Abenteuer Metagenom

76 VO R B I L D NA T U R

NICHT KULTIVIERTEBAKTERIEN - DIEVERSTECKTE VIELFALT

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METAGENOMBENTEUER

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NA T U R S T O F F-FO R S C H U N G I N DE U T S C H L A N D 77

16S-rRNA-GenanalyseEine Methode zur Bestimmungder Verwandtschaftsverhältnissevon Mikroorganismen. Die 16S-rRNA-Gensequenz dient dabei alsVerwandtschaftsmarker.

In situ-HybridisierungBei dieser Methode werden Bakte-rien mit einer Fluoreszenz-mar-kierten Sonde hybridisiert undspezifisch und kultivierungsunab-hängig in einer Originalprobesichtbar gemacht.

SekundärstoffwechselSynthetische Prozesse, deren End-produkte, die Sekundärmetabolite,keine direkte Rolle in der Ökono-mie der lebenden Zelle haben.Während der Primärmetabolismusin allen lebenden Organismenmehr oder weniger konserviert ist,ist der Sekundärmetabolismus oftlimitiert auf niedere Lebensformenund dann auch stammspezifisch.

Inzwischen zeichnet sich jedoch ab, dass dieStrukturvielfalt der Naturstoffe aus den gutkultivierbaren Bakterien begrenzt ist und derForschungsaufwand zur Identifizierungneuartiger Wirkstoffe - insbesondere neuerAntibiotika - stetig steigt mit dem Ergebnis,dass immer mehr Pharmaunternehmen dasInteresse an bakteriellen Naturstoffen verlie-ren. Dies ist alarmierend, denn es gibt zur-zeit keine überzeugende Alternative, um denwachsenden Resistenzraten infektiöserMikroorganismen gegenüber gebräuchlichenAntibiotika zu begegnen.

Die mikrobiologische Revolution

Den Entwicklungen der letzten Jahre ist eszu verdanken, dass sich unser Bild von Bak-terien grundlegend gewandelt hat. Moleku-lare Methoden wie 16S-rRNA-Analyse undin situ-Hybridisierung erlaubten es erstmals,Mikroorganismen zu studieren, ohne sie vor-her zu kultivieren. Die Arbeiten enthüllteneine völlig unerwartete, spektakuläre Viel-falt. Es wurde schnell deutlich, dass in jedembeliebigen Lebensraum gewaltige Zahlenneuartiger Mikroben entdeckt werden kön-nen, gegen die der Anteil kultivierter Vertre-ter verschwindend gering ist. Man schätztheute, dass in Bodenhabitaten 99,9% dermikrobiellen Arten bislang nicht kultivierbarsind. Damit müssen nicht nur die bislang an-genommenen Daten zur Biodiversität, son-dern auch unsere Vorstellungen über diemikrobielle Biomasse erheblich korrigiertwerden: Untersuchungen von Tiefseebohr-kernen führten zu der Erkenntnis, dassMikroorganismen wahrscheinlich den größ-ten Teil der Biomasse unserer Erde ausma-chen.

Angesichts der Tatsache, dass Mikroorganis-men unter allen Organismen über den varia-tionsreichsten Metabolismus verfügen, deu-ten diese Ergebnisse darauf hin, dass wirmöglicherweise den Sekundärstoffwechselbislang noch nicht einmal ansatzweise er-forscht haben. Dass bisher nicht kultivierba-re Mikroorganismen tatsächlich eine aus-sichtsreiche Quelle für neuartige Wirkstoff-klassen sein können, lässt sich durch eineReihe von Arzneimittel-Kandidaten unter-mauern, die aus niederen Tieren wie zum

Mikroorganismen sind die ältesten zellulären Organismen auf diesem Planeten.Über fast zwei Milliarden Jahre hinweg waren sie die alleinigen Herrscher undkonnten sich an eine beispiellose Vielfalt von Lebensräumen anpassen, die vonden Eiswüsten der Antarktis bis zu den Temperaturhöllen der Tiefseevulkane rei-chen. Die Vielseitigkeit des mikrobiellen Stoffwechsels spiegelt sich auch wider ineiner breiten Palette an Arzneimitteln, die in den letzten 50 Jahren ausgehend vonSekundärstoffwechselprodukten aus Bakterien-Kulturen von Naturstoff-Chemi-kern entwickelt wurden. Für die Gewinnung neuer Wirkstoffe werden die Mikro-organismen üblicherweise auf Labormedien angezogen und Extrakte ihrer Kultu-ren auf biologische Aktivität hin durchmustert. Bei positiven Befunden werden dieentsprechenden Bakterien in so genannten Fermentern oder Bioreaktoren im Maß-stab von 10 bis 200 Litern angezogen, um ausreichend Biomasse für die Isolierungund Strukturaufklärung der Wirkprinzipien zu erhalten. Auf diese Weise konntein der Vergangenheit eine Vielzahl an neuen Wirkstoffen aus Bakterien-Kulturengewonnen werden.

AB E N T E U E R I M ME T A G E N O M

Der mediterrane Schwamm Aplysina aerophoba(oben) und mit ihm assoziierte mikrobielle Symbionten(unten, elektronenmikroskopische Aufnahme). Diemeisten Vertreter dieses hochdiversen Bakterienkonsor-tiums sind bisher nur aus Schwämmen bekannt.


ExpressionswirtEin kultivierbares Bakterium, daszur Expression von rekombinan-ten Genen verwendet wird.

Funktionsbasiertes ScreeningDas Durchmustern oder „Scree-nen” einer DNA-Bibliothek nachbiologischen Aktivitäten und an-deren Eigenschaften.

KlonDurch ungeschlechtliche Vermeh-rung entstandene und somit gene-tisch identische Nachkommen-schaft eines einzelnen Individu-ums.

MetagenomGesamtheit des genetischen Mate-rials von Organismen, die nicht inKultur gebracht werden können,z.B. aus Erde oder aus anderenmikrobiellen Vergesellschaftun-gen.

Metagenom-Bank /Metagenom-BibliothekSammlung von Klonen, die ver-schiedene Abschnitte eines Meta-genoms als Fremd-DNA tragen.

Beispiel marinen Schwämmen und Mantel-tierchen isoliert wurden und für die bakte-rielle Symbionten als die tatsächlichen Pro-duzenten wahrscheinlich sind. Die frühereAnnahme, dass mit der Erschöpfung des Na-turstoff-Reservoirs einiger weniger Mikroor-ganismen-Gruppen Bakterien nun „leerge-forscht” seien, erweist sich damit immermehr als unbegründet. Die Erschließung desbislang noch nicht abzuschätzenden chemi-schen Potenzials ist jedoch nicht einfach,sondern erfordert neuartige kultivierungs-unabhängige Techniken, die hier vorgestelltwerden sollen.

Das Metagenom

Das grundlegende Prinzip der meisten Tech-niken zur Erschließung der bakteriellen Viel-falt ist die Isolierung der Gesamt-DNA - dessogenannten Metagenoms - einer Umwelt-probe und ihre Übertragung in kultivierbareBakterien. Falls die transferierte Erbinforma-tion die Anweisung zum Zusammenbau ei-

nes Wirkstoffs enthält, kann der neue Wirts-organismus dieser „Umwelt-DNA” an-schließend für die Produktion der Substanzin Bioreaktoren gezüchtet werden. Aller-dings sind die technischen Herausforderun-gen dieser Strategie gewaltig: Umweltpro-ben enthalten gewöhnlich eine sehr großeAnzahl unterschiedlichster Organismen, ausderen Genomen immer nur relativ kurze Ab-schnitte in das Zielbakterium übertragenwerden können. Das Aufspüren der ge-wünschten Wirkstoffgene gleicht daher dersprichwörtlichen Suche nach der Nadel imHeuhaufen. Der Standardvorgehensweisefolgend legt man zunächst Metagenom-Bi-bliotheken an, große Sammlungen von Klo-nen des Wirtes, die jeweils unterschiedlicheAbschnitte des Metagenoms beherbergen.Zur Identifizierung des korrekten Klons kön-nen die DNA-Bibliotheken anschließendunterschiedlichen Auswahlverfahren oderScreenings unterzogen werden.

Funktionsbasierte Screenings

Über funktionsbasierte Screenings könnenzum Beispiel neue Antibiotika gefundenwerden: Wenn ein Klon mit Hilfe der einge-brachten Fremd-DNA eine antibakterielleSubstanz produziert, so bilden sich Wachs-tumshemmhöfe um diesen Klon, wenn er aufein Medium gesetzt wird, in das ein bakte-rieller Testkeim eingesät wurde. Dieser Weghat schon zur Isolierung neuer Vertreter ausder Familie der Turbomycine geführt, aller-dings müssen für einen erfolgreichen Durch-bruch noch eine Reihe methodischer Proble-me aus dem Weg geräumt werden. So ent-halten die Metagenom-Bibliotheken ge-wöhnlich nur eine geringe Anzahl positiverKlone. Auch sind die bisher isolierten Sub-stanzen strukturell einfach aufgebaut, da sienur in sehr kurzen Biosynthese-Sequenzengebildet werden. Eine der Ursachen dafürist, dass bisher hauptsächlich E. coli als Ex-pressionswirt verwendet wurde. E. coli istzwar von allen Bakterien molekularbiolo-gisch am besten charakterisiert und gentech-nisch am leichtesten zu handhaben, für dieBiosynthese von pharmakologisch wichtigenSubstanzklassen wie zum Beispiel Polyketi-den und nichtribosomalen Peptiden ist eraber ungeeignet. Dieser Nachteil sollte aller-dings in Zukunft durch die Wahl zusätz-licher Expressionswirte aus unterschied-lichen taxonomischen Gruppen gelöst wer-den. Weiterhin ist die maximale Größe der

DI E ZU K U N F T H A T S C H O N B E G O N N E N – SI N D W I R D A B E I?

Die Suche nach Wirkstoffen in nicht-kultivierten Bakterien.Nach Extraktion aus Umweltproben, hier z.B. einem Meeres-schwamm, wird die DNA in geeignete Vektoren kloniert undin ein kultivierbares Bakterium übertragen. Anschließendwerden entweder Klone mit veränderten Eigenschaften (Far-be, antibiotische Aktivität, usw.) ausgewählt oder über Se-quenzanalyse nach spezifischen Genklassen gesucht.

Übertragung des Metagenoms inkultivierbare Bakterien

bisher nicht-kultivierbareMikroorganismen aus Schwämmen

Screening

Genexpression und Wirkstoffgewinnung


ß-Lactam-AntibiotikaVerbindungsklasse mit charakte-ristischem Strukturelement, diedie Bakterienzellwandbildung in-hibieren.

Biosynthese-GenclusterGruppe von benachbarten Genen,die für die an der Synthese einesNaturstoffes beteiligten Proteinecodieren.

KB (Kilobasen)Einheit zur Beschreibung der Größe von DNA.

Sequenzbasiertes ScreeningDas Durchmustern oder „Scree-nen” einer DNA-Bibliothek nachbestimmten Gensequenzen.

Umwelt-DNA-Fragmente bisher auf ca. 80 KBbeschränkt. Biosynthese-Gencluster struktu-rell hochkomplexer Wirkstoffe sind jedochhäufig wesentlich größer und können gegen-wärtig noch nicht vollständig funktionell ex-primiert werden. Die Entwicklung neuarti-ger Verfahren zur Isolierung, Klonierungund stabilen Expression hochmolekularerUmwelt-DNA ist daher eine wichtige Aufga-be, die mit Hilfe innovativer molekularbiolo-gischer Ansätze gelöst werden muss.

Sequenzbasierte Screenings

Der Großteil bakterieller Wirkstoffewird von nur wenigen unterschied-lichen Enzymfamilien erzeugt. Beispie-le für solche Enzyme sind Polyketid-synthasen, die zu Naturstoffen wie Er-ythromycin, Avermectin oder Doxoru-bicin führen, und nichtribosomale Pep-tidsynthetasen, mit deren Hilfe ß-Lac-tam-Antibiotika, Vancomycin oderBleomycin gebildet werden. Sequenz-basierte Screenings von Metagenom-Bibliotheken, die auf Sequenzhomolo-gien zu solchen Enzymen beruhen,können daher zur gezielten Isolierungpotenzieller Wirkstoff-Gene führen.Besonders vielversprechend ist dieserAnsatz bei metagenomischer DNA auswirbellosen Tieren, da diese häufig miteiner Vielzahl an Bakterien assoziiertleben. Beispielsweise können bei Mee-

resschwämmen bis zu 40% der Biomasse ausMikroorganismen bestehen. Daher könnendiese Tiere auch als „mikrobielle Fermenter”betrachtet werden, deren genetisches undbiotechnologisches Potenzial es auszulotengilt. Insbesondere aus wirbellosen marinenTieren sind schon eine Reihe viel verspre-chender, hoch komplexer Wirkstoffe isoliertworden, die als Kandidaten für eine klini-sche Entwicklung in Frage kommen, fallsdenn genügend Substanz-Mengen verfügbarwären. Wenn nun - wie in vielen Fällen ver-mutet - die tatsächlichen Produzenten derZielsubstanzen bislang nicht kultivierbareBakterien sind, sollten die Wirkstoffe durchdie gezielte Klonierung der Biosynthese-Ge-ne und ihre Expression in einem kultivierba-ren Bakterium in praktisch unbegrenztenMengen im Bioreaktor hergestellt werdenkönnen. Damit sind Lösungen für eine öko-logisch nachhaltige Produktion in greifbareNähe gerückt, denn bislang gibt es kaumBeispiele, wie aus Tieren isolierte Wirkstoffeohne Schäden für die Umwelt in größerenMengen zugänglich gemacht werden kön-nen - es sei denn durch chemische Synthese.Dieser Ausweg kommt für hoch komplexeWirkstoffe unter wirtschaftlichen Gesichts-punkten aber nicht in Betracht.

Wie begründet die Hoffnung ist, aus Tierenisolierte pharmakologisch viel versprechen-de Substanzen durch Fermentation zugäng-lich machen zu können, zeigt das folgende

Screening nach neuen Funktionen oder Verbindungenals Ausgangspunkt neuer Verfahrensentwicklungen


Moderne Bioreaktoren ermöglichen dienachhaltige Produktion von Grund- undFeinchemikalien.


Beispiel: Pederin und Pederin-verwandteAntitumor-aktive Wirkstoffe wurden sowohlin Käfern der Gattung Paederus als auch inMeeresschwämmen gefunden. Die Klonie-rung und Sequenzierung der Biosynthese-Gene legt nahe, dass in beiden Fällen bishernicht kultivierbare bakterielle Symbiontendie Wirkstoffe erzeugen. Weder für Pederin,dessen Strukturaufklärung seinerzeit dieExtraktion von 25 Millionen Käfern forderte,noch für die übrigen Vertreter dieser Sub-stanzgruppe existieren zurzeit nachhaltigeHerstellungsverfahren. Damit sind die näch-sten Arbeitsschritte klar vorgegeben: Es gilt,die Wirkstoff-Gene in einem leicht kultivier-baren Bakterium funktionell zu exprimieren,um Wirkstoffmengen in die Hand zu bekom-men, die eine pharmakologische Evaluie-rung ermöglichen.

Eine gezielte Isolierung bestimmter Biosyn-these-Genfamilien könnte aber auch zur Ent-deckung ganz neuer Wirkstoffe aus Umwelt-oder Symbionten-DNA führen, denn die Se-quenzierung der isolierten Gene erlaubtRückschlüsse darauf, ob sie die Biosyntheseeines bereits bekannten Naturstoffs kodie-ren, zu einem neuen Vertreter einer pharma-kologisch wichtigen Substanzfamilie gehö-ren oder sogar für einen völlig neuartigenStrukturtyp stehen. Die Entwicklung vonHochdurchsatz-Verfahren für sequenzba-sierte Screenings, effiziente Genanalysenund die Etablierung neuartiger Systeme fürdie Routine-Expression von Genen aus exoti-schen Bakterien-Gruppen werden in Zu-kunft ermöglichen, das bislang noch ver-steckte Potenzial zur Synthese von neuen

Wirkstoffen aus der nahezu unerschlossenenOrganismenvielfalt unseres Planeten zu nut-zen.

Ute Hentschel und Jörn Piel

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Der Kurzflügelkäfer Paederus fuscipes(links) setzt Pederin zur Verteidigung ge-gen Feinde ein. Diese Substanz, ein hoch-aktiver Antitumorwirkstoff, wird von bis-her nicht-kultivierbaren symbiontischenBakterien produziert, die im Inneren desKäfers leben. Ähnliche bioaktive Substan-zen werden auch von Bakterien des Mee-resschwamms Theonella swinhoei(rechts) gebildet. Metagenomische Studienhaben zur Isolation der Gene geführt, diefür die Produktion der Naturstoffe codie-ren.


Weiterführende Literatur

Piel J: Bacterial symbionts: prospects for the sustainable production of invertebrate-derivedpharmaceuticals (2006), Curr Med Chem. 13(1), 39-50

Piel J: Bakterielle Wirkstoff-Fabriken in Tieren (2005), Naturw. Rundsch. 58, 5-11

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König GM, Kehraus S, Seibert SF, Abdel-Lateff A, Müller D: Natural products from marine or-ganisms and their associated microbes (2006), Chembiochem. 7(2), 229-238

Salomon CE, Magarvey NA, Sherman DH: Merging the potential of microbial genetics withbiological and chemical diversity: an even brighter future for marine natural product drug dis-covery (2004), Nat Prod Rep. 21(1), 105-121

Scheuermayer M, Pimentel-Elardo S, Fieseler L, Grozdanov L, Hentschel U: Microorganisms ofsponges: phylogenetic diversity and biotechnological potential. In: Biotechnology of MarineNatural Products (2006), Proksch P, Müller WEG (Hrsg.), Horizon Bioscience, Norfolk (Eng-land) pp. 289-312

Internetlinks

The Science Creative Quarterlywww.scq.ubc.ca/?p=509

Diversa Corp.www.diversa.com/Pages/Technology/Overview/TechOverview.html

Zentrum für Infektionsforschung - Institut für Molekulare Infektionsbiologiewww.infektionsforschung.uni-wuerzburg.de/hentschel/hentschel.htm

Universität Bonn - Arbeitskreis Prof. Dr. Jörn Pielwww.chemie.uni-bonn.de/oc/ak_piel/index-de.html

Health Science Center der University of Utahwww.pharmacy.utah.edu/medChem/faculty/schmidt/index.html


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