A fosforilação regulatória por proteína cinase A modula de forma hierárquica as interações intra- e inter-moleculares da

Cu(I)-ATPase de levedura, Ccc2

THIAGO BRITTO-BORGES

Orientador: Adalberto Vieyra

Co-Orientador: Rafael Valverde

Laboratório de Físico-Química Biológica Aída Hassón-Voloch

MONOGRAFIA APRESENTADA COMO REQUISITO PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE BACHAREL EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – MODALIDADE

BIOFÍSICA ÊNFASE EM BIOLOGIA ESTRUTURAL

Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2010

2

Sumário

AGRADECIMENTOS ..............................................................................................................6 

RESUMO...................................................................................................................................7 

ABSTRACT...............................................................................................................................8 

1.

.

3.

M

.

4.

EFERÊNCIAS......................................................................................................................54 

  INTRODUÇÃO ..................................................................................................................9 

1.1.  O íon cobre em sistemas biológicos.............................................................................9 

1.2.  A homeostase de cobre em mamíferos ......................................................................10 

1.3.  Ccc2, modelo de Cu(I)-ATPase eucariótica ..............................................................17 

1 4.  Proteína cinase dependente de AMPc........................................................................21 

2.  OBJETIVOS ....................................................................................................................25 

  MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................26 

3.1.  Predição de sítios consenso em Ccc2 para fosforilação por PKA .............................26 

3.2.  Expressão heteróloga de Ccc2 e seus mutantes .........................................................27 

3.3.  Preparação das frações de membrana de células Sf9 .................................................28 

3.4.  Dosagem das proteínas totais.....................................................................................28 

3.5.  Eletroforese (SDS-PAGE) e Western Blotting ..........................................................29 

3.6.  Medida de atividade da PKA .....................................................................................29 

3.7.  Fosforilação catalítica ................................................................................................30 

3.8.  Fosforilação regulatória e imunoprecipitação............................................................31 

3.9.  edida de atividade Cu(I)-ATPásica ........................................................................32 

3 10.  Análise estatística...................................................................................................33 

  RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................34 

4.1.  A busca por substratos de PKA em Ccc2 ..................................................................34 

4.2.  Ação de PKA endógena em membranas de Sf9.........................................................37 

4.3.  Fosforilação regulatória de Ccc2 e seus mutantes .....................................................38 

4.4.  Fosforilação catalítica de Ccc2: sensibilidade ao ADP .............................................44 

4.5  Atividade Cu(I)-ATPásica de Ccc2 e mutantes em serina.........................................45 

4.6  Curso temporal de fosforilação catalítica de Ccc2 e mutantes ..................................49 

4.7  Considerações finais ..................................................................................................51 

R

3

A FOSFORILAÇÃO REGULATÓRIA POR PROTEÍNA CINASE A MODULA DE FORMA HIERÁRQUICA AS INTERAÇÕES INTRA- E INTERMOLECULARES DA Cu(I)-ATPase DE LEVEDURA, Ccc2 Thiago Britto-Borges Orientador: Adalberto Vieyra Co-orientador: Rafael Valverde Monografia apresentada como requisito para obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas – Modalidade Biofísica (ênfase em Biologia Estrutural) Aprovada por: ____________________________ Professora Denise Pires de Carvalho UFRJ ____________________________ Professor Rodrigo Alves Portela Martins UFRJ ____________________________ Professor Adalberto Vieyra (Orientador) UFRJ ____________________________ Professor Rafael Valverde (Co-orientador) UFRJ

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BRITTO-BORGES, Thiago A fosforilação regulatória por proteína cinase A modula de forma hierárquica as

interações intra- e inter-moleculares da Cu(I)-ATPase de levedura, Ccc2. Rio de Janeiro: UFRJ/IBCCF, 2010.

57f.; 31 cm.

Orientador: Adalberto Vieyra

Co-orientador: Rafael Valverde

Monografia (Bacharelado): UFRJ/ IBCCF/ Graduação em Ciências Biológicas –modalidade Biofísica (ênfase em Biologia Estrutural), 2010.

Referências Bibliográficas: f. 55-58. 1. Cu(I)-ATPase. 2. PKA. 3. Fosforilação regulatória. 4. Homeostasia de cobre. 5. Ciclo

catalítico. I. Vieyra, Adalberto; Valverde, Rafael. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Graduação em Ciências Biológicas – Modalidade Biofísica (ênfase em biologia estrutural) III. Título.

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Lista de Abreviações

AMPc – monofosfato de adenosina cíclico

ATP – trifosfato de adenosina

ATP7A – enzima Cu(I)-ATPase humana relacionada com a doença de Menkes

ATP7B – enzima Cu(I)-ATPase humana relacionada com a doença de Wilson

BCS – ácido batocuproíno dissulfônico

BSA – (bovine serum albulmine) albumina de soro bovino

Ccc2 – enzima Cu(I)-ATPase de Saccharomyces cerevisiae

CHAPS – 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato

DTT – ditiotreitol

DMT – (divalent metal transporter) – transportador de metais divalentes

MBDs – (metal binding domains) – domínios ligadores de metal

MRC – meio de reação comum

MOPS – ácido (3-[N-Morpholino]propanosulfônico)

Na+K+ATPase – Sódio, potássio ATPase

PMCA – Ca2+-ATPase de membrana plasmática

Sf9 – linhagem celular derivada de ovócito de Spodoptera frugiperda

TCA – ácido tri-cloro acético

TMBs – (transmembrane binding site) – sítio de ligação intramembrana

TMDs - (transmembrane domains) – domínios transmembrana

PKA – proteína cinase dependente de AMPc

SDS – dodecil sulfato sódio

SEM – (standard error of the mean) – erro padrão da média

6

AGRADECIMENTOS

A minha família, em especial meus pais e irmãos que toda a estrutura sem a qual eu não poderia nem começar a caminhar essa jornada, obrigado.

Ao professor Adalberto por ter aberto as portas do LFQB para mim e ter me aceitado como orientado. Por ter me ensinado que a natureza pode, e deve, ser vista com simplicidade e que eu não deveria complicá-la.

A professora Jennifer e o professor Marcelo, meus “pais científicos”, grandes amigos que me ensinaram o cotidiano da vida acadêmica, me auxiliaram em diversos momentos e nunca me deixaram na mão. Ao professor e camarada Gustavo, companheiro nos jogos do Vascão e do clube do cobre.

Ao professor Rafael, me ensinou tudo “da bancada”. Ao Rafa, meu melhor amigo e camarada de congressos e festas.

Ao pessoal do LFQB um grande abraço, desculpe qualquer coisa e um obrigado em especial a Priscilla minha companheira de bancada e a Juliana Dias, amiga de trabalho por quem tenho muito apreço.

Aos alunos da Biofísica, nós que achávamos que era impossível, além de possível até que foi divertido...

André, Camila, Luis Flávio, Luis Fernando, Natália, Renato e aos grandes amigos de ontem, hoje e amanhã, aturam meu mau humor cotidiano sem nem ao menos precisar.

Aos professores do IBBCF e de outros centros da UFRJ (a maioria, mas não todos) que se dedicaram muito além do que um professor é requisitado para ensinar e educar. E além disso, fizeram crescer a vontade de ser um professor também. Uma lista de professores que marcaram a minha vida, durante a graduação, seria uma lista muito extensa e por isso irei omiti-la.

A coordenação do curso de Biofísica, principalmente ao professor Paulo Bisch e Ricardo Manoel, o trabalho destas pessoas que possibilitaram que o curso pudesse existir efetivamente e hoje se tornar referência para outros cursos que se iniciam.

A todos que direta ou indiretamente participaram da minha vida.

As agências de fomento que possibilitarem nosso trabalho: FAPERJ | CAPES | CNPQ | COFECUB (França)

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RESUMO BRITTO-BORGES, Thiago. A Fosforilação Regulatória da Cu(I)-ATPase de Levedura, Ccc2, por Proteína Cinase A Modula de Forma Hierárquica suas Interações Intra- e Inter-Moleculares. Rio de Janeiro, 2009. Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas – Modalidade Biofísica, Ênfase em Biologia Estrutural). Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Dentre as diversas modificações póstraducionais, a fosforilação regulatória se apresenta como grande moduladora de processos biológicos em curtíssimo espaço de tempo. Atuando sobre macromoléculas efetoras, como ATPases transportadoras de íons, possibilita a modificação da sua localização subcelular, sua afinidade por substratos/ligantes ou sua atividade.

Cabe as ATPases transportadoras, conhecidas como P-ATPases, o transporte de íons acoplado à hidrólise de ATP com a formação de um intermediário enzima fosforilada. Este transporte possibilita o estabelecimento de gradientes de potencial eletroquímico, compartimentaliza sinalizadores intracelulares ou permite a entrega destes íons a aceptores específicos em diferentes organelas. Em função destes papéis, a regulação fina do transporte ativo constitui um dos mais críticos processos celulares.

Pouca informação existe na literatura sobre a regulação das ATPases transportadoras de cobre. Os resultados da presente monografia demonstram a dependência da ligação de cobre no domínio intramembrana da Cu(I)-ATPase de levedura (Ccc2) para sua fosforilação por proteína cinase A, além permitir propor novos sítios regulatórios e interações de longa distância entre estes sítios e Asp627, alvo da autofosforilação durante a catalise das P-ATPases.

Estes resultados acrescentam no estudo da regulação desta importante família de transportadores, as P-ATPases, que é crítica para fisiologia celular e essencial para vida.

8

ABSTRACT BRITTO-BORGES, Thiago. Regulatory phophorylation of the budding Cu(I)-ATPase, Ccc2, by protein kinase A hierarchically modulates its inter- and intra-molecular interactions. Rio de Janeiro, 2009. Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas – Modalidade Biofísica, Ênfase em Biologia Estrutural). Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Among the various posttranslational modifications, regulatory phosphorylation is considered as a major modulator of short-term biological processes. Its effect on effector macromolecules, such as ion ATPases, allows the modification of its sub cellular localization, their affinity for substrates/ligands or their biological activity.

In the P-ATPases subfamily, ion transport is coupled to ATP hydrolysis with the formation of a phosphorylated enzyme intermediate. This transport allows the establishment of electrochemical potential gradients, compartmentalization of chemical signals and enables the delivery of these ions to specific acceptors in different organelles. Within these roles, the fine adjustment of active transport is one of the most critical cellular processes.

Few reports are currently available in the literature concerning regulation of copper pumps. The results of this work demonstrate the dependency of copper in the intramembrane domain of Cu(I)-ATPase of yeast (Ccc2) for its phosphorylation by protein kinase A (PKA), in addition, allow to propose, new regulatory sites and long-distance interactions between these sites and Asp627, the target of autophosphorylation during the catalytic cycle of P-ATPases.

This results sums up to the overall knowledge of regulation of this important transporters subfamily that have a main role in cellular physiology and are essential for life.

9

1. INTRODUÇÃO 1.1. O íon cobre em sistemas biológicos

O íon cobre é considerado um metal pesado, pois sua densidade é superior a 5 g/cm³. Por

possuir um orbital d incompleto (distribuição eletrônica de Cu no estado fundamental: 4s2

3d9) ainda é classificado como um metal de transição. Em sistemas biológicos encontra-se nos

estados Cu(I) e Cu(II) e o baixo potencial redox para a transição Cu2+ + 2e- → Cu0 (+ 0,34 V)

torna o metal altamente eficiente em reações que envolvem diferentes processos de

transferência de elétrons, em todos os seres vivos, razão pela qual é um elemento traço

essencial.

O cobre é essencial em mínimas quantidades, já que sua forma livre é extremamente

deletéria para os organismos vivos. Portanto, no ambiente intracelular, o cobre se encontra

sequestrado por proteínas (metalochaperonas1) de alta afinidade pelo metal tornando-o assim

biodisponível2, sendo praticamente negligenciável a concentração do íon livre no meio

intracelular (Rae et al., 1999). A capacidade de ceder ou ganhar elétrons em reações de óxido-

redução faz com que o cobre participe também em reações de geração de radicais livres

(Halliwell e Gutteridge, 1984), além de interagir de forma inespecífica estabelecendo ligações

covalentes com átomos de resíduos de cisteína, metionina e histidina na estrutura de proteínas

(Koch et al., 1997), processos que o tornam citotóxico.

A importância biológica do cobre é a sua essencialidade na estrutura de diversas

proteínas (cuproproteínas). Além disso, o cobre participa de diversas reações enzimáticas

como a respiração celular, a síntese de neurotransmissores, o metabolismo de ferro, a síntese

1 A família das chaperonas corresponde às enzimas que participam da recuperação do enovelamento protéico, quando este ocorre de forma inadequada. Já as metalochaperonas têm função de sequestrar certos metais, sendo quelantes biológicos dos mesmos. Apesar do nome semelhante, a função das duas proteínas é extremamente distinta. 2 Diferente do conceito de disponibilidade farmacológica, o cobre é o considerado biodisponível quando associado a uma metalochaperona, sendo o cobre livre dispensável e deletério para o meio intracelular.

10

de pigmentos e, principalmente, a proteção contra o estresse oxidativo, exercido pela

superóxido-dismutase. Assim, o cobre se apresenta essencial num vasto campo funcional em

todos os seres vivos. Contudo, a compreensão dos mecanismos controladores da sua atividade

biológica é relativamente recente, restando ainda elucidar importantes processos regulatórios

que modulam o funcionamento das proteínas que estão associadas à homeostasia do cobre.

1.2. A homeostase de cobre em mamíferos

Em seres humanos existem, aproximadamente, oitenta cuproproteínas. Estima-se que

grande parte deste repertório esteja envolvido na homeostase do cobre (Andreini et al., 2009),

que compreende o balanço entre ingestão, absorção, distribuição, estoque, reabsorção e

excreção. Cerca de 50% entre todas as cuproproteínas de todos os organismos vivos (Figura

1) são associadas à homeostase do metal, segundo os autores supracitados. Esta porcentagem

demonstra a importância deste processo, que é finamente regulado por diversas proteínas.

Assim é essencial que este íon seja endereçado aos componentes protéicos que o utilizam

como cofator, sem que seja encontrado no estado livre, danoso para o organismo, como acima

mencionado.

Em mamíferos, duas enzimas homólogas estruturais são encarregadas de transportar

ativamente o cobre as expensas da hidrólise de ATP. Estas duas enzimas são codificadas pelos

genes ATP7A e ATP7B, que possuem a informação genética para expressão das proteínas

associadas à Síndrome de Menkes (ATP7A) e Doença de Wilson (ATP7B), respectivamente.

Ambas são doenças genéticas provenientes de mutações nos genes ATP7A e ATP7B, dando

origem às desordens genéticas de Menkes e Wilson. São síndromes que levam a perturbações

no metabolismo de cobre e que têm sido de modo geral, ignoradas pela comunidade médica e

científica em razão de sua baixa prevalência. Enquanto o acometido pela Síndrome de

11

Figura 1. Distribuição das cuproproteínas de função conhecida. Metaloproteoma in silico de 57 organismos

representativos entre bactérias, archeas e eucariotos. Enquanto 8% destas cuproteínas têm função estrutural, 48%

são enzimas que dependem do cobre como cofator. Quase a metade do total de enzimas está envolvida com o

controle dos níveis e o endereçamento do metal. Adaptado de Andreini et al., 2009.

12

Menkes dificilmente atravessa a infância, o portador da Doença de Wilson apresenta

distúrbios crônicos, que podem se manifestar apenas na idade adulta, requerendo tratamento

com quelante de cobre por toda a vida. Ambas as doenças se apresentam com fisiopatologias

e sintomatologias complexas, variando de caso a caso e de forma ainda não elucidada,

dependendo da mutação ocorrida, como foi exemplificado no estudo de Gromadzka e

colaboradores (2005).

Estas ATPases participam da absorção e distribuição do cobre entre os diferentes

órgãos e tecidos de mamíferos. Em humanos adultos, o cobre contido nos alimentos ingeridos

atravessa o trato gastro-intestinal, num complexo mecanismo representado na Figura 2.

Apesar do mecanismo molecular da absorção de cobre ser considerado um tema em aberto

(Kaplan e Lutsenko, 2009) sabe-se da presença de um transportador de metais divalentes

(Dmt1), um forte candidato para o transporte do cobre na face apical do enterócito, além do já

conhecido fenômeno endocítico, responsável por parte da absorção de outros nutrientes. Após

atravessar a membrana apical, o cobre é entregue ao seu receptor solúvel, uma

metalochaperona que poderá ter diversos destinos subcelulares. Atox1 é a metalochaperona

que, em humanos, endereça cobre para Cu(I)-ATPase ATP7A, que por sua vez, disponibiliza

o metal para a via secretória (como mais bem descrito a seguir), permitindo o subsequente

transporte para a corrente sanguínea (associado a proteínas de baixa afinidade e aminoácidos)

e sua transferência para as células do fígado, que o internalizam através da permease Ctr1.

Este orgão é o centro de controle homeostático do cobre; nele o metal pode ser adicionado à

proteína transportadora solúvel ceruloplasmina — que possui também importante atividade

ferroxidase — o maior carreador de cobre em humanos e que, em consequência disto, é o

grande responsável pelo aporte de cobre a outros tecidos. O excesso de cobre do organismo é

13

secretado do fígado para a bile graças à atividade da outra ATPase humana, ATP7B, que

transfere ativamente o cobre citoplasmático para vesículas que depois o externalizam,

permitindo sua excreção na bile. O gene que codifica para ATP7B se localiza no

cromossomo 13, existindo cerca de uma centena de mutações já documentadas para tal gene.

Das diversas manifestações clínicas decorrentes da Doença de Wilson a mais comum é a

falência hepática, mas distúrbios neurológicos e comportamentais também podem ser

observados como efeitos decorrentes da toxicidade do metal depositado no tecido nervoso.

Um dos sinais clínicos presentes em todos os pacientes com manifestações neurológicas da

Doença de Wilson são os anéis de Kayser-Fleischer, que revelam a deposição do metal na

córnea devido à incapacidade da bomba em disponibilizar o cobre na via secretória. Esta

mesma incapacidade, no fígado, leva a outras manifestações clínicas, como baixo nível de

ceruloplasmina sérica e aumento do cobre hepático, que culmina no estabelecimento de um

quadro de cirrose. Esta doença ocorre com maior frequência que a Síndrome de Menkes e

atinge uma a cada 40 mil pessoas.

Já a Síndrome de Menkes, relacionada com o gene ATP7A, é recessiva e ligada ao

cromossomo X. Por isso é mais comumente encontrado em homens, já que em mulheres os

genes em ambos os alelos deveriam estar mutados para a ocorrência da Síndrome, sendo

também muito mais rara que a Doença de Wilson (estima-se um caso a cada 250 mil – 350

mil nascidos vivos). Pacientes acometidos por esta Síndrome possuem deficiência na entrega

de cobre para metaloproteínas e na secreção do metal do enterócito para a corrente sanguínea,

devido a restrições na atividade de ATP7A. Sinal disto é o aumento de cobre em enterócitos

do intestino delgado, células da barreira hematoencefálica, túbulos proximais renais e na

placenta do feto afetado. O acúmulo do metal nestes tecidos contrasta com sua ausência em

tecidos efetores. Assim, o cérebro do paciente de Menkes contém 2% de todo o cobre do

organismo (Mercer et al., 2002), enquanto o normal encontra-se em torno de 35% do

14

Enterócito

Núcleo

Mitocôndria  

Cuproproteínascitosólicas

Cuproproteínascitosólicas

Figura 2. Modelo de absorção de cobre no enterócito de mamíferos. O cobre atravessa a membrana que separa o lúmem do intestino do meio intracelular do enterócito de forma ainda desconhecida. Em seguida, o cobre se liga a uma cuprochaperona que o endereça até ATP7A e atravessa do meio intracelular para o sangue de maneira dependente da permease Ctr1. Ctr2 e ATP7B estão, possivelmente, envolvidos com o oferecimento do cobre em vesículas intracelulares. TGN: trans Golgi network; CTR1 e CTR2: permeases de cobre; ATP7A e ATP7B: Cu(I)-ATPases. Modificado de Kaplan e Lutsenko, 2009

15

total. Portanto, este paciente sofrerá de diversos males relacionados à ausência de atividade

das cuproproteínas, levando-o-a morte na primeira década de vida (a Síndrome de Menkes se

apresenta em vários graus de severidade) devido à má formação cerebral e a outros defeitos

neurológicos e vasculares. Em síntese, as doenças de Menkes e de Wilson representam a

manifestação de dois extremos de alteração do metabolismo de cobre: a deficiência em

transportar o cobre para a corrente sanguínea e fornecê-lo aos diversos tecidos (Doença de

Menkes) ou o acúmulo do excesso de cobre no tecido responsável por sua excreção, além de

deposições localizadas (Doença de Wilson), estando os sintomas diretamente associados com

a distribuição destas ATPases pelo organismo humano (Figura 3).

Outras pequenas modificações no metabolismo de cobre ainda não foram bem

exploradas e elas parecem estar relacionadas com a ingestão. Estima-se que mais de um

quinto da população tenha uma ingestão aquém do necessário (International Copper

Association, 2009), enquanto em outros grupos culturais a utilização de utensílios de cobre

aumenta a ingestão do mesmo, o que poderia alterar o seu metabolismo em nível hepático,

especialmente em casos de alcoolismo e outras doenças. Sabe-se, ainda, que este íon e as

Cu(I)-ATPases humanas, estão envolvidos em processos patológicos, dentre eles a

neurodegeneração — esclerose lateral amiotrófica, Alzheimer, Parkinson e doenças priônicas

vastamente revisados na literatura científica — além de estarem envolvidos nos processos de

angiogênese (Lowndes et al., 2009), hipertensão arterial (Qin et al., 2008), metabolismo de

lipídios (Huster et al., 2007) e inflamação (White et al., 2009) o que leva a hipotetizar que

refinados e eficientes mecanismos de regulação devem participar na regulação do

metabolismo do cobre, especialmente nas suas etapas mais críticas, como as que envolvem as

ATPases transportadoras do metal.

16

Cobre Ingesto

Bloqueado na doença de Menkes

Bloqueado na doença de Wilson

•Pulmão•Placenta•Coração•Glândula mamária

Intestino

Sangue

Cérebro

Intestino

Fígado

Figura 3. Distribuição das Cu(I)-ATPases no organismo humano. ATP7A está envolvida com a absorção

intestinal de cobre e na entrega de cobre em tecidos (virtualmente todos os tecidos). ATP7B (hepática e

intracerebral) é responsável pela excreção do metal em certos compartimentos. Alguns tecidos, como o rim,

pulmão, glândulas mamárias, placenta e coração, expressam as duas proteínas. CP: ceruloplasmina. Adaptado

de Lutsenko, 2007.

17

1.3. Ccc2, modelo de Cu(I)-ATPase eucariótica

Como já mencionado, as ATPases transportadoras são enzimas que acoplam a

hidrólise de ATP com a translocação de íons através de membranas que separam

compartimentos biológicos. Uma subfamília, denominada ATPases do tipo P (ou P-ATPases)

(Pedersen e Carafoli, 1987), é caracterizada por formar um intermediário fosforilado durante

o ciclo catalítico ― resultado da autofosforilação ― e tem a catálise ativada por um cátion

que ao final da reação é transportado (discute-se atualmente, mas em geral o transporte é

contra gradiente de potencial eletroquímico) para o compartimento alvo.

As ATPases de metais pesados estão classificadas no grupo I das P-ATPases

(Lutsenko e Kaplan, 1995) e dentro deste as Cu(I)-ATPases são classificadas como do grupo

B. A P1B-ATPase responsável pelo transporte de cobre em Saccharomyces cerevisiae,

homóloga as ATPases humanas, é denominada Ccc2p e aqui referida como Ccc2. Esta enzima

de 110 kDa se encontra inserida na membrana do transGolgi. A enzima possui domínios

comuns às P-ATPases além de outros característicos das P1-ATPases. Dotada de oito hélices

transmembrana, Ccc2 possui, como todas as P-ATPases, uma grande e uma pequena alças

citoplasmáticas com papel central na catálise. Além de possuir um N-terminal regulatório,

com dois domínios de ligação de metal ou MBDs (metal binding domains), contendo a

sequência CxxC, onde C corresponde aos resíduos de cisteína capazes de coordenar o íon

cobre em seus grupamentos sulfidrílicos como proposto para outras Cu(I)-ATPases

(Voskoboinik et al., 1999). No domínio C-terminal se encontra o motivo LL, já sabidamente

envolvido com a sua localização subcelular (Petris et al., 1998), e o domínio PDZ, que é

classicamente conhecido como domínio de interação, os quais permitem que as ATPases

transportadoras formem complexos supramoleculares, como por exemplo, oligomerização,

18

fenômeno já descrito anteriormente para a Ca2+-ATPase de membrana plasmática (PMCA) de

eritrócitos (Coelho-Sampaio et al., 1991) e para a H+-ATPase de

Figura 4. Diagrama esquemático do ciclo catalítico de Ccc2, a Cu(I)-ATPase de levedura. Após o termino

de um ciclo de catalise a enzima é encontrada no estado desligado do metal (estado E2). No passo (1) ocorre a

ligação de Cu(I) (estado E1) no TMBs ocasionando uma mudança conformacional que permite a ligação de ATP.

O metal é ocluído quando ocorre a transferência da fosforila γ-terminal do ATP para o resíduo Asp627 do

domínio DKTGT (passo 2). Após a formação do intermediário fosforilado de alta energia em Asp627 (E~P), a

energia potencial química da ligação acilfosfato decai na transição para E-P (Tanford, 1984) e, simultaneamente,

ocorre o transporte do Cu(I) para o lúmen do Golgi (passo 3). A enzima é finalmente defosforilada (liberação de

Pi, passo 4) e o ciclo recomeça. n: indica um número ainda não determinado de íons cobre transportados por

ciclo (Lowe et al., 2004).

19

Neurospora crassa - que formaria um hexâmero com prováveis consequências na catálise em

situações de deprivação de nutrientes (Kühlbrandt et al., 2002). Para detalhes acerca de outros

domínios e sequências ver Figura 5A.

O fenômeno de transporte ocorre de forma sequencial em etapas discretas (e

reversíveis in vitro) seguindo os passos descritos a seguir, conforme o clássico ciclo de Post-

Albers, revisado por Apell (2004) e proposto por Lowe (2004) especificamente para Ccc2

(Figura 4), e com bases em recentes detalhes estruturais obtidos fundamentalmente com a

Ca2+-ATPase de retículo sacorplasmático (Toyoshima et al., 2.000). A enzima já defosforilada

sem seu metal ligado após a finalização de um ciclo prévio de catalise (conformação chamada

E2) transita para a conformação E1, capaz de ligar com alta afinidade o íon a ser transportado.

A ligação do metal no sítio de transporte (TMBs), constituído por diversos aminoácidos de

vários segmentos intramembranares, faz com que a enzima sofra uma mudança

conformacional global permitindo a aproximação do domínio nucleotídico (domínio N), onde

se encontra ancorada a molécula de ATP para o sítio de fosforilação catalítica (domínio P;

Figura 5). A enzima pode então se autofosforilar através da transferência da fosforila γ-

terminal do ATP para o resíduo de ácido aspártico invariante entre as P-ATPases, presente na

sequência consenso DKTGT. Após a formação do intermediário enzima fosforilada de alta

energia (E1~P) com o íon ocluído, esta transita para a forma de baixa energia (E2-P) no

processo acoplado à translocação e dissociação do íon do outro lado da membrana. No passo

seguinte, uma molécula de água coordenada pela pequena alça citoplasmática da bomba

(domínio A), cliva a ligação acilfosfato em E2-P liberando Pi e levando ATPase ao estado E2,

desligada do metal e pronta a recomeçar um novo ciclo de catálise.

20

A B

S

SS

trans Golgi

Citoplasma

Lúmen do Golgi

Figura 5. Modelo estrutural e topologia de Cu(I)-ATPases. (A) Modelo pseudoatómico de CopA de Bacillus

subtilis com resolução de 17 Å (Wu et al., 2008) onde pode ser observada a região N-terminal (em violeta)

localizada entre os domínios N e A, permitindo interações regulatórias durante a catálise. Nota-se que no

constructo analisado através de crioeletromicografia foi removido o MBD da região C-terminal, típico de CopA.

(B) Domínios e topologia apresentados de Ccc2 sem organização estrutural espacial onde são mostradas as

sequências dos dois MBDs da região N-terminal em tono dos motivos CxxC, o motivo TGES da pequena alça

entre os TMDs 4 e 5, a sequência DKTGT de fosforilação catalítica (denominada também centro catalítico), a

sequência em torno do motivo típico de P1B-ATPases HP, a sequência GDGVND do domínio N, a sequência

CPC no sexto TMD.

21

Além de Ccc2, todos os componentes do metabolismo de cobre em levedura são bem

conhecidos. O transporte/distribuição do cobre em leveduras (Figura 6) se inicia no meio

extracelular: ali o cobre é reduzido [Cu(II) → Cu(I)] pelo complexo com atividade oxidases

Fre1-Fre2. Ctr1 e Ctr3 são permeases, homólogas às humanas, que permitem a entrada do

Cu(I) na célula, entregando-o para uma das chaperonas citosólica de cobre: Cox17, CCS e

Atx1. Esta última especificamente direciona o metal para Ccc2 e possibilita o transporte para

a via secretória, para incorporação do mesmo na ferroxidase Fet3, que na presença do cofator

está pronta para atuar na captação do ferro do meio extracelular.

1.4. Proteína cinase dependente de AMPc

A proteína cinase dependente de AMP cíclico (PKA) é encontrada sob a forma de um

heterotetrâmero composto por duas subunidades catalíticas e duas subunidades regulatórias.

Cada subunidade regulatória possui dois sítios de ligação para o monofosfato de adenosina

cíclico (AMPc, sintetizado a partir de ATP em uma reação catalisada pela enzima adenilato

ciclase). A ligação deste substrato ao sítio regulatório leva a uma dissociação das subunidades

regulatórias e catalíticas, permitindo que estas últimas catalisem a fosforilação de proteínas

em resíduos regulatórios. Sabe-se que a PKA possui especificidade pelos aminoácidos serina

e treonina presentes em motivos específicos, ou sequências consenso, fosforilados em

resposta a diferentes sinais intra- (Cabral et al., 2007) e extracelulares (Taskén e Aandahl,

2004). A sinalização por esta cinase é crítica em todos os níveis de organização celular

estudados até hoje.

A sequência consenso tida como substrato canônico para PKA é RRXS (onde X é um

aminoácido qualquer). Entretanto, num contexto fisiológico, outras sequências podem ser

22

Figura 6. Distribuição do cobre em Saccharomyces cerevisiae. O Cu(II) ganha um elétron através da atividade

de Fre1-Fre2 e é internalizado graças à presença das permeases Ctr1 e Ctr3. Dentro da célula o metal tem

destinos diferentes. Cada destino está associado com uma metalochaperona: Cox17 é responsável pela entrega do

cobre na mitocôndria, onde será utilizado pela citocromo c oxidase. CCS possibilita a incorporação do metal na

cobre-zinco-superóxido-dismutase. Atx1 (homóloga de Atox1) entrega diretamente o Cu(I) para Ccc2, no

transGolgi da levedura. A entrega do cobre neste compartimento possibilita a incorporação do mesmo em

diversas proteínas, como a apoferoxidase Fet3, de uma maneira dependente de Gef1, um canal de cloreto. Fet3

junto com a permease de ferro Ftr1 são as proteínas responsáveis pela entrada de ferro na levedura. Outras

cuprochaperonas servem como sensores de cobre, como por exemplo, Mac1 e Ace1 são fatores de transcrição

nucleares com função detoxificadora. Retirado de Peña (1999).

23

fosforiladas por esta cinase tendo sido determinada (Shabb, 2001) a ordem de preferência de

PKA por estas sequências: RRXS > RRXT, RKX(S/T) > KKX(S/T), KRX(S/T) > RXXS,

RXS.

Assim, RRXS é a sequência mais frequentemente fosforilada por PKA enquanto

RXXS ou RXS são substratos menos encontrados. Entretanto, não basta a existência desse

motivo para que a proteína se apresente como um substrato fisiológico da PKA. Outro

requisito para a fosforilação da sequência canônica de PKA é um resíduo hidrofóbico vizinho

o resíduo alvo da fosforilação. Além disso, deve-se levar em conta a proximidade da PKA

com a proteína que é seu substrato, a existência de um conjunto de eventos que ativem a

cinase e a acessibilidade da serina/treonina à atividade cinásica3.

Entres os efeitos possíveis resultantes da fosforilação de enzimas por cinases estão: (a)

a mudança da afinidade por um substrato/ ligante, modificando a velocidade ou a seletividade

na catálise; (b) a localização subcelular, que para proteínas membranares está diretamente

relacionada com sua atividade; (c) modificações estruturais, que possibilitariam ou aboliriam

por impedimentos estéricos para a formação de complexos supramoleculares, com outras

proteínas, por exemplo.

A fosforilação regulatória é conhecida reguladora da interação intermolecular entre

diferentes proteínas (Bonifacino e Traub, 2003) incluindo proteínas transportadoras como

aquaporina e outras. Quando fosforilada por PKA em um resíduo de serina específico, a

aquaporina interage com proteínas adaptadoras vesiculares que atuam no direcionamento para

a membrana plasmática (Katsura et al., 1997). Fenômeno semelhante ocorre com o

transportador de glicose GLUT4, cujo endereçamento também depende da ativação de uma

cinase C atípica (PKCγ/ζ) (Farese et al., 2005). A abertura dos canais de Na+ em resposta ao

3 Uma sequência RRXS num segmento transmembrana apresenta, evidentemente, dificuldades estéricas que a indisponibilizam para ser fosforilada.

24

fenômeno de despolarização, e a facilitação da metabolização lipídica pela perilipina nas

gotículas de gordura dos adipócitos, são exemplos de como a fosforilação regulatória de um

resíduo chave possibilita processos subsequentes de modificação póstraducional. Portanto,

modificações postraducionais, como a fosforilação regulatória, resulta em re-arranjos

intramoleculares da proteína alvo (como por exemplo a P-ATPase) atuando de forma

convergente ou orquestra culminando na modificação da sua função.

25

2. OBJETIVOS

Considerando que o mecanismo de regulação das P1B por cinases é ainda um campo

pouco explorado e que os processos envolvidos na homeostase do íon cobre são também

pouco conhecidos, os objetivos desta monografia foram:

• Identificar os resíduos regulatórios (fosforiláveis) por PKA presentes na Cu(I)-

ATPases de levedura Ccc2 utilizando ferramentas baseadas em redes neurais

artificiais.

• Confirmar a ocorrência de fosforilação regulatória in vitro nos resíduos preditos.

• Investigar a eventual influência desta fosforilação em etapas discretas do ciclo

catalítico de Ccc2 através de experimentos de fosforilação catalítica nos diferentes

mutantes em resíduos de serina.

• Desvendar a dependência do íon cobre na fosforilação regulatória de Ccc2.

• Propor um papel fisiológico para a fosforilação de Ccc2 por PKA.

26

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Predição de sítios consenso em Ccc2 para fosforilação por PKA

A partir da hipótese inicial de que ocorreria a fosforilação regulatória por PKA em

Ccc2, o primeiro passo foi o de procurar motivos de serina/treonina cinase que seriam

potenciais alvos da cinase. Para esta etapa utilizou-se a ferramenta de predição in silico dos

sítios potencialmente fosforiláveis: o NetPhos 2.0 (Blom et al., 1999). Este algoritmo

computacional é baseado em bancos de dados experimentais (learning sets) programados para

relacionar a sequência alvo com os aminoácidos das sequências consenso, sabidamente

reconhecidas por PKA. No caso do presente estudo a sequência de aminoácidos da proteína

Ccc2 foi confrontada com esta base de dados, o que evidenciou diversas serinas com

probabilidade predita de fosforilação acima do limiar de confiabilidade mínimo estabelecido

pela ferramenta (score4). As de maior score teórico foram escolhidas para serem mutadas; as

variantes resultantes foram expressas heterologamente em sistema de células Sf9 e ensaiadas

em experimentos de fosforilação regulatória e catalítica descritos abaixo.

A ferramenta NetPhos 2.0 possui como banco de dados as sequências sabidamente

fosforiladas derivadas de centenas de estudos. Para confirmar este resultado, foi utilizada uma

segunda ferramenta o pkaPS (Neuberger et al., 2007) que, com outra abordagem de análise,

compara uma longa vizinhança na sequência primária em torno do resíduo potencialmente

fosforilável, ao qual se atribui uma posição arbitrária zero (0). A região analisada pela

ferramenta se estende até o aminoácido -18 (no sentido N-terminal) e +23 (no sentido C-

terminal) sendo, portanto, muito maior que a reduzida região local de 4 aminoácidos. Isto

4 O limiar estabelecido é de 0,5 e, quanto mais alto o valor, maior a confiança na predição e a similaridade com outros sítios de fosforilação existentes no banco de dados alimentado pelo Phosphobase Data Bank (PDB) (http://phospho.elm.eu.org/).

27

permite que os resultados obtidos com pkaPS ratifiquem ou não, de forma mais refinada a

análise feita pelo NetPhos 2.0 para escolher possíveis alvos de fosforilação regulatória por

PKA na molécula de Ccc2.

3.2. Expressão heteróloga de Ccc2 e seus mutantes

A obtenção do gene CCC2, amplificação, sequenciamento, mutagênese sítio dirigida e

expressão heteróloga deste trabalho foram realizados no Laboratoire de Chimie et Biologie

des Métaux do CEA (Comissariat à l’Énergie Atomique), em Grenoble (FR), como resultado

de uma colaboração que existe desde 2001, apoiada pelo convênio CAPES/Cofecub e pelas

agências de fomento FAPERJ (Brasil), CNPQ (Brasil) e ÉGIDE (França). Utilizando os

resultados obtidos pela ferramenta computacional foram realizadas mutações sítio dirigidas no

gene CCC2, confirmadas a posteriori por sequenciamento do plasmídio vetor. O sistema

utilizado para expressão heteróloga da proteína nativa e mutantes foi de células de inseto Sf9

infectada com o baculovírus que contém os diferentes plasmídeos e que não será abordado em

detalhe neste texto (Lowe et al., 2004; Valverde et al., 2008).

Após a expressão das proteínas de interesse na membrana das células Sf9 foi realizada

uma preparação de membranas, como descrito na seção seguinte, contendo Ccc2 em grande

quantidade (em torno de 8% da proteína total, dependendo da preparação). Além da proteína

selvagem (Ccc2 wt), foram expressos: D627A (o ácido aspártico do centro ativo é substituído

por alanina, tornando Ccc2 incapaz de se autofosforilar), S258A, S36A, S971A e

S258A/S971A mutantes correspondentes às serinas de alto score preditas em 4.1 e, portanto

substratos com alta probabilidade para fosforilação por PKA; C583S e C585S (nas cisteínas

essenciais para o ciclo catalítico de Ccc2 e localizadas no TMBs). A expressão de Ccc2 e suas

variantes em membranas provenientes de Sf9 apresenta a vantagem de estas células possuírem

28

baixa quantidade de outras P-ATPases, que em geral têm massa molecular semelhante,

representando um ruído ao se fosforilar como o faz Ccc2, em experimentos de fosforilação em

géis.

3.3. Preparação das frações de membrana de células Sf9

As membranas, contendo Ccc2 e suas variantes, foram descongeladas e

subsequentemente sedimentadas por centrifugação (10 min a 13.000 rpm, rotor de ângulo fixo

45º, e 4°C) e suspensas em tampão de extração [KCl 200 mM, MgCl2100 mM, CaCl2 100

mM, TES-KOH 100 mM (pH 7,5), glicerol 20% (v/v), PMSF 1 mM] e centrifugadas

(50.000g, rotor 45Ti, 4°C por 30 min) como descrito em Miras e colaboradores (2001). Esta

fração foi homogeneizada em um homogenizador Potter, sofrendo nova centrifugação, na

mesma condição anterior. Este procedimento foi repetido por mais uma vez. Agora

homogêneas, as membranas sedimentadas foram suspensas em tampão de estocagem

contendo MOPS-KOH 100 mM (pH 7,0), glicerol 40% (v/v) e DTT 5 mM e, em seguida,

estocados em N2 líquido para uso posterior.

3.4. Dosagem das proteínas totais

O conteúdo de proteínas totais das membranas foi determinado seguindo o método

descrito por Lowry e colaboradores (Lowry et al., 1951) modificado, com adição de SDS (1%

m/v) para solubilização solubilizar completamente as membranas e a leitura

espectrofotométrica foi feita em 600 nm.

29

3.5. Eletroforese (SDS-PAGE) e Western Blotting

As enzimas Ccc2 ou PKA, das frações obtidas, foram imunodetectadas após a

separação em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE). As frações de

membrana foram sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em 40 μL tampão de amostra

[Tris 1,5 M (pH 8,8), glicerol 25% (v/v), SDS 2% (m/v), azul de bromofenol 0,01% (m/v), β-

Mercaptoetanol 0,05%], aplicadas em gel de poliacrilamida (gel de concentração 5% e gel de

separação 10%) e foram separadas sob uma voltagem de 60 mA/gel, utilizando a corrida do

azul bromofenol como referência. Em seguida as proteínas contidas no gel foram transferidas

para uma membrana de nitrocelulose (90 min, 350 mA).

Ccc2 foi imudetectada utilizando-se anticorpo policlonal anti-Ccc2 (Neosystem,

Strasbourg, França) (diluição 1:4.000) e anticorpo secundário conjugado a peroxidase

(diluição 1:20.000). Este anticorpo primário reconhece o epítopo

CIKATESISDHPVSKAIIRY localizado na grande alça citoplasmática da ATPase. O

anticorpo anti-subunidade catalítica da PKA (Santa Cruz Biotechnology, CA) foi utilizado na

diluição de 1:1.000 e para o secundário (conjugado a peroxidase) na de 1:4.000, reconhecendo

uma banda de aproximadamente 40 kDa. O produto da atividade de peroxidase foi detectado

utilizando-se o kit quimioluminescente ECL™ (GE Healthcare, Amersham, UK) em

autoradiograma.

3.6. Medida de atividade da PKA

Para investigar a existência de uma PKA endógena ativa nas frações de membrana

provenientes de Sf9 foi adicionada a esta preparação Histona 2B, substrato fosforilável por

esta cinase (Cabral et al., 2007). Para tal, 100 μg de frações de membrana contendo Ccc2

foram incubadas por 10 min a 30°C na presença ou na ausência de Histona 2B (1 mg/mL)

30

num meio contendo MgSO4 10 mM e MOPS-KOH 50 mM (pH 7,4) (volume final de 100

μL). A atividade cinásica de PKA foi calculada através da diferença entre a fosforilação

medida na ausência e na presença de 100 nM do inibidor específico, o peptídeo PKAi5-24

(Calbiochem, San Diego, CA) 100 nM (ou apenas PKAi). A reação foi disparada com [γ-

32P]ATP 100 μM (4,5 μCi/nmol) e parada aos 10 min com 100 μL TCA 50% (m/v). Os tubos

foram centrifugados (17.000g por 15 min, 4ºC) e os sobrenadantes foram filtrados em filtros

de celulose com poros de 0,45 μm de diâmetro e lavados com 8 mL de TCA 20% (m/v) e 12

mL de tampão fosfato 0,2 M. Estes filtros foram levados ao cintilador líquido para contagem

do 32P incorporado nas histonas como resultado da atividade catalítica da PKA presente na

membrana de Sf9.

3.7. Fosforilação catalítica

Os ensaios de fosforilação catalítica foram realizados em condições destinadas a frear

o ciclo catalítico da ATPase — preservando o intermediário fosforilado: o pH levemente

ácido, baixa temperatura e baixa concentração de ATP. 50 µg de proteínas da fração de

membranas contendo a Ccc2 ou suas variantes foram inicialmente incubadas em meio de

reação contendo BIS-TRIS-Propano 20 mM (pH 6,0), MgCl2 5 mM e KCl 200 mM seguindo

protocolo descrito anteriormente (Lowe et al., 2004). A reação de autofosforilação, a 4°C (no

gelo), foi iniciada pela adição de [γ-32P]ATP 5 µM (10 µCi/nmol) e paralisada com solução

gelada de TCA 40% (m/v) nos tempos indicados em cada experimento. Em seguida os

precipitados formados pela adição do ácido foram centrifugados por 10 min (a 4°C em rotor

de ângulo fixo 45°), lavados com água gelada por três vezes para retirar o 32Pi e o [γ-32P]ATP

ligados inespecificamente à enzima. Após a última lavagem, os precipitados foram

ressuspensos em 35 μL de tampão de amostra ácido [TRIS-Ácido fosfórico 5 mM (pH 5,8),

uréia 6,6 M, DTT 0,4 M e SDS 5% (m/v)] e aplicado em gel ácido (Weber-Osborn) 7%. Este

31

gel possui pH menor daquele do gel de Laemmli clássico, tendo o gel de concentração pH 5,5

e o de separação pH 6,5. Este pH estabiliza a ligação aspartil-acilfosfato no resíduo Asp627 de

Ccc2. Após a corrida (60 mA/gel), o gel foi exposto a uma tela (Storage Phosphor Screen,

Perkin Elmer, MA) capaz de detectar o complexo enzima fosforilada (E-32P ou E~32P),

quando revelada por um Phophoimager (STORM 860, GE Healthcare Life Sciences, CA). A

intensidade do sinal radiativo foi corrigida pelo controle de carregamento do gel, quantificado

pela coloração com corante Comassie Blue. Testou-se a sensibilidade do intermediário

fosforilado de alta energia (E~P) pela adição de ADP (10 µM) em tempos determinados. A

quantificação da fosforilação catalítica foi comparativa - e, portanto relativa – tomando como

referência 100% o fosfosinal em 32P-Ccc2 selvagem a 1 min.

3.8. Fosforilação regulatória e imunoprecipitação

A fosforilação regulatória por PKA origina uma ligação química, um éster fosfato,

distinta da formada durante a autofosforilação catalítica. Essa diferença química pode ser

utilizada para quantificar os níveis de atividade cinásica da PKA, utilizando como substrato

Ccc2, excluindo o sinal proveniente do intermediário catalítico. Entre as diferenças estão a

labilidade do intermediário catalítico (acilfosfato) ao pH básico e a sensibilidade à

hidroxilamina, enquanto que a fosforilação regulatória é resistente a estes tratamentos. No

caso da utilização do gel básico não há diferença entre o uso de hidroxilamina ou não, pois a

ligação acilfosfato no aspartato catalítico é sensível ao pH do gel de Laemmli. Assim a

fosforilação nas serinas ou treoninas regulatórias foi quantificada da mesma forma que a

fosforilação catalítica, mas utilizando-se do gel básico, que abole o sinal da fosforilação

catalítica (Valverde et al., 2008). Assim 100 μg das frações de membrana de células Sf9 eram

incubadas, por 10 min e 30ºC, em MRC [DTT 1 mM, MgSO410 mM, MOPS-KOH 20 mM

(pH 7,4)], na presença ou não de PKAi5-24 para confirmar a especificidade da reação. A reação

32

foi iniciada com [γ-32P]ATP 100 μM de ATP (2,2 μCi/nmol), e a parada ocorria após 30 min

com 10 μL de CHAPS 1% (m/v). Em seguida as frações de membrana eram sedimentadas por

centrifugação e os sedimentos eram lavados três vezes com água gelada e submetidos a

imunoprecipitação.

A imunoprecipitação ocorreu com adição de proteína A-agarose (Sigma Chemical

Co.,), que foi preparada da seguinte forma: lavada por três vezes com 1 mL de TBS e

centrifugada a 600 rpm por 1 min a 4ºC. Deste sedimento, 5 μL foram misturados com o

mesmo volume (1:1) de anti-Ccc2, para cada diferente tubo de reação. A mistura foi agitada

suavemente em vórtex por 20 min e, após este tempo, incubada com BSA 1 mg/mL e CHAPS

0.1% (m/v). A reação de imunoprecipitação foi deixada por uma noite incubando as frações

fosforiladas e anti-Ccc2/proteína A. Os imunoprecipitados foram lavados três vezes com 1 ml

de TBS, ressuspensos em 70 μL de tampão de amostra para SDS-PAGE e fervidos por 4 min

para separar as pérolas da proteína. Os tubos eram em seguida centrifugados por 2 min a

17.000g (rotor de ângulo fixo 45º) a 4ºC e 50 μL do sobrenadante contendo a Ccc2 fosforilada

foi aplicado e o gel analisado como em 3.7.

3.9. Medida de atividade Cu(I)-ATPásica

A atividade Cu(I)-ATPásica de Ccc2 e suas variantes foi ensaida medindo a liberação

de 32Pi a partir de [γ-32P]ATP em meios contendo concentrações residuais de cobre, corrigido

pela atividade medida na ausência de cobre (adição do quelante BCS) (Lowe et al., 2004). À

MRC [MOPS 20 mM (pH 6,0), K2SO4 120 mM, MgSO4 5 mM, glicerol 4% v/v e NaF 20

mM] eram adicionados [γ-32P]ATP (1 mM, 2 μCi por tubo e volume final 100 μL) e as

membranas (10 μg de proteína total). O MRC da atividade total contém concentrações

contaminante de cobre, ascorbato 1 μM (antioxidante) e Na2SO3 20 μM (redutor), que

33

mantém o metal no estado Cu(I). A atividade total foi diminuída da atividade independente de

cobre, que foi testada na presença de 250 μM ácido batocuproíno dissulfônico (BCS),

quelante do metal. Após 5 min a 37ºC, a reação foi parada com adição de 300 μL de carvão

ativado, diluído em HCl 0,1 N. Os tubos foram centrifugados a 5.000 RPM (rotor fixo 45º)

por 15 min e 100 μL do sobrenadante foram aplicados sobre papeis de filtro. Estes eram

colocados dentro de vials contendo solução cintiladora [POPOP 0,1% g/L] e finalmente

contados por cintilação líquida (Perkin Elmer).

3.10. Análise estatística

Os resultados foram comparados utilizando teste de t-student e foi estabelecido p <

0,05. A diferença estatisticamente significativa entre grupos experimentais foram denotadas

por um asterisco (*).

34

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. A busca por substratos de PKA em Ccc2

Para estudar a possível interação entre Ccc2 e PKA, inicialmente analisou-se a

estrutura primária de Ccc2 em busca de sequências consenso sabidamente reconhecidas como

substrato para esta cinase. Foram utilizadas ferramentas de bioinformática (in silico)

disponíveis na rede que se baseiam em um banco de dados (ou learning sets) construído a

partir da compilação de centenas de estudos já publicados referentes a fosforilação regulatória

(Phospho.ELM, 1999) criando uma rede inteligente. Uma destas ferramentas, NetPhos 2.0

(Blom et al., 1999) analisa estruturas primárias em busca de sequências homólogas àquelas

encontradas em peptídeos sabidamente fosforilados e já demonstrados em estudos de

espectrometria de massa. Uma versão mais atual desta ferramenta, denominada NetPhosK 1.0

(Blom et al., 2004), aprofunda esta metodologia, verificando sítios possivelmente

fosforiláveis por cinases eucarióticas específicas. Ambas as ferramentas inferem em seu

diagnóstico um score, sendo o limite mínimo de significância o score de 0,5 e o máximo 1,

que indica alta probabilidade do sítio ser fosforilado (NetPhos 2.0), ou a cinase com maior

probabilidade de estar implicada neste fenômeno regulatório (NetPhosk 1.0). Na Figura 6, os

resultados apresentados limitam a busca aos resíduos de serina de Ccc2, aminoácidos

preferidos por PKA (Shabb, 2001). Os resultados foram filtrados levando-se em consideração

as características topológicas da enzima, já que estas ferramentas não são capazes de discernir

entre as serinas posicionadas em porções citosólicas da bomba e aquelas inacessíveis a cinases

intracelulares (como quando em um dos oito domínios transmembrana ou em alças no lúmen

do Golgi). Com isso os resíduos Ser258, Ser36, Ser971 foram preditos com alto score para

fosforilação específica por PKA (Figura 6A) como Ser258, substrato para atividade cinásica da

PKA como demonstrado por Valverde e col. (2008). O posicionamento estratégico de Ser36 e

35

A

B

Figura 6. Predição de resíduos fosforilados em Ccc2 e comparação com outras Cu(I)-ATPases. Em A,

resultados da ferramenta NetPhos 2.0 (fosforilação geral) e NetPhosK 1.0 (fosforilação cinase específica) para

determinar, dentre as 82 serinas na sequência de Ccc2, os 23 possíveis substratos para PKA. Estes resultados

foram cruzados com os resultados do programa pkaPs para confirmação. Além disso, (B) utilizou-se a

ferramenta de alinhamento múltiplo ClustalW2 para alinhamento entre as sequências primárias de ATP7A

(humana), ATP7B (humana), CopA (Archaeoglobus fulgidus) e Ccc2 (gene ATU2, Sacaromices cerevisiae).

Em vermelho, Ser258 sítio de fosforilação (serina 0) por PKA (Valverde et al., 2008), resíduos positivos (azul,

posições -3 e -2 em relação a serina ser fosforilada) e um ou dois resíduos hidrofóbicos (verde, posições +1 ou

+2). A sequência de 22 aminoácidos hidrofóbicos representa o primeiro domínios transmembrana das Cu(I)-

ATPases (nem todos aqui exibidos devido à presença de gap no alinhamentos). Resultado do ClustalW2 "*"

significam resíduos idênticos na coluna de alinhamento, ":" representa uma substituição conservada e "." uma

substituição semi-conservada.

36

Ser971 (resíduo foco deste trabalho) nas regiões C e N-terminal poderiam, assim como ocorre

em outras ATPases de tipo P fosforiladas por cinases, incluindo PKA (Valverde et al., 2005),

modular o funcionamento de Ccc2 como veremos nos experimentos de fosforilação catalítica

(Figura 7). Neste experimento observa-se que a modificação de uma serina regulatória

modifica o ciclo catalítico da enzima, podendo-se atribuir, então, um importante papel para

este resíduo.

A região do entorno da sequência consenso que abriga a Ser258 predita por NetPhosK,

quando alinhada pela ferramenta ClustalW2 (Larkin, et al., 2007) com a sequência primária

de outras Cu(I)-ATPases como ATP7B e ATP7A (Figura 6B) revela uma grande conservação

desta sequência nas ATPases humanas, que dispõem igualmente dos requisitos necessários

para fosforilação por PKA. A serina correspondente a Ser258 em ATP7B, a serina 653,

igualmente posicionada na entrada da primeira hélice transmembrana (Figura 6B), quando

mutada a tirosina leva a manifestação de uma forma severa da doença de Wilson (Gromadzka

et al., 2005) o que revela a importância fisiopatológica da possível perda da fosforilação deste

resíduo numa sequência conservada altamente em eucariotos. Todavia, o estudo da estrutura

primária de CopA, a Cu(I)-ATPase de Archaeoglobus fulgidus, demonstra que esta ATPase

procariótica não apresenta uma serina equivalente a Ser258 como a em ATP7A e ATP7B

(Ser653) (Figura 6B). Sabe se que organismos procarióticos possuem níveis de regulação

postraducional menores que os níveis de eucariotos. O processo evolutivo parece ter dotado as

ATPases de organismos eucarioticos com uma maior variedade de sequências regulatórias.

A presença de uma serina fosforilável por PKA no N-terminal localizada na proximidade da

entrada do primeiro domínio transmembrana parece ser uma característica comum as P-

ATPases eucarióticas sendo também encontrada na Na+K+ATPase. Nesta bomba, a transição

entre as diferentes conformações do ciclo catalítico foi associada à capacidade de fosforilação

deste resíduo de serina por PKA (Sweadner e Feschenko, 2001).

37

Uma das ferramentas mais recentemente desenvolvidas, o programa denominado

PkaPS se faz valer da estrutura cristalina do sítio catalítico de PKA para predizer sítios de

fosforilação por esta cinase em uma proteína de interesse (Neuberger et al., 2007). Esta

ferramenta de predição compara uma faixa de 40 aminoácidos em torno da serina a ser

fosforilada com a sequência primária da proteína alvo, onde são analisadas todas as possíveis

interações intramoleculares resultantes deste ancoramento, sendo conferido um score a cada

docking hipotético. O diagnóstico de PkaPS ratifica a predição de NetPhos, indicando a Ser258

como alvo preferencial da cinase.

4.2. Ação de PKA endógena em membranas de Sf9

Com o intuito de investigar a regulação por PKA de Ccc2 expressa em células Sf9

procurou-se inicialmente a presença da cinase ancorada nas frações de membrana de células

Sf9. Em todas as preparações de membrana testadas ― contendo cada uma das variantes

protéicas superexpressas ― foi detectada PKA endógena que co-migra com a subunidade

catalítica α da PKA humana purificada de aproximadamente 40 kDa (Figura 8, lane na

extrema direita). A detecção de PKA endógena em frações de membrana é condizente com a

sua associação a AKAPs constitutivas de Sf9. Mesmo a preparação derivada de células Sf9

transfectadas com plasmídio vazio (MOCK) expressa a cinase e, portanto, independe da

transfecção do gene CCC2 selvagem, mutante ou a da transfecção por um plasmídio vazio,

permitindo concluir que a infecção viral não interfere no nível de transcrição da PKA

endógena ou da maquinaria que a ancora as membranas de células Sf9. O reconhecimento das

cinases de inseto e de humano pelo mesmo anticorpo indica que esta proteína é conservada

mesmo em distâncias filogenéticas grandes. Em leveduras, três isoformas de PKA são

conhecidas, denominadas Tpk 1, 2 e 3, possuindo um papel redundante podendo ser

38

substituídas pela expressão da PKA de mamíferos em leveduras knock-out para as três

isoformas endógenas (Zoller et al., 1991).

Para testar se este pool de PKA ancorada à membrana se encontra ativa, a fração

contendo a ATPase selvagem foi submetida a ensaio de fosforilação de histona 2B na

presença ou não do peptídeo inibidor de PKA, PKAi5-24 (Figura 9). As histonas são

conhecidas como alvo de fosforilação mediada por diversas cinases, incluindo PKA. Observa-

se que 40% da atividade cinásica endógena pode ser atribuída a PKA (inibida na presença de

PKAi5-24). A parcela de fosforilação insensível ao peptídeo inibidor resulta da atividade de

outras cinases igualmente ancoradas a estas frações de membrana, de acordo com a

capacidade de AKAPs em associar complexos moduladores que incluem não apenas PKA,

mas outras cinases e fosfatases (Tasken e Aandahl, 2004). Este resultado demonstra a

presença de um pool membranar de PKA que, in vivo, agiria em conjunto com a PKA

citosólica recrutada mediante diversos estímulos que elevam a concentração de AMPc em

organismos eucarióticos. O papel da PKA citosólica seria então distinto do papel da PKA

membranar pelos diferentes alcances e gamas de substratos disponíveis para estes dois pools

(Carstens e Weller, 1981).

4.3. Fosforilação regulatória de Ccc2 e seus mutantes

Ao longo dos últimos cinco anos, nosso grupo demonstrou o papel fundamental de

duas cisteínas no sexto domínio transmembrana de Ccc2 com papéis distintos no transporte

do íon cobre através da membrana (Lowe et al., 2004). Posteriormente, determinamos a

dependência de cobre para o fenômeno de fosforilação regulatória de Ccc2 catalisado por

PKA (Valverde et al., 2008). No entanto, a presença de domínios distintos de ligação para o

39

Figura 7. Curso temporal da fosforilação catalítica de Ccc2 e S258A. Preparações de membrana contendo

Ccc2 ou o mutante S258A foram incubadas com [γ-32P]ATP 5 µM (como descrito em Material e Métodos) e a

reação paralisada com TCA 40% em diferentes tempos entre 15 s e 10 min. A, painel superior, autoradiogramas

representativos do sinal de fosforilação revelado por um phosphoimager; painel inferior, gel corado com

comassie blue como controle de carregamento do autoradiograma respectivo. B, Representação gráfica da

fosforilação apresentada em “A” (painel superior) corrigida pelo carregamento da proteína (painel inferior).

Ccc2 wt e S258A: média de sete experimentos ± S.E.M. (Valverde et al., 2008). Pode-se observar que enquanto

Ccc2 tem uma cinética natural para uma P-ATPase, composta por uma fase de fosforilação rápida que dura até

um minuto e meio seguida de defosforilação. Entretanto a enzima mutante S258A, que perde a regulação nesta

serina, possuí um acúmulo dos intermediários fosforilados mesmo em tempos iniciais, mantendo-se assim por

até 10 min.

40

metal, localizados tanto nas cisteínas presentes em cada um dos dois MBDs da região N-

terminal, quanto àquelas do domínio transmembrana, levantando a possibilidade de que

ambos os sítios estejam envolvidos na acessibilidade da ATPase a PKA. Os resultados

apresentados a seguir nos permitem identificar o papel fundamental da correta coordenação

do cobre no TMBs para que a fosforilação regulatória atinja níveis máximos.

A fração de membrana expressando Ccc2, os mutantes S258A, C583S e C585S foram

desta forma ensaiadas quanto a sua capacidade de fosforilação por PKA endógena conforme

descrito em Materiais e Métodos (Figura 10). Observamos que Ccc2 é fosforilada por cinases

presentes na fração de membrana de Sf9 sendo 40% desta fosforilação inibida por PKAi5-24,

resultado que reforça o perfil da atividade cinásica evidenciado anteriormente (Figura 9). O

nível reduzido de fosforilação regulatória endógena observada nos mutantes C583S e C585S

quando comparado aquele alcançado pela ATPase selvagem (além de da perda de

sensibilidade à adição do peptídeo inibidor de PKA) nos trazem informações valiosas a

respeito da dependência de cobre da fosforilação regulatória que podem ser resumidas da

seguinte maneira: o cobre deve estar corretamente coordenado no sítio C583PC585 para que a

ATPase seja susceptível à fosforilação por PKA. Como demonstrado anteriormente ― e re-

apresentado na presente monografia (Figura 10) ― o mutante S258A é insensível tanto à

adição de PKA exógena quanto ao inibidor de PKA endógena, resultado que aponta para o

papel central da serina 258 no controle da acessibilidade da ATPase a fosforilação por PKA.

Os níveis de fosforilação regulatória observados nos mutantes do domínio CPC são

equivalentes àqueles apresentados por S258A. A coordenação não correta do cobre no sítio

CPC poderia exercer influência negativa na fosforilação da serina 258, resíduo chave no

acesso de PKA as suas sequências consenso de fosforilação como visto anteriormente

(Valverde et al., 2008). A conformação assumida por ambas as variantes C583S e C585S ao

longo de seu ciclo catalítico prejudicaria a acessibilidade da Ser258 por mecanismos de

41

Figura 8. Imunodetecção da subunidade catalítica de PKA ancorada nas frações de membrana de células

Sf9 contendo diferentes variantes de Ccc2. Vinte µg de fração de membrana de células Sf9 infectadas com

MOCK (plasmídio vazio), ou expressando D627A, Ccc2, S258A, C583S e C585S foram submetidos à separação

por SDS-PAGE 15% e Western Blotting. A membrana de nitrocelulose foi então incubada com anticorpo

policlonal específico para a subunidade catalítica de PKA (40kDa). PKAαcat, subunidade catalítica purificada da

PKA utilizada como controle positivo.Observa-se que todos as preparações possuem a subunidade catalítica da

PKA e que estas comigram com a enzima purificada, utilizada como controle positivo.

42

comunicação intramolecular de longa distância. Observamos também que, além de serem

inacessíveis a fosforilação por PKA, os níveis detectados de fosforilação regulatória total para

os mutantes no sitio CPC e S258A são menores do que os da ATPase selvagem e resultantes

da ação de outras cinases endógenas das frações de células Sf9 ainda não identificadas.

Segundo Lowe e col. (2004), os resíduos Cis583 e Cis585 são essenciais para a correta

coordenação no TMBs e seu transporte do cobre durante o ciclo catalítico. Enquanto o

mutante no resíduo Cis583 é incapaz de realizar a transição CuE~P → E-P (conforme

demonstrado em seguida), liberando Cu(I) no lúmem do Golgi, o mutante no resíduo Cis585

liga o Cu(I) de uma forma cataliticamente ineficiente, o que impossibilita a autofosforilação

por ATP (Lowe et al., 2004), não sendo formado um intermediário fosforilado. A semelhança

detectada no comportamento de C583S e C585S em relação a S258A (Figura 11) levanta a

possibilidade de que a fosforilação regulatória seja dependente de cobre. Até onde chega

nosso conhecimento não são conhecidas cinases dependentes ou reguladas por cobre, muito

embora fosfatases sejam inibidas por concentrações de cobre consideradas patológicas

(Hanahisa et al., 1998). Os resultados desta monografia indicam um mecanismo específico de

modulação da fosforilação regulatória por PKA, que aconteceria só quando a enzima se

encontra ligada ao cobre (CuE) no sítio de transporte intramembrana, o que, até onde chega

nosso conhecimento, não foi descrito na literatura de P-ATPase. De forma interessante, o

mutante D627A também apresenta perda na sensibilidade a PKAi5-24, mas mantém um nível

de fosforilação regulatória idêntico ao controle. Estes resultados nos levam a crer que a

dinâmica de fosforilação regulatória mediada por PKA em Ccc2 necessita de um ciclo

catalítico completo, corroborando a idéia de que as duas modalidades de fosforilação

diferentes estejam interconectadas por algum fenômeno estrutural na enzima enovelada, como

sugerido anteriormente para a Na+K+ATPase (Sweadner e Feschenko, 2001), para a qual o

43

Figura 9. Atividade cinásica endógena em frações de membrana de células Sf9. 100 µg de frações de

membrana de células Sf9 contendo Ccc2 foram incubadas, como descrito em Material e Métodos, na presença ou

não de 1 mg de Histona 2B (primeiro e segundos grupo de colunas, respectivamente) e na presença ou não do

inibidor específico de PKA (colunas pretas e cinzas, respectivamente), PKAi5-24 100 nM conforme mostrado na

ordenada. A fosforilação foi iniciada pela adição de [γ-32P] ATP 1 mM (2 µCi/nMol) e parada após 30 min com

TCA 40%. Média ± S.E.M de três experimentos. Existe atividade cinásica nesta fração de membrana e 40%

desta fosforilação pode ser atribuída a PKA. Além disso, na ausência das histonas, pode-se evidenciar a

fosforilação de proteínas associadas as membranas.

44

evento de fosforilação regulatória por PKA foi associado ás mudanças conformacionais

inerentes ao ciclo catalítico desta bomba.

4.4. Fosforilação catalítica de Ccc2: sensibilidade ao ADP

O padrão de fosforilação regulatória apresentado pelos mutantes S258A e C583S e

C585S, demonstrado acima, abriu a possibilidade de que, assim como acontece com S258A

(Valverde et al., 2008), C583S teriam o intermediário fosforilado acumulado em uma etapa

comum do ciclo catalítico como reflexo impropriedades na conformação de ambos mutantes.

Através de experimentos de fosforilação catalítica testamos a sensibilidade destes

mutantes ao ADP. Este experimento nos permite identificar em que etapa há o acúmulo no

ciclo catalítico das ATPases mutantes: no intermediário fosforilado de alta ou no de baixa

energia. Anteriormente, mostramos que o ciclo catalítico S258A se acumula em etapa

fosforilada de alta energia (E~P), sendo a fosforilação da Ser258 por PKA um importante

modulador do passo CuE~P → E-P + Cu+ (Valverde et al., 2008). Os experimentos aqui

apresentados mostram uma gradativa diminuição da transição entre intermediário fosforilado

de alta e baixa energia do ciclo catalítico de C583S, em etapa do ciclo sensível ao ADP. Este

resultado mostra que a mutação de Cis583 assim como a mutação de Ser258 acarreta um

acúmulo do intermediário na mesma etapa do ciclo, CuE~P, sendo dificultada a liberação do

íon cobre pela ATPase (Figura 11). Todavia, este efeito é mais pronunciado em C583S do que

em S258A, mas o perfil semelhante observado para ambos nos permite concluir que um dos

efeitos da não fosforilação de Ser258 em S258A seria o de afetar o transporte do cobre a partir

do domínio CPC ― como acontece no mutante C583S ― em fenômeno de interação

molecular de longa distância entre o sítio de fosforilação regulatória no N-terminal e o

domínio de transporte. Esta idéia é reforçada pela observação de que a fosforilação regulatória

45

apresenta os mesmos níveis nos três mutantes (S258A, C583S e C585S) que, nos três casos é

insensível a PKAi (Figura 10).

Observamos que a ATPase selvagem apresenta gradativa queda no nível de

fosforilação catalítica assim como uma perda na sensibilidade ao ADP no curso de 3 min de

reação (Figura 11), resultado que é compatível com o de uma ATPase capaz de ciclar

normalmente e se defosforilar a medida que a pequena quantidade de ATP fornecida é

exaurida no meio de reação. Tanto S258A como C583S são gradativamente mais suscetíveis

ao ADP, decorrente do acúmulo da enzima na etapa CuE~P e não na etapa E-P, reforçando a

hipótese de que C583S seria incapaz de transportar o metal permanecendo o ciclo bloqueado

no passo CuE~P.

4.5 Atividade Cu(I)-ATPásica de Ccc2 e mutantes em serina

Com a finalidade de analisar ciclo completo de Ccc2, realizamos ensaios de hidrólise

de ATP medindo a formação de fosfato inorgânico (Pi) no meio de reação. Cada uma das

frações de membrana expressando as diferentes variantes de Ccc2 criadas foi ensaiada. Não

há diferença estatisticamente significativa entre a atividade medida para Ccc2, S36A, S258A

e S971A (Figura 12). O mutante S258A/S971A por sua vez hidrolisa três vezes mais ATP.

Como não se observa qualquer diferença entre as atividades dos mutantes S258A, S971A e a

detectada para Ccc2, podemos concluir que na ausência de fosforilação regulatória mediada

em Ser258, outro sitio de fosforilação regulatória posicionada Ser971 é capaz de controlar a

etapa de quebra do intermediário fosforilado (passo 4 na Figura 4).

A adição de PKAi (Figura 12, barras cinza) inibe a liberação de Pi somente no caso do

mutante S971A. A falta do efeito do inibidor na ATPase do mutante duplo, bem como os

níveis três vezes mais altos observados para sua atividade ATPásica são fortes indicativos de

46

Figura 10. Sensibilidade da fosforilação regulatória de Ccc2 e mutantes ao peptídeo inibidor específico de

PKA. Membranas de células Sf9 contendo Ccc2 ou um dos mutantes foram incubadas, como descrito em

Matérias e Métodos, na presença ou não de 100 nM de inibidor específico de PKA (barras cinza e pretas,

respectivamente), PKAi5-24, conforme mostrado na ordenada. A, Auto-radiograma representativo do sinal de

fosforilação em cada uma das variantes protéicas. B, Coloração com prata do gel apresentado em A utilizada

como controle de carregamento do experimento. C, Representação gráfica do sinal de fosforilação (A) corrigido

pelo carregamento (B). Média ± S.E.M ao menos 3 experimentos. Observa-se que Ccc2 pode ser fosforilada e

que 40% dessas fosforilação é atribuída a PKA. Os mutantes S258A, C583S e C585S são fosforilados em níveis

aparentemente idênticos de Ccc2 na presença do inibidor PKAi.

47

que o passo de hidrólise do intermediário fosforilado é controlado pela fosforilação de Ser971,

desde que Ser258 esteja presente, a resistência ao PKAi no mutante duplo reforça a hipótese de

que a fosforilação de Ser258 governaria também a hidrólise do intermediário fosforilado via

uma influência sobre Ser971, a interação entre domínios distantes da estrutura primária da

ATPase modularia o acoplamento entre hidrolise de ATP e transporte de cobre.

A fosforilação por PKA no domínio C-terminal de ATPases do tipo P já foi observada

no caso da Ca2+-ATPase de membrana plasmática (PMCA), onde a fosforilação pela cinase

leva a ativação desta bomba ao diminuir a sua interação com o domínio autoinibitório

(Penniston e Enyedi, 1998). Esta fosforilação mediada por PKA no domínio C-terminal destas

ATPases, poderia afetar a pequena alça citoplasmática entre os TMBs 4 e 5 (Figura 5),

domínio considerado responsável por carrear a molécula de água durante a etapa de hidrólise

no ciclo catalítico (Figura 4). A fosforilação por PKA em Ser971 desempenharia desta forma

um papel importante na última etapa do ciclo catalítico controlando a hidrólise, num processo

dependente de PKA que envolveria a fosforilação em Ser258, como se observa ausente no

mutante S258A/S971A (Figura 13). Outra possibilidade seria a de que Ser971 também poderia

ser fosforilada por outra cinase, diferente de PKA, igualmente ancorada às frações de

membrana de células Sf9, cuja sequência consenso de fosforilação guarde semelhança com a

sequência canônica reconhecida por PKA. É importante salientar que a aproximação da

estrutura tridimensional da proteína enovelada em seu estado nativo, pode influenciar a

especificidade de um sítio de fosforilação, ou ainda, criar outros aparentemente inexistentes

quando analisada apenas a estrutura primária de uma proteína. Em estudo recente, a atividade

de ATP7B foi descrita como sensível à adição do inibidor da caseína cinase, sem que nenhum

resíduo específico tenha sido atribuído a este fenômeno (Vanderwerf et al., 2001).

48

Figura 11. Sensibilidade do intermediário fosforilado (CuE~P) detectado para Ccc2, S258A e C583S ao

ADP. Cinquenta µg de frações de membrana contendo Ccc2, S258A ou C583S foram fosforiladas com 5 µM [γ-32P] ATP em intervalos crescentes de tempo entre 1 e 3 min, após o qual foi adicionado ADP para uma

concentração final de 10 µM. A reação foi paralisada pela adição de TCA 40% após 10, 20 ou 30 segundos após

a adição do ADP. A, autoradiogramas representativos da fosforilação catalítica de cada uma das variantes após 1,

2 e 3 minutos (painéis superiores, intermediários e inferiores, respectivamente). B, Representação gráfica da

fosforilação apresentada em “A” corrigida pelo carregamento da proteína (não representado). A diferença entre o

primeiro ponto e os seus seguintes, em cada série, mensura os níveis dos intermediários enzima fosforilada de

alta energia, no caso da proteína selvagem o que se vê é uma diminuição. Pode-se observar que, com o decorrer

do tempo, os níveis de intermediário de alta energia aumentam nos mutantes S258A e C583S, neste último o

efeito muito

49

4.6 Curso temporal de fosforilação catalítica de Ccc2 e mutantes

O estudo da velocidade de formação do intermediário fosforilado em Asp627 fornece

informações valiosas a respeito do funcionamento das P-ATPases. A etapa de

autofosforilação em Asp627 (passo 2, Figura 4) é limitada pela correta coordenação do metal

no domínio de ligação transmembrana, já que, dadas as altas concentrações intracelulares de

ATP, este parece estar sempre associado ao domínio N da bomba (Figura 5).

Para averiguar se as mutações nos resíduos de serina potencialmente fosforiláveis por

PKA influenciariam a etapa de formação do intermediário fosforilado em Asp627, os mutantes

foram submetidos a ensaios de fosforilação catalítica em intervalos curtos de tempo. Neste

tipo de experimento, pode-se ter uma estimativa da rapidez da bomba em diferentes etapas do

ciclo catalítico. Seja na interconversão das defosfoenzimas E + Cu+ → Cu+E, pré-requisito

para a autofosforilação de Asp627, ou no próprio passo de autofosforilação da ATPase.

Os experimentos com os mutantes S971A e S258A/S971A (Figura 13B e C

respectivamente) apresentam perfis cinéticos de fosforilação que os distinguem em relação a

Ccc2 selvagem. Enquanto S971A se fosforila muito lentamente, o duplo mutante

S258A/S971A se acumula em etapa fosforilada, e o pool de fosfoenzima formada atinge

níveis superiores aos detectados para Ccc2. O perfil cinético da ATPase do mutante duplo se

assemelha ao previamente detectado para o mutante S258A (Valverde et al., 2008) e contrasta

com o perfil observado com S971A. A ausência de fosforilação em Ser258 anula o efeito

inibitório da autofosforilação causado pela ausência de fosforilação em Ser971. Uma vez que

observamos anteriormente que o duplo mutante apresenta atividade hidrolítica aumentada,

podemos postular que a Ser258 influencia a etapa de fosforilação e regula a velocidade de

50

Figura 12. Atividade ATPásica de Ccc2 e seus mutantes. Dez µg de preparações de membrana contendo Ccc2

ou um dos mutantes (S258A, S971A ou S258A/S971A) foram empregadas em ensaios de hidrólise de ATP

seguindo o protocolo descrito em Materiais e Métodos. PKAi5-24 (100 nM) foi adicionada aos tubos onde

conforme indicado. Média de ao menos três experimentos ± S.E.M ou apenas média, quando o n = 2. As

atividades da proteína selvagem, de S258A e S971A são estatisticamente iguais. A atividade ATPásica de

S258A/S971A é 3 vezes maior que atividade da proteína selvagem. Malgrado a ausência de comprovação

estatística, mutante S971A é o único sensível a presença da PKA, no ensaio de atividade ATPásica.

51

hidrólise na última etapa do ciclo catalítico de Ccc2 exercendo o papel de serina master sobre

Ser971 (Figura 4). Podemos concluir que as modificações estruturais proporcionadas pela

fosforilação regulatória seriam acumulativas e concertadas, sendo resultado de eventos de

comunicação intramolecular de longa distância na proteína enovelada.

4.7 Considerações finais

Apesar do aumento sensível no número de estudos abordando a regulação

póstraducional de P1-ATPases, a literatura disponível ainda pode ser considerada escassa,

sendo majoritariamente focada no controle da localização subcelular destes transportadores

(Cobbold et al., 2002; Veldhuis et al., 2009). O primeiro relato foi do grupo de pesquisa de

Lutsenko (Vanderwerf et al., 2001) que determinou a fosforilação de ATP7B como primeiro

relato de fosforilação desta subfamília de P-ATPases. Foram propostas duas classes de

fosforilações: uma basal (de natureza constitutiva) e outra responsiva ao aumento da

concentração de cobre (rápida e reversível). Além disto, os autores propõem, através do uso

de um inibidor, que a caseína cinase seria responsável pela fosforilação sensível ao aumento

dos níveis de cobre, que modificariam conformacionalmente ATP7B tornando-a mais

suscetível à ação da cinase. Esta fosforilação culminaria na redistribuição da ATPase do

transGolgi até compartimentos vesiculares. A hiperfosforilação da enzima estaria então

associada com sua reciclagem entre o transGolgi e a vesícula, enquanto o mapeamento dos

aminoácidos (serinas, treoninas ou tirosinas) ainda não era acertado.

Outro grupo (Voskoboinik et al., 2003) propôs para mesmo modelo (basal e

hiperfosforilado com o aumento de cobre citosólico) de fosforilação para ATP7A, ensaiando

tanto in vitro como in vivo. Este grupo já havia determinado (Voskoboinik et al., 2001) o

aumento da autofosforilação com o aumento da concentração do metal. Sobre a fosforilação

52

regulatória o grupo indica a sensibilidade a γ-fosfatase e identificou apenas fosforserinas no

mapa de fosfopeptídios. Além disso, demonstra a necessidade do N-ter (de função regulatória

e indispensável para fosforilação catalítica) para a hiperfosforilação cobre dependente.

Levantou-se a hipótese que o íon cobre estaria modulando atividade de cinases e fosfatase.

Esta hipótese, apesar de válida, caracterizaria o fenômeno como inespecífico.

Entretanto, o uso de mutantes nas cisteínas do TMBs no ensaio de fosforilação

regulatória indicou que estes sofrem fosforilação no mesmo nível dos mutantes em Ser258. O

requerimento da coordenação do cobre no TMBs para fosforilação regulatória é algo inédito

na literatura. O N-ter é essencial para o funcionamento catalítico da ATPase e sua função

regulatória depende das cisteínas nos motivos CXXC, capazes de coordenar o cobre.

Atualmente, sabe-se que este N-ter é fosforilado por uma cinase (Bartee et al., 2009). Em

2009, foram feitos os fosfoproteomas das Cu(I)-ATPases humanas (Veldhuis et al., 2009;

Pilankatta et al., 2009) e, apesar de diversas fosfoserinas terem sido detectadas, as posições

relativas na ATPase não foram determinadas.

O primeiro relato de fosforilação resíduo-específico (verificado por mutagênese sítio

dirigida) e dependente de PKA (curva dose resposta para o inibidor específico) foram dados

por nosso grupo (Valverde, 2007). Além disso, foi proposto que esta fosforilação estaria

influenciando o mecanismo da ATPase, modificando o mecanismo do transporte, de uma

forma ainda não elucidada.

A fosforilação regulatória, a luz de resultados recentes, é a modificação postraducional

mais atuante no âmbito das ATPases do tipo P. Por isso há de se postular a interação direta

entre estes dois elementos essenciais para a célula. Além disso, a compreensão da estrutura,

mecanismo e regulação das novas P1B-ATPases é parte importante para o entendimento da

fisiologia dos elementos traços essências.

53

Figura 13. Cinética rápida de fosforilação catalítica (CuE~P + E-P) para Ccc2, S971A e S258A/S971A.

Cinquenta µg de frações de membrana contendo Ccc2, S258A ou C583S foram fosforiladas com 10 µM [γ-32P]

ATP em intervalos crescentes de tempo conforme descrito em Materiais e Métodos. Painel superior,

autoradiogramas representativos da fosforilação catalítica de cada uma das variantes nos intervalos de tempo

representados no eixo da ordenada. Painel inferior, sinal de 32P-E corrigido pelo carregamento da proteína (não

representado). Média ± S.E.M de três experimentos. Para tempos curtos, S971A apresenta níveis diminuídos de

intermediário enzima fosforilada em relação a enzima selvagem, já S258A/S971A se acumula na forma de

enzima fosforilada, mesmo pra tempos muito curtos.

54

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