Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
„ABC“ o ABC transportérech
Aktivní a pasivní transport živin
ABC transportéry a jejich detekce
Fyziologická role
Kmenové buňky a regenerace
Nádorové bujení
Multiléková rezistence
Regulace exprese ABC transportérů
Zdroj energie
www.doctorjackson.org
Permeabilita živin
Hydrophobické molekuly
bez náboje
Malé polární
molekuly bez náboje
Velké molekuly
bez náboje
Ionty
O2, CO2, N2
H2O, glycerol
Glukóza,
sacharóza
H+,Na+,NCO3–,
Ca2+,CL-,Mg2+,K+
Fosfolipidová dvouvrstva
Nízká permeabilita
Vysoká permeabilita
100
10-2
10-4
10-6
10-8
10-10
10-12
H2O
Glycerol
Glukóza
Cl–
K+
Na+
Transport přes membránu
http://www.solvo.hu
Typy aktivního transportu
Transportérspecifický projednu molekulu
Transportérpro dvě molekulyve stejném směru(H+/sacharóza)
Transportérpro dvě molekulyv opačném směru
http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120068/bio04.swf
ABC transportéry
ATP-binding cassette
Za spotřeby ATP pumpují
toxické látky/metabolické
produkty VEN z buňky
(výjimka CFTR)
Fyziologická funkce – sekrece
látek produkovaných buňkou
+ obrana proti xenobiotikám
http://publications.nigms.nih.gov/medbydesign/images/ch1_mdr.jpg
Struktura
Sarkadi et al., Physiol Rev • VOL 86 • 2006
FULLTransporter
MDR1, MRP1
HALFTransporter
BCRP
NBD = ABC
Krystalografická struktura
http://www-ssrl.slac.stanford.edu/research/highlights_archive/Rees_Fig1-1.gif&
ABC domény
Substrát
Transmembránové domény
Filogenetický strom ABC transportérů
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf
48 různých proteinů u lidí
7 rodin (A-G) podle homologie
Výskyt ABC transportérů
Šipky označují výskyt a směr transportu
http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Students/spring2000/buxton/a
Fyziologická role ABC transportérů
Substráty ABC transportérů - výživa
Živina Membránový Transportér Efekty
Fytochemikálie z výživy P-glycoprotein (MDR1) Inhibice
Flavonoidy (quercetin,) flavonoid
glycosidy (genistein-7-
glucosid) a flavonoid
glucuronidy – ovoce, zelenina
Multidrug Resistant Protein 1 (MRP1)
Multidrug Resistant Protein 2 (MRP 2)
Breast Cancer Resistance Protein BCRP (MXR)
P-glycoprotein (MDR1)
Akumulace, transport a potenciální efekty živiny
Flavonoid-like molecules
(polyphenol phloretin)
Multidrug Resistant Protein 1 (MRP1)
Multidrug Resistant Protein 2 (MRP 2)
Breast Cancer Resistance Protein BCRP (MXR)
P-glycoprotein (MDR1)
Akumulace, transport a potenciální efekty živiny
Extrakty z hořkého melounu (1-
monopalmitin), grape fruitu
(bergamottin and quercetin),
sóji
P-glycoprotein (MDR1) Inhibice
Extrakt z hroznových jader P-glycoprotein (MDR1) Inhibice
Steroly (e.g. Cholesterol) ABCA1, ABCG1, ABCG5 and ABCG8 Substrát
Sezamové semínko
(lsophosphatidylcholine,
linoleoyl)
Některé transportéry ve střevu Inhibice
Mono-, di-, and triglutamáty folátů Breast Cancer Resistance Protein BCRP (MXR)
Multidrug Resistant Protein 1 (MRP1)Substrát
Rostlinné výtažky P-glycoprotein (MDR1)
Inhibice (Curcumin, ginsenosides, piperine, some
catechins from green tea, silymarin from milk
thistle); Some catechins from green tea
(modulation); Hyperforin, kava (Activation of
pregnane X receptor, an orphan nuclear
receptor acting as a key regulator of MDR1)
http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Students/spring2000/buxton/a
Syntéza antigenu 0
http://www.uoguelph.ca/~cwhitfie/images/abc_transporter.gif
Antigeny - lipopolysacharidy
Lipidové jádro
Polysacharid
Lipid fukóza N-acetyl galaktózaglukosamin
Kmenové buňky
http://community.livinglakecountry.com/blogs/eagles_eye/Stem%20cells%20diagram%5B1%5D.jpg
V průběhu
diferenciace
klesá
exprese
ABC
transportérů
Detekce ABC transp.
„Dye exclussion assays“MDR1 - JC1, rhodamin 123 x Cyclosporin D, reversin
MRP1 - Calcein AM x MK571, NSAID
BCRP - Hoechst 33342 x fumitremorgin C
- Bodipy-prazosin
- Pheophorbid A
Obecné inhibitory transportu – verapamil, cyclosporin A
Imunodetekce
qRT-PCR
Inhibitory Kompetitivní substráty
Inhibice funkce transportéru
Calcein AM
Calcein AM je substrátem MRP1, MDR1
Inhibitory - MK571, NSAID, cyclosporin D, reversin
www.solvobiotech.com
ABC v kmenových buňkách
MDR1/Pgp << MRP1
http://www-bml.ucdavis.edu/facresearch/images/cherr_fig8.jpg
Barvení Calcein AM
„SP“ buňky
http://www.bu.edu/cms/www.bumc.bu.edu/leukemia-lymphoma-laboratory/files/Images/sidepop.jpg
Hoechst 33342 - substrát BCRP, MDR1
- inhibitor verapamil
Buňky C2C12 - myoblasty
Důkaz „kmenovosti“
Hirschmann-Jax, C. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 14228-14233
A: V linii se vyskytují SP buňky a majoritní populace
B: SP buňky z neuroblastomové buněčné linie produkují SP a ne-SP
C: Buňky majoritní populace zůstávají jen majoritními
Linie SK-N-SH
SP buňky Majoritní populace
Játra
Rozhraní
krev vs. Hepatocyty
Regenerace –
MDR + BCRP
Regenerace ledvin
BCRP Transporter Na+
http://www.sciencedaily.com/images/2009/01/090128074622-large.jpg
glomerulus
Dědičné choroby
16 ABC genů bylo asociováno s dědičnými poruchami
Tangierova choroba (ABCA1) – poruchy sekrece
cholesterolu a fosfolipidů (nadměrná hladina v buňkách, narušena
homeostáza)
Dubin Johnson syndrom (ABCC2) – neschopnost jater
sekretovat konjugovaný bilirubin do žluče
Pseudoxanthoma elasticum (ABCC6) – mineralizace a
fragmentace elastinových vláken, problém s vitamínem K
Cystická fibróza (ABCC7) – poruchy sekrece působků
pankreatu a dalších exokrinních žláz
Patologický výskyt
Teorie vzniku metastáz
http://www.isrec.ch/images/research/figures/Trumpp_06_Fig_5.jpg
Model klonální selekce
Model paralelní evoluce nádoru
Integrující model evoluce nádoru
A normální kožní tkáň
B primární nádor
C subkutánní metastázy
D metastázy v lymfatické uzlině
E metastázy v plicích
Nádorová kmenová buňka
http://www.gnf.org/assets/001/23050.jpg
Strategie léčby
MDR a rakovina
Selhání chemoterapie (nádorové b. jsou obvykle citlivější než „zdravé“ buňky)
De novo/získaný fenotyp MDR (cytotoxic in vitroMTT-assay)
Mechanizmy: – Změny v metabolických drahách, které se podílejí na
detoxifikaci látek
– Změny v reakci organizmu na poškození DNA
– Změny v aktivitě topoizomerázy II
– Změny v drahách regulujících apoptózu
– Zvýšená produkce ABC transportérů
Nádorová b. se vymyká vlivu svého prostředí (obsahujícího chemoterapeutikum), získává „evoluční“ výhodu
(multidrug rezistance, multiléková rezistence)
! Různé substráty -> MULTIléková rezistence!
ABC-B1 – MDR1; ABC-C1 – MRP1; ABC-G2 - BCRP
Dean et al.: THE ROLE OF THE ABC TRANSPORTERS DRUG RESISTANCE AND PHARMACOLOGY
Mitoxantron - substrát BCRP a MDR1
senzitivní
rezistentní
Chemoterapeutika
Gen Substráty - chemoterapeutika Inhibitory
ABCB1/PGP colchicine, doxorubicin, VP16, Verapamil, PSC833
adriamycin, vinblastine, digoxin
ABCC1/MRP doxorubicin, daunorubicin, VP16, Cyclosporin A, V-104
colchicines, etoposide, rhodamine
ABCG2/BCRP Mitoxantrone, topotecan, CPT-11, Fumitremorgin C,
rhodamine GF120918
Pgp substráty ve vstupní terapii:
Podle:The Medical Letter
Lung:
Breast:
Prostate:
Colorectal:
Pancreas:
Ovarian:
Uterus:
Lymphoma:
Leukemia:
Bladder:
Myeloma:
SCLC: C + G or C + Taxol or C + Vinorelbine
NSCLC: Taxol + P
Adriamycin + C Taxol or C + Adriamycin + F or CMF
GnRH analogue
5-Fu + L
G
C + Taxol
M or Adriamycin + P + C
HD:Adriamycin +B + Vinblastine + D or M + Vincristine +PP/ABV
NHL: C + Adriamycin + Vincristine + P or C + Vincristine + P
High grade: C + Adriamycin + Vincristine + P + M
ALL: Vincristine +P + L-asp + Adriamycin / Daunomycin
AML: Ara-C + Daunomycin / Idarubicin
CLL: C + Vincristine + P or Fludarabine
CML: Gleevec
M + Vinblastine + Adriamycin + C
Vincristine + Adriamycin + D or MP
Aktuální projekt
ABC transportéry
Stres (teplo, zánět, hypoxie, UV záření, diferenciační činidla) vedou k zvýšení jejich exprese – enhacesom
Rychlé zvýšení exprese po inkubaci s jejich substráty (doxorubicin, vinca alkaloidy, etoposid, taxely) = jak zamezit zvýšení exprese dřív než nastane???
Studium signálních drah vedoucích k zvýšené expresi ABC transportérů ve stresových podmínkách
– role p38 MAP kinázy
MDR1 enhacesom: Scotto KW, Johnson RA. Transcription of the multidrug
resistance gene MDR1: a therapeutic target. Mol Interv. 2001 Jun;1(2):117-25
MAPKhttp://www.bch.msu.edu/faculty/gallo/mapk-pathways-new.jpg
Metody
Modelová buněčná linie– A549 epiteliální buňky NSCLC
– mESC wt, mESC p38-/-
– HL-60 transfektanti
Modelový treatment– IFN (prozánětlivý cytokin, terapie CML, melanomů…, kombinace
s imanitibem, cytarabinem, obnovuje bun. cyklus buněk v G0)
– Chemoterapeutika
Experimentální design
Dye exclussion assays (průtoková cytometrie)– MDR1: JC1 / Cyclosporin D
– MRP1: Calcein AM / MK571
– BCRP: bodipy-prazosin, pheophorbid A / Fumitremorgin C
Exprese studovaných proteinů– Western blotting, qRT-PCR
Vysetí buněk (inhibitory kináz) / IFN Sběr buněk
24 h 48 h
HL-60 transfektanti
JC1(MDR1/CSD) Calcein AM (MRP1/MK571)
Bodipy-prazosin (BCRP/Fumitremorgin C) Pheophorbid A
„Dye exclussion assays“
2
HL60 transfektant
HL60 transfektant+ inhibitor
HL60
IFN způsobuje fosforylaci kinázy p38
Krejčová et al. 2009, General physiology and biophysics, in print
1.5x103 U/ml
x1000 U/ml
A549
A549 IFN vede k zvýšení exprese ABC transportérů
„Western Blotting“
Krejčová et al. 2009, General physiology and biophysics, in print
A549
„Dye exclussion assays“JC1(MDR1) Calcein AM (MRP1)
Pheophorbid A (BCRP)
JC1 Calc. Pheo.
Kontrola 55,7 111,4 56,3
IFN 50,9 73,6 45,7
SB203580 57,7 148,5 99,1
IFN + SB 42,9 87,4 85,8
IFN snižuje funkčnost MRP1 a BCRP,
inhibice p38 tento efekt zvrátí
mESC
„Dye exclussion assays“
median 45.3 67.9 median 37.5 57.2
median 74.3 90.5 median 107.1 164.5
JC1(MDR1) Calcein AM (MRP1)
Bodipy-prazosin (BCRP) Pheophorbid A
Inhibice p38 vede k snížení funkčnosti všech ABC tr.
p38+/+p38-/-
Substráty ABC transportérů
HL-60 MDR1 MRP1 BCRP
0,1 mM Actinomycin D 0,71 0,44 0,94 0,42
5 mM Actinomycin D 0,26 0,16 0,78 0,16
0,1 ug/ml Mitomycin 0,91 1,07 0,83 1,13
0,2 ug/ml Mitomycin 0,97 0,87 0,91 1,38
0,4 ug Mitomycin 0,94 0,81 0,94 1,40
0,5 ug/ml Mitomycin 0,61 0,32 0,53 0,63
1 ug/ml Mitomycin 0,69 0,62 0,28 0,61
0,01 nM Roscovitin 0,48 0,77 0,55 0,35
0,1 nM Roscovitin 0,75 0,57 0,42 0,23
0,1 ug/ml Geldanamycin 0,55 0,94 0,86 0,62
0,4 ug/ml Geldanamycin 0,41 0,84 0,75 0,52
0,5 ug/ml Geldanamycin 0,06 0,06 0,34 0,15
1 uM 5-azacytidin 0,93 0,81 0,86 1,22
2 uM 5-azacytidin 0,97 0,74 0,81 1,29
35 uM 5-azacytidin 1,07 0,66 0,90 1,03
0,1 ug/ml Nocodazol 0,49 0,31 0,57 0,48
1 mM Butyrát sodný 0,95 0,71 0,86 1,05
10 uM Pioglitazon 0,93 0,98 1,12 0,80
1 uM Valinomycin 0,89 0,64 0,80 0,48
2 uM Valinomycin 0,76 0,85 0,68 0,74
3 uM Valinomycin 0,56 0,60 0,56 0,99
0,01 uM Camptothecin 0,67 0,63 0,76 0,77
0,1 uM Camptothecin 1,03 0,71 0,76 0,83
10 uM Camptothecin 0,22 0,17 0,62 0,28
2 ug/ml Ionomycin 1,33 1,22 0,95 2,02
3 ug/ml Ionomycin 1,58 1,42 1,05 1,96
5 ug/ml Ionomycin 2,02 1,75 1,09 2,14
Shrnutí
IFN indukuje stabilní zvýšení aktivity p38
MAPK
IFN vede k zvýšení exprese ABC transportérů
Inhibice p38 sníží expresi ABC transportérů
Děkuji za pozornost
ABC transporters' by Vicky Summersby, inspired by the Review on p218