo que o gênero enteritidis foi um dos gêneros de

maior prevalência. Constatou-se que 50% dos isolados de salmonela foram

resistentes a enrofloxacina e 75% demonstrou resistência a um ou mais antibióticos

(ANTUNES et al., 2003).

Para colistina, a concentração inibitória mínima encontrada neste estudo foi

de 0,00125 mg/Kg, a mesma encontrada para enrofloxacina.

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Um total de 178 amostras de Salmonella spp., isoladas de carcaças de aves

da região sul do país, no período de 2004 a 2006, foram utilizadas em testes de

antibiogramas, onde foram testados 24 antibióticos. Entre estes antimicrobianos,

utilizou-se 50 µg (0,05 mg) de colistina e 10 µg (0,01 mg) de enrofloxacina. A

resistência das amostras de salmonela frente a colistina e a enrofloxacina foi de

5,1% e 2,2%, respectivamente. A cepa do gênero enteritidis (87 amostras)

apresentou maior resistência aos antibióticos (14/24 antimicrobianos), sendo que

1,1% das amostras de Salmonella enteritidis mostraram-se resistentes a

enrofloxacina e 3,4% a colistina (PALMEIRA, 2007).

Neste presente estudo, tanto para a enrofloxacina quanto para a colistina, o

que observa-se é a mesma dose necessária para inibir este patógeno.

Já para a amoxicilina a dosagem mínima foi de 0,005 mg/Kg para combater a

bactéria salmonela.

De acordo com os resultados obtidos em relação a 13 amostras de salmonela

isoladas de carcaças de frango, constatou-se que 69,23% (9 amostras) foram

resistentes a enrofloxacina, 30,76% (4 amostras) foram resistentes a amoxicilina,

sendo que a concentração utilizada de cada aditivo foi de 30 µg (0,03 mg/Kg) e 5 µg

(0,005 mg/Kg), respectivamente (BORSOI, 2005).

De acordo com o presente estudo, observa-se uma maior eficácia do

antibiótico enrofloxacina em comparação com a amoxicilina, sendo esta afirmação

contraditória ao estudo acima citado por Borsoi.

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Fonte: Da autora

Os resultados encontrados dos antimicrobianos frente a bactéria listeria são

demonstrados acima, onde observa

uma MIC de 0,005 mg/Kg sendo qu

A enrofloxacina mostra

como a listeria (OTERO; MESTORINO; ERRECALDE, 2001) sendo que não

apresenta praticamente nenhuma atividade contra bactérias anaeróbicas (BAS

PULGA; PANTOJA, 2003

eficiência deste antibiótico foi mais promissor no combate a bactéria salmonela em

comparação com a listeria, uma gram

A colistina mostrou

recomendada é de 0,01 mg/Kg e

0,04 mg/Kg, sendo esta dose acima do recomendado.

(UNIQUÍMICA, 2011), é devido a este aditivo ser eficaz contra bactérias gram

negativas, demonstrando

salmonela.

Ennaji et al. (2008) realizaram es

Casablanca, Marrocos, com 426 amostras de carnes, produtos cárneos e aves,

averiguando a ocorrência de variadas espécies de listeria. Entre as 43 espécies de

listeria isoladas, 10 cepas eram do gênero

um total de 23,3%. Na determinação da atividade



demonstrados acima, onde observa-se que a enrofloxacina mostrou

uma MIC de 0,005 mg/Kg sendo que a dose recomendada é de 0,01 mg/Kg.

A enrofloxacina mostra-se eficiente frente a algumas bactérias gram


apresenta praticamente nenhuma atividade contra bactérias anaeróbicas (BAS

2003). Este fato pode ser observado neste trabalho, onde a


comparação com a listeria, uma gram-positiva.

A colistina mostrou-se ineficiente no combate a listeria, sendo que a dose

recomendada é de 0,01 mg/Kg e este antimicrobiano foi eficaz somente na dose de

0,04 mg/Kg, sendo esta dose acima do recomendado. Este fato, segundo

, é devido a este aditivo ser eficaz contra bactérias gram

ativas, demonstrando no presente estudo, notória eficiência frente a bactéria

Ennaji et al. (2008) realizaram estudo em açougues e supermercados de


ia de variadas espécies de listeria. Entre as 43 espécies de

listeria isoladas, 10 cepas eram do gênero Listeria monocytogenes

3%. Na determinação da atividade in vitro de diversos antibióticos

34


se que a enrofloxacina mostrou-se eficaz, tendo

e a dose recomendada é de 0,01 mg/Kg.

se eficiente frente a algumas bactérias gram-positivas


apresenta praticamente nenhuma atividade contra bactérias anaeróbicas (BASIC;

). Este fato pode ser observado neste trabalho, onde a


listeria, sendo que a dose

foi eficaz somente na dose de

Este fato, segundo

, é devido a este aditivo ser eficaz contra bactérias gram-

notória eficiência frente a bactéria

tudo em açougues e supermercados de


ia de variadas espécies de listeria. Entre as 43 espécies de

Listeria monocytogenes, representando

de diversos antibióticos

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frente as cepas de Listeria monocytogenes de carne vermelha e aves, dentre os 21

antibióticos testados, a amoxicilina foi suscetível (40%), porém a colistina mostrou-se

100% resistente a esta bactéria.

De acordo com o Gráfico 3, a amoxicilina teve 100 % de eficiência frente a

bactéria listeria. Obteve-se uma MIC menor que 0,00125 mg/Kg sendo que a dose

recomendada é de 0,02 mg/Kg.

Segundo Perez-Gonzalez et al. (2001), a amoxicilina age tanto em bactérias

gram-positivas quanto gram-negativas.

Em estudo in vitro para verificar a eficiência da amoxicilina, dentre outros

antibióticos, sobre o crescimento intracelular da bactéria L. monocytogenes,

observou-se que este antibiótico obteve uma MIC menor que 0,03 mg/L (MICHELET

et al.,1994). Porém, em teste realizado com 10 cepas de L. monocytogenes, para

verificar a susceptibilidade destas frente a amoxicilina, entre outros antibióticos,

obteve-se uma concentração inibitória mínima de 0,03 mg/mL (MICHELET et al.,

1997).

De acordo com Zaviezo (2009) os antibióticos não possuem o poder de

eliminar a infecção por completo, além de conseguir eliminar também a microflora

benéfica e criar cepas resistentes.

Para que um antimicrobiano seja eficaz, ele precisa inibir o invasor, sem

prejudicar o seu hospedeiro, sendo seletivo, tendo então uma toxicidade seletiva,

atacando somente as células prejudiciais (SANTANA, 2006).

Portanto, os antibióticos podem atuar dependendo do mecanismo de ação de

cada um, sendo que entre eles está a criação de alterações na permeabilidade

seletiva da membrana citoplasmática, ocasionando diminuição de substâncias

importantes, essenciais, e como consequência, ocorrendo a passagem de

substâncias nocivas; “por interferência do cromossomo, degenerando o DNA

bacteriano”; entre outros (GOMES, 2004).

Segundo (WHO; CDS; CSR, 2001) o fato de uma determinada bactéria resistir

aos efeitos de um antimicrobiano, torna-se cada vez mais frequente. Este

mecanismo é natural, no qual uma cepa consegue se reproduzir, em concentrações

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cada vez mais elevadas

as cepas, que antes eram sensíveis, tornam

transferência de genes.

vários mecanismos. Assim,

antimicrobiano, não sendo

situação, este mecanismo provocado pelos genes, pode

outros antibióticos da mesma classe, e ainda,


Fonte: Da autora

Como consta no Gráfico 4, a concentração ini

Citrex foi de 0,2 mg/Kg, sendo a mesma indicada para combate a salmonela.

Já o acidificante utilizado foi ineficiente, não conseguindo combater a

proliferação da Salmonella enteritidis

mg/Kg, sendo que na concentração máxima utilizada neste experimento, 1,92

mg/Kg, não houve eficiência, demonstrando necess

maior deste acidificante pa

Em experimento realizado com

mg) da dose recomendada

Utilizando uma concentração de até

sendo estes da microflora benéfica, não foram afetados (

2009). Isso comprova o fato deste ultrabiótico não afetar a microflora benéfica,

mesmo com uma quantidade elevada do mesmo

de um determinado antibiótico. Este fato

as cepas, que antes eram sensíveis, tornam-se resistentes pela mutação ou

Os genes conseguem reunir em códigos a

vários mecanismos. Assim, a bactéria consegue resistir aos e

não sendo inibida pelo aditivo em questão. Agravando ainda mais a

ituação, este mecanismo provocado pelos genes, pode induzir

mesma classe, e ainda, à diferentes classes.

endada X MIC

Como consta no Gráfico 4, a concentração inibitória mínima do ultrabiótico

foi de 0,2 mg/Kg, sendo a mesma indicada para combate a salmonela.


Salmonella enteritidis. A concentração indicada para o uso é de 0,12


mg/Kg, não houve eficiência, demonstrando necessidade de

maior deste acidificante para alcançar a MIC frente a esta bactéria.

Em experimento realizado com Citrex, constatou-se que com 200 ppm

da dose recomendada deste aditivo, a Salmonella enteritidis

Utilizando uma concentração de até 500 ppm (0,5 mg), os Lactobac

sendo estes da microflora benéfica, não foram afetados (VEDIA apud

. Isso comprova o fato deste ultrabiótico não afetar a microflora benéfica,

mesmo com uma quantidade elevada do mesmo.

36

. Este fato é originado porque

se resistentes pela mutação ou

Os genes conseguem reunir em códigos a resistência de

efeitos adversos do

inibida pelo aditivo em questão. Agravando ainda mais a

induzir uma resistência a

diferentes classes.

bitória mínima do ultrabiótico

foi de 0,2 mg/Kg, sendo a mesma indicada para combate a salmonela.


. A concentração indicada para o uso é de 0,12


idade de uma concentração

ra alcançar a MIC frente a esta bactéria.

se que com 200 ppm (0,2

Salmonella enteritidis foi eliminada.

Lactobacillus plantarum,

VEDIA apud ZAVIEZO,

. Isso comprova o fato deste ultrabiótico não afetar a microflora benéfica,

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Comparando-se

quantidades, 200, 350 e 5000 ppm

Salmonella enteritidis, obteve

Citrex. Em relação ao acidificante

200 e 350 ppm, 9 UFC

ZAVIEZO, 2009). Assim

contrapartida, a ineficiência d

Foi utilizado Citrex

avaliar a eficiência do mesmo contra a bactéria

foi positivo, sendo observado o não surgimento de efeitos deletérios (efeitos

indesejáveis para a saúde) que são causados por esta bactéria (KON

apud ZAVIEZO, 2009).

Segundo Tamames

30 minutos sobre a bactéria

gram-negativos, destruindo assim a bactéria em questão.


Fonte: Da autora

Os resultados encontrados para o Citrex e o acidificante estão contidos

acima, sendo que o Citrex foi eficiente no combate a listeria, onde a MIC foi a

mesma que a dosagem recomendada 0,1 mg/Kg.

O acidificante também demonstrou ineficiência em relação a listeria

concentração indicada para o uso é de 0,12 mg/Kg, sendo que a MIC obtida foi de

1,92 mg/Kg.

Citrex, colistina e um acidificante, em três diferentes

quantidades, 200, 350 e 5000 ppm (0,2, 0,35 e 5 mg/Kg respectivamente)

obteve-se um resultado de 0 UFC/mL nas doses de

m relação ao acidificante, obteve-se um crescimento

, 9 UFC/ml, como também em 5000 ppm

. Assim comprova-se novamente a eficiência do ultrabiotic

ncia do acidificante.

Citrex na água de beber de perus em um experimento, a fim de

avaliar a eficiência do mesmo contra a bactéria Salmonella typhimurium


indesejáveis para a saúde) que são causados por esta bactéria (KON

Tamames (2010) estudos comprovaram que expondo o

bactéria Salmonella typhimurium, ocorreu redução dos bacilos

negativos, destruindo assim a bactéria em questão.




mesma que a dosagem recomendada 0,1 mg/Kg.

ambém demonstrou ineficiência em relação a listeria


37

idificante, em três diferentes

mg/Kg respectivamente), frente a

resultado de 0 UFC/mL nas doses de colistina e

tanto nas doses de

(MUNAKATA apud

ncia do ultrabiotico e em

em um experimento, a fim de

Salmonella typhimurium. O resultado


indesejáveis para a saúde) que são causados por esta bactéria (KONCICKI et al.

) estudos comprovaram que expondo o Citrex por

, ocorreu redução dos bacilos



ambém demonstrou ineficiência em relação a listeria. A


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Observa-se que este acidificante foi mais eficaz no combate a Listeria

monocytogenes, porém torna-se duvidoso, pelo fato de não conseguir inibir as

bactérias em estudo, na sua dose recomendada.

Contemplando a veracidade dos resultados encontrados no presente trabalho,

em estudo realizado in vitro para observar a eficácia do Citrex frente a Listeria

monocytogenes, concluiu-se que a MIC foi de 25 ppm, (0,025 mg/L) sendo utilizada

uma diluição de 400 a 0,781 ppm (IN, 2010).

As MICs encontrados para Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium e

Salmonella choleraesuis foram de 12,5 (100 ppm); 50 (200 ppm) e 50 (200 ppm)

respectivamente, utilizando Citrex segundo (TAMAMES, 2010).

Uma das grandes vantagens em utilizar produtos naturais, como o Citrex, um

produto formado por ácidos orgânicos é citado por IN, (2010) como uma alternativa

favorável pelo fato destes ácidos serem o resultado do metabolismo natural de frutas

e legumes (produtos frescos), como exemplo o ácido cítrico e lático. Além disso, os

ácidos orgânicos tem atividade microbicida, constatando-se uma redução na

pemeabilidade da membrana celular bacteriana.

O Citrex é eficaz contra bactérias gram-negativas e positivas (ZAVIEZO,

2009). Isto demonstra uma grande vantagem na utilização deste aditivo,

conseguindo inibir um elevado número de bactérias.

Observou-se notoriamente a ineficiência do acidificante utilizado neste estudo,

tanto para o combate da salmonela quanto para a listeria. Segundo Durango e

Barguil, (2006) ácidos orgânicos que não estão bem separados, não dissociados,

têm seu efeito reduzido, pois estando como moléculas intactas, desta maneira não

conseguem penetrar na célula. Para que a atividade microbiana (toxicología

molecular) seja exercida com eficiência, é preciso que haja uma diminuição da

permeabilidade da membrana celular bacteriana.

Portanto, quando consegue-se atingir a acidificação desejada, ocorre uma

diminuição das bactérias patógenas, devido a diminuição do pH e do substrato,

desfavorecendo estas bactérias (RUTZ; LIMA, 2001), sendo comprovada a eficiência

ou ineficiência do aditivo, como observada neste presente estudo.

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A diferença encontrada nos MICs realizados neste presente estudo (utilizando

os antibióticos) em comparação com alguns trabalhos citados, pode ter ocorrido

devido à utilização de cepas de laboratório, sendo o caso deste trabalho, e cepas

selvagens, usadas talvez em estudos comparativos.

As cepas selvagens, muitas vezes podem estar em contato com produtos

químicos (IN, 2010), que contêm genes de resistência (NOGUEIRA, 2010), como os

utilizados em indústrias de alimentos, por exemplo, os desinfetantes. Assim, essas

cepas conseguem se adaptar a este meio, adquirindo resistência (resistência

adquirida) (IN, 2010). Este fato também pode ocorrer devido a modificação genética

(SOUZA apud SEQUEIRA, 2004).

Nas Figuras 11 a 15, observa-se os MICs de alguns aditivos frente as

bactérias em estudo, onde é possível observar a turvação do meio, comprovando a

ineficiência do aditivo frente a bactéria.

Figura 11 - MIC do acidificante frente a Salmonella

Fonte: Da autora

Observa-se na Figura 5 que houve turvação em todos os tubos de ensaio,

demonstrando total resistência da salmonela frente ao acidificante.

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Figura 12 - MIC da colistina frente a Salmonella

Fonte: Da autora

Observa-se a eficiência do antimicrobiano colistina frente a proliferação da

salmonela. Ocorre turvação somente no primeiro tubo de ensaio, com a menor

concentração, de 0,000625 mg/Kg.

Figura 13 - MIC Citrex frente a Salmonella

Fonte: Da autora

No teste realizado com o aditivo Citrex frente a bactéria Salmonella, conforme

visualiza-se na Figura 13, obteve-se concentração inibitória mínima de 0,2 mg/L

sendo que a bactéria conseguiu proliferar até a concentração de 0,1 mg/L.

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Figura 14 - MIC enrofloxacina frente a Listeria

Fonte: Da autora

A concentração inibitória mínima da enrofloxacina já relatada anteriormente

foi de 0,005 mg/Kg para inibir a proliferação da bactéria listeria, conforme é

demonstrado na Figura 14.

Figura 15 - MIC acidificante frente a Listeria

Fonte: Da autora

Resistência quase total da bactéria frente ao aditivo como consta na Figura

9. A maior concentração de aditivo conseguiu combater a proliferação da bactéria

em destaque.

Os Gráficos 6, 7 e 8 demonstram qual das bactérias em estudo, Listeria ou

Salmonella, mostrou maior resistência aos aditivos utilizados e qual destes aditivos

foi mais eficaz.

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Gráfico 6 – Concentração dos aditivos utilizados na técnica de macrodiluição

Fonte: Da autora

O Gráfico 6 mostra as concentrações

correspondem ao limite

enrofloxacina, a salmonela foi resistente até a dose de 0,000625 mg/Kg e a listeria

foi resistente até a concentração de 0,0025

salmonela apresentou resistência

listeria, essa resistência foi

colistina observou-se que a listeria foi mais resistente, 0,02 mg/Kg, em comparação

a salmonela que demonstrou resistência até a concentraç

amoxicilina obteve maior resistência em relação a salmonela, 0,0025 mg/Kg,

listeria não demonstrou resistência na concentração mínima uti

comprovado que foi inferior a

resistente até 0,1 mg/L e a listeria foi resistente até

Concentração dos aditivos utilizados na técnica de macrodiluição

O Gráfico 6 mostra as concentrações máximas de aditivos, sendo q

correspondem ao limite máximo de resistência bacteriana.


foi resistente até a concentração de 0,0025 mg/Kg. Em relação ao acidificante a

resistência superior a 1,92 mg/Kg, sendo que em relação a

listeria, essa resistência foi observada até a concentração de 0,96 mg/Kg. Para

se que a listeria foi mais resistente, 0,02 mg/Kg, em comparação

a salmonela que demonstrou resistência até a concentração de 0,000625

amoxicilina obteve maior resistência em relação a salmonela, 0,0025 mg/Kg,

listeria não demonstrou resistência na concentração mínima uti

que foi inferior a 0,00125 mg/Kg. Para o Citrex

e a listeria foi resistente até 0,05 mg/L.

42

máximas de aditivos, sendo que estas,

máximo de resistência bacteriana. Assim, para a


. Em relação ao acidificante a

1,92 mg/Kg, sendo que em relação a

concentração de 0,96 mg/Kg. Para a

se que a listeria foi mais resistente, 0,02 mg/Kg, em comparação

ão de 0,000625 mg/Kg. A

amoxicilina obteve maior resistência em relação a salmonela, 0,0025 mg/Kg, já a

listeria não demonstrou resistência na concentração mínima utilizada, sendo

Citrex a salmonela foi

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Gráfico 7 – Resistência bacteriana em porcentagem

Fonte: Da autora

O Gráfico 7 apresenta a resistência de cada bactéria em relação a cada

aditivo, em porcentagem. Sendo assim

enrofloxacina em relação a salmonela. A listeria também mostrou maior resistência

a colistina em relação a salmonela.

ao acidificante em relação a listeria.

demonstraram a mesma resistência em relação ao

esistência bacteriana em porcentagem


aditivo, em porcentagem. Sendo assim, a listeria mostrou-se


a colistina em relação a salmonela. A salmonela foi mais resistente a amoxicilina

ao acidificante em relação a listeria. Tanto a listeria quanto a salmonela

traram a mesma resistência em relação ao Citrex.

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se mais resistência a


A salmonela foi mais resistente a amoxicilina e

teria quanto a salmonela

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Gráfico 8 – Resistência bacteriana X

Fonte: Da autora

Observando o Gráfico 8,

da salmonela, sendo comprovada

inibir a bactéria em questão.

levando em consideração os tipos de aditivos, tão somente a aplicabilidade de cada

um.

Observa-se também neste gráfico que o aditivo mais eficaz no combate

patógenos em questão foi a amoxicilina.

considerado bactericida,

parede celular dos micro

Realizando uma comparação distinta, entre antibióticos e os demais aditivos,

observa-se a eficiência do Citrex na inibição e

Vale ressaltar que os antibióticos são tidos como um dos responsáveis pela

resistência bacteriana, pelo seu uso sem restrições e limitações,

um grande agravante no tratamento de enfermidades, tanto dos animais quanto dos

seres humanos.

esistência bacteriana X aditivo

ráfico 8, é notória a predominância na resistência ba

comprovada pela maior concentração de acidificante para

em questão. Esta comparação é realizada de modo geral, não


se também neste gráfico que o aditivo mais eficaz no combate

patógenos em questão foi a amoxicilina. Segundo Oliveira, (2011)

considerado bactericida, interferindo “na síntese de peptidoglicanos que formam a

parede celular dos micro-organismos”.


se a eficiência do Citrex na inibição e combate as bactérias patógenas.


pelo seu uso sem restrições e limitações,


44

a predominância na resistência bacteriana

pela maior concentração de acidificante para

é realizada de modo geral, não


se também neste gráfico que o aditivo mais eficaz no combate aos

Oliveira, (2011) este aditivo é

interferindo “na síntese de peptidoglicanos que formam a


combate as bactérias patógenas.


pelo seu uso sem restrições e limitações, tornando este fato,


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5 CONCLUSÃO

A busca por alimentos seguros vem ganhando cada vez mais espaço na

sociedade. Consumidores preocupados e atentos por uma melhor qualidade de vida

estão mais exigentes e a procura do que lhes satisfaça.

A saúde do animal torna-se o ponto de partida para que o produto final

chegue a mesa dos consumidores em plenas condições de sanidade e qualidade,

livre de resíduos indesejáveis.

A partir dos resultados obtidos no presente estudo, nota-se a eficiência dos

antimicrobianos. Contudo, indícios de resistência bacteriana apontam para uma

nova era, no qual estas bactérias serão as grandes vilãs no controle de doenças e

infecções, devido ao uso exagerado e indisciplinado de antibióticos.

O Citrex demonstrou eficiência no combate a estas bactérias patógenas,

sendo este ultrabiótico, um grande aliado na produção de alimentos de origem

animal com boa qualidade.

O acidificante utilizado não demonstrou efetividade em relação a nenhuma

das duas bactérias patógenas.

É preciso que haja conscientização de todos para que a guerra entre

resistência bacteriana X antibióticos diminua ou até mesmo seja extinta, utilizando

aditivos naturais e eficazes no controle dos patógenos, alcançando assim, a plena

qualidade alimentar.

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REFERÊNCIAS

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A AÇÃO DOS ADITIVOS NA MINIMIZAÇÃO DA ATIVIDADE … · O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a eficácia de cinco aditivos frente a culturas de bactérias patogênicas