A próxima geração em preparação e análise de amostras de N … · 2015. 3. 20. · 5 [SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLICANOS] PROCESSAMENTO DE DADOS Software UNIFI® e MassLynx

[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLICANOS]

A próxima geração em preparação e análise de amostras de N glicano

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[SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLICANOS] [SOLUÇÕES PARA ANÁLISE DE GLICANOS]

ANÁLISE DE GLICANOS

LIVRES

COMPOSIÇÃO DOS MONOSSACARÍDEOS

Com

plex

idad

e do

mét

odo

Aumento das informações

ANÁLISE DA SUBUNIDADE

MAPEAMENTO DE GLICOPEPTÍDEOS

ANÁLISE DE PROTEÍNA INTACTA

União de técnicas complementares para otimizar a análise de glicanosA Waters oferece abordagens completas, baseadas em fluxo de trabalho, para analisar glicoproteínas em todos os níveis estruturais.

¡ Definição de perfis das glicoproteínas ¡ Caracterização e monitoramento de glicanos livres

¡ Análise da subunidade ¡ Composição dos monossacarídeos

¡ Mapeamento de glicopeptídeos

2

E se... a análise de N glicanos livres pudesse

ser otimizada e altamente sensível?

Finalmente, um fluxo de trabalho inteligente sem

limitações.

5


Fluxo de trabalho da análise de proteína intacta

INJEÇÃO NA COLUNA PARA ANÁLISE LC

Cartucho de dessalinização MassPREP™ ou Coluna ACQUITY UPLC® BEH C4 de 300 Å, Mistura de padrões de proteína MassPREP

e Kit de análise de massa intacta

ANÁLISE EM LCCOM DETECTOR TUV

Sistemas ACQUITY UPLC

CONFIRMAÇÃO DE MASSA COM QTof MS

Xevo® G2-XS QTof MSSYNAPT® G2-Si HDMS

GLICOPROTEÍNA

Padrão de verificação de massa

de mAb intacto

Fluxo de trabalho da análise da subunidade

Fluxo de trabalho do mapeamento de glicopeptídeos

Fluxo de trabalho da composição dos monossacarídeos


Coluna ACQUITY UPLC Protein BEH C4 de 300 Å


Coluna de amida de fase reversa ou BEH Waters

RÓTULO COM UM FLUORÓFORO

ANÁLISE EM LCCOM DETECTOR UV

Sistemas Alliance® HPLC ouACQUITY UPLC

ANÁLISE EM LC COM DETECTOR TUV

ACQUITY UPLC

Injeção na coluna para análise LC

Coluna ACQUITY UPLC BEH C18, de 130 Å, 1,7 μm,

2,1 x 100 mm

DIGESTÃO ENZIMÁTICA IdeS COM REDUÇÃO OPCIONAL

REDUÇÃO, ALQUILAÇÃO E DIGESTÃO DE ENZIMAS

Fragmentos de peptídeos glicosilados e não glicosilados

LIBERAÇÃO DE MONOSSACARÍDEOS

Hidrólise com ácido

GLICOPROTEÍNA

GLICOPROTEÍNA

GLICOPROTEÍNA


de mAb intacto


de mAb intacto

3

5


PROCESSAMENTO DE DADOS

Software UNIFI® e MassLynx® massa

147700 148000 148300 148600 148900 149200

F0G/F0

G

F1G/F0

G

F2G/F0

G ,F1G/F1

G

F2G/F1

G

F2G/F2

G

Espectro MS ESI-TOF deconvolutado

m/z2000 2500 3000 3500

+51

+48+54

Espectro MS ESI-TOF de um mAb

CONFIRMAÇÃO DE MASSA UTILIZANDO QTof MS

Xevo G2-XS QTof MS SYNAPT G2-Si HDMS

ANÁLISE DE MAPEAMENTO DE PEPTÍDEOS UTILIZANDO

QTof MSXevo G2-XS QTof

SYNAPT G2-Si HDMS

Análise em LCcom detector FLR

Sistemas Alliance HPLC ouACQUITY UPLC


Software MassLynx


Software MassLynx e UNIFI


Software Empower® 3

0,00

0,06

0,12

0,18

0,24

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 min

A21

4

Fc/2 + glicanos

LC Fd’

50

45

40

35

30

25

20

EU

15

10

5

0

10 15 20 25 30 min-5

1

2

3 4 5

6

1. N-acetilglucosamina (GlcNAc)2. N-acetilgalactosamina (GalNAc)3. Galactose (Gal)4. Manose (Man)5. Glucose (Glc)6. Fucose (Fuc)

A

B

5 10 510 20 25 30 35 40 45 min

Glicopeptídeos

BPI de MS

Aumentado em 6x

Aumentado em 4x

UV em 280 nm

Resultados

Resultados

Resultados

Resultados

Glicanos N rotulados como RapiFluor-MS

monitorados utilizando um Sistema

ACQUITY UPLC H Class Bio configurado

com detecção de massa FLR e ACQUITY

QDa para confirmação de estruturas

conhecidas e dados de massa para picos

removidos.

0

240

480

min10 15 20 25 30

Inte

nsid

ade

0

1,6x106

3,2x106

min10 15 20 25 30

EU

MS

FLR


MONITORAMENTO DE ROTINA

Explore as possibilidades

Em função do aumento da eficiência de ionização e maior afinidade de prótons do RapiFluor-MS, a detecção

de massas dos glicanos com o Detector ACQUITY QDa finalmente se tornou possível.

¡ Fornece sensibilidade inigualável para detecção de FLR e MS.

¡ Oferece maior confiança com a confirmação de massa dos picos de FLR.

¡ Tempos de análise de cromatografia mais curtos com a definição de perfis de glicanos MS para o desenvolvimento rápido do processamento.

¡ Pode ser facilmente integrado com os fluxos de trabalho UPLC existentes que atendem aos padrões GMP com o software Empower 3.

Monitoramento de glicanos com o Sistema ACQUITY UPLC H Class Bio com detecção FLR e ACQUITY QDa

13

6

Apresentamos o Kit N glicano GlycoWorks RapiFluor-MS

A Waters, líder em inovações para análise bioterapêutica, reinventou o fluxo de trabalho para análise de N glicanos

livres. O novo reagente, RapiFluor-MS™, inclui a capacidade de ionização necessária para maximizar as informações

geradas pela detecção MS. O novo fluxo de trabalho agiliza a deglicolisação e otimiza a rotulagem.

É o fluxo de trabalho inteligente que os laboratórios biofarmacêuticos estavam esperando: não é mais necessário

escolher entre uma ferramenta de rotulagem “rápida” e sensibilidade para a espectrometria de massas; não há mais

processos complicados e trabalhosos propensos a erros.

Com a Waters, não é necessário comprometer a velocidade e a sensibilidade na preparação de amostras, há somente

ganhos na confiança de seus resultados analíticos.

QUANTIFICAÇÃO DE FLRDESEMPENHO DE MS VELOCIDADE/RENDIMENTO

Junte-se à Waters e pense em alternativas para a análise de glicanos livres.


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Software UNIFI, MassLynx e Empower

GLICOPROTEÍNA

N GLICANOS LIVRES

ANÁLISE EM LCCOM DETECTOR FLR

Sistemas Alliance HPLC ou ACQUITY UPLC

CARACTERIZAÇÃO OU CONFIRMAÇÃO DE MASSA

Detector ACQUITY® QDa® Xevo G2-XS QTof MSSYNAPT G2-Si HDMS

0,0E+0

1,2E+6

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 min

0,0E+0

1,2E+6

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 min

MS

FLR

Resultados

N GLICANOS LIVRES POR

DEGLICOLISAÇÃO

GlycoWorks™ Rapid PNGase F e tampão e tensoativo

RapiGest™ SF

GLICANOS ROTULADOS

Rotulagem como GlycoWorks

RapiFluor-MS

GLICANOS PURIFICADOS

Plate ou cartuchos GlycoWorks HILIC µElution


Coluna Amida BEH de glicanos, Padrão de teste de desempenho de glicanos e Gráfico de calibração de

dextrana

GLICOPROTEÍNA

Padrão de verificação de massa de mAb

intacto

Como funciona?

A análise de N glicanos livres é uma técnica com muitas informações,

mas que envolve procedimentos complicados e preparação de amostras.

Quando os glicanos são liberados por PNGase F, é necessária a

rotulagem para promover a separação e a detecção eficazes. O novo

protocolo da Waters agora oferece um fluxo de trabalho versátil para:

¡ Identificação de glicanos ¡ Estrutura de glicanos

¡ Monitoramento de glicanos

Veja a ciência por trás dos NOVOS Reagentes GlycoWorks RapiFluor-MS, que proporcionam novos recursos para análise, monitoramento e caracterização de glicanos. Assista ao vídeo em waters.com/SeeTheScience

N GLICANOS LIVRES

GlycoWorks Rapid PNGase F e tampão e tensoativo

RapiGest SF

GLICANOS ROTULADOS

Rotulagem como GlycoWorks RapiFluor-MS

GLICOPROTEÍNA

Padrão de verificação de massa de mAb

intacto

GLICANOS PURIFICADOS

Plate ou cartuchos GlycoWorks HILIC µElution

E se a preparação de amostras de N glicanos livres fosse rápida e simplificada?

¡ Prepare amostras rotuladas de N glicanos livres com facilidade e rapidez.

¡ Reduza os erros e a perda de amostras.

¡ Treine facilmente os analistas e transfira métodos em seu laboratório.

TRÊS ETAPAS, 30 MINUTOS

< 15 minutos

10 minutos

5 minutos

ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3

Assista a um breve vídeo de demonstração, com 2 minutos, sobre o Kit N glicano GlycoWorks RapiFluor-MS.

www.waters.com/RapiFluorMS


8


E se você pudesse obter sensibilidade incomparável de FLR e MS?

¡ Aumento da compreensão sobre a qualidade do produto com a caracterização aprofundada dos picos que não foram identificados anteriormente utilizando a quantificação da fluorescência obtida com uma resposta MS equivalente.

¡ Agilização na tomada de decisões.

¡ Identificação facilitada de glicanos ligados a N pouco abundantes.

SENSIBILIDADE INCOMPARÁVEL

Fluorescência de 14x e resposta MS de 160x em comparação com os rótulos tradicionais (2-AB e procainamida). Fluorescência de 2x e resposta MS de 1.000x em comparação com os rótulos instantâneos.

*Com base em valores teóricos publicados.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Des

empe

nho

rela

tivo

(%)

52,5

7,00,1 0,6

30,0*

7,0*

Fluorescência MS (BPI)

2X

1000X

3X

160X14X

Rotulado como AB instantâneo

Rotulado como RapiFluor-MS

Rotulado como 2-AB

Rotulado como procainamida

NH

O

NH

NNH

O

N

Glicano

NH

O

NHGlycan

O

NH2

NHGlycan

NH2O

NHGlycan

O

NHN

Proc

aina

mida*

RapiFluor

-MS

2-AB

AB in

stan

tâne

o

RapiFluor

-MS

2-AB

AB in

stan

tâne

o

Proc

aina

mida*

Veja como é possível levar possibilidades extraordinárias à sua análise de rotina.

www.waters.com/XevoG2XS

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0,0E+0

1,2E+6

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 min

0,0E+0

1,2E+6

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 min

MS

FLR

A maior eficiência em ionização do RapiFluor-MS proporciona fluorescência quantitativa e detecção de massas com o Detector ACQUITY QDa.

E se os dados de massa estivessem facilmente disponíveis a qualquer momento para a análise de glicanos de rotina?

¡ Maior confiança no monitoramento de perfis de glicano com a detecção de massas de rotina.

¡ Obtenha informações sobre as alterações de fabricação com execução rápida das amostras.

¡ Resolução rápida do desenvolvimento de métodos e de problemas de transferência.

CONFIANÇA

Detalhamento do perfil N glicano de um mAb

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Assista a um breve vídeo de 1 minuto sobre como levar o poder da detecção de massas para seu laboratório.

www.waters.com/QDa


Kits completos para preparação de amostras

Descrição Nº de peça

Kit básico N glicano GlycoWorks RapiFluor-MS

O kit contém: Módulo de deglicolisação GlycoWorks, Módulo de rotulagem GlycoWorks, Módulo de limpeza GlycoWorks, Módulo de coleta de amostras GlycoWorks, Coluna ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide, 1,7 μm, 2,1 x 150, Concentrado de fase móvel: formato de amônio

176003635

Kit N glicano GlycoWorks RapiFluor-MS

O kit contém: Módulo de deglicolisação GlycoWorks, Módulo de rotulagem GlycoWorks, Módulo de limpeza GlycoWorks, Módulo de coleta de amostras GlycoWorks

176003606

Informações sobre kits para análise de glicanos

Padrões e acessórios

Descrição Qde. Nº de peça

Gráfico de calibração de dextrana RapiFluor-MS 50 μg/vial 186007982

Padrão de teste de desempenho de glicanos RapiFluor-MS

Total de 400 pmol/vial 186007983

Análise de glicanos em solução de formato de amônio — 186007081

Calços do coletor a vácuo — 186007986

Espaçador do coletor de pressão positiva do Kit N glicano GlycoWorks RapiFluor-MS

— 186007987

176003635 176003606

Saiba como rotular glicanos em seu intervalo de almoço

Quer ver como o Kit N glicano RapiFluor-MS e o detector de massas ACQUITY QDa podem ajudá-lo a melhorar a análise de glicanos? Mostraremos como em um seminário no local durante o intervalo de almoço. Para obter mais informações ou agendar um seminário “Almoço e rotulagem”, acesse waters.com/GlycansForLunch

Seminário Almoço e rotulagem

11

12

5,5 10,0 15,0 20,0 25,0 min

Glicano de 10 µg de proteína 2-AB convencional

Preparação de amostras em 1,5 dia

RapiFluor-MSGlicano de 0,1 μg de proteína Preparação de amostras em <1 hora

1: TOF MS ES+BPI

6.93e6

1: TOF MS ES+BPI

6.93e6

z/m 0061008

FA2G2Ga11130,9423, 2+

Fucose

GlcNAc

Manose

Galactose

O NH

ON

O

NHN

N

O

O

RápidoFluorescência

MS

Grupo de identificação rápida de carbamato NHS Fluoróforo de quinolinil

Tag de carga de amina terciária

A próxima geração em rotulagem de glicanos

Com base na expertise da Waters em rotulagem rápida por

fluorescência dos aminoácidos, o RapiFluor-MS foi projetado com

propriedades químicas aprimoradas para proporcionar uma análise

de glicanos superior. Em uma reação de 5 minutos,

o RapiFluor-MS modifica as glicosilaminas geradas pela

liberação enzimática de uma glicoproteína.

¡ Identificação rápida

¡ Fluorescência eficiente

¡ Resposta MS incomparável


Atribua componentes de glicanos de baixo nível com mais facilidade e confiança

Obtenha níveis incomparáveis de atribuições estruturais de sensibilidade MS e MS/MS

combinando o RapiFluor-MS com os mais avançados espectrômetros de massa Xevo

G2-XS QTof ou SYNAPT G2-Si HDMS.

Caracterização de glicanos por UPLC® FLR com o Espectrômetro de massa Xevo G2-XS QTof

Comparação do cromatograma LC-MS de glicanos N rotulados como 2AB e glicanos N rotulados como RapiFluor-MS do mesmo mAb. Resposta de ESI+ MS 100 vezes maior observada para a amostra rotulada como RapiFluor-MS. Um espectro MS (inserção) mostra o espectro somado de um glicano pouco abundante dentro da amostra.

CARACTERIZAÇÃO

Reagente RapiFluor-MS

GlycoWorks RapiFluor-MS

Waters, T he Science of What’s Possible, ACQUITY UPLC, UPLC, Alliance, ACQUITY, QDa, UNIFI, SYNAPT, Empower, Xevo, MassPREP e MassLynx são marcas registradas das Waters Corporation. RapiFluor-MS, GlycoWorks e RapiGest são marcas comerciais da Waters Corporation.

© 2015 Waters Corporation. Impresso nos EUA.Fevereiro 2015 720005271PB KP-SIG

www.waters.com/glicanos

Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA 01757 U.S.A. T: 508 478 2000 F: 508 872 1990 www.waters.com

Filiais:

Alemanha 49 6196 400 600

Austrália 61 2 9933 1777

Áustria 43 1 877 18 07

Bélgica e Luxemburgo 32 2 726 1000

Brasil 55 11 4134-3788

Canadá 1 800 252 4752

China 86 21 6156 2666

Cingapura 65 6593 7100

Coreia 82 2 6300 9200

Dinamarca 45 46 59 8080

Espanha 34 93 600 9300

EUA 1 800 252 4752

Finlândia 358 9 5659 6288

França 33 1 30 48 72 00

Hong Kong 852 2964 1800

Hungria 36 1 350 5086

Índia 91 080 49292200 03

Irlanda 353 1 448 1500

Israel 9723 3731391

Itália 39 02 265 0983

Japão 81 3 3471 7191

México 52 55 52 00 1860

Noruega 47 6 384 6050

Países Baixos 31 76 508 7200

Polônia 48 22 101 5900

Porto Rico 1 787 747 8445

Portugal 351 21 893 61 77

Reino Unido 44 208 238 6100

República Tcheca 420 2 617 11384

Rússia/CEI 7 495 727 4490/336 7000

Suécia 46 8 555 115 00

Suíça 41 56 676 7000

Taiwan 886 2 2508 5500

UAE 971 4 214 62 38

Documents

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