A Genomic Regulatory Network for

Development

Davidson EH, et al.

Science 2002 295(5560):1669-1678. Review.

מבואהתפתחות של "תוכנית" הגוף נשלטת בצורה קשיחה •

ע"י רשת גדולה של גנים רגולטורים.

מאמר זה דן ברשת כזאת של התמיינות המסודרם •והאנדודרם בעובר קיפוד הים.

הרשת נגזרה מאנליזות חסר-הפרעה רבות, בשילוב •עם מטודולוגיות חישוביות, מידע גנומי, אנליזת

ציס-רגולטורי ואמברולוגיה מולקולרית.

הגישה הקודמת של האמבריולוגיה התמקדה •בתיאור שלבים שונים של התפתחות העובר.

הגישה במאמר זה מנסה לשלב את כל הנתונים •לכלל מערכת.

המערכת מתוארת למעשה כרשת רגולטורית של •קודקודים שבה כל קודקוד מסמל גן (או תוצר שלו)

וכל קשת מסמלת רגולציה.

ההסתכלות היא כמו הסתכלות על מעגל במיתוג. •כלומר כל קודקוד יכול לקבל קלט ולעבד אותו,

שימוש במעגלי משוב וכו'.

גישת תיאור המערכת או "מיתוג" בביולוגיה

גן מטרה

פקטור שיעתוקפקטור שיעתוקאזורי הבקרהאזורי הבקרה

שער "מיתוגי-ביולוגי"שער "מיתוגי-ביולוגי"

ה"ארכיטקטורה" של הרשת מגלה היבטים ספיציפיים •לגבי התפתחות קיפוד הים וכלליים של התפתחות.

לדוגמא כיצד תאים ספיציפיים מחוללים את התהליך •שקובע את גורלם, ומדוע התהליך מתקדם באופן "קשיח"

ומובנה בגנום.

•

הגישה הישנה למחקר הייתה של בחינת גן אחד או מעט גנים •בזמן מסוים, שיטה שלא מתאימה לרשת מתואמת של הרבה

גנים רגולטורים.

במערכת הציס-רגולציה כל אחד מקודקודי הרשת, מעבד •קלט אינפורמציה "קינטי": עליה וירידה של פעילות של

פקטורי טרנסקריפציה אליהם הוא מגיב

. cis-regulatory analysis ניתן לבחון את קשרי הרשת ע"י •, זיהוי אתרי המטרה שלהם, controlכלומר, זיהוי אלמנטי ה-

ובדיקה ע"י ניסוי של החשיבות הפונקציונלית של אתרי המטרה.

ההתפתחות מתקדמת כרצף של מצבים שמוגדרים באופן •

מרחבי של ביטויי גנים רגולטורים. זה הוא התהליך שבכל איזור מרחבי של האורגניזם מתחיל לבטא סט אחר של גנים

רגולטורים.סט גנים א'

סט גנים ב'

1סט גנים א2סט גנים א

סט גנים 1ב

האותות המרחביים שמפעילים את הספיציפיקציה הם •"ליגנדי איתות" שנשלחים ע"י תאים אחרים ששולחים אותם

עקב המצאות בעצמם במצב כלשהו של ספיציפיקציה.

בנוסף לאיתותים בין תאיים, מולקולות בעלות חשיבות •רגולטורית של האם (להלן אותות מטרנליים) מועברים

בביצית ומפוזרים באופן מרחבי עם ההתבקעות.

מאיפה באים הקלטים ?

הייחודיות של כל רשת רגולטורית התפתחותית הינה •במודלים האופרטיביים הציס-רגולטורים.

הגנים הללו פעמים רבות לא משמשים רק כקשר פשוט בין •קלט לביצוע אלא גם כמעין מעבדים – לדוג' הרבה פעמים

גורמי שעתוק חייבים להיות and 2הם משתמשים בלוגיקת –קשורים באותו הזמן לאתר ציס-רגולטורי בדנ"א על מנת

שהטרנסקרפציה תצא לפועל.

ייחודיות הרשת הרגולטורית

אין עדיין שום מקרה שבו הצליחו למפות קישוריות סיבתית • לתהליך עקרי של התפתחות של יצור הגנומימהרצף

בילטרלי (דו צדדי).

אחת מהסיבות לכך שלא הצליחו היא שרב מערכות •תהליכי ההתפתחות שנחקרו באופן אינטנסיבי הם של

התפתחות של אברים של מבוגרים.

בהתפתחות אברי מבוגרים, רקמה של איבר מתפתחת •מרקמה שהיא בעצמה כבר מפותחת – הדבר הזה מקשה

שנוצרו מדפוסים מורכביםמשום שהוא יוצר דפוסים . קודמיםמורכבים

קצת על התפתחות קיפוד הים לעומת מחקרי התפתחות אחרים

הגן מקודד לחלבון פולי-פונקציונלי גדול שמופרש לחלל •העוברי של המעי האמצעי (הלא מפותח).

תתי 2 השלבים המוקדמים והמאוחרים נשלטים ע"י •איזורים שונים של הרצף הרגולטורי.

כל אחד מתתי האיזורים מכיל כמה מאות בסיסים. • פקטורי שעתוק שונים. 9ביחד הם עוברים רגולציה ע"י

endo16הגן

שימושים של מערכת מודל שלב ראשון של רשת

רגולטורית

טקטורה י מודל מושלם של הרשת יאפשר לראות את הארכ•הבין-גנית שלה, ואת תהליכי עיבוד המידע של כל צומת

)ברשת (קלט ופלט ושיטה המטרה העקרית היא להגיע למודל שלם של הרשת •

הרגולטורית.

החוקרים הגיעו למודל כזה לגבי ספיציפיקציה של • בעובר של קיפוד הים. אנדומסודרםה 

במונחים אבסולוטים מספר הגנים במערכת הוא די •), אבל הם רק מעט מאד 50-מעט כגדול (כיום ידועים כ

.8500מהגנים שמבוטאים בעובר, שמוערכים כיום בכ-

: דרכים להתייחס למודל כזה2יש •מקבילה להסתכלות מהצד . התייחסות אחת ה1

הגנומי-. פונקציונלי

וזה למעשה להסתכל על המעגל בשלמותו: הקלטים שנכנסים לכל את כלבו זמניתבמודל מראים התאים כלאלמנט ציס-רגולטורי. ואת זה מראים לגבי

נקודות הזמן של תהליך ההתפתחות. ובכל זה מראה את הארכיטקטורה הגנטית של הרשת ומנבא

.את אתרי המטרה

. ההתייחסות השנייה מהצד של ביולוגיה של התפתחות. 2או למעשה להסתכל על הקונפיגורציה הרגעית של

הרשת בתא מסויים בזמן מסויים:

המבט מסתכל בעיקר על האינטרקציות שקורות בגרעין נתון בזמן נתון. וזה מסביר מדוע גנים מבוטאים או לא,

בזמנים שונים בתאים שונים.

למה קיפוד ים?

הביולוגיה של עובר קיפוד הים מציעה יתרונות טבעיים •לאנליזה של רשת רגולטורית של התפתחות.

לא הרבה צעדים רגולטורים מפרידים בין שלב תחילת •הזיגוטה לבין ההפעלה הטרמנלית של גנים של התפתחות

ודיפרנציאציה.

עובר קיפוד הים מפתח צורות מוקדמות פשוטות ביותר עם • סוגי תאים. בניגוד להתפתחות המורפולוגית 10-12רק כ-

המסובכת של גרסאות "ילדותיות" של רקמות מבוגרים בהתפתחות בחרקים ובבעלי החוליות.

בנוסף על כך גם תריסרים של גנים •התפתחותיים-רגולטורים שובטו. תבניות הביטוי העובריות

תוארו כבר, והגנום כבר די אופיין יחסית. קיימות גם ספריות .BAC, וספריות cDNAשל

הביציות גדולות וצלולות – מאפשרות בקלות לראות •פנוטיפים.

ניתן להשיג את הביציות בכמויות גדולות בקלות.•

הכי חשוב למטרה הנוכחית עובר קיפוד הים מהווה •מערכת בעלת תפוקה גבוהה לביצוע אנליזת ציס-רגולטורי

.gene transferע"י

ספיציפקציית האנדומסודרם בעובר קיפוד הים

של עובר קיפוד הים מתפתח מאב endomesodermה- •קדמון בקצה הדרומי של העובר המוקדם.

של העובר מכיל בסופו של דבר את endomesoderm ה- • (מצבור התאים שמתפתח לרקמת mesenchymeה-

), כמה סוגי תאי micromereהחיבור או לדם שמקורו ב-mesoderm .אחרים ואת שכבת אנדודרם של המעי

רב שכבת האנדודרם של המעי ורב התאים המסודרמים • תאי ביקוע 6 -8מתפתחים כצאצאים של טבעת של

" כל שאר שכבת האנדודרם של המעי veg2שנקראים "

".veg1 תאי "אחות" שנקראים "8מתפתחים מ-

לוונדר (סגול בהיר) - skeletogenic

lineage. theסגול כהה -

small micromere precursors of adult

mesoderm aboralאפור כהה-

ectoderm

endomesodermal veg2 lineage that later gives rise to endodermירוק בהיר -

endodermצהוב -

mesodermכחול בהיר - (שכבה חיצונית של "הפה")oral ectodermאפור בהיר-

אנדודרם, veg2 בלסטולה. ספיציפקציה של mesenchyme שעות - שלב ה- 24

ושל תאים מסודרמליים הושלמה. תאים). הציור מתאר את 800 שעות – שלב הגסטלורה המאוחרת (בערך 55

הפריסה של כל התאים האנדומסורמיים בערך בחצי הדרך של המורפוגנזה (עיצוב צורת האורגניזם במהלך התפתחותו)

שעות – חתך 10אופטי אמצעי של בלסטולה

מוקדמת בערך לאחר ביקוע

שביעי

שעות – כנ"ל 15 9לאחר כ-ביקועים

באב הקדמון של VEG2לספציפיקציה של צאצאי קלטים:2האנדומסודרם יש צורך ב-

סיגנל אחד מועבר מהמיקרומרים לאבות הישירים של .4-6 בביקוע הveg2טבעת ה

מיקרומרים אבות ישירים veg2של

סיגנ1ל

בגרעיני התאים cateninוהשני הוא הצטברות של cateninהמתאימים שהם התאים האנדומסודרמים.

וההצטברות שלו Tcfהוא קופקטור של פקטור השעתוק בגרעין היא אוטונומית ולא תלויה בסיגנל.

catenin

עם זאת התאים האנדומסודרמיים די מהר מפעילים , כאשר עם הקשרו Wnt8גן שמקודד לליגנד-סיגנל

(מעין signal transductionלתאים שכנים מעורר רשת סיגנלים – פקטורים וכ"ו) שגורמים להצטברות

בגרעין. כלומר מעין catenin/Tcfגדולה יותר של-.לולאה מגבירה

catenin

Wnt8

אנליזה של הרשת

הרשת הציס-רגולטורית של ספיציפקצית האנדומסודרם •שהוצגה במאמר הופקה בחלקה מהרבה אנליזות "הפרעה",

בהן ביטוי של הרבה גנים רגולטוריים ומערכות סיגנל שונו לשם הניסוי.

האפקט על הרבה גנים אחרים נמדדו ע"י ראקציית מדידה • זרחני. PCRבזמן אמת של

על מנת שקלט ייחשב בעל חשיבות האפקט של ההפרעה •צריך היה להיות שונה בסדר גודל של שלושת מונים. כלומר

300%,< 30%קצב שעתוק גן המטרה היה צריך להיות >ממדידות הביקורת.

Pmar 1

GFP

חלבון )זוהר)

pmar1איזור קשירה של גן

mRNA שעבר fusion

תרגום

GFP

חלבון )זוהר)

נשאר זוהר בחושך...(GFP)מכבים את האור ורק ה

Pmar 1

GFP

חלבון )זוהר)

pmar1איזור קשירה של גן

mRNA שעבר fusion

תרגום Morphilino oligonucleotide.

)מכבים את האור וחושך...(

רב הקשרים ברשת שנתגלו במחקר הנ"ל מבוססים על • morpholino-substitutedהפרעות שסילקו פונקציות, כמו

antisense oligonucleotides

או חסימה של כל ספיציפקציית האנדומסודרם או •המסודרם.

שמקודד fusion mRNA( החוקרים השתמשו גם חיברו (• Engrailedשמקודד לדומיין של הגן mRNAלגורם שעתוק ו

(גן שעושה רפרסיה). החיבור גרם לכך שבכל איזור שבו הפקטור נקשר הוא גורם להפסקת השיעתוק שם.

•mRNA ים שמקודדים לגנים שאותם רצו החוקרים- לבדוק, הוחדרו לביצה בכמות שתגביר בסדר גודל את

הכמות המקורית ולעיתים אפילו בכמה סדרי גודל.

יש לזכור שלמעשה ההגברה קטנה יותר, מכיוון שיש • החיצוני.mRNAהתכלות של ה-

לבד, אנליזה של הפרעות לא יכולה להבחין בין השפעות •ישירות ולא ישירות.

ניתן להשתמש באנליזה ציס-רגולטורית על מנת לבדוק אם •השפעה היא ישירה או לאו.

נסיונות אחרים שנעשו הם נסיונות לגרום לביטול ההפרעה • שמקודד לפקטור אחר שיכול להיות mRNAע"י הוספת

מתווך של הפקטור שפגענו בו.

בתהליך שחוזר על עצמו, התוצאות מהאנליזות נבדקו כנגד •המודל, תוכננו עוד ניסויים, המודל שונה בהתאם לתוצאות

וכן הלאה.

, מכשיר חדש לשם Netbuilder המודל נבנה ע"י התוכנית •בנייה מודל חישובי שמאפשר סימולציה ע"מ לבדוק האם

הקשרים שנבנו מתאימים לתוצאות.

מאמץ גדול במיוחד הושקע בגילוי גנטי על מנת לגלות את •הגנים שמסתתרים תחת האינטרקציות האמברולוגיות,

ולהוסיפם לגנים שגולו כבר שמעורבים בספציפקציה של האנדומסודרם.

נעשו מספר ניסויים בהם הופרעה ספציפקצית •האנדומסודרם ע"מ שיהיה חומר למבחני

הפחתה-היברידיזציה רגישים שנועדו לשימוש עם macroarrays.

התוצאות עברו "דיגיטליזציה" ואובחנו ע"י תוכנה שמעבדת • שנועדה לשם אנליזה של BioArrayתמונה שנקראת

differential macroarray screens

נמצאו גנים רגולטורים חדשים וגם גנים שמקודדים לחלבוני •דיפרנציאציה באנדודרם ובמסודרם.

כנראה שרב הגנים הרגולטורים שקשורים לשעתוק, • שעות 24שמעורבים בספציפיקציה של האנדומסודרם עד

כעת ידועים.

עם זאת, רק מספר קטן של גנים דיפרנציאיצים של •האנדומסודרם, גולו וזאת מכיוון שרב המבחנים נעשו על

שלבים מוקדמים של תהליך הספציפיקציה.

אנליזה ישירה של ציס-רגולטורי , חיונית ע"מ לבדוק את •הקשרים הצפויים של הרשת. אבל המשימה של למצוא את

האלמנטים הללו ברשת דרשה שיטות אחרות מאשר השיטות המסורתיות של חיפוש באופן ניסויי סביב הדנ"א מסביב לגן

שאנו מעוניינים בו.

ע"מ לפתור את הבעיה הזאת החוקרים פנו לאנליזת רצף •Interspecific:

ביצעו השוואה בין האיזורים של הגנים המבוקשים בין הזן ובין הזן S. purpuratusשעליו עשו את כל הניסוי -

Lytechinus variegatus שמתפתח בדרך דומה. על מנתלמצוא איזורים דומים סביב הגנים. האיזורים הללו חשודים

אכן מצאו את חלקם gene transferכאיזורי רגולציה ובמבחני כאיזורי רגולציה.

.FamilyRelations החיפוש נעשה ע"י התוכנה •

חבילות תוכנה:3סה"כ נעשה שימוש ב- •Netbuilder, FamilyRelations, BioArray

http://sea-urchin.caltech.edu ניתן להוריד אותן ב:/software

קדם סיכום

אנליזה של רשת רגולטורית התפתחותית יכולה •להיעשות על כל אורגניזם שניתן לעשות לו בקלות

וביעילות החדרת גנים.

כמו כן כל שאר השיטות המולקולריות המשניות •זמינות.

האנליזה דורשת תערובת של טכנולוגיות ורמה •חדשה של שיתוף פעולה בין ביולוגים של מערכות

למדענים חישוביים.

על מנת להבין מערכת רגולטורית והאינטרקציות שבונות אותה, חייבים להשתמש במודלים

חישוביים:ארגון ניסויי המשך.1.

בדיקת כל שלב של בניית המודל.2.

בדיקת עקביות. 3.

שילוב תוצאות ניסוייות עם הארכיטקטורה הקיימת 4.של הרשת ע"י אמצעים של סימולציה.

מודל הרשת מקשר בין המאפיינים הללו ועוד •מאפייני התפתחות ותכונות של תהליך התפתחות

האנדומסודרם ישירות לגנום.

המודל אם כן נותן תרשים של התוכנית המורשת • של התפתחות, אבל התוכנית היא לא המכונה.

רשת הרגולציה של הדנ"א חיה יחד עם עוד •מערכות מרובות חלקים אשר ביחד מרכיבות את

המכונה.

מערכות אלו מפעילות את הפונקציות •הביו-כימיקליות, מייצרות מסלולי העברת סיגנל, אשר בסה"כ גורמות לשינויים בתאים ביולוגיים

לקרות.

גיוסם נשלט על ידי "מתגים" של שעתוק אשר •מחברים אותם אל מערכת הרגולציה הגנומית.

אין ספק כי התפתחות של תוכניות גוף מורכבות •. Bilaterianהיא תכונה של ה-

קידוד של מערכת ההתפתחות היא תכונת רגולציה •גדולה וחשובה בפונקציה של הגנום.

היה ברור כבר הרבה זמן כי האבולציה של תוכנית •הגוף קרתה על ידי שינוי בתוכניות הגנומיות.

כעת זה ברור כי אנו צריכים להתחשב בזה •. במושגים של שינוי ברשתות רגולטוריות

יש פחות או יותר את אותה bilateriansלכל ה- •"קופסת כלים" גנטית.

אנליזה של רשת נותנת את האמצעים להתמקד על •התוצאות המדויקות של השוני בשימוש בגנים הללו.

על מנת לפתור את שאלת אבולוצית התפתחות •תוכנית הגוף יהיה עלינו:

. ללמוד כיצד שינויים ארכיטקטוריים ברשתות 1ההתפתחות יכולות להוסיף בכל שלב אבולוציוני,

ועדיין לשמור על אפשרויות הביצוע של מה שהיה .קודם

. להתייחס לרשתות רגולטוריות כ-"לוחות ציור 2של תבניות" אבלוציוניות של אינטרקציות

רגולטוריות אשר בזה אחר זה נכתבות בו תבניות רגולציה חדשות.

הבנת מה הוא בע"ח הניתן לנו, כולל אנחנו. •היא למעשה:

הבנה איפה כל זיקה של הרשתות ההתפתחויות עלו,

אילו צורות חיים אחרות חולקות איתנו את אותן הזיקות,

אילו הן חדשות ואילו הן עתיקות.

רעיונות לדיון

גנים, הציעו כל 30,000כאשר גילו כי לאדם יש רק • alternativeמיני הסברים למורכבות הגדולה שלו כמו

splicing, .'וכו

מאמר זה יכול לתת הסבר לכך: ניתן לראות כי •תוספת לינארית של גנים יוצרת עלייה

אקספוננציאלית בסיבוכיות הרשת.

ייתכן וניתן ללמוד גם שיטות חישוביות חדשות •מהביולוגיה!