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A COSA SERVE il CLONAGGIO del DNA??A COSA SERVE il CLONAGGIO del DNA??CREARE ‘COPIE IDENTICHE’ (= CLONI) DI UN
FRAMMENTO DI DNA
DIFFERENZE con la PCR:
• è una reazione in vivo
• sfrutta l’apparato di replicazione del DNA della cellula ospite (batteri)
• è un processo più accurato
COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?
PREMESSE:
1) I BATTERI→ CELLULE PROCARIOTICHE:
assenza nucleo
singola molecola circolare di DNA
possono acquisire “facilmente” piccole molecole di DNAesogeno
2) I VETTORI
piccole molecole circolari di DNA che portano pochigeni
possono “facilmente” essere acquisiti dalle cellulebatteriche
COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?PREMESSE:
3) GLI ENZIMI DIRESTRIZIONE
Estremità piatte
Estremità coesive
ENDONUCLEASI che tagliano ilDNA in corrispondenza dispecifiche sequenze di basi
COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?COME FUNZIONA il CLONAGGIO del DNA?1. IL DNA DA CLONARE VIENE
TAGLIATO CON ENZIMI DIRESTRIZIONE
4. IL VETTORE RICOMBINATEVIENE INSERITO IN UNACELLULA BATTERICA E AL SUOINTERNO SI DUPLICA(TRASFORMAZIONE)
2. INSERITO IN UN VETTORETAGLIATO CON GLISTESSI ENZIMI
3. LIGASI
ENZIMA di RESTRIZIONE
PLASMIDE
LIGASI
PLASMIDE RICOMBINANTE
CELLULA BATTERICA
Le FASI deL CLONAGGIOLe FASI deL CLONAGGIO
1. Preparazione del terreno di coltura e delle piastre di crescita
2. Preparazione del DNA da clonare
→ purificazione
→ creazione delle estremità coesiva
3. Inserzione del DNA da clonare in un vettore
4. Inserzione del vettore nell’ospite → TRASFORMAZIONE
5. Piastramento delle cellule
6. Crescita
7. Recupero dei CLONI
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PIASTRA DI CRESCITA TRASFORMAZIONE DI CELLULE BATTERICHE
1. DNA NUDO E VETTORI DI CLONAGGIO
2. CELLULE “COMPETENTI”
3. VALUTAZIONE DEL PROCESSO DITRASFORMAZIONE (resistenza antibiotico)
TRASFORMAZIONE E CELLULE COMPETENTITRASFORMAZIONE E CELLULE COMPETENTI
La trasformazione batterica è una tecnica dibiologia molecolare messa a punto perfacilitare l'introduzione di plasmidi neibatteri, processo che in natura avviene inmisura minima. Questo si ottienemodificando alcune proprietà chimico-fisiche delle pareti e delle membrane cellularicon l'impiego di sostanze chimiche (CaCl2),utilizzando rapidi sbalzi di temperatura o discariche elettriche ad alto voltaggio(elettroporazione); ne deriva unapermeabilizzazione, transitoria, delle celluleal DNA esogeno.
Tutti i metodi chimici si basanosull’osservazione che batteri trattaticon soluzioni di ioni bivalentilasciano entrare DNA “nudo” in modopiù efficiente. Si ipotizza chel’aggiunta di ioni bivalenti (Ca++),maschera le cariche negative del DNAfavorendone l’ingresso nella cellula(E. coli).
TRASFORMAZIONE CHIMICA (CaCl2)TRASFORMAZIONE CHIMICA (CaCl2)
La presenza di un campo elettricodestabilizza le membrane di E. coli edinduce la formazione di pori transientidel diametro di alcuni nanometri. Lemolecole di DNA passano attraversoquesti pori applicando impulsi divoltaggio elevato.
ELETTROPORAZIONEELETTROPORAZIONEGHIACCIO
37 - 45 °C
Formazione di elettropori
GENE GUN
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PROBLEMATICHE RELATIVE AI VETTORIPROBLEMATICHE RELATIVE AI VETTORI
PUO’ SUCCEDERE CHE…
1) La cellula non acquisisce il VETTORE e quindi neanche il DNA da clonare:TRASFORMAZIONE FALLITA
2) Il vettore si richiude su se stesso senza acquisire il DNA da clonare: la cellulaingloba il vettore richiuso PRIVO del DNA da clonare
VETTORI DI CLONAGGIOLa grande maggioranza degli esperimenti diclonaggio utilizza il batterio E. coli per lapropagazione dei frammenti di DNA clonati(OSPITE).
VANTAGGI di E. coli:1. Facile da coltivare in laboratorio2. La sua genetica è ben conosciuta3. Il suo genoma è interamente mappato e
sequenziato
VETTORI DI CLONAGGIOSequenza di DNA capace di replicarsi in manieraautonoma che può essere utilizzata per trasferireframmenti di DNA esogeno. Quelli più utilizzatisono basati su DNA di plasmidi o sul DNA delbatteriofago lambda.
Vettori di clonaggio: utilizzato per amplificare, inun sistema in vivo, un frammento di DNA.
Vettori di espressione: utilizzato per esprimere ungene contenuto nel frammento di DNA clonato.
VETTORI DI CLONAGGIOCaratteristiche:—Replicazione autonoma—Caratteristica selezionabile che permette didistinguere cellule trasformate da quelle nontrasformate—Presenza di almeno un sito di restrizione
PLASMIDISono elementi extra-cromosomiali naturali chevengono ereditati in maniera stabile da unagenerazione all’altra conservando le lorocaratteristiche individuali.
•Plasmidi rilassati (10-200) utilizzano, per lareplicazione, proteine dell’ospite
•Plasmidi stringenti (1-2) sintetizzano fattoriproteici necessari per la replicazione
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PLASMIDI MODIFICATI:
pBR322Rappresenta il primo vettore (4.363 bp) costruitoutilizzando componenti di plasmidi naturali:
•Origine di replicazione•Resistenza ad antibiotici•Siti di clonaggio
pBR322
pBR322
INATTIVAZIONE INSERZIONALE
Resistenza agli antibiotici:
Solo i batteri che hanno integrato un plasmide contenente il gene checodifica per la resistenza alla Kanamicina possono crescere su
terreno nutritivo in presenza di antibiotico
PLASMIDI pUCAlto numero di copie:
mutazione in ori produce 500-600 copie
MCS: multiple cloning site(polylinker)
MCS
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OPERONE lac di E. coli:l’esempio classico
PLASMIDI pUCAlto numero di copie:
mutazione in ori produce 500-600 copie
MCS: multiple cloning site(polylinker)
MCS
PLASMIDI pUCScreening blu-bianco
PLASMIDI pUCScreening blu-bianco
α-complementazione