Upload
isabelle-gaillard
View
212
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
� ������ ����� � ������ ���������� ����� ��� ���� �� ���������
������� ���� ��� ������ ������� �� ����� ������ ����! �� ��� "��� ��# ������ ��� ��� $�%���� & ���%��
������ '������� ��� '�������� ��� �������� �� �� ����� ��� �� �� ���������� ����� ����������� ����� �� ��������!� �� �� �"��� ��� �� �� ���������� ��"�� ����������� ����� �� ����� ���!� ��!�� ���� ��� �� �� ����������
��"�� ����������� ����� �� �����
��������# ��$��� %�����$ &����'���(� )��&� ������� ��������&� ���� ����$������� ��*������� &��������� )���*& �* �������)�������&
���� ��
( � ����� � ����� �� ������� �� � � ��������� � ����� �������� �� ����� � ����� � ��� ��� �� ��� ��� ����������) *�+��� �
������ �� ,��+� ���� ��� �������� � ������ -.�/ ���������� ��� �����) �� � � � ����� +� ,� +� ��������� � � �� ���� ������ � ��� �� ��������� ���� �� �� ������ ����� .�0�!�0# �� ��������� � � � ��� �� ������� ����� ������
���� ����� �� ����� � ������� +�� .� �� ��� �� ���1 � ������) ( � ��� � ���� � ��� ��� ��� �� � � ������������ �
,������ +�� � ��� ��� � ��� � �� ����� � �� � ��� ���� �� � ����� � ��� � �� ������� ������ �� �������� $! � $#) ( � � �� ��� � ��������� � � ��� ��� ��� �� � ��+ � �2343�235") 6� �� � ��� �� ������ ��� � 72 �� ���������� �
� � ��� �� +� ��� +� �����) ( � ��� � � ���� � .�0�!�0# �� ��� ��������� ���������� � � � � �� ������������
������ � � � 1����� � � +� �� ����� �� � � ����� ���� �� ���� �� �� � ������ ���� �������� �� ��� ���������)
��� ��������
��� ��������� ��� ��� � �� �� �������� ���� ��� � �� �
��������� � � �� ����� � �� ������ ���� ��� ���� �� �� ��� ���
�� ������ ��� �� �� �� ���� ��� ��� ����� �� �� ��� ���� �
����� � ���� ����� ������� � ���� ! ��� "� �� �� ���� ���
������ ��� ���� �� ������# �� ������ � ���� ��� ����� ��
�$% ������� �� �� �� ������ �� ���� ��� ����� ������
�$&' (���� ��� �� � � ������ �� ��)��� �� ���� ��� �����# � ��
�������� �������)� ��� �&�������� ���* ! $��� ��� ����� ��
����# � �� ��� ������ +,��� ���,������ ����� �� �+-.%
��������� ��� ��� ������� �� � ��#� �� �#��� ������ ��� ���
���� �"�� �� �� ����� � ���� ���� ��� ��� �� �� ����� �&����
�� ��!� ���/� %��� �� ��!� ���0� ���,���� �� ��!� ���*� 1��� �# �� ��!�
���2� %��3���� �� ��!� ���2 !
�� ����� ��� ��( $% ������� �� ������� ��� ������� ��
�� �� ������� ��� ��� �� ������ �#���� ���� �����# ����"�
������ �� ����� $% � � �������� � �����3��� �! ��� "�
����� �� ��� �� �� ������ 4����� �� �� ���� ��� (� ���������
�� ���� ���# ���������,����� �� #��� ������ �� �� ����� ��
$%,56 �7��� �� ��!� ���2 ! 5� ������ ����� �� ��!� �����
�������� ��� ��� �������� ��(��# �� ����� �� ������
���� ��������� $&' ������ � � ���� �� ������ ������ ��
���� �"�� ��� �� �� $% #��� ������� �� ���� ������ ,
��������# $&'! 5� ��������� �� �� ��� ���� �� �� ��
������� ���� �� ��� �� ���� ������ ���! 8�(����� ����� �� ��
��#� ��� �� �$%/0 �������� �� ��!� ���� � � � �� ���(�
(�� ��� � ����� ����� ��� (��� ����,�������� ����#��)� ��
��� � �� ������ �� (� ���#���� ��� � ���� ��� �� $&'
���� (���� � (� ��� ��!
���� �� �������� � �� �� �� ����#�� �� � ������� �
��� $%,�#��� ����"�� � ��� � ����� �� �� ���� ���� ����
����� �� ��������� ����� �� ��� ���! 8�(����� �� � �������
�� ��� � �� �� ���� �������� ������ $% ��� � ������ �
��"���� � � �� ���� �������� ���.�� ��� �� ��!� ���6 ���
������ �������� �������� $% ��� ��� ���� ���� ��#������� �
��( ���� ���� �������� �� �� ����#�� �� �9��� (�� �� ��!�
���2� :� )� �� ��!� ���� !
8��� (� ��� � ������� ��� �� � ��( ��#�� ����� ���
�������� � �� �� �� ����#�� �� (� � � �������# ������,
��� ��� �������� �� ���� �;������,<��� �� ��!� ���� � �
������ ���� ��� ����"� ������ �#��� �� $%��/,�0 �� ����
��� �����! ��� � �� (� ����� �� ���# $% �56 � � ��� ��
�9��� (�� �� ��!� ���2 ! 5� ���� ���� �� ����" � �� ��
���� �"�� ������ (� ���"���� �� (� �������� ��������
� �� ���# � ��#�,��� �������# ���������! 5� ����� ��
������ �� �� �� ��� (� ��������� � ������#��� ������
������ �� ��� �� �=42� ! :� �������� ������ ���)�� $%��/,�0
�� � ������ �� ����� �������# ����� ��� ���� �%��3����
�� ��!� ���2� %��3���� �� ��!� ���� � ��� ���� ���)�� �� ������
�� �#��"��� �����#���� ���� �� � ��� $% #���� � ���� ���� �
��� ����� ����� ��,����"� ������ ! 5� �� ����� � (� "�� ��
���� $%��/,�0 (� ����"� � ����� �� �� ���! ���� ����"�
������ (��� ��� � �� �� ����� $%��/,�0! ���� "����#
��� �#� �� �� �� ��� �� �� ����"�� � �� �� ���� ���
����� ��� ��� � ��� �� �� ������� ���� ���� ��� �� ����
�� �� ���� �!�! ��( �� ���� � ��������� ��� ��������� ��!
������ ����> ;� 5���� +������ �5+8� � �����!?,���> #�����@�#�!���!��
������� �� ���� ����� ����� �� ������� ����� ������� �� �����������
������� ������ �� ������������ ��� ��� �� !�"#!�$� ���� � %� ������ �� ������� ����������� &��������
"�� ��� �� ��� ���
�������� ������ ������� � �������� ���������
'���� (�"��)"� ��������
� ��(� �� 1�#! �� �� ����� $%��/,�0 �����#��� (�
������� �� � �� ������� ��� ��� ��� �%9A! ��� ������
�� � ��� �+��� +� � ���� �� ��� �� � �� A�,��� �� ��
����� $%��/,�0 �����# �3����� ������������# � ��� ��� ��
�� �� �� ������� ', ������ ������ (� ������ �� �� -.%,
�� �#���� ���# ��� ��� �� ���� �� � �� ������ ��1� A�,.��.�.���++�.�..+����.�����.�.�++.��+,0�� �%� A�,.��+..�+�+�� ���+,����.++�+�..���+�+��+,0� ���
*�� ����� �������� �& �� �#��� ! ��#���� �� ����� ��/4�0
�3����� (� � ����� ���� �3����� �� � ��� �� ���#�� #���
��(�� �� +��� � �������� �� � �� ����� ��������
�%��3���� �� ��!� ���� ! ��� ��+ ��������� #����� �� ��
���%5 �� ��� ��� � �! ����� �� �������# �������� (� ����
�� ������� ��#������ ��� �� � 9�)�� �3����� �9�)��� ��26�
9�)��� ���6 ��� � ����"�� ��B���)� �����#� ���� �#�� �58&
�3����� �+��� �� ��!� ���/ � ��� ��� �� �3����� �����# ��� ��
��������� ��� �?C9D5&??;D' �� �� ����� �,��� #��� �?���
�� ��!� ��2A (��� ���� �� �� ���� � �� A�,��� �� �� �����
$%��/,�0 �����# �3�����! ��� �,��� ��� ��� (� ���� ��
�� (��� �� 58& �3����� ��� �� ����� �� ', ������� 0� � ��
�#�� ��� ���� �����#� � �� � ���� �� �� �������� �� ��
����� �� �� �� �������� �� ������B��������� �����# ����� �
�� "�� ���! ��� �%9,��/4�0 ������� ����/4�0� 1�#! � (�
��� ���� �� �3������# �� �� � ����!
+���� (�"��)"� ��������
�� ���%54,��5 �/2 �� �� ��� ��� ���#��� �����������# � �
��� ��� ���� ��������� �� �+� � �� 0�, �� ����� ���� �� ��
���� $%��/,�0 #��� �%��3���� �� ��!� ����� +������ �������
������ �1�*E06/ (� ������� �� � �� ���%5F,��5,��#� ��
���/4�0 �������� ��� �� �1�#! � !
+���� (�)-� ��������
��� ��/4��6 ���� � �� ���� $%,56 �9��� (�� �� ��!� ���2�
+������ ������� ������ �1�=E==6 (� �� ����� �� -.% ����
���� #������ ;'� ���# ����"� ������ ��56,1�� A�,..�++,
�+����++���+�.�.,0�� �56,%�� A�,+��+��+++���+�+,
.���++,0� ��� ������� �� � �� &�5 �� ��� ��� � � �� �� �.%,
���� ��� &9�G �����# ��� �� �& �� �#��� ! ���%< ��� &��55
���3�� �� ��� ��� � � (��� ��� ���� �� �� �� �#���� �� �
��/��� ��6� ����� ����� �� �� � ���/4�0 ��� &9�G ,�56 �
�������� �����! � E*=,�� ���%<)&��55 �� ��� ��� ���#���
�����������# � �� ��/4��6������ �� ���� $%,56(� ���
������� ��,����� �� � �� ���/4�0 ��� �� �1�#! � ! ����
��� ��� ����/4�0 ��� �$%,56 (��� ��� ���� �� �3������#!
��� �������
1���� �� �� ���� ����� �� ������� (� � �������� #���� B����,
��� ��� ��� �+1- (��� �� ��� ��� ��! 1�� ���/4�0,+1- ��� �56,
+1- �������� +1- (� ������ ���� �?+1- �+������ �������
������ H6EAE� �� &���.,��5 ��#� ��� ��� �#� �� ��,�����
�� (��� �� &��5 �� ��� ��� � � ��� �� �� � �� ., ������ �� ��
$% ��� �� ,��5 � � �� �� ��� �� �������� �1�#! � ! 1�� ��
gccacc atg aag acg atc atc gcc ctg agc tac atc ttc tgc ctg gtt aac gcg gac atc atg gag cag aag ctg atc tca gag gag gac ctg ctt cga gga tct atg
M K T I I A L S Y I F C L V N A D I M E Q K L I S E E D L L R G S M
IHS sequence c-myc tag epitope
Cleavage site
100bp
TAA
TAA
h912-93
m912-93
SacIIEcoRV
StuI XbaI
A
EcoRVSacII
TAA
h912-93
mI7 TMII-VII region
B
EcoRI
100bp
15+! �! �������� �������� ��� ��� ! �� ��� �������� �������� ������� ��� ��� �A�,9�)�� �3����� ���������� � �� �����#��#��� �� � ����"�� ��B���)� �����##� �����#�� �3����� ����� ���� � � �,��� �#��� ��� �#��� ���� ��� �� $% �����#�3�����! ��� �����#� � � ��� �#����� ���� � ������ �� �� � ��� ��� ����(!.�� ��� ���/4�0 ��� ���/4�0 ���������� �� � �� �� �� �� �� ����! ������ ��� �� �� ������ �� � ��� ������ �� ��� ����+�� �� � � ��� � ������ �� �� ������� ��� ��� �� � ���� �� ! ����� � � ��� #����� �� �� ���%5 �� ��� ��� � ��� ���/4�0 �� (� ��� ��� �� ������� ��� ! ��� ����< ��� �� &��55 ���3���� ��� ��� � � ���� �� �� �� �#���� ��������� ��! ��� &��5 ��� �� ,��5 ���3���� ��� ��� � � ��� � #����� � �� $%,+1-��� ��� ��� ������� ��! �� �� ���%<#&��55 E*= �� �� ��� ��� ���#��� �����# ��� �� ��/4��6 ��#��� �� �� �56$% ���������� (� ����� ��,����� �� (��� �����%< ��� &��55 � � �� �� ���/4�0��� ��� !
*�= 5! +����� �� ��
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2
���/4�0,+1- ��� ��� � � &��5 �� ��� ��� � � (� �� ������� ��
�� �#���� � �� ��� ��� ��� �� �� .,��� ������ +1-
�������#!
������� ������
��� %��,���/4�0$% ������� �9��� (�� �� ��!� ���2�
.����������� �� ��!� /=== (� #����� �� �� �� ����#� ������
-.% �� ����� �����3�� ���� � � &��#�� ���� ! ��� �������
��� ��� �� 0� "� ����� ���� �� ������ �������� �� �����
(� � �� ���� ��,��# � $%��/,�0 �����# �3�����! ���
������ �������� ���#��� (� ����"�� ���� � �;'� ����
����� �������� �� ;� �!-! &����� �.��� �� ��!� ���/ ! ���
������� (� ����� �� � � �?�9�= �������� ��� �� �?�#�
���� ��� �; !
������ ��� ������� ���� ���� ��� ��� ��� ���������
�����
8?9 /�0 ��� ����"�� 8?9/�0 ��?�9����� �� (��� �� ���� ��
;�?� �5.' -�������� ���� 5��! .� ������� �� (� � �=I
�� � ��� ����� =!0 #FD D,#� ����� =!=A #FD ��� ������ ���
A= === 5HFD ��������! ?�� ������ ��� (� ��������� (� � A ��
�= � �=E �� �/E= <� A==�1� ���,%�� #��� ���� ��� ������ ��
�� ��� ������ ��� ������ �A= �� 9/8-$*� /= �� .80.$$9�
/= �� 9$8 ! 5� �� �������# �������� ���# �� � �� ������
�������� �� ;������,<��� �� ��!� ����� � $% ��� ��� ;'� (���
�� ������ �� (� � +��A �9��� (�� �� ��!� ���2� .�����������
�� ��!� /=== ��� �� �� � �� +�3� ����� +�3�+J ����� �� ��!�
���2 ����� ;'� � � ��)� �� -5-/ �#����# �� �(�� ��
������# $% � ���������� .� �$�������� � &����� ���A !
��� ��� �� � �%9,+1- (� �� ������ �� � � ��� �� �� ��
������ ��� ��"������! ��� �� (��� �� �� �� ��� �� ��� �� �
(�,(� ������� ��� ��F��� ��#� ,(� ������� ���
�D����� ���,��� ���! �AA06� ��� �66*=/ �� D��� ������#��
1����� �������� ��� �� (� � ��� D,���� ���� ��A �#F�D� �:
*= ===� &�#�� .������� &� D���� �$ ! ����, ������ �� ��
(��� �������� ����� �� ��� ����� ��� � �������� ����� ��
������ ��# 8?9/�0 (� � ��� �� �%9,+1- �����! 1�� ��#�,
��� �������#� �%9,+1- (� �� ��� � ������ ��� ��� ��!
�� �� ��� ������ ���� �� �� (��� ����� �� � �/ �� �������
��� �� �������� (� � ��� D,���� ����! ������� ��� ��"�������
(��� ������ E=I!
���������� ��� ����� ������
������� �� �� (��� �� �� �� � ��#� ,(� ������� ��� ��� ��
�������� (� � ��� D, ���� ����! .� (��� ������ (� � ������ �,
�������� ���� �-�& ��� �����# �I �&� ��� �,��� ��� ���
������� �� �� ������ �� ����# �� (� �� �� �� �� ������ ��#
(� � �� �� �,�,��� �������� �� ����� �� ?�=� �� ! K&.,*=� &�� �
.��) ��� ������#�� .� � � � > /== ��� ��� �� ������# �� ���
��� *A ��� � 06 �.! ���� �� (��� ������ �� �� ��� ��� ���
���L�#� �� ��"��-��� 1���� / ���#��� #�� �� �,���� 5#+ �M�����
5������������� ���! ��A4=6E4==0 � "��� ��� �= ��� �� *I
��������������� �� -�& ��� ����� �� ���� ��# ������ �#�
���� ���! �$�� ������� ����!� 1� �� .� �� .� ! ��� ���� ���
�� ����� (� �� �� �� �� ��� ������# ������� ���������
������ � �� ����� �� ���������! ?��� � ��� (� ���� �� �
A�E �� ��� ������ (� " ���� � E/= ��! +1- B��������� ��
����� ��� ��� (� ����� � �� �� �� �� ����# �� �� �������
���������! 1��������� �� +1- (� ���� �� ���# � *22,�� ��#��F
���� �� ���� ��� ��� �� B��������� (� �� �� �� (� � A�A4A*=,
�� ���� �� " ��!
������� �������
��� ��� ���� � ���� �� ���� ��� .�/G,��� ��� ��� 1H%�,/ (� ���
��� N.�/GO� ���#��# ���� �� ��#� �� � �������� ��������
�+������(��) �� ��!� ��2A ! ����B�� ������ �� �� (��� ����� ��
������ ��� (� � /!A ���FD �� �� ��� ����� �� � �� �� 1H%�,/
��� =!=/I -������ 1,�/6 �1H%�,/F�� ��� -������� �������
-���� 5��!� ?�#���� $% � �� D���� ������ ��� ��> '�.� �*=� 9.� A�
98/-$*� �!/� �#&$*� �!/� .�./� �!2� #����� �= ��� 8?-?& �=�
�8 6!/ ! ;�� �����# (� ������� �� ��� *= ��� � 06 �.!
1�� �� "� �������# ����# �� ��� �� ������ �������� ��
;������,<��� �� ��!� ����� � �� ����� �� (��� ���3��� �
����� ����� ��� �� D���� ������ ��� �� (�,(� ������� ���
(� ����� �� �� �#� �� �� ����� �� ��������� �$���� 5P6=
�3������ ��� ���B���������! 1�� ���� ��������� � ���� � �� ���
(� ����� ��� �� ��� A= �D (� ������ ������ (� � �
��������� � �� � �� �������! 5����� ��� (� ��� � D&%
&��� ����&�?% ���������� �� ������ � �� ��������� " ��
(� � � H<, �������� �� ��L�� ��� �H���F0*= /= � F�!0A ! ���
���#� (� �� �� �� (� � �� D&% � ����� �/F�* �� ����� ������
��#� � ������! ��� �?%D5' � �� ��?%D5'� D��� &������
%������ D�;� .������#�� H9 ��� ���� �� ������ �� ���
������� ��� ��������� ���#� �� ����# ��� �����! ��� �� ��� � ��
B������� �#� ������ � A�= ��� ���# ���� � ��� � 0*= ���
02= ��� (� ���� ���� ���� ���� ��#� 1H%�,/,����� ��! ���
�� �� �� B��������� ������ (��� ���� �� � 0*= �� � ��
��������� ���� �� 1H%�,/ ����� � .�/G � 02= �� � ��
��������� ���� �� ���� 1H%�,/ (� ��� � �� ����� �� N.�/GO��
(� � �� ������� �� �� �� �� �#������# �� ������� �� �� ������� ����
������! $�� +1- ��� ��� �� (��� ������! 1�� ��#�,���
�������#� �� �� (��� ����� � �������� ����� ��� ����� �� � �
����� � ���� ��� ���� �� �,�������� ������� ������ ��������#!
$�� �� ��(��# �� � �+1- ��� 1H%�,/ ������ B���������
(��� �������� (� � �� �� ���"�� ����� ����#�,������ ������
������ �-�� ���P +�� 5�� -����� �� 5� ����� � ���� ��� 'M !
.����� ��3��� ��� �� � (� /== � ��� #������� N.�/GO� (�
������� ��� �/= ! N.�/GO ����#� (��� ��3����� (� � �� �B���
�H������ ���#��# ����! :� .�� ��� -� ��� ������ (� � 5#��
-�� 0!�E �� (��� �:����� ���� 5��!� D��� $(�#�� $% ! ���
������ � (��� ������,�L�� �� �����# �4�= ! 1�(,�� � (�
��L� �� � ��( � ����(� �� �� � �� ��� (� ��� �= !
!�����
��� ������ � �� ������ ���� � �������� �� ;������,<���
�� ��!� ����� ��� ��� �������� �������� ����� ��� � ��
��� ��������� /,��� ����� ��� �����! 5� �� ��� �� ����
$%��/,�0� ��� ��� �#�� (��� �������� ���# �� � ! $�����
�� ��� (��� �������� � � � ��� �� ���� �� ������� �;�&$ �
�������� ����� �� ��#��� ��� (��� ��� ��� �� (� � D���� ������!
� �� �� ��� (��� ��� (� ��� � �!
1�� �� ��#�,��� �������#� �� ���(��# 6= ������ (���
� �� � �== ��>
� &� �> /,��� ���� /,������� /,��� ���� �,�� ���� /,�� ����
/,������� �,������� /,������� #������� �� ������
� &� �> ������� ��� ���� �� ���� ������� ������� �� �����,
����� ���� ���������� ��� ���� �� ������ ��������������
� &� .> /,�� ������ /,��� ������ /,��������� /,��� ������ 0,
��� ������ *,��� ������ /,�� ������ /,��������� /,��������� ��,
������ � ��
� &� ;> ��� ��������� ;,�������� D,�������� ������� ������
������������� ������� ������ /40,��� ��������� /40,�� ���������
�������� �������
$��� ��� ����� �� ����#��)� ��� ��� �� �� *��
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2
� &� ?> ��������� ����)���� ������� /,���� � �� ��������)����
/,��� �,0,�� ������)���� /,�� �� ����)���� � ���� ������)����
���)� ���)��� ���� �� ������� ��������������
� &� 1> ��������� ����� ���� ���� ����� �������� ����� ������
����� �� ������� �� �� ��� ���� �� ��� � ������� �������
����� � #����� ��� � �� /,�� �� ������ �����
� &� +> ����#���� ��#���� #������ ������ ������� ��� ���,
���� ��� �� ��� �� �,������ �,������� ;,�������� D,�������!
� ������ ������� (��� �������� ���� ������ ����� 0,
��� ������ *,��� ������ /,�� ������ /,��������� /,��������� /,
�������� ��� /,��� ������ �������� �� D���� �� �� ��� D ��
1�����!
�������
�������� �� ��� � ��������� � ���" �������
H���� �� �� ����#�� ��� ����� $% ��� ������� ��� ��� �
������ � � �� ���� �������� ���.�� ��� �� ��!� ���6�
+������� �� ��!� ���� ! %���� �� (� �������� ���� ���� ��(�
�� �� ���� ��� �� � �������� ', ������ �#��� �9��� (��
�� ��!� ���2 �� � A,8�0 ����� �� ', ������ �3����� �:� )� �� ��!�
���� � �� ����� $% ����� � �� �� ������ ����)� ��� �� ��
����� ��! 8���� (� ���� � ���� � ������� ��B���)� �����#� ����
�#�� �58& �3����� � �� ��#�����# �� $%��/,�0� ������ � (�
����� �� �� �� ���� ��� �� �� �#�� �3����� � �� ����� �/
�������#�� ����� �� ��� �� �� � (���� ������� �� �� �������� ��
�� ���� ���� ��� ��� �� �� �������� �+��� �� ��!� ���/ �1�#! ��
��� �� �� ��� �� ��� !
5� �� ����� (���� �������� $% ������ �� �� 8?9,/�0 ��
(��� ������� ��� ������ � ������� � �� ���� �������� ���
(��� ��� ��� ��� ����� �� 58& �3�����> �� ���# �� $%,+1-
��� ��� � �� �������� �� +1- ������ � ���/4�0� ���/4�0 ���
�� �56 ��� �� �1�#! /�� . ��� ? (��� �� �� �� �� �� �������� ��
����# ��� ��� �� ������ �� �������� �� �� �� ������� �,���
��� ��� (� �� �� �� �� �� ���� ��� �� ������ �����# ����� �
�� "�� ��� �1�#! /�� ; ��� 1 ! � � ��� �� ��� ������ ���
��"������� � �%9,+1- ��� ��� (� � ��� ���� �� ������ ��
(� � �� $% �������! �������� E=I �� �� ������� +1-� ���
/AI �� �� +1-,��� ��� �� ������� � �� �� ��� ����� �� $%
�� �� ���� ��������� ������ ��# �� ��������� �� �AI �� ��
�� ����� ��� ����� � �� �� ��� ���� ���� ����� ��! � �����
������ �#� (� ������� ��� �� �������� �� $% �� 9��� (��
�� ��!� ����2 ! 8�(����� �������� � � ����� �� ��/% (���� ��
������ � ����� � �� ���� �������� (��� ����� � ���� �����
������� �� ����� � ������ �� 8?9 �� �� ���# ��������,�/%
������� �.����������� �� ��!� /=== ! � ����� ������ ��� � ��
�� ���� ���� �������� �� $% �� �� ����#�� � �� ��3����
����"� ���������� � �������� ��� ���/��� ����������
������ �;(��� �� ��!� ���2 � � ���#� ��� ����� �� ���� �� ����
����� �� �� ����� �� !
��� ���� ���� ����� �� ������ � ��#� �� ����� �� ��3���� ��
��� ����� ��"���� � (� � � ����� ����#�� � �� �� �������
� �������� ������ ���� �#��� ������#! 5� ���� ��� �#����#�
�� ��� �� �� ���- �� �(�� � ��( 3�� � (� � ������ ��� ��
���� ���#� ����� �� �� �� ���� �"�� ��� �� ������)�� ������
�� +�� ����� ����� ��� �� ����� ����� ��� �� ��� �� ������ ��
�� ���� ��� ���� �M��� � %���� ��2�� ������� � %���� ���=�
;���� �� ��!� ���= ! 8���� �� ����� � ����� � � ��� ���� ����
������ (� ������� $% (� � ������� �� +,��� ��� � ����� !
+��A � ���(� � ����� � (��� ���#� �� ����� �� � ����������
. �.����������� �� ��!� /===� $�������� � &����� ���A�
15+! /! ?������� ��� ����)� ��� �� �� 58&,$% ��� ��� ! $% ��� ��#� �� � �� ���� �������� �� 8?9,/�0 �� ���# � ������� 58&��� ��� � �#�� �3�����! ;���� ������� ������ ��� �� ����# �� ������ �� (� � �� ���/4�0 �� ��� ���/4�0 �. ��� ��� ��� �����##���� B������� ��� ��� ���� � �� ., ������ ��� ���"���� ���������� �� $% �� �� ���� ��������! 5�����B��������� �����#�� ���,���������)�� �� �������# �� ���/4�0 �� ��� ���/4�0 �; ��� ��� ������� �� �������� �� �� �,��� �# ��� ��� �� ���� ������� ������ �� �� ���� ��������! ��� �,��� ��� ��� (��� �� �� ���# �� �?�= �� �,�,��� �������� �� �����! �?4+ .�� ����������� > �56,����"� �#��� ��� ��� ���� � �� �� ������� .�/G
����� �� �� ���������# �$%,56� +��A, ��� +3�+�,��� ���! �?41 �������� ���#� �� 8?9/�0 ������ �� (� � �� �56,+1- ��� ��� �? ��� �� �56 ��� ��� �1 ����� �� �������� �� �� ����� �� �� ������ ��������! �+ ��� ���,������� �� ������� .�/G ������� ��1H%�,/ ����� 8?9,/�0 �� ������ �� (� � �� �56 ��� ��� ��� +��A
��� +3�+� ����� ��� ���� ! ��� .�/G � ������� � ��� �� � ���������� �� �Q�EI (� ��� �� ������ "��� � R �2= ��� ������������� ! ��� ��� ��� �� ���� ��� �� ��� ��� ������ ��� ��������� �� ���# �� ����� �� �� #����! '� .�/G �#�� (� ������� ������, ������ �� �� ���� ��� ��� ������ ��� ���#� ����� � R �/=� (���������� ! � �� �� ���� ��� �� �� �� ����� ���� ��- ��== �� ������� � .�/G ������ �� � �� �� � ��!
*�/ 5! +����� �� ��
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2
9��� (�� �� ��!� ���2 � ��� +�3�+J� � �� � �� +� ����� � ��
����� ���� ����� � ����� � �� +�F� +-.%4���������� . �����
�� ��!� ���2 5� �� � ��� �� �� ���� ���� ���� ��� (� � ��������
�56 ������� �� 1H%�,/,����� ��#� �� ������� �� ������,
��� �� � �� ��� ��� �� � �� ������ �� �� ��� �� �� � ������
������� �� �� ������� .�/G �1�#! /+ � � �������� �������� ��
9��� (�� �� ��!� ����2 ! ��� ��� ����� �� � �� ��� � �� �
���� ���� ��� �#���,����"�! :� �� ����� �� �� ������ (�
�������� �� ������� ��,+� �9��� (�� �� ��!� ���2�
.����������� �� ��!� /=== ! 5� ���� ���� (� ����� �� $% (���
�� ���� ���� (��� ��� ��� ��� ������ � +1-!
�����#���� �����#� ������� ���� !��$�%��
&������/ ���� ��
��� �� ������ ��� �� �� ������� ����� ��� ���#� �� � ��� ����� $%
� ���� � �������� �� ������ �� ������ ���� �#��� �������#
�� ��3���� �� ������� ���#� �� ������ ! 8�(����� ;������,
<��� �� ��!� ����� ���� ���� �"�� � ������ � �� ������
������� � ��� �� �� 3��� � ��� ���� ��� ���� �;������,<���
�� ��!� ����� �� �� ��� �� ��� ! ��� ������ � (� � �� ��
8?9,/�0 �� �� ������ �� (� � 58&,���,���/4�0 ��� ����,
��� ��,+�! � ��(� �� 1�#! 0� � ��� �� �� ������� .�/G (�
������� ���� ���� ��� (� � �== �� �������� � � ��� (� � /,
��� ����� ��� � �== ��� � ��! � � ��� �� ��� �� ���� � �� ��
� ������� � ��� �� N.�/GO�� ��- ��== �� (� ��� � �� ��� ��
���� ��������� ������ 8?9,/�0 �� ���� �� ����� -/J ����� ��
������ � �� -5-/ �� �(�� ��� ����#���� +,��� ��� �8����
�� ��!� ���0 ! ���� ��������� � ���� (��� ��� � �� �� ����
��� �� ��� ���� �� ����� ���!
��� ������� ������ (� ����� ��, ��� +��A +3�+�,��������
������ �� �� (��� �� �� ������ �� �� ��� (� � $% �1�#! 0. ��
+,��� ��� �1�#! 0; ��� �� ��##�� .�/G ����#� ���� � � �==,���
��#��� ������ ������ �� ���� (��� � ���# ������� �� N.�/GO� (�
�������� �� �� ���� ��� (� � ��-! 8�(����� �� �����# ������,
���� (��� ������� ���# ��� ��� �� �� (� +,��� ��� ���
��(� !
&���� �� ���� ���'� �����
%���� ���� ���� ��(� �� �� ��# � �� �� ������ ����� � ��
����� �� ��� ��� �� ������� �� ������# ����� �� ������
�9��� (�� �� ��!� ���2� ����� �� ��!� ���� ! ������ ���/4�0
�������� � � �� /,��� ������ �� /,�� ��� (� � ���� ���������
� �� ����"� �#���� ���� ��������� /,�� ��� (� � ������ �����
��# � (��� �����! �� ������ � ����� ��� ��� � ���������� ��
�� ������ �� ����� �� ������� ��� ��� (� �������� �� �����
������ ����# �������� ������ � �� �� ��� ��� ������ ���
��������� ��� �� ��� ! 1�� � #���� ������ �� ��� �� �� � ����
������ �.* � .�= ����� (��� � �� �� ����� � ��� ��������
��� �� ������ �#� �� �� �� �������� � �� ���� ���� ���
�� (� �� �������! �� ������� �� N.�/GO� (� ������� ��� ��
���� /,�� ��� �1�#! *� ! 1�#��� A ��( �� ������ ���"� ��
���/4�0 ������ �� �� ���� �� (� � /,�� ����� �.* � /,
��� ����� �.6 ��� /,�������� �.�= � � ��! :��� /,��������
��� /,��� ����� ������� �� ������� �� N.�/GO� ��� �EI ��� �0I ��
������ �� ��� ����� ����� /,�� ����� ��� �� �� � ������ �� ���
EI �� ��! ��������� � � �(�� ������ �� ��� ��=42� � � �����
������ (� �������� ��� ��� /,�������� ���I �� �� ��� /,
��� ����� �6I �� �� �1�#! A ! ���� ��� ����� �� � �� /,
�� ��� (� � � ������ ����� ��# � �� ���� ���� � ����� ������ ��
������# �$%��/,�0! '���� ���� (��� �(����# �� ������
������ �� ��� � ������#��� ���� ��=42� � � ������ ������
����� ��# � �� ���� (� ��3�����!
(�� ������� �� �� � ���'�"� ����
��� ��� ��� ��� �� �������� � �� ������� �� �� ������ 4$%
�� ���� ��� (� �� �������� �� ��� ��� ��� ��� �� �� ���� ����
#���� �� �� ����� ������ �����! �� ��� ��� ������ ��� (�
������ �� ������ �� �$%��/,�0 � ������ ������� ������ �
aniso
le
isoam
yl ac
etat
e
isoam
yl ac
etat
e 1µM
cam
phor
acet
ophe
none
2-he
ptan
one
2-he
ptan
one
1µM
(R)-(
+)-lim
onen
e
(S)-(
-)-lim
onen
e
O
O O
B
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
0 100 200 300sec
2-Heptanone 10µM 100 µM
ATP
0.7
0.8
0.9
1.0
0 100 200 300 400sec
2-Heptanone 1µM
ATP
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
0 100 200 300sec
ATP 2-Heptanone 10µM 100 µM
0 100 200 300 400sec
0.7
0.8
0.9
1.0
1.12-Heptanone 100µM
ATP
F340
/F38
0
F34
0/F
380
F34
0 /F
380
F34
0 /F
380
C
D E
A
15+! 0! &�������# �� ������ ����"� � �$%��/,�0! �� 1H%�,/,�����8?9,/�0 �� (��� ������ �� ��� � �� (� � �� ��� �� ������ ��"��� �� ;������,<��� �� ��!� ����� ! ?��� ������ (� �� �,������ � ��#� ������ �� ��� ��== �� � ��� ��� ��������# � ��� ��� �#���/,��� ����� ��� ����� ��� � � (��� ���3��� � � �� � � �(�������� �� ��� �� �� ! ��� ������� �������# ������ �� �� �$%��/,�0 � ���� �� �� ������ (���� ��� ������ �� �� ���#� ,������� �� ���#����! ��� ���������� �� �$%��/,�0� +��A ��� +3�+� ��� ��� �� ���� � ���# .�/G �#�� �� �0I �� �� (� ��� �� ������ "�� ���� ���� ��� (� � � �� �� �,������ /,��� ����� �� R *== ��� ������������� ! ��� .�/G �#�� � ������� � ��� �� �������� ��! 5���� �� � ���� ��� �� �$%��/,�0 (� � /,��� ����� �� �� ������ ��+��A ��� +3�+� �� R 0*=� "�� ��������� �. �� (� � +��A ��� +3�+�(� ��� �$%��/,�0 �� R �2=� ���� ��������� �; ���� �� #����� � �.�/G �#�� ���� ���# � �==,��� ��#��� /,��� ����� ������ �� ���! '������� ,������� .�/G �#�� (� ������� �� ����, ������ �� �� �? ! � ���# ������ �#�� (� �������� �� �� ������ ��� �� �== �� ��- �� � �� �� � ��! ��� ��� ��� �� ���� ��� �� ���� �� � ������ ��� �� /,��� ����� ��� ������ �� ���# �� ����� �� �� #����!
$��� ��� ����� �� ����#��)� ��� ��� �� �� *�0
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2
� ���3�� ������ �� ��� �� �� � �� ������ �� ��! � ��(� ��
1�#! *�� �� ������� �� �� ������4���#�� �����,���� � �������
�� �$%��/,�0,������ ������# ������ �� ��� �� � /,��� �����
��� /,�������� �1�#! *� � �� ������� �� N.�/GO� (� ������� �� ��
������ ��� �� ������ ��� ���� ���� #���� �� /,��� ��� ������
#���� ! ��������� �� ��� ��� �� �� ������� #���� �� �� ������
����� � �� �� ����� �� ������ ��� �� �� �#��� ����#�� ���! 5������
�$%��/,�0 ��� �� �� ��� �� �� ��� ���� /, ��� 0,��� ����� ���
(���� �� ������� #���� � �� ��� ��� .�� ./ ��� .0� ����� �����
�� �� �� *,��� ����� ���� ��� .* � �##� ��# �� �� �������
#���� � �� ������� (��� ������ ����� (� � � ���� ������
� �� ��� ����� �� �� � ��� �1�#! *. ! 5� ���� ���� (� ���� �,
#� �� �� ����� �� �� ������� #���� ��� ��� �� ����� �� ������
�� ���� � ��� ������ ����� �/,�� ������ ���� ����������
�� ���������� 1�#! *; ! � ��� ��� �#�� (� �������� ��� ���
/,�� ����� �. R $ �� ��� ��� ./� ���� ��� � ��� ��� .0 � ��� ��
��� �� ��������� ���� ��� .� �� ���� ���������! ���� �� � ��(
�� �$%��/,�0 ����#��)� ����� �� ������ (� � � ������� #����
��������� ��� �� �� ��� ��� ./ �� .0 �� �� ����� ������ � (� �
/, �� 0,��� ����� �1�#! *. !
$����� ��� ����� �##� �� �� ������� �� � �������
#����� � ��� ��� �� �� ������ ������ ��� �� ��# � �� �� ������
����� ��� ���,�� ������� �� �#��� ����#�� ��� �� �$%��/,�0!
&����%����� ���������
�� ����� ��� "����# �� �$%��/,�0 � ����"� ��� ����� ��
�� ��� ��� � ����� � ��� ��������� � ��������� (� � �� � ��#�
� �� ������ ! &���� � ������ ��� �� ���� ��� �� ���� ���
1�#! E� (��� ����� �� ���� ��� ��� � �� �#��� (�
��� ��� �� �$%��/,�0! ��� "� ��� ��� � �� ������� 58&,
���,�$%��/,�0 ����� �� ������ ��� �� ����� � � ����"��
��������,$% ������� �9��� (�� �� ��!� ���2 ��#������� �
�������� �� .����������� �� ��!� �/=== (�� #����� �� ��������
����� �� ���# �� "� 0� ����� ���� �� �������� ��� ������
�������� � � ����� �� �/%! �� ������� �� �������� ��� ��
�/% �������� � �?�9 �������� � �� �?�#� ���� ��,�; (�
���! ���� �� �� ����� (� ��� ��� �� � ��������,�$%��/,�0
������� ����,�$%��/,�0 �� (� ������ �� �� �?�9����� ��!
5� ������ (� ����"�� �� ��������� � ����� ��� �� �� ������
���#��# ��������� ��� �� ���� ��� �� ��� �� �� � ��� �
2-Heptanone
0
02- butanone
02- pentanone
02- hexanone
02- heptanone
2- octanone
0
2- nonanone
0
2- decanone
0
+
+
+
+
+
+
+
10-6M
-
+
ND
+
+
+
+
10-8M
A-
-
10-6M
B nonane
0H2-heptanol
C 02- heptanone
+
+
+
-
10-6M
04- heptanone
0
3- heptanone
heptanal0 D +
-
-
10-6M
2- butanone
isobutyraldehyde
butyraldehyde
0
0
0
15+! *! %�"����� �� �� �������# �� �� ������ ����"� � �$%��/,�0! ��� �������# � ��� ��� �� /,��� ������ (���� (� ������ �� �� �� ��������������# �1�#! 0 � �� � �� � ��� ������ �� �� ������� �� ����"� � �$%��/,�0! ��� �������# ��������� � �� ��� ��� �� 1�#! 0! �� 5���� ������ �� ����� ��# �> /,�� ��� (� � ����� ���� *4�= ������ � �� (��� "� � �� � �=4E
�! .*� .6� ��� .�= /,�� ��� (��� ���3��� � � �� � �=42��
��� .6 ��� .�= /,�� ��� ������ � ��� ��� �#��! �� 5���� ���� �� �� ���� ���� #����> �� ������� #���� �� /,�� ��� (� �� ��� ������� ������� ��������� �� ��� ��� #���� ������� ��� ��� ! 5� �� � ���� ��� ���� � ��� ����� ��� ��������� ��� ������� ��� �� ���� � ��� ��� �#�� (��������� � �=4E
�! �. 5���� ���� �� �� ��� ��� �� �� ���� ���� #����> ���# /,��� ����� � � ����� ������� (� � � .6 ������ ����� ��� � �������#���� �� ��� ��� .� ���� ��� � ./ �/,��� ����� � .0 �0,��� ����� ��� .* �*,��� ����� (��� ����� � �=4E
�! ?���� *,��� ������ � �� ������������� � ��� ��� �#��� �##� ��# �� �$%��/,�0 ����� ���� �� ������� #���� (��� � � B����� �� ������ ����� �� � ���� ������ � ��! �; ������ ��� �� �� ������� #���� ��� � ������ ������ ����� ��# � ��� �� � ��3����� � ������ � ��� ��� �#��! :��� � �� � �=4E
�� �� ��������� ������� ��������� �.* ��� .0 ����� ��# � (� � �� ������� #���� �� ��� ��� .� ��� �� ���� � ��� ��� �#�� ��� ���� � /,�� ����� �.*,����� ���������� #���� �� ��� ��� ./� �� �� ��� � ! $����� ��� ��� ��( �� �$%��/,�0 � ����"� ��� �� ��� (� � �� ������� ����� �� � ���� ������� �� ��� �� ������� #���� �������� ��� �� ��� ��� ./ �� .0!
*�* 5! +����� �� ��
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2
��)���)� �� ���� �� �� �� ��� ��� ��� ���� ��� ��� �� �� ����� ��!
N.�/GO ����#� (��� ������� ���# � �� � �������� � �� ��� �
�� ��� (��� ������,�L�� �� (� � � ������� )�� ������ � ��� �0 !
��� ��������� � (� ��� ������ ����� �� �� �����# ��
��������#� �= ������ ������ ������ ���! � ��(� �� 1�#! E�� �
���# ��� ����������� �#�� (� ������� ��� �� (� ��� ��� �
(� � �� ������ � . �� ��� ��� �� ����� �� �� ��� �.* � .�= !
'� �#�� (� �������� �� �� � � �= ������ ��� �� � ��� ������
� ! 5� �� (� � ��� ������� ������ ��� �� ����� �� �� ���
�� � �#��"��� � ������� ������� ������ ��# � ����� �)� ���
����� �� � ������ ��� �� �� ���� ���� $% �1�#! E. ! :��� ��
������ (��� ������� �� N.�/GO �� ����� � ������ ��� �� ��
�= ���� �� ���� ���� ������ ��� (� �� ��"���� � ������� ��� ��
���� ��� �� �� ������ �#�� �1�#! E. !
(�� ����� !��$�%��
& �� ��# ���� �� ���� ��� �� �� ���#�� $% #��� ������
����� �� (���� ���� �� ��� �� �� ������ � (� ��� /,��� �����
��� /,�������� � ���� � ����� $%��/,�0 ��$%��/,�0 ! ���
(��, ��� �3����� �� �$%��/,�0 ��� ��� �� ��4����� �� �����
��� �� � �� A�,��� �� �� �����# �3����� ������������# �
��� ��� �� �� �� �� ������� ', ������ ������ � (���� (�
������ �� �� �� �#���� �� �� $% ��� ��� ���/4�0 �1�#! � ! &���
���� ��� ������������� ������ (��� �������� ��� � �� ��(� �
0A. 2-Butanone
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
100 200sec0
ATP
2-Butanone 10nM
F340
/F38
0
0 .7
0 .8
0 .9
1 .0
1 .1
100 150sec 0
ATP
2-Butanone 1µM
F34
0/F
380
0B . 2-Heptanone
0 100 200 300 400sec
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
2-Heptanone 10nM
ATP
0 .7
0 .8
0 .9
1 .0
1 .1
0 100 200 300 400 500sec
2-Heptanone 1µM
ATP
F34
0/F
380
F34
0 /F
380
C. 2-Decanone0
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
F34
0/F
380
0. 7
0. 8
0. 9
1. 0
1. 1
0 100 200 300sec0 100 200 300 400sec
2-Decanone 10nM
2-Decanone 1µM
ATPATP
F34
0/F
380
0.7
0.8
0.9
1.0
1.12-Butanon e 100µM
ATP
F34
0/F
380
100 200sec0
0. 7
0. 8
0. 9
1. 0
1. 1
2-Heptano ne 100µM
ATP
F34
0/F
380
500sec4003002001000
0 .7
0 .8
0 .9
1 .0
1 .1 2-Decanone 100µM
ATP
F34
0/F
380
3002001000 400sec
15+! A! 5���� ���� �� �� ������ ����� ��# � ��� �#��� ����#�� ��� �� �$%��/,�0! 5� 8?9,/�0 �� ������ �� (� � ���/4�0� +��A ��� +3�+�� � ��� ��N.�/GO� ���� �� ������� �� /,�� ����� � � �� �EI �� ��� � R �*= ��� (� ��������� ��� �� ���� � /,��� ����� � � �� ��� �= �� N��� �� ���� �0I �� ��� � R *==� ���� ��������� ��� ������ ���� 6I �� ��� � R �/=� (� ��������� O ��� /,�������� � � �� ��� �= �� N�.� �� ���� �EI�� ��� � R �2=� ���� ��������� ��� ������ ���� ��I �� ��� � R /==� ���� ��������� O! ��� .�/G �#�� ��� ������� � ��� �� �� �������� ��(� ��� �� ������ "��! 5� ��� �� � /,�� ����� � �= �� ���� �� #����� � � .�/G �#�� ��� ����� ���� ! ��� ��� ��� �� ���� ��� �� ���� �� ������� ��� �� ������ ��� ������ �� ���# �� ����� �� �� #����! '� .�/G �#�� (� ������� �� ���� ������ �� �� �� R �/=� (� ��������� ��4.� ��#� ����!
$��� ��� ����� �� ����#��)� ��� ��� �� �� *�A
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2
������ ��# �� �� ������ ��� �� �� ��,����� (� �� ��"���� �
�� ��� �� ����� ��/4�0 ���� ���!
'���������
$��� ��� ����� �� ���� ���� ���� �"�� ��� ���� �= ���� ��
������� ���"�� �� �� �� ��� �� ���� ���� ��� �� �� �� �� �� ����
�������� ���� �� ���� ������ ��� � � ����� ����� ���!
5������ ���� � � � ���(� ���� �� ������� ��� �� �� ���� ���
��"������ (���� �������� �� � ������� �� ��� ������� �� ���,
��� �!�! (���� ������ �� ��� �������� ��� �� ���#� �� ����
�� �� ���� �� ���� � � �� �� ���� � �(�� ������ �� ��� �� ��
��������� ��� ��(��!
5� �� (��� (� ����� �� � �� ���� $%��/,�0 (� ����"� �
����� �� �� ���! ��� ����� ��� �� ���� ��� ��� �� ������� ���
������� � ����� �� ������#> �� �$%��/,�0 ����#��)� ���
����� �� ������ (� � � ������� #����� ��� ����"� ������ ���� �
���#� ������ ����� ��# � �� � ���� ������ � �� (� � � ������
����"�� � (��� ��# � � ����� ��� ���� �� ������� #���� �
�������� ��� ��� �� �� ��� ��� ./ �� .0 �� �� ����� �����!
����� ��� ���#� � ����#��)� ���� �= === ����� � ���� (� �
�� � �������� ������� ��� ���� �����# � ���"�� � ������
���� ��� �� ������ ����"� � � #���� ����� ��! 8�(����� ;������,
<��� �� ��!� ����� ���� ����� � ������ ���)��� �� ����� � ������ �
�� ������ ������� � ��� �� ���� 3��� �� �;������,<��� �� ��!�
���� ! ���� �� ��� ��(�� �� ��� ��������� $&' � ��������
� � �� ��� �������� �� �� � ���� � ! ���� �� ��
���� ��� �� ��� $&' ����� ��� ��� $% ������ �� ��!� ���� �
� � ����� � ���� � ��� ��� ������ ��� � ��#� $% ���# ��
������ � (��� ������ � ��#� ������ �� ��� ��== �� ! ��� "�
�� ��( ��� � ��"�� �� ���� �"�� ��� �� ��#�� ����"� �#���
�� ���3��� � � ��# ��� �� ������ �� � �������� �������#!
H��# �� ���������� �$%��/,�0 (� "� � �� �#��� �� ��
������ ������ �� ��� �� ��� � ��� ��� ������ (� ��������
��� /,��� ������ � ������� � ��� ������ �� �� ���#� ,�������
�� ��� #����! &������� ��� ����� ��(�� �� �� � �� �������
#���� ��� �� ������ ����� ��# � ��� (� ��� �� �� ������� > ��
��� ������� �� ������ � ������� �� ���# /,��� ��� �� ��� ��
/,��� ������ ��� ��� �� ������� #���� � �� ������� �� � �
B����� �� �� � ��� �� ������ ����� �� � ���� ������ � �� � ��
�� ��� �� *,��� �����! 1�� �������� �� ������� #���� �� ��
��� �� �� ��� ��� ./ �� .0 �� �� ����� �� �����!
$�� ��� �� ��( �� ����� ��� �� �� ������ ������ �� ���
��� �� ����#� �� �� ���� ��� �� �� ����� ��! 1�� �������
���� $%��/,�0 (� ���� �� �� /,�������� ���� �== �� �
�= ��� � ���#� � ������� �� �� ������ ������ �� ��� ��� �� �� �
������� �� �� ������ �#� �� ��������# �� � � ��B�� ��� �� �
��#�� ��� ��� ������! 5� ��� �� � ��� ������ ��3����� ��#� ��
������ ������ �� ��� � ���� � ������� �!�! ����� ��� � � (�
��� �� �� �� � �== �� ��� /,�� ����� (� ����#��)�� � � �� ��
�� � � �(�� ������ �� ���! &������� � �� ���� ��(� �� �� ��
�� ������ �� ��������# $&' �������� (� � �� ������
������ �� ��� ������ �� ��!� ����� ;������,<��� �� ��!� /=== ! 5�
�� ��� (��� � � �� ���(� �� � ����#� �� �� ������
������ �� ��� ��� ��� �� � ����#� �� �� ��������� ����� (����
���� �� �� ����3����� �� �� �� ��� ��� �� �������� $% ��� ��
�������� ������ �� ��� �� ������ ! � ���#� �� ��� �� ����
��������� �� � �� ����#�� � ��� ��� ����3��� � �� �� ������
�� �� ��� ��� �� (���� ��� ���(� � ������ �� ������ �#��
�<��� �� ��!� ���* � �� ������ �� �� �� ��� �� ����"� ������
(� ��������� � �� ������#��� ������ ������ �� ��� ��=42� !
5 � �������� ���� �� �� ����� �$%��/,�0 ���� ����#��)� ���
������ � �(�� ������ �� ���!
5������ �$%��/,�0 � ����"��� �� ��� �� �� �� ��� ������
(���� �� ���� ��� ��� ������� �� ������� ! ��� ������ � ��
�#������ (� � ����� ���� �##� ��# �� ����� ���� �� �� � ��
���� ���� #���� ��� �� ��# � �� �� ������ ����� �� ����� ��
������ �� $% ����#�� ��� �9��� (�� �� ��!� ���2� 7��� �� ��!�
���2� ����� �� ��!� ����� ������� �� ��!� /=== ! � �� ���� � (�
15+! E! D��#�,��� �������#> �� ������ � ����� �� �� ��� �� . (��� �� ����� (� � �� (� $%���/4�0 �������� 58&,�$%��/,�0 ���� ��� ���� ��� %��,���/4�0 ��� ���� ! ��� �������� �#�� (��� ����"� ���(��� �� ������� �� �� ������ ��� �� ��� ��� ������ � ! ��� ������ ����� �� �������� � ��� � �� �� �� �� ���� ��� �� ��� �� ���!.���� ��( �� ���� G &?� �� ���� ���������� ��������� ! �� N.�/GO ������� �� 58&,���,�$%��/,�0 ��� �� %��,���/4�0 ���#� ������ �� �� (� ������� �� ����� �� �� ��� ������ ! ��� ����� �� ���� ������ � �� ��� ��� ���� ��� �� ������ ������ ���! �. �� ������ �� ����� �� �� ��� ��##�� ���� �� ��� ��� �� �$%��/,�0 ���(���� � ����� �)� ��� �� �� ����� �� �� ��� �������� �� �� �= ��� ��� ����! &����� ��� (��� �� ����� (� � �� (� ��� ��� !
*�E 5! +����� �� ��
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2
� ���� ��� ���( ��� ����������! 1�� � ��� � ���#�� ���#� �� ��
������ ������ � ��������� �� ��� ���� ��� ����� �� �� �� �� ��#
��� ��� �� �� ��� ��� ��� ��� N�� ��� ��� �&�������� ���* O ��
�� ������! � ��#� ������ ������ ��� ��� ��� ��������
��� ��� ����� (���� ��� ����"��� �� ��� � �������� ����� ��!
��� ������� ��� �� �� ��� �� ����� �� ������� � ���3�� ��� ��
����� �� (���� (� �� ��� � � ���3�� ��� �� #������ ��� ��# ��
�� ������ ��� �� � ����� � ����! 5� �� ���� �� ���� ��� ����� ��
(��� ����#��)� � ��� ��� �� �� �� ��� ��� �� �� ��� ������!
&������ $% �� ���� (� � �� ��� ��� �� �� �� ��� ������ ������
(����� �� ���� ���� �� ��� ��� � ����"� �� ������� � �� ��� � ��
����� ��! 5� �� � �� ���� (� ��� �� (��� �� ��3����� ��� ����� ��
�� ��� ���> �� �� ������� �� �� ��� ��� �� �� ��� � �������,
��� � ��� ��� �� �� ���� ��� �� �� ������# � � (� � �� �� ��� �� �
��#� ��� �� �� ������ ������! ��� � ������ � �� �#������
(� � ���� ��� ���� ������� ��� ���� ������ �� �� �)� ��
�� ������# ����� �������� �� ��!� /=== !
5� ���� ���� � ��"�� �� ����"�� � �� �$%��/,�0 ��� � �������
�� ���� �� �� �� ������ � ����� �� �� ���� (� � �� � ��#�
���� �� ������ ���# (� �$%��/,�0 �������� � ��! :� �
�� (� ��� ��� � ��� �� � ������� �� ����� �� �� ��� �� .
��#� �� ��� �� �$%��/,�0 (� � �� ������ ������ ��� �� ��= !
'� �#�� (� �������� (� � �� ��� ������ �������# ����� �� ���
��� ����� ����� �� �������� (� � ������ ���� ���� #����� ��
����� ��� ����� �� �� ���! � ��#� ���������� (� �������
�� (��� �� (� �������# ���������� ��� ��� ���� �� � N.�/GO
����#� ��� �� �� "� ����� � ��! ��� ���������� � �������
��� � �� ��� ���� ��� �� �� ������ ������ ��� �� �� � ��
������ �� ������ (� �� ������� �� �� �� ��#! 5� � ����
����� �� �� ��� ��##���� ���� ����� �� �� ��� ���! � ����� �� ���
���� ���� $%� ������� ������ ��� �� � ����� �)� ��� (� � �
������ �#�� �� ��� �������� �� �� �= ��� � ����! $�� ���
�##� �� ����#� �� �� ������� ��� ��� �� �� ���� ����
#���� ��� �� ������ ��� �� ���� � �� �� ���� � �� �� ������
� �� ��� � �� ����� ��! 5� ��� ������ ������ ������� �� ���� ���
�� �� ����� �� ����� ��# � �##� �� �� �#���4����� ��
�� ���� ��� � ��� ������ �� �� �������� �� �� ������# ����� !
$� �� � ��� ����� �������� ������ ��� ���� ���� ��
�� ���#�� ��� �������� $% ����#��)� ���� ��� �� �#���!
5������ 7��� �� ��!� ����2 ���� �"�� �� ��� ��� � � ��� �� ��
��� ��� ��� ������ � ����"� �#��� ��� �� �� $%,56� (���
9��� (�� �� ��!� ����2 ������� ��� �� ���� $%,56 � ����#� ��
�� �#��� ����"�� � ���� �� ��� � ��� ��� ��� � � �����F
�������� �� � � ��� �� ��A! ���� ��� ����� �� ���� �� ��
��/4��6 ��#��� ��������� � �� �#��� ������# ����� ��� ��
�� ���#�� ����� �� ����� �� ��� �#��� ����"�� � (� �
����� �� � ����������! 5� ������� (���� (� ���� ��(� ��
$%��/,�0 ��� ��� � ��#� ������ ���� �� � ��� �� �����
�%��3���� �� ��!� ���2 (����� �� #��� � �� �� ��� �����# ��
���� �%��3���� �� ��!� ���� ! $�� ��� ��( �� �� �� � � ���
�� ���� ������ ������ � +��� #� ���� ���� �+��� �� ��
�� ������� '8/,��� � � �� ��"���� � �� ��� �� ����� $%��/,
�0 ���� ��� ��� �##� �� ��� ���� �� � ���� ��� �����
�� � ���� ���� ���������� ��� ��������� ����#� �� (���
������ ��/ ��� ��6! � ����"� �#��� �� ���� $%��/,�0
��� ��������� � ���� �� ����� ��� ���� � �� ��� �� $%��/,�0
� ���3�� ��� ������� ���� �� ������ ��� ��� �##� �� ��
���3�� ��� �� ����� �� (���� � �� ��� �� �� ��� �� �� ����"�
�#���� ������ �� (��� ����� ��� ���� �� � �� ��� ����� ��! 5�
� ��� (���� � � ���� �� ����"� ������ �� �$%��/,�0 ��� ��
����#��)�� �� � ��� $%! .���3��� �� ���� ��� ����� ���
�������� ��� ������ �������� � ������ � ��� ������ ���
���� � �������� ���� �� $% �� �� (� �����!
��� "��#"� #��� ��� � � � �� ������ ���� � ��� ��
���� ��� �� $%! 5� �� ����� ���� (� ��(�� �� �� ����� ���
(���� � ������� ���� �� ������ � ����"� � � � �� ������
��� �����# ������ ��� ��� �� �� �� ����! 5 � �������
���� �� �� �� ����� ��� �� �� � #��� � �������
�������� �� (� � ����� � � ��� ����� ��� � �����
�������� �� ! 5� ������� ����� (� ���� �##� �� �� ��
������� ��� �� �� �� ����� ���� ������ � (� � �� ������� ��
� ��#� ���� ��� �� $% �����#��� �%��3���� �� ��!� ���2� %��3����
�� ��!� ���2 ! ��� ��� ��� � � ���� ���)� �� �� � ��
���� ���� #��� �� ����� ���� ������ �� ������� ���� ���� ��
����� �� ������� ��� �� ��� �� ��� �� �� � ��� ����� ������ ����
��������� ���� � �� ���� ������ ��� (� � ����� � ������� ��
�����!
��,��+����������
:� ��� #�� ��� � '! D�� ����� �.%5.� ��� ����� ��� ������� ��������� � ;! 1���� ��� %������ 9������ ��� ��� ��� ������# �� �� �������� !5! +! ��� .! �! ��� ���( �� 5'%�! ��� ������� (� ����� �� �� #��� ���� 5'%� ��� 5! + ��� .! �! ��5- $��� ��� ����,�'&� ���� � � #��� ���� �� -��#����� +�S���� �� .'%& ��� &! %��3����! ��� ;! +� ��� #��� ���� �� 1���� ��� �� 1����� ��6==0�2/ ��� ���� 8���� ,������,%���D����� ���� �1%8�%�F�6=/ ��� &! %������!
��� ��������
+-.%� +,��� ���,������ ����� ��� $%� ������ ,���� ��� ����� ��� $&'����� ��� ����� ������!
��� �����
�������� %!.!� 9���� �!;! � 1��� ���� &! �/=== ��� ������� ����� ������#� �� �� ������ ����� ��! ����� ������� � �� �/*24�/AA!
�������� 8!�! � %���� %!%! ����= 5��� �"�� ��� �� � ������)�� ����������� �� ��� ����� � ������ �� �� ���! &������� ���� �*=04�*=E!
���,����� '!� D���� � ;!� ������ .!� 9���� �!� :����� '!� D���� ��� ;!8!�.����))�� %!� -� �� 9!� &����� ;!� D������� 8! � '�� �� �!�! ����* $��� ��� ����� �� #��� �� �� �� ����� ��������� �6> ����������� ��� �� �� ���� �� ����� �� ����� ����! '�� +�� 0���� � �� //�4/0A!
����� M!'!� ����� &!� -������ M!� �� .��� .!� ����� � 5!� ������� � M! � -���M!-! ����2 ?� ���� . ������ �� + ��� ��� ����,����� ��� ��� � � � �� ��������� � �� (��� +�,������ �� ��� ����� #� ��� � ����� ��! � 1��� 2��� ���� /A6EA4/A6E�!
����� D! � ���� %! ����� � ���� �� �#��� ����� ��� ������ ������ ����� ��> � ������� ��� ��� ���� ����#�� ���! ���� ��� �6A4�26!
.���� �!� D��� �! � &������ �!-! ����/ 5� ����� ��� �� �������,������#����� ���� ���� �� ��������� ��� �� ��� �� ��������! ����� ������ � � ��� �������� ��� ���,#���� ���� ��#��� ��� �� ����#! � 1��� 2�� � ���� �*624�*2=!
.������������ M!� ������ 9!D!� 8���� �!�!� ����� ?!� 1��#� D!� +��� :!�7����� .!&! � %���� '!M! �/=== �/% ���� ��� � �� �� � � ����� ��!���� ���� 6=046��!
;����� %!&!� J��� 9!:!� &�������� 9!�! � %���� %!%! ����= -������ ��� ��� ��� ���� ���� �������� �� � ����� ����� ���,�� ��� �� ���������� ���� ��� ������! ������ ���� �2*4�26!
;������,<��� � -!� .���� � �!�! � ;������� �! ����� $��� ������������ �� �� �� ���� ��� ����� �� ������! &������� ��� /�6�4/�6*!
;������,<��� � -!� ;������� �! � .���� � �!�! �/=== -�������� ���������# �� �� �� ��� ���#> 3��� � ��� �� ��� � ����"�� ���! � ������� ���� /0204/0�=!
;(���� '!;!� ������� ?!%!� &��#�� �� -! � ���#����� .!5! ����2 $����� ����� �� ����)� ��� � ���� ��� ���� � ����� �� �� $;%,*� � ������������,����� �� ��� ���! ���� �� *AA4*EE!
?���� +!5!� D�(�� +!9!� %����� +! � ������ M!�! ���2A 5�� ��� ��
$��� ��� ����� �� ����#��)� ��� ��� �� �� *�6
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2
�������� �� ������ ����"� ��� ����� �,��� ��� �,����#��� ������ !+�� ��� 1��� � �� 0E�=40E�E!
1��� �#� M!� D��(�#� +!� ��������� 5!� %���� -! � ������ 8! ����2 $��� �������� �� �� �3�� �� ��� ���� ��� ��� ���� �! � ��� *2����� � ��� E0A4EA=!
+������� � �!�!� & �� �!;!� D������ �!�! � ��.�� ���� �!&! ����� ������ ��� ����� ���� ��� ����� �� ���� �� ��������� �� ����� ���� ����#�� ��! � �����2�� � ��� /0=�4/0��!
+������(��)� +!� -������ �! � ����� %!J! ���2A � ��( #����� ��� �� .�/G������ �� (� � #��� � �������� B��������� ������ ��! � 1��� 2�� ����� 0**=40*A=!
+���� P!�!� 9������ �!&! � 9������ �!9! ����/ ?��������� ���������� ���� ��� ��� ���� ��� �� � ��� 555� �������� ��� ������(��# �� ����� ��� �� � ������� �#�� ��� ���! � 1��� 2�� � ����/���A4/���2!
8����� �!� ��� ���� &!� ;������ ?!%! � &�������� �!M! ����0 5� ������������� �#����# ������� �� �� ������� �������� A�, �������� � ������������ ���� ��� �� ���(�� ��� ���� ��! � ��� &�� � ���� ��A4�==*!
M���� ;!�! � %���� %!%! ���2� +��> �� ���� ��� ������ ����"� +,��� ���������� �� ������ �#�� ������ ���! &������� ���� 6�=46�A!
9�)��� �! ���26 �� ����� �� A�,��������# �3����� ���� E�� ��� ���� �����#�� %'�! ���� 3�� � ��� � ��� 2�/A42�*2!
9�)��� �! ����6 %���#�� ��� �� �H+ ��� � ���� ��� ��� �� �� ����� ���#��� �� �� + �� ��� ��� G* �� � �� #������ ����� �� �� ������� ��� �� ��� ��� GA ��� GE! �+1( � � ��� /*2/4/*�/!
9��� (�� � ;!� J��� 9!:! � %���� %!%! ����2 5��� �"�� ��� �� �#��� ������� ��� ����� �� �� ���� ���� �������� �� � ����� �� ������! ���� ����64�/E!
������ �!� 8������ M!� &� �� �! � ����� D!�! ����� .������ ���� ����� ������ ��� ����! ���� �� 6�046/0!
��.�� ���� �!&!� D������ �!�!� +������� � �!�!� 1���� D!7!� M�������!�!� M���(�������� .!9! � D������ �!%! ����6 1��� ���� �������� ������ ���,�������#�� ����� �� ������� ��� �� ������� �� �� ��� ���� ����#��� ������� ���� ��� ����� ��! 1��� ��� +�� 1��� ��� ��� /6=4/62!
��� �� %!9! � &��#�� M! ����� ����#�,������,�� ����� -.% �� ��� ������ ��� ��# �������� #���! 1�����2��4���� ��� �=2/4�=2E!
������� � -! ����� ������� ����#� �� ������ ����� �� �� ��� ���� �!3��� ��� ������� � ��� *264A=�!
$��������� &! � &����� �!5! ����A + ���� �A ��� + ���� �E ����� �(��� ����� � �� ����� �� � ���������� .! � 1��� 2�� � ���� �A�6A4�A�2=!
%���� 9!M!� &������ &!D! � ����� D!�! ����0 � )��� ��#���)� ��� �������� ����� �� #��� �������� �� �� ���� ��� ��� �����! ���� ��� A�64E=�!
%��3����� &!� 1�������� .!� ;�� ��� .!� ��� ��� ?�#�� +!� �������� �!�.�����,%��� �!� ����� �!M! � +���#�� ;! ����2 � #��� ����� � ���� ��� ���� ����� ��"�� � ��( ���� ��� ����� �� ����� �� �����! '�� +�� 0���� � �� �0064�0*A!
%��3����� &!� & ���� D!� +�����,&�����)� 5! � +���#�� ;! ����� &�3�������� ��������� ����)� ��� �� �� ���� �� ���# �� �� ����� ���� �������� �� #��� ��/4�0! +��� 0������ ��� ��6/4��6*!
%��3����� &!� �������� &!� ����� �!M!� �����,������ <!� ��� ��� ?�#�� +!�;������ M! � +���#�� ;! ����2 ;� ���� ��� �� ���� ��� ����� �� #��� �� �� ����� #�����! ����� 0���� � �� /*04/A=!
&����� D!�!� ��(����,'������� �!� 5����� �!-! � &����� M! ����/ '���+ ��� ���,������ ����� ��> � #��� ����� �� �� � ��� ����� ���� �������� �� �3�����! 1��� ��� +�� 1��� ��� � ��� �A�4�E0!
&�������� +!�! ����* ;�������� ��� �� ������� �#�� �� �� ���� �������� �� ������! ������ ��� 66�46�=!
�������� 9!� &��#���� &!� 5����� 9!� ������ �!� 8������ M!� &� �� �!� &������8! � 8�#�� �! ����� 1��� ���� ���� �"�� ��� ��� ����� � � ��� �� �������� ����� �� �� ��#� ���� ��� ������! *�� ���� 3�� &�� 5&3� ��*=*=4*=*A!
<���� %!� .���� &!9!� &� ������� %!� '���)� M!�!� <���� D!�! � ���� %!����* ����#������ ��#���)� ��� �� ����� ���L�� ��� � �� ���� ������! ���� �� �2�4���!
:� )�� .!8!� $�� �!� :��������� .!� 9��)��(���� �!� +������� +! �8� � 8! ����� &����"�� � ��� ��� ��� � �� � ����� ���� ��� ����� ������ ����� ������� �� ����� ��������� ������ /�0 �� ��� ���������� ���� �! � ������� � �� 6*/E46*00!
7���� 8!� 5���� D!� $ ���� M!�!� 8����� �� �!� ��������� 9! � 1��� ���� &!����2 1��� ���� �������� �� � �������� ������ ����� ��! &���������� /064/*/!
*�2 5! +����� �� ��
� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2