10
A single olfactory receptor speci®cally binds a set of odorant molecules Isabelle Gaillard, 1 Sylvie Rouquier, 1 Jean-Philippe Pin, 2 Patrice Mollard, 3 Sylvain Richard, 1 Ce  cile Barnabe Â, 1 Jacques Demaille 1 and Dominique Giorgi 1 1 IGH, CNRS UPR 1142, rue de la Cardonille, 34396 Montpellier cedex 5, France 2 CCIPE, CNRS UPR 9023, rue de la Cardonille, 34094 Montpellier cedex 5, France 3 CCIPE, INSERM U469, rue de la Cardonille, 34094 Montpellier cedex 5, France Keywords: ligand binding speci®city, mouse odorant receptors, odor recognition, olfaction, structural motifs of odorant molecules Abstract The sense of smell is mediated by the initiation of action potential in olfactory sensory neurons during odor stimulation. However, little is known about odorant-olfactory receptor (OR) recognition mechanisms. In the present work, we identi®ed the structural motifs of odorant molecules required to activate mouse OR912-93 by detection of the odorant response using calcium measurement in cells transfected with OR and Ga q and Ga 15 proteins. The use of sets of odorants led to the identi®cation of ketones with an aliphatic carbon chain length > four carbon atoms and a carbonyl group preferentially located in position C2 or C3. The threshold of detection of these odorants is as low as 10 ±6 ±10 ±8 M. No other odorant ligand, out of 70 representatives of the odorant world, was active. The human ortholog of OR912-93 is not functional, suggesting that apart from a stop-mutation located at the 5¢-end that was corrected in the construct, it incurred other deleterious mutations during evolution. Introduction The remarkable sensitivity of the mammalian olfactory system to discriminate a vast variety of diverse odors results from the activation of neurons located in the olfactory epithelium of the nasal cavity (Buck & Axel, 1991; Mombaerts, 1999). The ®rst step in olfactory transduction consists in binding of odorants to olfactory receptors (ORs) expressed on the cell surface of olfactory sensory neurons (OSN) which initiates a cascade of enzymatic reactions leading to cell membrane depolarization (Shepherd, 1994). Olfactory receptors belong to the heptahelical G-protein-coupled receptor (GPCR) superfamily and are encoded by a large multigene family, initially identi®ed in rat (Buck & Axel, 1991) and then in most species (Selbie et al., 1992; Ressler et al., 1993; Ben-Arie et al., 1994; Freitag et al., 1998; Rouquier et al., 1998). To understand how ORs transduce the information represented by the molecular structure of odorant ligands, identifying speci®c odorants of chosen ORs is a fundamental prerequisite. The ®rst demonstration of an odorant±receptor interaction was performed in vivo using adenovirus-mediated gene transfer of the cloned rat OR-I7 (Zhao et al., 1998). In parallel, Malnic et al., (1999) developed another approach allowing the analysis of responses from individual OSNs exposed to a series of odorants before the identi®cation of the OR gene expressed by each odorant- responding OSN. In conclusion, the authors pointed out the combinatorial nature of odor perception. However, except in the single case of MOR23 (Touhara et al., 1999), it is not known whether a cloned receptor, when over-expressed, recognizes the same set of odorants that was originally used to identify the OSN from which it was isolated. Thus, an expression system in heterologous cells is necessary to study OR-ligand speci®city and to carry out detailed functional analyses of individual receptor proteins. However, the establishment of such systems has been labourious because ORs fail to translocate ef®ciently to the plasma membrane (McClintock et al., 1997) and various chimeric expression OR constructs have been engineered to allow functional expression in heterologous cells (Krautwurst et al., 1998; Wetzel et al., 1999). Here we used a combination of a new highly effective expression system in heterologous cells with a screening proced- ure used previously in vivo (Duchamp-Viret et al., 1999), to rapidly identify speci®c odorant ligands of OR912-93 in mouse and human. The system was validated using OR mI7 as a control (Krautwurst et al., 1998). In addition, the speci®ty of the identi®ed odorants was con®rmed in two different expression systems using a large-scale screening procedure. In mouse, the threshold of detection was comparable to physiological odorant concentrations (< 10 ±8 M). We previously characterized OR912-93 in a number of species including human and mouse (Rouquier et al., 1998; Rouquier et al., 1999), and hypothesized that because of signi®cant divergence from the other OR genes, it could bind a particular receptor-speci®c odorant. In this report, we ®nd that mouse OR912-93 was speci®c to aliphatic ketones. These speci®c odorants were then tested on human OR912-93. These ®ndings shed light on the nature of the speci®city of the olfactory receptors, and ultimately the combinatorial codes used in odor detection, i.e. how an odor is perceived and discriminated. Correspondence: Dr Isabelle Gaillard, 1 IGH, as above. E-mail: [email protected] Received 25 July 2001, revised 27 November 2001, accepted 30 November 2001 European Journal of Neuroscience, Vol. 15, pp. 409±418, 2002 ã Federation of European Neuroscience Societies

A single olfactory receptor specifically binds a set of odorant molecules

Embed Size (px)

Citation preview

� ������ ����� � ������ ���������� ����� ��� ���� �� ���������

������� ���� ��� ������ ������� �� ����� ������ ����! �� ��� "��� ��# ������ ��� ��� $�%���� & ���%��

������ '������� ��� '�������� ��� �������� �� �� ����� ��� �� �� ���������� ����� ����������� ����� �� ��������!� �� �� �"��� ��� �� �� ���������� ��"�� ����������� ����� �� ����� ���!� ��!�� ���� ��� �� �� ����������

��"�� ����������� ����� �� �����

��������# ��$��� %�����$ &����'���(� )��&� ������� ��������&� ���� ����$������� ��*������� &��������� )���*& �* �������)�������&

���� ��

( � ����� � ����� �� ������� �� � � ��������� � ����� �������� �� ����� � ����� � ��� ��� �� ��� ��� ����������) *�+��� �

������ �� ,��+� ���� ��� �������� � ������ -.�/ ���������� ��� �����) �� � � � ����� +� ,� +� ��������� � � �� ���� ������ � ��� �� ��������� ���� �� �� ������ ����� .�0�!�0# �� ��������� � � � ��� �� ������� ����� ������

���� ����� �� ����� � ������� +�� .� �� ��� �� ���1 � ������) ( � ��� � ���� � ��� ��� ��� �� � � ������������ �

,������ +�� � ��� ��� � ��� � �� ����� � �� � ��� ���� �� � ����� � ��� � �� ������� ������ �� �������� $! � $#) ( � � �� ��� � ��������� � � ��� ��� ��� �� � ��+ � �2343�235") 6� �� � ��� �� ������ ��� � 72 �� ���������� �

� � ��� �� +� ��� +� �����) ( � ��� � � ���� � .�0�!�0# �� ��� ��������� ���������� � � � � �� ������������

������ � � � 1����� � � +� �� ����� �� � � ����� ���� �� ���� �� �� � ������ ���� �������� �� ��� ���������)

��� ��������

��� ��������� ��� ��� � �� �� �������� ���� ��� � �� �

��������� � � �� ����� � �� ������ ���� ��� ���� �� �� ��� ���

�� ������ ��� �� �� �� ���� ��� ��� ����� �� �� ��� ���� �

����� � ���� ����� ������� � ���� ! ��� "� �� �� ���� ���

������ ��� ���� �� ������# �� ������ � ���� ��� ����� ��

�$% ������� �� �� �� ������ �� ���� ��� ����� ������

�$&' (���� ��� �� � � ������ �� ��)��� �� ���� ��� �����# � ��

�������� �������)� ��� �&�������� ���* ! $��� ��� ����� ��

����# � �� ��� ������ +,��� ���,������ ����� �� �+-.%

��������� ��� ��� ������� �� � ��#� �� �#��� ������ ��� ���

���� �"�� �� �� ����� � ���� ���� ��� ��� �� �� ����� �&����

�� ��!� ���/� %��� �� ��!� ���0� ���,���� �� ��!� ���*� 1��� �# �� ��!�

���2� %��3���� �� ��!� ���2 !

�� ����� ��� ��( $% ������� �� ������� ��� ������� ��

�� �� ������� ��� ��� �� ������ �#���� ���� �����# ����"�

������ �� ����� $% � � �������� � �����3��� �! ��� "�

����� �� ��� �� �� ������ 4����� �� �� ���� ��� (� ���������

�� ���� ���# ���������,����� �� #��� ������ �� �� ����� ��

$%,56 �7��� �� ��!� ���2 ! 5� ������ ����� �� ��!� �����

�������� ��� ��� �������� ��(��# �� ����� �� ������

���� ��������� $&' ������ � � ���� �� ������ ������ ��

���� �"�� ��� �� �� $% #��� ������� �� ���� ������ ,

��������# $&'! 5� ��������� �� �� ��� ���� �� �� ��

������� ���� �� ��� �� ���� ������ ���! 8�(����� ����� �� ��

��#� ��� �� �$%/0 �������� �� ��!� ���� � � � �� ���(�

(�� ��� � ����� ����� ��� (��� ����,�������� ����#��)� ��

��� � �� ������ �� (� ���#���� ��� � ���� ��� �� $&'

���� (���� � (� ��� ��!

���� �� �������� � �� �� �� ����#�� �� � ������� �

��� $%,�#��� ����"�� � ��� � ����� �� �� ���� ���� ����

����� �� ��������� ����� �� ��� ���! 8�(����� �� � �������

�� ��� � �� �� ���� �������� ������ $% ��� � ������ �

��"���� � � �� ���� �������� ���.�� ��� �� ��!� ���6 ���

������ �������� �������� $% ��� ��� ���� ���� ��#������� �

��( ���� ���� �������� �� �� ����#�� �� �9��� (�� �� ��!�

���2� :� )� �� ��!� ���� !

8��� (� ��� � ������� ��� �� � ��( ��#�� ����� ���

�������� � �� �� �� ����#�� �� (� � � �������# ������,

��� ��� �������� �� ���� �;������,<��� �� ��!� ���� � �

������ ���� ��� ����"� ������ �#��� �� $%��/,�0 �� ����

��� �����! ��� � �� (� ����� �� ���# $% �56 � � ��� ��

�9��� (�� �� ��!� ���2 ! 5� ���� ���� �� ����" � �� ��

���� �"�� ������ (� ���"���� �� (� �������� ��������

� �� ���# � ��#�,��� �������# ���������! 5� ����� ��

������ �� �� �� ��� (� ��������� � ������#��� ������

������ �� ��� �� �=42� ! :� �������� ������ ���)�� $%��/,�0

�� � ������ �� ����� �������# ����� ��� ���� �%��3����

�� ��!� ���2� %��3���� �� ��!� ���� � ��� ���� ���)�� �� ������

�� �#��"��� �����#���� ���� �� � ��� $% #���� � ���� ���� �

��� ����� ����� ��,����"� ������ ! 5� �� ����� � (� "�� ��

���� $%��/,�0 (� ����"� � ����� �� �� ���! ���� ����"�

������ (��� ��� � �� �� ����� $%��/,�0! ���� "����#

��� �#� �� �� �� ��� �� �� ����"�� � �� �� ���� ���

����� ��� ��� � ��� �� �� ������� ���� ���� ��� �� ����

�� �� ���� �!�! ��( �� ���� � ��������� ��� ��������� ��!

������ ����> ;� 5���� +������ �5+8� � �����!?,���> #�����@�#�!���!��

������� �� ���� ����� ����� �� ������� ����� ������� �� �����������

������� ������ �� ������������ ��� ��� �� !�"#!�$� ���� � %� ������ �� ������� ����������� &��������

"�� ��� �� ��� ���

�������� ������ ������� � �������� ���������

'���� (�"��)"� ��������

� ��(� �� 1�#! �� �� ����� $%��/,�0 �����#��� (�

������� �� � �� ������� ��� ��� ��� �%9A! ��� ������

�� � ��� �+��� +� � ���� �� ��� �� � �� A�,��� �� ��

����� $%��/,�0 �����# �3����� ������������# � ��� ��� ��

�� �� �� ������� ', ������ ������ (� ������ �� �� -.%,

�� �#���� ���# ��� ��� �� ���� �� � �� ������ ��1� A�,.��.�.���++�.�..+����.�����.�.�++.��+,0�� �%� A�,.��+..�+�+�� ���+,����.++�+�..���+�+��+,0� ���

*�� ����� �������� �& �� �#��� ! ��#���� �� ����� ��/4�0

�3����� (� � ����� ���� �3����� �� � ��� �� ���#�� #���

��(�� �� +��� � �������� �� � �� ����� ��������

�%��3���� �� ��!� ���� ! ��� ��+ ��������� #����� �� ��

���%5 �� ��� ��� � �! ����� �� �������# �������� (� ����

�� ������� ��#������ ��� �� � 9�)�� �3����� �9�)��� ��26�

9�)��� ���6 ��� � ����"�� ��B���)� �����#� ���� �#�� �58&

�3����� �+��� �� ��!� ���/ � ��� ��� �� �3����� �����# ��� ��

��������� ��� �?C9D5&??;D' �� �� ����� �,��� #��� �?���

�� ��!� ��2A (��� ���� �� �� ���� � �� A�,��� �� �� �����

$%��/,�0 �����# �3�����! ��� �,��� ��� ��� (� ���� ��

�� (��� �� 58& �3����� ��� �� ����� �� ', ������� 0� � ��

�#�� ��� ���� �����#� � �� � ���� �� �� �������� �� ��

����� �� �� �� �������� �� ������B��������� �����# ����� �

�� "�� ���! ��� �%9,��/4�0 ������� ����/4�0� 1�#! � (�

��� ���� �� �3������# �� �� � ����!

+���� (�"��)"� ��������

�� ���%54,��5 �/2 �� �� ��� ��� ���#��� �����������# � �

��� ��� ���� ��������� �� �+� � �� 0�, �� ����� ���� �� ��

���� $%��/,�0 #��� �%��3���� �� ��!� ����� +������ �������

������ �1�*E06/ (� ������� �� � �� ���%5F,��5,��#� ��

���/4�0 �������� ��� �� �1�#! � !

+���� (�)-� ��������

��� ��/4��6 ���� � �� ���� $%,56 �9��� (�� �� ��!� ���2�

+������ ������� ������ �1�=E==6 (� �� ����� �� -.% ����

���� #������ ;'� ���# ����"� ������ ��56,1�� A�,..�++,

�+����++���+�.�.,0�� �56,%�� A�,+��+��+++���+�+,

.���++,0� ��� ������� �� � �� &�5 �� ��� ��� � � �� �� �.%,

���� ��� &9�G �����# ��� �� �& �� �#��� ! ���%< ��� &��55

���3�� �� ��� ��� � � (��� ��� ���� �� �� �� �#���� �� �

��/��� ��6� ����� ����� �� �� � ���/4�0 ��� &9�G ,�56 �

�������� �����! � E*=,�� ���%<)&��55 �� ��� ��� ���#���

�����������# � �� ��/4��6������ �� ���� $%,56(� ���

������� ��,����� �� � �� ���/4�0 ��� �� �1�#! � ! ����

��� ��� ����/4�0 ��� �$%,56 (��� ��� ���� �� �3������#!

��� �������

1���� �� �� ���� ����� �� ������� (� � �������� #���� B����,

��� ��� ��� �+1- (��� �� ��� ��� ��! 1�� ���/4�0,+1- ��� �56,

+1- �������� +1- (� ������ ���� �?+1- �+������ �������

������ H6EAE� �� &���.,��5 ��#� ��� ��� �#� �� ��,�����

�� (��� �� &��5 �� ��� ��� � � ��� �� �� � �� ., ������ �� ��

$% ��� �� ,��5 � � �� �� ��� �� �������� �1�#! � ! 1�� ��

gccacc atg aag acg atc atc gcc ctg agc tac atc ttc tgc ctg gtt aac gcg gac atc atg gag cag aag ctg atc tca gag gag gac ctg ctt cga gga tct atg

M K T I I A L S Y I F C L V N A D I M E Q K L I S E E D L L R G S M

IHS sequence c-myc tag epitope

Cleavage site

100bp

TAA

TAA

h912-93

m912-93

SacIIEcoRV

StuI XbaI

A

EcoRVSacII

TAA

h912-93

mI7 TMII-VII region

B

EcoRI

100bp

15+! �! �������� �������� ��� ��� ! �� ��� �������� �������� ������� ��� ��� �A�,9�)�� �3����� ���������� � �� �����#��#��� �� � ����"�� ��B���)� �����##� �����#�� �3����� ����� ���� � � �,��� �#��� ��� �#��� ���� ��� �� $% �����#�3�����! ��� �����#� � � ��� �#����� ���� � ������ �� �� � ��� ��� ����(!.�� ��� ���/4�0 ��� ���/4�0 ���������� �� � �� �� �� �� �� ����! ������ ��� �� �� ������ �� � ��� ������ �� ��� ����+�� �� � � ��� � ������ �� �� ������� ��� ��� �� � ���� �� ! ����� � � ��� #����� �� �� ���%5 �� ��� ��� � ��� ���/4�0 �� (� ��� ��� �� ������� ��� ! ��� ����< ��� �� &��55 ���3���� ��� ��� � � ���� �� �� �� �#���� ��������� ��! ��� &��5 ��� �� ,��5 ���3���� ��� ��� � � ��� � #����� � �� $%,+1-��� ��� ��� ������� ��! �� �� ���%<#&��55 E*= �� �� ��� ��� ���#��� �����# ��� �� ��/4��6 ��#��� �� �� �56$% ���������� (� ����� ��,����� �� (��� �����%< ��� &��55 � � �� �� ���/4�0��� ��� !

*�= 5! +����� �� ��

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2

���/4�0,+1- ��� ��� � � &��5 �� ��� ��� � � (� �� ������� ��

�� �#���� � �� ��� ��� ��� �� �� .,��� ������ +1-

�������#!

������� ������

��� %��,���/4�0$% ������� �9��� (�� �� ��!� ���2�

.����������� �� ��!� /=== (� #����� �� �� �� ����#� ������

-.% �� ����� �����3�� ���� � � &��#�� ���� ! ��� �������

��� ��� �� 0� "� ����� ���� �� ������ �������� �� �����

(� � �� ���� ��,��# � $%��/,�0 �����# �3�����! ���

������ �������� ���#��� (� ����"�� ���� � �;'� ����

����� �������� �� ;� �!-! &����� �.��� �� ��!� ���/ ! ���

������� (� ����� �� � � �?�9�= �������� ��� �� �?�#�

���� ��� �; !

������ ��� ������� ���� ���� ��� ��� ��� ���������

�����

8?9 /�0 ��� ����"�� 8?9/�0 ��?�9����� �� (��� �� ���� ��

;�?� �5.' -�������� ���� 5��! .� ������� �� (� � �=I

�� � ��� ����� =!0 #FD D,#� ����� =!=A #FD ��� ������ ���

A= === 5HFD ��������! ?�� ������ ��� (� ��������� (� � A ��

�= � �=E �� �/E= <� A==�1� ���,%�� #��� ���� ��� ������ ��

�� ��� ������ ��� ������ �A= �� 9/8-$*� /= �� .80.$$9�

/= �� 9$8 ! 5� �� �������# �������� ���# �� � �� ������

�������� �� ;������,<��� �� ��!� ����� � $% ��� ��� ;'� (���

�� ������ �� (� � +��A �9��� (�� �� ��!� ���2� .�����������

�� ��!� /=== ��� �� �� � �� +�3� ����� +�3�+J ����� �� ��!�

���2 ����� ;'� � � ��)� �� -5-/ �#����# �� �(�� ��

������# $% � ���������� .� �$�������� � &����� ���A !

��� ��� �� � �%9,+1- (� �� ������ �� � � ��� �� �� ��

������ ��� ��"������! ��� �� (��� �� �� �� ��� �� ��� �� �

(�,(� ������� ��� ��F��� ��#� ,(� ������� ���

�D����� ���,��� ���! �AA06� ��� �66*=/ �� D��� ������#��

1����� �������� ��� �� (� � ��� D,���� ���� ��A �#F�D� �:

*= ===� &�#�� .������� &� D���� �$ ! ����, ������ �� ��

(��� �������� ����� �� ��� ����� ��� � �������� ����� ��

������ ��# 8?9/�0 (� � ��� �� �%9,+1- �����! 1�� ��#�,

��� �������#� �%9,+1- (� �� ��� � ������ ��� ��� ��!

�� �� ��� ������ ���� �� �� (��� ����� �� � �/ �� �������

��� �� �������� (� � ��� D,���� ����! ������� ��� ��"�������

(��� ������ E=I!

���������� ��� ����� ������

������� �� �� (��� �� �� �� � ��#� ,(� ������� ��� ��� ��

�������� (� � ��� D, ���� ����! .� (��� ������ (� � ������ �,

�������� ���� �-�& ��� �����# �I �&� ��� �,��� ��� ���

������� �� �� ������ �� ����# �� (� �� �� �� �� ������ ��#

(� � �� �� �,�,��� �������� �� ����� �� ?�=� �� ! K&.,*=� &�� �

.��) ��� ������#�� .� � � � > /== ��� ��� �� ������# �� ���

��� *A ��� � 06 �.! ���� �� (��� ������ �� �� ��� ��� ���

���L�#� �� ��"��-��� 1���� / ���#��� #�� �� �,���� 5#+ �M�����

5������������� ���! ��A4=6E4==0 � "��� ��� �= ��� �� *I

��������������� �� -�& ��� ����� �� ���� ��# ������ �#�

���� ���! �$�� ������� ����!� 1� �� .� �� .� ! ��� ���� ���

�� ����� (� �� �� �� �� ��� ������# ������� ���������

������ � �� ����� �� ���������! ?��� � ��� (� ���� �� �

A�E �� ��� ������ (� " ���� � E/= ��! +1- B��������� ��

����� ��� ��� (� ����� � �� �� �� �� ����# �� �� �������

���������! 1��������� �� +1- (� ���� �� ���# � *22,�� ��#��F

���� �� ���� ��� ��� �� B��������� (� �� �� �� (� � A�A4A*=,

�� ���� �� " ��!

������� �������

��� ��� ���� � ���� �� ���� ��� .�/G,��� ��� ��� 1H%�,/ (� ���

��� N.�/GO� ���#��# ���� �� ��#� �� � �������� ��������

�+������(��) �� ��!� ��2A ! ����B�� ������ �� �� (��� ����� ��

������ ��� (� � /!A ���FD �� �� ��� ����� �� � �� �� 1H%�,/

��� =!=/I -������ 1,�/6 �1H%�,/F�� ��� -������� �������

-���� 5��!� ?�#���� $% � �� D���� ������ ��� ��> '�.� �*=� 9.� A�

98/-$*� �!/� �#&$*� �!/� .�./� �!2� #����� �= ��� 8?-?& �=�

�8 6!/ ! ;�� �����# (� ������� �� ��� *= ��� � 06 �.!

1�� �� "� �������# ����# �� ��� �� ������ �������� ��

;������,<��� �� ��!� ����� � �� ����� �� (��� ���3��� �

����� ����� ��� �� D���� ������ ��� �� (�,(� ������� ���

(� ����� �� �� �#� �� �� ����� �� ��������� �$���� 5P6=

�3������ ��� ���B���������! 1�� ���� ��������� � ���� � �� ���

(� ����� ��� �� ��� A= �D (� ������ ������ (� � �

��������� � �� � �� �������! 5����� ��� (� ��� � D&%

&��� ����&�?% ���������� �� ������ � �� ��������� " ��

(� � � H<, �������� �� ��L�� ��� �H���F0*= /= � F�!0A ! ���

���#� (� �� �� �� (� � �� D&% � ����� �/F�* �� ����� ������

��#� � ������! ��� �?%D5' � �� ��?%D5'� D��� &������

%������ D�;� .������#�� H9 ��� ���� �� ������ �� ���

������� ��� ��������� ���#� �� ����# ��� �����! ��� �� ��� � ��

B������� �#� ������ � A�= ��� ���# ���� � ��� � 0*= ���

02= ��� (� ���� ���� ���� ���� ��#� 1H%�,/,����� ��! ���

�� �� �� B��������� ������ (��� ���� �� � 0*= �� � ��

��������� ���� �� 1H%�,/ ����� � .�/G � 02= �� � ��

��������� ���� �� ���� 1H%�,/ (� ��� � �� ����� �� N.�/GO��

(� � �� ������� �� �� �� �� �#������# �� ������� �� �� ������� ����

������! $�� +1- ��� ��� �� (��� ������! 1�� ��#�,���

�������#� �� �� (��� ����� � �������� ����� ��� ����� �� � �

����� � ���� ��� ���� �� �,�������� ������� ������ ��������#!

$�� �� ��(��# �� � �+1- ��� 1H%�,/ ������ B���������

(��� �������� (� � �� �� ���"�� ����� ����#�,������ ������

������ �-�� ���P +�� 5�� -����� �� 5� ����� � ���� ��� 'M !

.����� ��3��� ��� �� � (� /== � ��� #������� N.�/GO� (�

������� ��� �/= ! N.�/GO ����#� (��� ��3����� (� � �� �B���

�H������ ���#��# ����! :� .�� ��� -� ��� ������ (� � 5#��

-�� 0!�E �� (��� �:����� ���� 5��!� D��� $(�#�� $% ! ���

������ � (��� ������,�L�� �� �����# �4�= ! 1�(,�� � (�

��L� �� � ��( � ����(� �� �� � �� ��� (� ��� �= !

!�����

��� ������ � �� ������ ���� � �������� �� ;������,<���

�� ��!� ����� ��� ��� �������� �������� ����� ��� � ��

��� ��������� /,��� ����� ��� �����! 5� �� ��� �� ����

$%��/,�0� ��� ��� �#�� (��� �������� ���# �� � ! $�����

�� ��� (��� �������� � � � ��� �� ���� �� ������� �;�&$ �

�������� ����� �� ��#��� ��� (��� ��� ��� �� (� � D���� ������!

� �� �� ��� (��� ��� (� ��� � �!

1�� �� ��#�,��� �������#� �� ���(��# 6= ������ (���

� �� � �== ��>

� &� �> /,��� ���� /,������� /,��� ���� �,�� ���� /,�� ����

/,������� �,������� /,������� #������� �� ������

� &� �> ������� ��� ���� �� ���� ������� ������� �� �����,

����� ���� ���������� ��� ���� �� ������ ��������������

� &� .> /,�� ������ /,��� ������ /,��������� /,��� ������ 0,

��� ������ *,��� ������ /,�� ������ /,��������� /,��������� ��,

������ � ��

� &� ;> ��� ��������� ;,�������� D,�������� ������� ������

������������� ������� ������ /40,��� ��������� /40,�� ���������

�������� �������

$��� ��� ����� �� ����#��)� ��� ��� �� �� *��

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2

� &� ?> ��������� ����)���� ������� /,���� � �� ��������)����

/,��� �,0,�� ������)���� /,�� �� ����)���� � ���� ������)����

���)� ���)��� ���� �� ������� ��������������

� &� 1> ��������� ����� ���� ���� ����� �������� ����� ������

����� �� ������� �� �� ��� ���� �� ��� � ������� �������

����� � #����� ��� � �� /,�� �� ������ �����

� &� +> ����#���� ��#���� #������ ������ ������� ��� ���,

���� ��� �� ��� �� �,������ �,������� ;,�������� D,�������!

� ������ ������� (��� �������� ���� ������ ����� 0,

��� ������ *,��� ������ /,�� ������ /,��������� /,��������� /,

�������� ��� /,��� ������ �������� �� D���� �� �� ��� D ��

1�����!

�������

�������� �� ��� � ��������� � ���" �������

H���� �� �� ����#�� ��� ����� $% ��� ������� ��� ��� �

������ � � �� ���� �������� ���.�� ��� �� ��!� ���6�

+������� �� ��!� ���� ! %���� �� (� �������� ���� ���� ��(�

�� �� ���� ��� �� � �������� ', ������ �#��� �9��� (��

�� ��!� ���2 �� � A,8�0 ����� �� ', ������ �3����� �:� )� �� ��!�

���� � �� ����� $% ����� � �� �� ������ ����)� ��� �� ��

����� ��! 8���� (� ���� � ���� � ������� ��B���)� �����#� ����

�#�� �58& �3����� � �� ��#�����# �� $%��/,�0� ������ � (�

����� �� �� �� ���� ��� �� �� �#�� �3����� � �� ����� �/

�������#�� ����� �� ��� �� �� � (���� ������� �� �� �������� ��

�� ���� ���� ��� ��� �� �� �������� �+��� �� ��!� ���/ �1�#! ��

��� �� �� ��� �� ��� !

5� �� ����� (���� �������� $% ������ �� �� 8?9,/�0 ��

(��� ������� ��� ������ � ������� � �� ���� �������� ���

(��� ��� ��� ��� ����� �� 58& �3�����> �� ���# �� $%,+1-

��� ��� � �� �������� �� +1- ������ � ���/4�0� ���/4�0 ���

�� �56 ��� �� �1�#! /�� . ��� ? (��� �� �� �� �� �� �������� ��

����# ��� ��� �� ������ �� �������� �� �� �� ������� �,���

��� ��� (� �� �� �� �� �� ���� ��� �� ������ �����# ����� �

�� "�� ��� �1�#! /�� ; ��� 1 ! � � ��� �� ��� ������ ���

��"������� � �%9,+1- ��� ��� (� � ��� ���� �� ������ ��

(� � �� $% �������! �������� E=I �� �� ������� +1-� ���

/AI �� �� +1-,��� ��� �� ������� � �� �� ��� ����� �� $%

�� �� ���� ��������� ������ ��# �� ��������� �� �AI �� ��

�� ����� ��� ����� � �� �� ��� ���� ���� ����� ��! � �����

������ �#� (� ������� ��� �� �������� �� $% �� 9��� (��

�� ��!� ����2 ! 8�(����� �������� � � ����� �� ��/% (���� ��

������ � ����� � �� ���� �������� (��� ����� � ���� �����

������� �� ����� � ������ �� 8?9 �� �� ���# ��������,�/%

������� �.����������� �� ��!� /=== ! � ����� ������ ��� � ��

�� ���� ���� �������� �� $% �� �� ����#�� � �� ��3����

����"� ���������� � �������� ��� ���/��� ����������

������ �;(��� �� ��!� ���2 � � ���#� ��� ����� �� ���� �� ����

����� �� �� ����� �� !

��� ���� ���� ����� �� ������ � ��#� �� ����� �� ��3���� ��

��� ����� ��"���� � (� � � ����� ����#�� � �� �� �������

� �������� ������ ���� �#��� ������#! 5� ���� ��� �#����#�

�� ��� �� �� ���- �� �(�� � ��( 3�� � (� � ������ ��� ��

���� ���#� ����� �� �� �� ���� �"�� ��� �� ������)�� ������

�� +�� ����� ����� ��� �� ����� ����� ��� �� ��� �� ������ ��

�� ���� ��� ���� �M��� � %���� ��2�� ������� � %���� ���=�

;���� �� ��!� ���= ! 8���� �� ����� � ����� � � ��� ���� ����

������ (� ������� $% (� � ������� �� +,��� ��� � ����� !

+��A � ���(� � ����� � (��� ���#� �� ����� �� � ����������

. �.����������� �� ��!� /===� $�������� � &����� ���A�

15+! /! ?������� ��� ����)� ��� �� �� 58&,$% ��� ��� ! $% ��� ��#� �� � �� ���� �������� �� 8?9,/�0 �� ���# � ������� 58&��� ��� � �#�� �3�����! ;���� ������� ������ ��� �� ����# �� ������ �� (� � �� ���/4�0 �� ��� ���/4�0 �. ��� ��� ��� �����##���� B������� ��� ��� ���� � �� ., ������ ��� ���"���� ���������� �� $% �� �� ���� ��������! 5�����B��������� �����#�� ���,���������)�� �� �������# �� ���/4�0 �� ��� ���/4�0 �; ��� ��� ������� �� �������� �� �� �,��� �# ��� ��� �� ���� ������� ������ �� �� ���� ��������! ��� �,��� ��� ��� (��� �� �� ���# �� �?�= �� �,�,��� �������� �� �����! �?4+ .�� ����������� > �56,����"� �#��� ��� ��� ���� � �� �� ������� .�/G

����� �� �� ���������# �$%,56� +��A, ��� +3�+�,��� ���! �?41 �������� ���#� �� 8?9/�0 ������ �� (� � �� �56,+1- ��� ��� �? ��� �� �56 ��� ��� �1 ����� �� �������� �� �� ����� �� �� ������ ��������! �+ ��� ���,������� �� ������� .�/G ������� ��1H%�,/ ����� 8?9,/�0 �� ������ �� (� � �� �56 ��� ��� ��� +��A

��� +3�+� ����� ��� ���� ! ��� .�/G � ������� � ��� �� � ���������� �� �Q�EI (� ��� �� ������ "��� � R �2= ��� ������������� ! ��� ��� ��� �� ���� ��� �� ��� ��� ������ ��� ��������� �� ���# �� ����� �� �� #����! '� .�/G �#�� (� ������� ������, ������ �� �� ���� ��� ��� ������ ��� ���#� ����� � R �/=� (���������� ! � �� �� ���� ��� �� �� �� ����� ���� ��- ��== �� ������� � .�/G ������ �� � �� �� � ��!

*�/ 5! +����� �� ��

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2

9��� (�� �� ��!� ���2 � ��� +�3�+J� � �� � �� +� ����� � ��

����� ���� ����� � ����� � �� +�F� +-.%4���������� . �����

�� ��!� ���2 5� �� � ��� �� �� ���� ���� ���� ��� (� � ��������

�56 ������� �� 1H%�,/,����� ��#� �� ������� �� ������,

��� �� � �� ��� ��� �� � �� ������ �� �� ��� �� �� � ������

������� �� �� ������� .�/G �1�#! /+ � � �������� �������� ��

9��� (�� �� ��!� ����2 ! ��� ��� ����� �� � �� ��� � �� �

���� ���� ��� �#���,����"�! :� �� ����� �� �� ������ (�

�������� �� ������� ��,+� �9��� (�� �� ��!� ���2�

.����������� �� ��!� /=== ! 5� ���� ���� (� ����� �� $% (���

�� ���� ���� (��� ��� ��� ��� ������ � +1-!

�����#���� �����#� ������� ���� !��$�%��

&������/ ���� ��

��� �� ������ ��� �� �� ������� ����� ��� ���#� �� � ��� ����� $%

� ���� � �������� �� ������ �� ������ ���� �#��� �������#

�� ��3���� �� ������� ���#� �� ������ ! 8�(����� ;������,

<��� �� ��!� ����� ���� ���� �"�� � ������ � �� ������

������� � ��� �� �� 3��� � ��� ���� ��� ���� �;������,<���

�� ��!� ����� �� �� ��� �� ��� ! ��� ������ � (� � �� ��

8?9,/�0 �� �� ������ �� (� � 58&,���,���/4�0 ��� ����,

��� ��,+�! � ��(� �� 1�#! 0� � ��� �� �� ������� .�/G (�

������� ���� ���� ��� (� � �== �� �������� � � ��� (� � /,

��� ����� ��� � �== ��� � ��! � � ��� �� ��� �� ���� � �� ��

� ������� � ��� �� N.�/GO�� ��- ��== �� (� ��� � �� ��� ��

���� ��������� ������ 8?9,/�0 �� ���� �� ����� -/J ����� ��

������ � �� -5-/ �� �(�� ��� ����#���� +,��� ��� �8����

�� ��!� ���0 ! ���� ��������� � ���� (��� ��� � �� �� ����

��� �� ��� ���� �� ����� ���!

��� ������� ������ (� ����� ��, ��� +��A +3�+�,��������

������ �� �� (��� �� �� ������ �� �� ��� (� � $% �1�#! 0. ��

+,��� ��� �1�#! 0; ��� �� ��##�� .�/G ����#� ���� � � �==,���

��#��� ������ ������ �� ���� (��� � ���# ������� �� N.�/GO� (�

�������� �� �� ���� ��� (� � ��-! 8�(����� �� �����# ������,

���� (��� ������� ���# ��� ��� �� �� (� +,��� ��� ���

��(� !

&���� �� ���� ���'� �����

%���� ���� ���� ��(� �� �� ��# � �� �� ������ ����� � ��

����� �� ��� ��� �� ������� �� ������# ����� �� ������

�9��� (�� �� ��!� ���2� ����� �� ��!� ���� ! ������ ���/4�0

�������� � � �� /,��� ������ �� /,�� ��� (� � ���� ���������

� �� ����"� �#���� ���� ��������� /,�� ��� (� � ������ �����

��# � (��� �����! �� ������ � ����� ��� ��� � ���������� ��

�� ������ �� ����� �� ������� ��� ��� (� �������� �� �����

������ ����# �������� ������ � �� �� ��� ��� ������ ���

��������� ��� �� ��� ! 1�� � #���� ������ �� ��� �� �� � ����

������ �.* � .�= ����� (��� � �� �� ����� � ��� ��������

��� �� ������ �#� �� �� �� �������� � �� ���� ���� ���

�� (� �� �������! �� ������� �� N.�/GO� (� ������� ��� ��

���� /,�� ��� �1�#! *� ! 1�#��� A ��( �� ������ ���"� ��

���/4�0 ������ �� �� ���� �� (� � /,�� ����� �.* � /,

��� ����� �.6 ��� /,�������� �.�= � � ��! :��� /,��������

��� /,��� ����� ������� �� ������� �� N.�/GO� ��� �EI ��� �0I ��

������ �� ��� ����� ����� /,�� ����� ��� �� �� � ������ �� ���

EI �� ��! ��������� � � �(�� ������ �� ��� ��=42� � � �����

������ (� �������� ��� ��� /,�������� ���I �� �� ��� /,

��� ����� �6I �� �� �1�#! A ! ���� ��� ����� �� � �� /,

�� ��� (� � � ������ ����� ��# � �� ���� ���� � ����� ������ ��

������# �$%��/,�0! '���� ���� (��� �(����# �� ������

������ �� ��� � ������#��� ���� ��=42� � � ������ ������

����� ��# � �� ���� (� ��3�����!

(�� ������� �� �� � ���'�"� ����

��� ��� ��� ��� �� �������� � �� ������� �� �� ������ 4$%

�� ���� ��� (� �� �������� �� ��� ��� ��� ��� �� �� ���� ����

#���� �� �� ����� ������ �����! �� ��� ��� ������ ��� (�

������ �� ������ �� �$%��/,�0 � ������ ������� ������ �

aniso

le

isoam

yl ac

etat

e

isoam

yl ac

etat

e 1µM

cam

phor

acet

ophe

none

2-he

ptan

one

2-he

ptan

one

1µM

(R)-(

+)-lim

onen

e

(S)-(

-)-lim

onen

e

O

O O

B

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

0 100 200 300sec

2-Heptanone 10µM 100 µM

ATP

0.7

0.8

0.9

1.0

0 100 200 300 400sec

2-Heptanone 1µM

ATP

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

0 100 200 300sec

ATP 2-Heptanone 10µM 100 µM

0 100 200 300 400sec

0.7

0.8

0.9

1.0

1.12-Heptanone 100µM

ATP

F340

/F38

0

F34

0/F

380

F34

0 /F

380

F34

0 /F

380

C

D E

A

15+! 0! &�������# �� ������ ����"� � �$%��/,�0! �� 1H%�,/,�����8?9,/�0 �� (��� ������ �� ��� � �� (� � �� ��� �� ������ ��"��� �� ;������,<��� �� ��!� ����� ! ?��� ������ (� �� �,������ � ��#� ������ �� ��� ��== �� � ��� ��� ��������# � ��� ��� �#���/,��� ����� ��� ����� ��� � � (��� ���3��� � � �� � � �(�������� �� ��� �� �� ! ��� ������� �������# ������ �� �� �$%��/,�0 � ���� �� �� ������ (���� ��� ������ �� �� ���#� ,������� �� ���#����! ��� ���������� �� �$%��/,�0� +��A ��� +3�+� ��� ��� �� ���� � ���# .�/G �#�� �� �0I �� �� (� ��� �� ������ "�� ���� ���� ��� (� � � �� �� �,������ /,��� ����� �� R *== ��� ������������� ! ��� .�/G �#�� � ������� � ��� �� �������� ��! 5���� �� � ���� ��� �� �$%��/,�0 (� � /,��� ����� �� �� ������ ��+��A ��� +3�+� �� R 0*=� "�� ��������� �. �� (� � +��A ��� +3�+�(� ��� �$%��/,�0 �� R �2=� ���� ��������� �; ���� �� #����� � �.�/G �#�� ���� ���# � �==,��� ��#��� /,��� ����� ������ �� ���! '������� ,������� .�/G �#�� (� ������� �� ����, ������ �� �� �? ! � ���# ������ �#�� (� �������� �� �� ������ ��� �� �== �� ��- �� � �� �� � ��! ��� ��� ��� �� ���� ��� �� ���� �� � ������ ��� �� /,��� ����� ��� ������ �� ���# �� ����� �� �� #����!

$��� ��� ����� �� ����#��)� ��� ��� �� �� *�0

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2

� ���3�� ������ �� ��� �� �� � �� ������ �� ��! � ��(� ��

1�#! *�� �� ������� �� �� ������4���#�� �����,���� � �������

�� �$%��/,�0,������ ������# ������ �� ��� �� � /,��� �����

��� /,�������� �1�#! *� � �� ������� �� N.�/GO� (� ������� �� ��

������ ��� �� ������ ��� ���� ���� #���� �� /,��� ��� ������

#���� ! ��������� �� ��� ��� �� �� ������� #���� �� �� ������

����� � �� �� ����� �� ������ ��� �� �� �#��� ����#�� ���! 5������

�$%��/,�0 ��� �� �� ��� �� �� ��� ���� /, ��� 0,��� ����� ���

(���� �� ������� #���� � �� ��� ��� .�� ./ ��� .0� ����� �����

�� �� �� *,��� ����� ���� ��� .* � �##� ��# �� �� �������

#���� � �� ������� (��� ������ ����� (� � � ���� ������

� �� ��� ����� �� �� � ��� �1�#! *. ! 5� ���� ���� (� ���� �,

#� �� �� ����� �� �� ������� #���� ��� ��� �� ����� �� ������

�� ���� � ��� ������ ����� �/,�� ������ ���� ����������

�� ���������� 1�#! *; ! � ��� ��� �#�� (� �������� ��� ���

/,�� ����� �. R $ �� ��� ��� ./� ���� ��� � ��� ��� .0 � ��� ��

��� �� ��������� ���� ��� .� �� ���� ���������! ���� �� � ��(

�� �$%��/,�0 ����#��)� ����� �� ������ (� � � ������� #����

��������� ��� �� �� ��� ��� ./ �� .0 �� �� ����� ������ � (� �

/, �� 0,��� ����� �1�#! *. !

$����� ��� ����� �##� �� �� ������� �� � �������

#����� � ��� ��� �� �� ������ ������ ��� �� ��# � �� �� ������

����� ��� ���,�� ������� �� �#��� ����#�� ��� �� �$%��/,�0!

&����%����� ���������

�� ����� ��� "����# �� �$%��/,�0 � ����"� ��� ����� ��

�� ��� ��� � ����� � ��� ��������� � ��������� (� � �� � ��#�

� �� ������ ! &���� � ������ ��� �� ���� ��� �� ���� ���

1�#! E� (��� ����� �� ���� ��� ��� � �� �#��� (�

��� ��� �� �$%��/,�0! ��� "� ��� ��� � �� ������� 58&,

���,�$%��/,�0 ����� �� ������ ��� �� ����� � � ����"��

��������,$% ������� �9��� (�� �� ��!� ���2 ��#������� �

�������� �� .����������� �� ��!� �/=== (�� #����� �� ��������

����� �� ���# �� "� 0� ����� ���� �� �������� ��� ������

�������� � � ����� �� �/%! �� ������� �� �������� ��� ��

�/% �������� � �?�9 �������� � �� �?�#� ���� ��,�; (�

���! ���� �� �� ����� (� ��� ��� �� � ��������,�$%��/,�0

������� ����,�$%��/,�0 �� (� ������ �� �� �?�9����� ��!

5� ������ (� ����"�� �� ��������� � ����� ��� �� �� ������

���#��# ��������� ��� �� ���� ��� �� ��� �� �� � ��� �

2-Heptanone

0

02- butanone

02- pentanone

02- hexanone

02- heptanone

2- octanone

0

2- nonanone

0

2- decanone

0

+

+

+

+

+

+

+

10-6M

-

+

ND

+

+

+

+

10-8M

A-

-

10-6M

B nonane

0H2-heptanol

C 02- heptanone

+

+

+

-

10-6M

04- heptanone

0

3- heptanone

heptanal0 D +

-

-

10-6M

2- butanone

isobutyraldehyde

butyraldehyde

0

0

0

15+! *! %�"����� �� �� �������# �� �� ������ ����"� � �$%��/,�0! ��� �������# � ��� ��� �� /,��� ������ (���� (� ������ �� �� �� ��������������# �1�#! 0 � �� � �� � ��� ������ �� �� ������� �� ����"� � �$%��/,�0! ��� �������# ��������� � �� ��� ��� �� 1�#! 0! �� 5���� ������ �� ����� ��# �> /,�� ��� (� � ����� ���� *4�= ������ � �� (��� "� � �� � �=4E

�! .*� .6� ��� .�= /,�� ��� (��� ���3��� � � �� � �=42��

��� .6 ��� .�= /,�� ��� ������ � ��� ��� �#��! �� 5���� ���� �� �� ���� ���� #����> �� ������� #���� �� /,�� ��� (� �� ��� ������� ������� ��������� �� ��� ��� #���� ������� ��� ��� ! 5� �� � ���� ��� ���� � ��� ����� ��� ��������� ��� ������� ��� �� ���� � ��� ��� �#�� (��������� � �=4E

�! �. 5���� ���� �� �� ��� ��� �� �� ���� ���� #����> ���# /,��� ����� � � ����� ������� (� � � .6 ������ ����� ��� � �������#���� �� ��� ��� .� ���� ��� � ./ �/,��� ����� � .0 �0,��� ����� ��� .* �*,��� ����� (��� ����� � �=4E

�! ?���� *,��� ������ � �� ������������� � ��� ��� �#��� �##� ��# �� �$%��/,�0 ����� ���� �� ������� #���� (��� � � B����� �� ������ ����� �� � ���� ������ � ��! �; ������ ��� �� �� ������� #���� ��� � ������ ������ ����� ��# � ��� �� � ��3����� � ������ � ��� ��� �#��! :��� � �� � �=4E

�� �� ��������� ������� ��������� �.* ��� .0 ����� ��# � (� � �� ������� #���� �� ��� ��� .� ��� �� ���� � ��� ��� �#�� ��� ���� � /,�� ����� �.*,����� ���������� #���� �� ��� ��� ./� �� �� ��� � ! $����� ��� ��� ��( �� �$%��/,�0 � ����"� ��� �� ��� (� � �� ������� ����� �� � ���� ������� �� ��� �� ������� #���� �������� ��� �� ��� ��� ./ �� .0!

*�* 5! +����� �� ��

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2

��)���)� �� ���� �� �� �� ��� ��� ��� ���� ��� ��� �� �� ����� ��!

N.�/GO ����#� (��� ������� ���# � �� � �������� � �� ��� �

�� ��� (��� ������,�L�� �� (� � � ������� )�� ������ � ��� �0 !

��� ��������� � (� ��� ������ ����� �� �� �����# ��

��������#� �= ������ ������ ������ ���! � ��(� �� 1�#! E�� �

���# ��� ����������� �#�� (� ������� ��� �� (� ��� ��� �

(� � �� ������ � . �� ��� ��� �� ����� �� �� ��� �.* � .�= !

'� �#�� (� �������� �� �� � � �= ������ ��� �� � ��� ������

� ! 5� �� (� � ��� ������� ������ ��� �� ����� �� �� ���

�� � �#��"��� � ������� ������� ������ ��# � ����� �)� ���

����� �� � ������ ��� �� �� ���� ���� $% �1�#! E. ! :��� ��

������ (��� ������� �� N.�/GO �� ����� � ������ ��� �� ��

�= ���� �� ���� ���� ������ ��� (� �� ��"���� � ������� ��� ��

���� ��� �� �� ������ �#�� �1�#! E. !

(�� ����� !��$�%��

& �� ��# ���� �� ���� ��� �� �� ���#�� $% #��� ������

����� �� (���� ���� �� ��� �� �� ������ � (� ��� /,��� �����

��� /,�������� � ���� � ����� $%��/,�0 ��$%��/,�0 ! ���

(��, ��� �3����� �� �$%��/,�0 ��� ��� �� ��4����� �� �����

��� �� � �� A�,��� �� �� �����# �3����� ������������# �

��� ��� �� �� �� �� ������� ', ������ ������ � (���� (�

������ �� �� �� �#���� �� �� $% ��� ��� ���/4�0 �1�#! � ! &���

���� ��� ������������� ������ (��� �������� ��� � �� ��(� �

0A. 2-Butanone

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

100 200sec0

ATP

2-Butanone 10nM

F340

/F38

0

0 .7

0 .8

0 .9

1 .0

1 .1

100 150sec 0

ATP

2-Butanone 1µM

F34

0/F

380

0B . 2-Heptanone

0 100 200 300 400sec

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

2-Heptanone 10nM

ATP

0 .7

0 .8

0 .9

1 .0

1 .1

0 100 200 300 400 500sec

2-Heptanone 1µM

ATP

F34

0/F

380

F34

0 /F

380

C. 2-Decanone0

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

F34

0/F

380

0. 7

0. 8

0. 9

1. 0

1. 1

0 100 200 300sec0 100 200 300 400sec

2-Decanone 10nM

2-Decanone 1µM

ATPATP

F34

0/F

380

0.7

0.8

0.9

1.0

1.12-Butanon e 100µM

ATP

F34

0/F

380

100 200sec0

0. 7

0. 8

0. 9

1. 0

1. 1

2-Heptano ne 100µM

ATP

F34

0/F

380

500sec4003002001000

0 .7

0 .8

0 .9

1 .0

1 .1 2-Decanone 100µM

ATP

F34

0/F

380

3002001000 400sec

15+! A! 5���� ���� �� �� ������ ����� ��# � ��� �#��� ����#�� ��� �� �$%��/,�0! 5� 8?9,/�0 �� ������ �� (� � ���/4�0� +��A ��� +3�+�� � ��� ��N.�/GO� ���� �� ������� �� /,�� ����� � � �� �EI �� ��� � R �*= ��� (� ��������� ��� �� ���� � /,��� ����� � � �� ��� �= �� N��� �� ���� �0I �� ��� � R *==� ���� ��������� ��� ������ ���� 6I �� ��� � R �/=� (� ��������� O ��� /,�������� � � �� ��� �= �� N�.� �� ���� �EI�� ��� � R �2=� ���� ��������� ��� ������ ���� ��I �� ��� � R /==� ���� ��������� O! ��� .�/G �#�� ��� ������� � ��� �� �� �������� ��(� ��� �� ������ "��! 5� ��� �� � /,�� ����� � �= �� ���� �� #����� � � .�/G �#�� ��� ����� ���� ! ��� ��� ��� �� ���� ��� �� ���� �� ������� ��� �� ������ ��� ������ �� ���# �� ����� �� �� #����! '� .�/G �#�� (� ������� �� ���� ������ �� �� �� R �/=� (� ��������� ��4.� ��#� ����!

$��� ��� ����� �� ����#��)� ��� ��� �� �� *�A

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2

������ ��# �� �� ������ ��� �� �� ��,����� (� �� ��"���� �

�� ��� �� ����� ��/4�0 ���� ���!

'���������

$��� ��� ����� �� ���� ���� ���� �"�� ��� ���� �= ���� ��

������� ���"�� �� �� �� ��� �� ���� ���� ��� �� �� �� �� �� ����

�������� ���� �� ���� ������ ��� � � ����� ����� ���!

5������ ���� � � � ���(� ���� �� ������� ��� �� �� ���� ���

��"������ (���� �������� �� � ������� �� ��� ������� �� ���,

��� �!�! (���� ������ �� ��� �������� ��� �� ���#� �� ����

�� �� ���� �� ���� � � �� �� ���� � �(�� ������ �� ��� �� ��

��������� ��� ��(��!

5� �� (��� (� ����� �� � �� ���� $%��/,�0 (� ����"� �

����� �� �� ���! ��� ����� ��� �� ���� ��� ��� �� ������� ���

������� � ����� �� ������#> �� �$%��/,�0 ����#��)� ���

����� �� ������ (� � � ������� #����� ��� ����"� ������ ���� �

���#� ������ ����� ��# � �� � ���� ������ � �� (� � � ������

����"�� � (��� ��# � � ����� ��� ���� �� ������� #���� �

�������� ��� ��� �� �� ��� ��� ./ �� .0 �� �� ����� �����!

����� ��� ���#� � ����#��)� ���� �= === ����� � ���� (� �

�� � �������� ������� ��� ���� �����# � ���"�� � ������

���� ��� �� ������ ����"� � � #���� ����� ��! 8�(����� ;������,

<��� �� ��!� ����� ���� ����� � ������ ���)��� �� ����� � ������ �

�� ������ ������� � ��� �� ���� 3��� �� �;������,<��� �� ��!�

���� ! ���� �� ��� ��(�� �� ��� ��������� $&' � ��������

� � �� ��� �������� �� �� � ���� � ! ���� �� ��

���� ��� �� ��� $&' ����� ��� ��� $% ������ �� ��!� ���� �

� � ����� � ���� � ��� ��� ������ ��� � ��#� $% ���# ��

������ � (��� ������ � ��#� ������ �� ��� ��== �� ! ��� "�

�� ��( ��� � ��"�� �� ���� �"�� ��� �� ��#�� ����"� �#���

�� ���3��� � � ��# ��� �� ������ �� � �������� �������#!

H��# �� ���������� �$%��/,�0 (� "� � �� �#��� �� ��

������ ������ �� ��� �� ��� � ��� ��� ������ (� ��������

��� /,��� ������ � ������� � ��� ������ �� �� ���#� ,�������

�� ��� #����! &������� ��� ����� ��(�� �� �� � �� �������

#���� ��� �� ������ ����� ��# � ��� (� ��� �� �� ������� > ��

��� ������� �� ������ � ������� �� ���# /,��� ��� �� ��� ��

/,��� ������ ��� ��� �� ������� #���� � �� ������� �� � �

B����� �� �� � ��� �� ������ ����� �� � ���� ������ � �� � ��

�� ��� �� *,��� �����! 1�� �������� �� ������� #���� �� ��

��� �� �� ��� ��� ./ �� .0 �� �� ����� �� �����!

$�� ��� �� ��( �� ����� ��� �� �� ������ ������ �� ���

��� �� ����#� �� �� ���� ��� �� �� ����� ��! 1�� �������

���� $%��/,�0 (� ���� �� �� /,�������� ���� �== �� �

�= ��� � ���#� � ������� �� �� ������ ������ �� ��� ��� �� �� �

������� �� �� ������ �#� �� ��������# �� � � ��B�� ��� �� �

��#�� ��� ��� ������! 5� ��� �� � ��� ������ ��3����� ��#� ��

������ ������ �� ��� � ���� � ������� �!�! ����� ��� � � (�

��� �� �� �� � �== �� ��� /,�� ����� (� ����#��)�� � � �� ��

�� � � �(�� ������ �� ���! &������� � �� ���� ��(� �� �� ��

�� ������ �� ��������# $&' �������� (� � �� ������

������ �� ��� ������ �� ��!� ����� ;������,<��� �� ��!� /=== ! 5�

�� ��� (��� � � �� ���(� �� � ����#� �� �� ������

������ �� ��� ��� ��� �� � ����#� �� �� ��������� ����� (����

���� �� �� ����3����� �� �� �� ��� ��� �� �������� $% ��� ��

�������� ������ �� ��� �� ������ ! � ���#� �� ��� �� ����

��������� �� � �� ����#�� � ��� ��� ����3��� � �� �� ������

�� �� ��� ��� �� (���� ��� ���(� � ������ �� ������ �#��

�<��� �� ��!� ���* � �� ������ �� �� �� ��� �� ����"� ������

(� ��������� � �� ������#��� ������ ������ �� ��� ��=42� !

5 � �������� ���� �� �� ����� �$%��/,�0 ���� ����#��)� ���

������ � �(�� ������ �� ���!

5������ �$%��/,�0 � ����"��� �� ��� �� �� �� ��� ������

(���� �� ���� ��� ��� ������� �� ������� ! ��� ������ � ��

�#������ (� � ����� ���� �##� ��# �� ����� ���� �� �� � ��

���� ���� #���� ��� �� ��# � �� �� ������ ����� �� ����� ��

������ �� $% ����#�� ��� �9��� (�� �� ��!� ���2� 7��� �� ��!�

���2� ����� �� ��!� ����� ������� �� ��!� /=== ! � �� ���� � (�

15+! E! D��#�,��� �������#> �� ������ � ����� �� �� ��� �� . (��� �� ����� (� � �� (� $%���/4�0 �������� 58&,�$%��/,�0 ���� ��� ���� ��� %��,���/4�0 ��� ���� ! ��� �������� �#�� (��� ����"� ���(��� �� ������� �� �� ������ ��� �� ��� ��� ������ � ! ��� ������ ����� �� �������� � ��� � �� �� �� �� ���� ��� �� ��� �� ���!.���� ��( �� ���� G &?� �� ���� ���������� ��������� ! �� N.�/GO ������� �� 58&,���,�$%��/,�0 ��� �� %��,���/4�0 ���#� ������ �� �� (� ������� �� ����� �� �� ��� ������ ! ��� ����� �� ���� ������ � �� ��� ��� ���� ��� �� ������ ������ ���! �. �� ������ �� ����� �� �� ��� ��##�� ���� �� ��� ��� �� �$%��/,�0 ���(���� � ����� �)� ��� �� �� ����� �� �� ��� �������� �� �� �= ��� ��� ����! &����� ��� (��� �� ����� (� � �� (� ��� ��� !

*�E 5! +����� �� ��

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2

� ���� ��� ���( ��� ����������! 1�� � ��� � ���#�� ���#� �� ��

������ ������ � ��������� �� ��� ���� ��� ����� �� �� �� �� ��#

��� ��� �� �� ��� ��� ��� ��� N�� ��� ��� �&�������� ���* O ��

�� ������! � ��#� ������ ������ ��� ��� ��� ��������

��� ��� ����� (���� ��� ����"��� �� ��� � �������� ����� ��!

��� ������� ��� �� �� ��� �� ����� �� ������� � ���3�� ��� ��

����� �� (���� (� �� ��� � � ���3�� ��� �� #������ ��� ��# ��

�� ������ ��� �� � ����� � ����! 5� �� ���� �� ���� ��� ����� ��

(��� ����#��)� � ��� ��� �� �� �� ��� ��� �� �� ��� ������!

&������ $% �� ���� (� � �� ��� ��� �� �� �� ��� ������ ������

(����� �� ���� ���� �� ��� ��� � ����"� �� ������� � �� ��� � ��

����� ��! 5� �� � �� ���� (� ��� �� (��� �� ��3����� ��� ����� ��

�� ��� ���> �� �� ������� �� �� ��� ��� �� �� ��� � �������,

��� � ��� ��� �� �� ���� ��� �� �� ������# � � (� � �� �� ��� �� �

��#� ��� �� �� ������ ������! ��� � ������ � �� �#������

(� � ���� ��� ���� ������� ��� ���� ������ �� �� �)� ��

�� ������# ����� �������� �� ��!� /=== !

5� ���� ���� � ��"�� �� ����"�� � �� �$%��/,�0 ��� � �������

�� ���� �� �� �� ������ � ����� �� �� ���� (� � �� � ��#�

���� �� ������ ���# (� �$%��/,�0 �������� � ��! :� �

�� (� ��� ��� � ��� �� � ������� �� ����� �� �� ��� �� .

��#� �� ��� �� �$%��/,�0 (� � �� ������ ������ ��� �� ��= !

'� �#�� (� �������� (� � �� ��� ������ �������# ����� �� ���

��� ����� ����� �� �������� (� � ������ ���� ���� #����� ��

����� ��� ����� �� �� ���! � ��#� ���������� (� �������

�� (��� �� (� �������# ���������� ��� ��� ���� �� � N.�/GO

����#� ��� �� �� "� ����� � ��! ��� ���������� � �������

��� � �� ��� ���� ��� �� �� ������ ������ ��� �� �� � ��

������ �� ������ (� �� ������� �� �� �� ��#! 5� � ����

����� �� �� ��� ��##���� ���� ����� �� �� ��� ���! � ����� �� ���

���� ���� $%� ������� ������ ��� �� � ����� �)� ��� (� � �

������ �#�� �� ��� �������� �� �� �= ��� � ����! $�� ���

�##� �� ����#� �� �� ������� ��� ��� �� �� ���� ����

#���� ��� �� ������ ��� �� ���� � �� �� ���� � �� �� ������

� �� ��� � �� ����� ��! 5� ��� ������ ������ ������� �� ���� ���

�� �� ����� �� ����� ��# � �##� �� �� �#���4����� ��

�� ���� ��� � ��� ������ �� �� �������� �� �� ������# ����� !

$� �� � ��� ����� �������� ������ ��� ���� ���� ��

�� ���#�� ��� �������� $% ����#��)� ���� ��� �� �#���!

5������ 7��� �� ��!� ����2 ���� �"�� �� ��� ��� � � ��� �� ��

��� ��� ��� ������ � ����"� �#��� ��� �� �� $%,56� (���

9��� (�� �� ��!� ����2 ������� ��� �� ���� $%,56 � ����#� ��

�� �#��� ����"�� � ���� �� ��� � ��� ��� ��� � � �����F

�������� �� � � ��� �� ��A! ���� ��� ����� �� ���� �� ��

��/4��6 ��#��� ��������� � �� �#��� ������# ����� ��� ��

�� ���#�� ����� �� ����� �� ��� �#��� ����"�� � (� �

����� �� � ����������! 5� ������� (���� (� ���� ��(� ��

$%��/,�0 ��� ��� � ��#� ������ ���� �� � ��� �� �����

�%��3���� �� ��!� ���2 (����� �� #��� � �� �� ��� �����# ��

���� �%��3���� �� ��!� ���� ! $�� ��� ��( �� �� �� � � ���

�� ���� ������ ������ � +��� #� ���� ���� �+��� �� ��

�� ������� '8/,��� � � �� ��"���� � �� ��� �� ����� $%��/,

�0 ���� ��� ��� �##� �� ��� ���� �� � ���� ��� �����

�� � ���� ���� ���������� ��� ��������� ����#� �� (���

������ ��/ ��� ��6! � ����"� �#��� �� ���� $%��/,�0

��� ��������� � ���� �� ����� ��� ���� � �� ��� �� $%��/,�0

� ���3�� ��� ������� ���� �� ������ ��� ��� �##� �� ��

���3�� ��� �� ����� �� (���� � �� ��� �� �� ��� �� �� ����"�

�#���� ������ �� (��� ����� ��� ���� �� � �� ��� ����� ��! 5�

� ��� (���� � � ���� �� ����"� ������ �� �$%��/,�0 ��� ��

����#��)�� �� � ��� $%! .���3��� �� ���� ��� ����� ���

�������� ��� ������ �������� � ������ � ��� ������ ���

���� � �������� ���� �� $% �� �� (� �����!

��� "��#"� #��� ��� � � � �� ������ ���� � ��� ��

���� ��� �� $%! 5� �� ����� ���� (� ��(�� �� �� ����� ���

(���� � ������� ���� �� ������ � ����"� � � � �� ������

��� �����# ������ ��� ��� �� �� �� ����! 5 � �������

���� �� �� �� ����� ��� �� �� � #��� � �������

�������� �� (� � ����� � � ��� ����� ��� � �����

�������� �� ! 5� ������� ����� (� ���� �##� �� �� ��

������� ��� �� �� �� ����� ���� ������ � (� � �� ������� ��

� ��#� ���� ��� �� $% �����#��� �%��3���� �� ��!� ���2� %��3����

�� ��!� ���2 ! ��� ��� ��� � � ���� ���)� �� �� � ��

���� ���� #��� �� ����� ���� ������ �� ������� ���� ���� ��

����� �� ������� ��� �� ��� �� ��� �� �� � ��� ����� ������ ����

��������� ���� � �� ���� ������ ��� (� � ����� � ������� ��

�����!

��,��+����������

:� ��� #�� ��� � '! D�� ����� �.%5.� ��� ����� ��� ������� ��������� � ;! 1���� ��� %������ 9������ ��� ��� ��� ������# �� �� �������� !5! +! ��� .! �! ��� ���( �� 5'%�! ��� ������� (� ����� �� �� #��� ���� 5'%� ��� 5! + ��� .! �! ��5- $��� ��� ����,�'&� ���� � � #��� ���� �� -��#����� +�S���� �� .'%& ��� &! %��3����! ��� ;! +� ��� #��� ���� �� 1���� ��� �� 1����� ��6==0�2/ ��� ���� 8���� ,������,%���D����� ���� �1%8�%�F�6=/ ��� &! %������!

��� ��������

+-.%� +,��� ���,������ ����� ��� $%� ������ ,���� ��� ����� ��� $&'����� ��� ����� ������!

��� �����

�������� %!.!� 9���� �!;! � 1��� ���� &! �/=== ��� ������� ����� ������#� �� �� ������ ����� ��! ����� ������� � �� �/*24�/AA!

�������� 8!�! � %���� %!%! ����= 5��� �"�� ��� �� � ������)�� ����������� �� ��� ����� � ������ �� �� ���! &������� ���� �*=04�*=E!

���,����� '!� D���� � ;!� ������ .!� 9���� �!� :����� '!� D���� ��� ;!8!�.����))�� %!� -� �� 9!� &����� ;!� D������� 8! � '�� �� �!�! ����* $��� ��� ����� �� #��� �� �� �� ����� ��������� �6> ����������� ��� �� �� ���� �� ����� �� ����� ����! '�� +�� 0���� � �� //�4/0A!

����� M!'!� ����� &!� -������ M!� �� .��� .!� ����� � 5!� ������� � M! � -���M!-! ����2 ?� ���� . ������ �� + ��� ��� ����,����� ��� ��� � � � �� ��������� � �� (��� +�,������ �� ��� ����� #� ��� � ����� ��! � 1��� 2��� ���� /A6EA4/A6E�!

����� D! � ���� %! ����� � ���� �� �#��� ����� ��� ������ ������ ����� ��> � ������� ��� ��� ���� ����#�� ���! ���� ��� �6A4�26!

.���� �!� D��� �! � &������ �!-! ����/ 5� ����� ��� �� �������,������#����� ���� ���� �� ��������� ��� �� ��� �� ��������! ����� ������ � � ��� �������� ��� ���,#���� ���� ��#��� ��� �� ����#! � 1��� 2�� � ���� �*624�*2=!

.������������ M!� ������ 9!D!� 8���� �!�!� ����� ?!� 1��#� D!� +��� :!�7����� .!&! � %���� '!M! �/=== �/% ���� ��� � �� �� � � ����� ��!���� ���� 6=046��!

;����� %!&!� J��� 9!:!� &�������� 9!�! � %���� %!%! ����= -������ ��� ��� ��� ���� ���� �������� �� � ����� ����� ���,�� ��� �� ���������� ���� ��� ������! ������ ���� �2*4�26!

;������,<��� � -!� .���� � �!�! � ;������� �! ����� $��� ������������ �� �� �� ���� ��� ����� �� ������! &������� ��� /�6�4/�6*!

;������,<��� � -!� ;������� �! � .���� � �!�! �/=== -�������� ���������# �� �� �� ��� ���#> 3��� � ��� �� ��� � ����"�� ���! � ������� ���� /0204/0�=!

;(���� '!;!� ������� ?!%!� &��#�� �� -! � ���#����� .!5! ����2 $����� ����� �� ����)� ��� � ���� ��� ���� � ����� �� �� $;%,*� � ������������,����� �� ��� ���! ���� �� *AA4*EE!

?���� +!5!� D�(�� +!9!� %����� +! � ������ M!�! ���2A 5�� ��� ��

$��� ��� ����� �� ����#��)� ��� ��� �� �� *�6

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2

�������� �� ������ ����"� ��� ����� �,��� ��� �,����#��� ������ !+�� ��� 1��� � �� 0E�=40E�E!

1��� �#� M!� D��(�#� +!� ��������� 5!� %���� -! � ������ 8! ����2 $��� �������� �� �� �3�� �� ��� ���� ��� ��� ���� �! � ��� *2����� � ��� E0A4EA=!

+������� � �!�!� & �� �!;!� D������ �!�! � ��.�� ���� �!&! ����� ������ ��� ����� ���� ��� ����� �� ���� �� ��������� �� ����� ���� ����#�� ��! � �����2�� � ��� /0=�4/0��!

+������(��)� +!� -������ �! � ����� %!J! ���2A � ��( #����� ��� �� .�/G������ �� (� � #��� � �������� B��������� ������ ��! � 1��� 2�� ����� 0**=40*A=!

+���� P!�!� 9������ �!&! � 9������ �!9! ����/ ?��������� ���������� ���� ��� ��� ���� ��� �� � ��� 555� �������� ��� ������(��# �� ����� ��� �� � ������� �#�� ��� ���! � 1��� 2�� � ����/���A4/���2!

8����� �!� ��� ���� &!� ;������ ?!%! � &�������� �!M! ����0 5� ������������� �#����# ������� �� �� ������� �������� A�, �������� � ������������ ���� ��� �� ���(�� ��� ���� ��! � ��� &�� � ���� ��A4�==*!

M���� ;!�! � %���� %!%! ���2� +��> �� ���� ��� ������ ����"� +,��� ���������� �� ������ �#�� ������ ���! &������� ���� 6�=46�A!

9�)��� �! ���26 �� ����� �� A�,��������# �3����� ���� E�� ��� ���� �����#�� %'�! ���� 3�� � ��� � ��� 2�/A42�*2!

9�)��� �! ����6 %���#�� ��� �� �H+ ��� � ���� ��� ��� �� �� ����� ���#��� �� �� + �� ��� ��� G* �� � �� #������ ����� �� �� ������� ��� �� ��� ��� GA ��� GE! �+1( � � ��� /*2/4/*�/!

9��� (�� � ;!� J��� 9!:! � %���� %!%! ����2 5��� �"�� ��� �� �#��� ������� ��� ����� �� �� ���� ���� �������� �� � ����� �� ������! ���� ����64�/E!

������ �!� 8������ M!� &� �� �! � ����� D!�! ����� .������ ���� ����� ������ ��� ����! ���� �� 6�046/0!

��.�� ���� �!&!� D������ �!�!� +������� � �!�!� 1���� D!7!� M�������!�!� M���(�������� .!9! � D������ �!%! ����6 1��� ���� �������� ������ ���,�������#�� ����� �� ������� ��� �� ������� �� �� ��� ���� ����#��� ������� ���� ��� ����� ��! 1��� ��� +�� 1��� ��� ��� /6=4/62!

��� �� %!9! � &��#�� M! ����� ����#�,������,�� ����� -.% �� ��� ������ ��� ��# �������� #���! 1�����2��4���� ��� �=2/4�=2E!

������� � -! ����� ������� ����#� �� ������ ����� �� �� ��� ���� �!3��� ��� ������� � ��� *264A=�!

$��������� &! � &����� �!5! ����A + ���� �A ��� + ���� �E ����� �(��� ����� � �� ����� �� � ���������� .! � 1��� 2�� � ���� �A�6A4�A�2=!

%���� 9!M!� &������ &!D! � ����� D!�! ����0 � )��� ��#���)� ��� �������� ����� �� #��� �������� �� �� ���� ��� ��� �����! ���� ��� A�64E=�!

%��3����� &!� 1�������� .!� ;�� ��� .!� ��� ��� ?�#�� +!� �������� �!�.�����,%��� �!� ����� �!M! � +���#�� ;! ����2 � #��� ����� � ���� ��� ���� ����� ��"�� � ��( ���� ��� ����� �� ����� �� �����! '�� +�� 0���� � �� �0064�0*A!

%��3����� &!� & ���� D!� +�����,&�����)� 5! � +���#�� ;! ����� &�3�������� ��������� ����)� ��� �� �� ���� �� ���# �� �� ����� ���� �������� �� #��� ��/4�0! +��� 0������ ��� ��6/4��6*!

%��3����� &!� �������� &!� ����� �!M!� �����,������ <!� ��� ��� ?�#�� +!�;������ M! � +���#�� ;! ����2 ;� ���� ��� �� ���� ��� ����� �� #��� �� �� ����� #�����! ����� 0���� � �� /*04/A=!

&����� D!�!� ��(����,'������� �!� 5����� �!-! � &����� M! ����/ '���+ ��� ���,������ ����� ��> � #��� ����� �� �� � ��� ����� ���� �������� �� �3�����! 1��� ��� +�� 1��� ��� � ��� �A�4�E0!

&�������� +!�! ����* ;�������� ��� �� ������� �#�� �� �� ���� �������� �� ������! ������ ��� 66�46�=!

�������� 9!� &��#���� &!� 5����� 9!� ������ �!� 8������ M!� &� �� �!� &������8! � 8�#�� �! ����� 1��� ���� ���� �"�� ��� ��� ����� � � ��� �� �������� ����� �� �� ��#� ���� ��� ������! *�� ���� 3�� &�� 5&3� ��*=*=4*=*A!

<���� %!� .���� &!9!� &� ������� %!� '���)� M!�!� <���� D!�! � ���� %!����* ����#������ ��#���)� ��� �� ����� ���L�� ��� � �� ���� ������! ���� �� �2�4���!

:� )�� .!8!� $�� �!� :��������� .!� 9��)��(���� �!� +������� +! �8� � 8! ����� &����"�� � ��� ��� ��� � �� � ����� ���� ��� ����� ������ ����� ������� �� ����� ��������� ������ /�0 �� ��� ���������� ���� �! � ������� � �� 6*/E46*00!

7���� 8!� 5���� D!� $ ���� M!�!� 8����� �� �!� ��������� 9! � 1��� ���� &!����2 1��� ���� �������� �� � �������� ������ ����� ��! &���������� /064/*/!

*�2 5! +����� �� ��

� /==/ 1����� ��� �� ?������� '���������� &���� ��� ������� ������ �� ������������ ��� *=�4*�2