NIER No 2009-19-1075발간등록번호

11-1480523-000343-01

내분비계장애물질에 대한 생물학적

분석법 적용연구(Ⅱ) Estrogenic effect

평가를 위한 bioassay 기법구축

Application of bioassay for endocrine disrupting chemicals(Ⅱ)

2009

내분비계장애물질에 대한 생물학적

분석법 적용연구(Ⅱ) Estrogenic effect

평가를 위한 bioassay 기법 구축

환경건강위해성연구부 위해성평가과

이병천 김수진 윤준헌 Duong NC 정기은 최일선

조천래 조재천 김은주 엄익춘 최경희 한진석

Application of bioassay for endocrine disrupting chemicals(Ⅱ)

BC Lee SJK im JH Yoon Duong N C KEJung IS ChoiCR Cho JCCho EJK im IC Eom KH Choi JS Han

Risk Assessment Division

Environmental Health Risk Research Department

National Institute of Environmental Research

2009

- i -

요 약 문

1 제목

내분비계장애물질에 대한 생물학적 분석법 적용연구(Ⅱ)

Estrogenic effect 평가를 위한 bioassay 기법구축

2 연구목적

가 최종연구목적

물 환경 중에 다종다양하게 존재하는 내분비계장애물질을 신속하고

통합적으로 분석하기 위해 in vitro screening 기법을 구축할 필요성이

대두되고 있다 따라서 본 연구에서는 국내외에서 사용되는 대표적

인 in vitro bioassay를 이용하여 환경매체 중 내분비계장애 영향을 나

타내는 화학물질을 screening 할 수 있도록 cell line을 확보하고 그

실험기법을 구축하고자 한다

나 2009년도 연구목적

1) 내분비계장애를 일으키는 화학물질에 대한 screening 기법으로서

신속 정확한 Bioassay 기법의 확립과 표준화

2) 환경 중에 다양하게 존재하는 화학물질과 유기물질의 존재 상태에서

통합내분비계장애영향을 평가

3) 화학물질의 내분비계장애영향에 대한 agonist antagonist effect를 신

- ii -

속하게 평가 가능하며 하천수와 하수처리장 방류수의 신속한 bio

monitoring이 가능한 기법을 확립하고 표준화

3 연구내용 및 방법

가 연구내용

내분비계장애물질의 위해성 평가를 위해 필요한 기반 기술 및

Bioassay 기법에 관한 정보 수집

에스트로겐 수용체 (estrogen receptor ER)에 대한 영향을 나

타내는 내분비계장애영향 화학물질 선정

Bioassay를 위한 세포배양 및 내분비계장애물질에 대한 농도반

응 곡선을 작성하고 물질별 활성도 비교

내분비계장애영향이 높은 하천 및 하수처리장방류수를 중심으로

bioassay 및 농도분석을 실시하여 비교

나 연구방법

국내외 내분비계장애물질의 screening 기법이 완료진행예정

중인 관련연구 정보의 수집 및 분석

- In vivo vitro bioassay 동향

- 내분비계장애영향 화학물질 조사(의약품 나노물질 등 포함)

Bioassay 세포배양

- Humanratmedaka의 estrogen receptor가 도입된 cell 배양으로

Yeast two-hybrid assay 수행

- MCF-7 BUS cell 배양으로 E-screen assay 수행

각각의 cell을 이용한 화학물질의 dose-response curve를 작성

- iii -

하여 각 bioassay의 민감도 재현성 검토

하천수 및 하수처리장방류수에 대한 bioassay 수행하여 기기분

석결과와 비교 검토

4 연구결과

가 화학물질의 bioassay 결과

1) 내분비계장애물질의 humanmedaka ER(estrogen receptor)

내분비계장애물질 E1(estrone) E2(17β-estradiol) EE2(17α

-ethinylestradiol) BPA(bisphenol A) Gen(genistein) 등 5종과 의

약품류 3종 페놀류 9종 프탈레이트류 9종에 대하여 human과

medaka 두 종류의 estrogen receptor(ER)를 이용하여 활성도를

분석하였다 분석결과 농도증가에 따라 양호한 반응곡선을 나타

냈으며 일반적으로 medaka receptor를 이용한 결과가 더욱 민감

한 결과를 나타냈다

(a) hER(human estrogen receptor)

- iv -

(b) mER(medaka estrogen receptor)

아래의 표는 mER 및 hER을 이용하여 E2의 최대농도인 10-7

M에

서의 활성도를 100로 두었을 때 10의 활성도를 계산하여

REC 10(E2 10를 나타내는 활성도)를 계산하여 상대적인 활성

도를 나타냈다

- v -

나 환경시료의 bioassay 결과

1) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐 활성도

2009년 내분비계장애물질 실태조사를 위하여 하middot폐수처리장의 유

입수와 방류수를 채수하여 분석하였다 이때 시료 중의 입자성

물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하였다(Filter) 여

액은 AcetonDCM HexaneDCM MeOH을 이용하여 연속적으

로 추출하였다 이는 내분비계장애물질의 종류가 다양하고 물리

화학적 성질도 다양하기 때문이다

하반기 시료인 mER-2차시료에서 9번지점(141 EEQ)과 11번지점

(117 EEQ)에서는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46

48를 나타냈으며 전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡

착된 내분비계장애물질도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타

났다

수질시료 중의 AceDCM 혼합용매를 이용한 추출시료의 경우

약 65의 활성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료의 경

우 약 12 HxDCM 혼합용매에서 추출된 시료의 경우 23의

활성도를 나타냈다

2009년 상반기 시료

- vi -

2009년 하반기 시료

2) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐물질 농도

채취된 시료 중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1

E2 E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석한 결과 E1의 농도가

10 ngL 이하의 수준으로 검출되었다

다 나노물질의 bioassay 결과

나노물질 Al2O3 ZnO Ag-C(citric acid ABC nanotech)

Ag-S(bare Sigma-aldrich) 4종류의 에스트로겐 활성도를 조사하

였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다 Viability 측정은 YPD agar plate method를

이용했다

일정한 농도의 10-6M E2가 다양한 나노물질과 공존할 때 에스

트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할 만한 점은

Ag-citrate를 20 100 200 500 1000 μgL 등으로 증가시켰을 때

Ag-citrate가 20 ~ 200 μgL 범위에서 공존할 때 E2의 에스트로

겐 활성도가 나노물질이 공존하지 않았을 때보다 높아짐을 알 수

있었다 또한 Ag-Sigma가 20 50 100 200 μgL로 공존할 때 에

- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

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약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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매뉴얼

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

내분비계장애물질에 대한 생물학적

분석법 적용연구(Ⅱ) Estrogenic effect

평가를 위한 bioassay 기법 구축

환경건강위해성연구부 위해성평가과

이병천 김수진 윤준헌 Duong NC 정기은 최일선

조천래 조재천 김은주 엄익춘 최경희 한진석

Application of bioassay for endocrine disrupting chemicals(Ⅱ)

BC Lee SJK im JH Yoon Duong N C KEJung IS ChoiCR Cho JCCho EJK im IC Eom KH Choi JS Han

Risk Assessment Division

Environmental Health Risk Research Department

National Institute of Environmental Research

2009

- i -

요 약 문

1 제목

내분비계장애물질에 대한 생물학적 분석법 적용연구(Ⅱ)

Estrogenic effect 평가를 위한 bioassay 기법구축

2 연구목적

가 최종연구목적

물 환경 중에 다종다양하게 존재하는 내분비계장애물질을 신속하고

통합적으로 분석하기 위해 in vitro screening 기법을 구축할 필요성이

대두되고 있다 따라서 본 연구에서는 국내외에서 사용되는 대표적

인 in vitro bioassay를 이용하여 환경매체 중 내분비계장애 영향을 나

타내는 화학물질을 screening 할 수 있도록 cell line을 확보하고 그

실험기법을 구축하고자 한다

나 2009년도 연구목적

1) 내분비계장애를 일으키는 화학물질에 대한 screening 기법으로서

신속 정확한 Bioassay 기법의 확립과 표준화

2) 환경 중에 다양하게 존재하는 화학물질과 유기물질의 존재 상태에서

통합내분비계장애영향을 평가

3) 화학물질의 내분비계장애영향에 대한 agonist antagonist effect를 신

- ii -

속하게 평가 가능하며 하천수와 하수처리장 방류수의 신속한 bio

monitoring이 가능한 기법을 확립하고 표준화

3 연구내용 및 방법

가 연구내용

내분비계장애물질의 위해성 평가를 위해 필요한 기반 기술 및

Bioassay 기법에 관한 정보 수집

에스트로겐 수용체 (estrogen receptor ER)에 대한 영향을 나

타내는 내분비계장애영향 화학물질 선정

Bioassay를 위한 세포배양 및 내분비계장애물질에 대한 농도반

응 곡선을 작성하고 물질별 활성도 비교

내분비계장애영향이 높은 하천 및 하수처리장방류수를 중심으로

bioassay 및 농도분석을 실시하여 비교

나 연구방법

국내외 내분비계장애물질의 screening 기법이 완료진행예정

중인 관련연구 정보의 수집 및 분석

- In vivo vitro bioassay 동향

- 내분비계장애영향 화학물질 조사(의약품 나노물질 등 포함)

Bioassay 세포배양

- Humanratmedaka의 estrogen receptor가 도입된 cell 배양으로

Yeast two-hybrid assay 수행

- MCF-7 BUS cell 배양으로 E-screen assay 수행

각각의 cell을 이용한 화학물질의 dose-response curve를 작성

- iii -

하여 각 bioassay의 민감도 재현성 검토

하천수 및 하수처리장방류수에 대한 bioassay 수행하여 기기분

석결과와 비교 검토

4 연구결과

가 화학물질의 bioassay 결과

1) 내분비계장애물질의 humanmedaka ER(estrogen receptor)

내분비계장애물질 E1(estrone) E2(17β-estradiol) EE2(17α

-ethinylestradiol) BPA(bisphenol A) Gen(genistein) 등 5종과 의

약품류 3종 페놀류 9종 프탈레이트류 9종에 대하여 human과

medaka 두 종류의 estrogen receptor(ER)를 이용하여 활성도를

분석하였다 분석결과 농도증가에 따라 양호한 반응곡선을 나타

냈으며 일반적으로 medaka receptor를 이용한 결과가 더욱 민감

한 결과를 나타냈다

(a) hER(human estrogen receptor)

- iv -

(b) mER(medaka estrogen receptor)

아래의 표는 mER 및 hER을 이용하여 E2의 최대농도인 10-7

M에

서의 활성도를 100로 두었을 때 10의 활성도를 계산하여

REC 10(E2 10를 나타내는 활성도)를 계산하여 상대적인 활성

도를 나타냈다

- v -

나 환경시료의 bioassay 결과

1) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐 활성도

2009년 내분비계장애물질 실태조사를 위하여 하middot폐수처리장의 유

입수와 방류수를 채수하여 분석하였다 이때 시료 중의 입자성

물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하였다(Filter) 여

액은 AcetonDCM HexaneDCM MeOH을 이용하여 연속적으

로 추출하였다 이는 내분비계장애물질의 종류가 다양하고 물리

화학적 성질도 다양하기 때문이다

하반기 시료인 mER-2차시료에서 9번지점(141 EEQ)과 11번지점

(117 EEQ)에서는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46

48를 나타냈으며 전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡

착된 내분비계장애물질도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타

났다

수질시료 중의 AceDCM 혼합용매를 이용한 추출시료의 경우

약 65의 활성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료의 경

우 약 12 HxDCM 혼합용매에서 추출된 시료의 경우 23의

활성도를 나타냈다

2009년 상반기 시료

- vi -

2009년 하반기 시료

2) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐물질 농도

채취된 시료 중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1

E2 E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석한 결과 E1의 농도가

10 ngL 이하의 수준으로 검출되었다

다 나노물질의 bioassay 결과

나노물질 Al2O3 ZnO Ag-C(citric acid ABC nanotech)

Ag-S(bare Sigma-aldrich) 4종류의 에스트로겐 활성도를 조사하

였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다 Viability 측정은 YPD agar plate method를

이용했다

일정한 농도의 10-6M E2가 다양한 나노물질과 공존할 때 에스

트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할 만한 점은

Ag-citrate를 20 100 200 500 1000 μgL 등으로 증가시켰을 때

Ag-citrate가 20 ~ 200 μgL 범위에서 공존할 때 E2의 에스트로

겐 활성도가 나노물질이 공존하지 않았을 때보다 높아짐을 알 수

있었다 또한 Ag-Sigma가 20 50 100 200 μgL로 공존할 때 에

- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

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354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- i -

요 약 문

1 제목

내분비계장애물질에 대한 생물학적 분석법 적용연구(Ⅱ)

Estrogenic effect 평가를 위한 bioassay 기법구축

2 연구목적

가 최종연구목적

물 환경 중에 다종다양하게 존재하는 내분비계장애물질을 신속하고

통합적으로 분석하기 위해 in vitro screening 기법을 구축할 필요성이

대두되고 있다 따라서 본 연구에서는 국내외에서 사용되는 대표적

인 in vitro bioassay를 이용하여 환경매체 중 내분비계장애 영향을 나

타내는 화학물질을 screening 할 수 있도록 cell line을 확보하고 그

실험기법을 구축하고자 한다

나 2009년도 연구목적

1) 내분비계장애를 일으키는 화학물질에 대한 screening 기법으로서

신속 정확한 Bioassay 기법의 확립과 표준화

2) 환경 중에 다양하게 존재하는 화학물질과 유기물질의 존재 상태에서

통합내분비계장애영향을 평가

3) 화학물질의 내분비계장애영향에 대한 agonist antagonist effect를 신

- ii -

속하게 평가 가능하며 하천수와 하수처리장 방류수의 신속한 bio

monitoring이 가능한 기법을 확립하고 표준화

3 연구내용 및 방법

가 연구내용

내분비계장애물질의 위해성 평가를 위해 필요한 기반 기술 및

Bioassay 기법에 관한 정보 수집

에스트로겐 수용체 (estrogen receptor ER)에 대한 영향을 나

타내는 내분비계장애영향 화학물질 선정

Bioassay를 위한 세포배양 및 내분비계장애물질에 대한 농도반

응 곡선을 작성하고 물질별 활성도 비교

내분비계장애영향이 높은 하천 및 하수처리장방류수를 중심으로

bioassay 및 농도분석을 실시하여 비교

나 연구방법

국내외 내분비계장애물질의 screening 기법이 완료진행예정

중인 관련연구 정보의 수집 및 분석

- In vivo vitro bioassay 동향

- 내분비계장애영향 화학물질 조사(의약품 나노물질 등 포함)

Bioassay 세포배양

- Humanratmedaka의 estrogen receptor가 도입된 cell 배양으로

Yeast two-hybrid assay 수행

- MCF-7 BUS cell 배양으로 E-screen assay 수행

각각의 cell을 이용한 화학물질의 dose-response curve를 작성

- iii -

하여 각 bioassay의 민감도 재현성 검토

하천수 및 하수처리장방류수에 대한 bioassay 수행하여 기기분

석결과와 비교 검토

4 연구결과

가 화학물질의 bioassay 결과

1) 내분비계장애물질의 humanmedaka ER(estrogen receptor)

내분비계장애물질 E1(estrone) E2(17β-estradiol) EE2(17α

-ethinylestradiol) BPA(bisphenol A) Gen(genistein) 등 5종과 의

약품류 3종 페놀류 9종 프탈레이트류 9종에 대하여 human과

medaka 두 종류의 estrogen receptor(ER)를 이용하여 활성도를

분석하였다 분석결과 농도증가에 따라 양호한 반응곡선을 나타

냈으며 일반적으로 medaka receptor를 이용한 결과가 더욱 민감

한 결과를 나타냈다

(a) hER(human estrogen receptor)

- iv -

(b) mER(medaka estrogen receptor)

아래의 표는 mER 및 hER을 이용하여 E2의 최대농도인 10-7

M에

서의 활성도를 100로 두었을 때 10의 활성도를 계산하여

REC 10(E2 10를 나타내는 활성도)를 계산하여 상대적인 활성

도를 나타냈다

- v -

나 환경시료의 bioassay 결과

1) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐 활성도

2009년 내분비계장애물질 실태조사를 위하여 하middot폐수처리장의 유

입수와 방류수를 채수하여 분석하였다 이때 시료 중의 입자성

물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하였다(Filter) 여

액은 AcetonDCM HexaneDCM MeOH을 이용하여 연속적으

로 추출하였다 이는 내분비계장애물질의 종류가 다양하고 물리

화학적 성질도 다양하기 때문이다

하반기 시료인 mER-2차시료에서 9번지점(141 EEQ)과 11번지점

(117 EEQ)에서는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46

48를 나타냈으며 전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡

착된 내분비계장애물질도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타

났다

수질시료 중의 AceDCM 혼합용매를 이용한 추출시료의 경우

약 65의 활성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료의 경

우 약 12 HxDCM 혼합용매에서 추출된 시료의 경우 23의

활성도를 나타냈다

2009년 상반기 시료

- vi -

2009년 하반기 시료

2) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐물질 농도

채취된 시료 중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1

E2 E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석한 결과 E1의 농도가

10 ngL 이하의 수준으로 검출되었다

다 나노물질의 bioassay 결과

나노물질 Al2O3 ZnO Ag-C(citric acid ABC nanotech)

Ag-S(bare Sigma-aldrich) 4종류의 에스트로겐 활성도를 조사하

였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다 Viability 측정은 YPD agar plate method를

이용했다

일정한 농도의 10-6M E2가 다양한 나노물질과 공존할 때 에스

트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할 만한 점은

Ag-citrate를 20 100 200 500 1000 μgL 등으로 증가시켰을 때

Ag-citrate가 20 ~ 200 μgL 범위에서 공존할 때 E2의 에스트로

겐 활성도가 나노물질이 공존하지 않았을 때보다 높아짐을 알 수

있었다 또한 Ag-Sigma가 20 50 100 200 μgL로 공존할 때 에

- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

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오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

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그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

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화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

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3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

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312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

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3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

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안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

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에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

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⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

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5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

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(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

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6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

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6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

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활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

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354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

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표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- ii -

속하게 평가 가능하며 하천수와 하수처리장 방류수의 신속한 bio

monitoring이 가능한 기법을 확립하고 표준화

3 연구내용 및 방법

가 연구내용

내분비계장애물질의 위해성 평가를 위해 필요한 기반 기술 및

Bioassay 기법에 관한 정보 수집

에스트로겐 수용체 (estrogen receptor ER)에 대한 영향을 나

타내는 내분비계장애영향 화학물질 선정

Bioassay를 위한 세포배양 및 내분비계장애물질에 대한 농도반

응 곡선을 작성하고 물질별 활성도 비교

내분비계장애영향이 높은 하천 및 하수처리장방류수를 중심으로

bioassay 및 농도분석을 실시하여 비교

나 연구방법

국내외 내분비계장애물질의 screening 기법이 완료진행예정

중인 관련연구 정보의 수집 및 분석

- In vivo vitro bioassay 동향

- 내분비계장애영향 화학물질 조사(의약품 나노물질 등 포함)

Bioassay 세포배양

- Humanratmedaka의 estrogen receptor가 도입된 cell 배양으로

Yeast two-hybrid assay 수행

- MCF-7 BUS cell 배양으로 E-screen assay 수행

각각의 cell을 이용한 화학물질의 dose-response curve를 작성

- iii -

하여 각 bioassay의 민감도 재현성 검토

하천수 및 하수처리장방류수에 대한 bioassay 수행하여 기기분

석결과와 비교 검토

4 연구결과

가 화학물질의 bioassay 결과

1) 내분비계장애물질의 humanmedaka ER(estrogen receptor)

내분비계장애물질 E1(estrone) E2(17β-estradiol) EE2(17α

-ethinylestradiol) BPA(bisphenol A) Gen(genistein) 등 5종과 의

약품류 3종 페놀류 9종 프탈레이트류 9종에 대하여 human과

medaka 두 종류의 estrogen receptor(ER)를 이용하여 활성도를

분석하였다 분석결과 농도증가에 따라 양호한 반응곡선을 나타

냈으며 일반적으로 medaka receptor를 이용한 결과가 더욱 민감

한 결과를 나타냈다

(a) hER(human estrogen receptor)

- iv -

(b) mER(medaka estrogen receptor)

아래의 표는 mER 및 hER을 이용하여 E2의 최대농도인 10-7

M에

서의 활성도를 100로 두었을 때 10의 활성도를 계산하여

REC 10(E2 10를 나타내는 활성도)를 계산하여 상대적인 활성

도를 나타냈다

- v -

나 환경시료의 bioassay 결과

1) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐 활성도

2009년 내분비계장애물질 실태조사를 위하여 하middot폐수처리장의 유

입수와 방류수를 채수하여 분석하였다 이때 시료 중의 입자성

물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하였다(Filter) 여

액은 AcetonDCM HexaneDCM MeOH을 이용하여 연속적으

로 추출하였다 이는 내분비계장애물질의 종류가 다양하고 물리

화학적 성질도 다양하기 때문이다

하반기 시료인 mER-2차시료에서 9번지점(141 EEQ)과 11번지점

(117 EEQ)에서는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46

48를 나타냈으며 전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡

착된 내분비계장애물질도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타

났다

수질시료 중의 AceDCM 혼합용매를 이용한 추출시료의 경우

약 65의 활성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료의 경

우 약 12 HxDCM 혼합용매에서 추출된 시료의 경우 23의

활성도를 나타냈다

2009년 상반기 시료

- vi -

2009년 하반기 시료

2) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐물질 농도

채취된 시료 중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1

E2 E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석한 결과 E1의 농도가

10 ngL 이하의 수준으로 검출되었다

다 나노물질의 bioassay 결과

나노물질 Al2O3 ZnO Ag-C(citric acid ABC nanotech)

Ag-S(bare Sigma-aldrich) 4종류의 에스트로겐 활성도를 조사하

였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다 Viability 측정은 YPD agar plate method를

이용했다

일정한 농도의 10-6M E2가 다양한 나노물질과 공존할 때 에스

트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할 만한 점은

Ag-citrate를 20 100 200 500 1000 μgL 등으로 증가시켰을 때

Ag-citrate가 20 ~ 200 μgL 범위에서 공존할 때 E2의 에스트로

겐 활성도가 나노물질이 공존하지 않았을 때보다 높아짐을 알 수

있었다 또한 Ag-Sigma가 20 50 100 200 μgL로 공존할 때 에

- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

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6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

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- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- iii -

하여 각 bioassay의 민감도 재현성 검토

하천수 및 하수처리장방류수에 대한 bioassay 수행하여 기기분

석결과와 비교 검토

4 연구결과

가 화학물질의 bioassay 결과

1) 내분비계장애물질의 humanmedaka ER(estrogen receptor)

내분비계장애물질 E1(estrone) E2(17β-estradiol) EE2(17α

-ethinylestradiol) BPA(bisphenol A) Gen(genistein) 등 5종과 의

약품류 3종 페놀류 9종 프탈레이트류 9종에 대하여 human과

medaka 두 종류의 estrogen receptor(ER)를 이용하여 활성도를

분석하였다 분석결과 농도증가에 따라 양호한 반응곡선을 나타

냈으며 일반적으로 medaka receptor를 이용한 결과가 더욱 민감

한 결과를 나타냈다

(a) hER(human estrogen receptor)

- iv -

(b) mER(medaka estrogen receptor)

아래의 표는 mER 및 hER을 이용하여 E2의 최대농도인 10-7

M에

서의 활성도를 100로 두었을 때 10의 활성도를 계산하여

REC 10(E2 10를 나타내는 활성도)를 계산하여 상대적인 활성

도를 나타냈다

- v -

나 환경시료의 bioassay 결과

1) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐 활성도

2009년 내분비계장애물질 실태조사를 위하여 하middot폐수처리장의 유

입수와 방류수를 채수하여 분석하였다 이때 시료 중의 입자성

물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하였다(Filter) 여

액은 AcetonDCM HexaneDCM MeOH을 이용하여 연속적으

로 추출하였다 이는 내분비계장애물질의 종류가 다양하고 물리

화학적 성질도 다양하기 때문이다

하반기 시료인 mER-2차시료에서 9번지점(141 EEQ)과 11번지점

(117 EEQ)에서는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46

48를 나타냈으며 전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡

착된 내분비계장애물질도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타

났다

수질시료 중의 AceDCM 혼합용매를 이용한 추출시료의 경우

약 65의 활성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료의 경

우 약 12 HxDCM 혼합용매에서 추출된 시료의 경우 23의

활성도를 나타냈다

2009년 상반기 시료

- vi -

2009년 하반기 시료

2) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐물질 농도

채취된 시료 중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1

E2 E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석한 결과 E1의 농도가

10 ngL 이하의 수준으로 검출되었다

다 나노물질의 bioassay 결과

나노물질 Al2O3 ZnO Ag-C(citric acid ABC nanotech)

Ag-S(bare Sigma-aldrich) 4종류의 에스트로겐 활성도를 조사하

였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다 Viability 측정은 YPD agar plate method를

이용했다

일정한 농도의 10-6M E2가 다양한 나노물질과 공존할 때 에스

트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할 만한 점은

Ag-citrate를 20 100 200 500 1000 μgL 등으로 증가시켰을 때

Ag-citrate가 20 ~ 200 μgL 범위에서 공존할 때 E2의 에스트로

겐 활성도가 나노물질이 공존하지 않았을 때보다 높아짐을 알 수

있었다 또한 Ag-Sigma가 20 50 100 200 μgL로 공존할 때 에

- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

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5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

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(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

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6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

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6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

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활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

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34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

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① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

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- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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- iv -

(b) mER(medaka estrogen receptor)

아래의 표는 mER 및 hER을 이용하여 E2의 최대농도인 10-7

M에

서의 활성도를 100로 두었을 때 10의 활성도를 계산하여

REC 10(E2 10를 나타내는 활성도)를 계산하여 상대적인 활성

도를 나타냈다

- v -

나 환경시료의 bioassay 결과

1) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐 활성도

2009년 내분비계장애물질 실태조사를 위하여 하middot폐수처리장의 유

입수와 방류수를 채수하여 분석하였다 이때 시료 중의 입자성

물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하였다(Filter) 여

액은 AcetonDCM HexaneDCM MeOH을 이용하여 연속적으

로 추출하였다 이는 내분비계장애물질의 종류가 다양하고 물리

화학적 성질도 다양하기 때문이다

하반기 시료인 mER-2차시료에서 9번지점(141 EEQ)과 11번지점

(117 EEQ)에서는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46

48를 나타냈으며 전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡

착된 내분비계장애물질도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타

났다

수질시료 중의 AceDCM 혼합용매를 이용한 추출시료의 경우

약 65의 활성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료의 경

우 약 12 HxDCM 혼합용매에서 추출된 시료의 경우 23의

활성도를 나타냈다

2009년 상반기 시료

- vi -

2009년 하반기 시료

2) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐물질 농도

채취된 시료 중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1

E2 E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석한 결과 E1의 농도가

10 ngL 이하의 수준으로 검출되었다

다 나노물질의 bioassay 결과

나노물질 Al2O3 ZnO Ag-C(citric acid ABC nanotech)

Ag-S(bare Sigma-aldrich) 4종류의 에스트로겐 활성도를 조사하

였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다 Viability 측정은 YPD agar plate method를

이용했다

일정한 농도의 10-6M E2가 다양한 나노물질과 공존할 때 에스

트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할 만한 점은

Ag-citrate를 20 100 200 500 1000 μgL 등으로 증가시켰을 때

Ag-citrate가 20 ~ 200 μgL 범위에서 공존할 때 E2의 에스트로

겐 활성도가 나노물질이 공존하지 않았을 때보다 높아짐을 알 수

있었다 또한 Ag-Sigma가 20 50 100 200 μgL로 공존할 때 에

- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

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5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

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(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

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6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

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6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

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활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

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34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

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① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

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- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

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L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

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DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

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정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

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20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

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① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

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그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- v -

나 환경시료의 bioassay 결과

1) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐 활성도

2009년 내분비계장애물질 실태조사를 위하여 하middot폐수처리장의 유

입수와 방류수를 채수하여 분석하였다 이때 시료 중의 입자성

물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하였다(Filter) 여

액은 AcetonDCM HexaneDCM MeOH을 이용하여 연속적으

로 추출하였다 이는 내분비계장애물질의 종류가 다양하고 물리

화학적 성질도 다양하기 때문이다

하반기 시료인 mER-2차시료에서 9번지점(141 EEQ)과 11번지점

(117 EEQ)에서는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46

48를 나타냈으며 전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡

착된 내분비계장애물질도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타

났다

수질시료 중의 AceDCM 혼합용매를 이용한 추출시료의 경우

약 65의 활성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료의 경

우 약 12 HxDCM 혼합용매에서 추출된 시료의 경우 23의

활성도를 나타냈다

2009년 상반기 시료

- vi -

2009년 하반기 시료

2) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐물질 농도

채취된 시료 중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1

E2 E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석한 결과 E1의 농도가

10 ngL 이하의 수준으로 검출되었다

다 나노물질의 bioassay 결과

나노물질 Al2O3 ZnO Ag-C(citric acid ABC nanotech)

Ag-S(bare Sigma-aldrich) 4종류의 에스트로겐 활성도를 조사하

였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다 Viability 측정은 YPD agar plate method를

이용했다

일정한 농도의 10-6M E2가 다양한 나노물질과 공존할 때 에스

트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할 만한 점은

Ag-citrate를 20 100 200 500 1000 μgL 등으로 증가시켰을 때

Ag-citrate가 20 ~ 200 μgL 범위에서 공존할 때 E2의 에스트로

겐 활성도가 나노물질이 공존하지 않았을 때보다 높아짐을 알 수

있었다 또한 Ag-Sigma가 20 50 100 200 μgL로 공존할 때 에

- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

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352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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매뉴얼

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국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

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- vi -

2009년 하반기 시료

2) 2009년 상middot하반기 시료 중의 에스트로겐물질 농도

채취된 시료 중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1

E2 E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석한 결과 E1의 농도가

10 ngL 이하의 수준으로 검출되었다

다 나노물질의 bioassay 결과

나노물질 Al2O3 ZnO Ag-C(citric acid ABC nanotech)

Ag-S(bare Sigma-aldrich) 4종류의 에스트로겐 활성도를 조사하

였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다 Viability 측정은 YPD agar plate method를

이용했다

일정한 농도의 10-6M E2가 다양한 나노물질과 공존할 때 에스

트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할 만한 점은

Ag-citrate를 20 100 200 500 1000 μgL 등으로 증가시켰을 때

Ag-citrate가 20 ~ 200 μgL 범위에서 공존할 때 E2의 에스트로

겐 활성도가 나노물질이 공존하지 않았을 때보다 높아짐을 알 수

있었다 또한 Ag-Sigma가 20 50 100 200 μgL로 공존할 때 에

- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- vii -

스트로겐 활성이 증가하는 현상을 발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서

E2가 나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하거나 E2의 세포내

이동성이 증가하여 에스트로겐활성을 증가시키는 것으로 예측된

다 Ag-Sigma의 첨가시 에스트로겐 활성이 Ag-citrate 보다 급격

하게 감소하는 것을 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문

이다 Ag2O3는 에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며

ZnO는 20 ppb에서 약간 증가하는 경향을 나타냈다

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- viii -

4 기대효과

내분비계장애물질의 영향을 산학연에서 쉽게 확인평가 가능한

분석기법을 구축하며 이에 관한 정보를 확인

OECD의 주요 사업인 내분비계장애물질에 관한 데이터베이스

구축과 안전성 시험법 개발 및 시험지침 개정 및 개발 등에 국

가 자료로 활용하여 OECD에 기여하고 내분비계장애물질 연구

분야의 국가 위상 제고 일본 국립환경연구소와 긴밀한 정보교

류 확대

- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

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약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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- ix -

Abstract

The main objective of this study is to investigate the effects of

pollutants originated from manufactured as well as environmental

sources using yeast-two hybrid system and human breast cancer

cell (MCF-7) assays

Chemicals used in the experiments include 4 hormones 4

pharmaceuticals 9 phenols 9 phthalates and 4 nanoparticles (NPs)

Toxicity and estrogenic activity of target pollutants were estimated

after the exposure on yeast (Saccaromycescervisiae Y190) carrying

medaka and estrogen receptors (mER and hER respectively) as

well as MCF-7 cell line 17-β estradiol (E2 10-6M) was used as an

estrogenic activity reference chemical Dose-response curves were

established using EC50 values of corresponded chemicals

Environmental samples were collected in amber glass bottles and

stored at 4oC immediately in prior of further treatment Different

mixtures of solvent were used in extraction steps in order to

maximize the efficiency of pollutants isolation Fractions of eluted

solvent after the extraction were kept in separated vials for the test

In yeast-two hybrid assays yeast was exposed to the NPs for 4

hours and then the estrogenic activity was evaluated using

chemiluminesence assay The viability of yeast exposed to NPs was

examined by agar plate and blue staining methods The results

showed that the NPs did not induce estrogenic activity in mER-yeast

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

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오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

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352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

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그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

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2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 69 -

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環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- x -

system Without sonication low concentrations of silver NPs (lt 01

mgL for Ag-S NPs and lt 10 mgL for Ag-C NPs) and ZnO NPs

(lt10 mgL) significantly increased estrogenic activity of E2 in

mER-yeast At concentration less than 10 mgL Al2O3 NPs showed

no significant effects to estrogenic activity of E2 However the

exposure of yeast system to Al2O3 NPs at concentration of 10mgL

and greater in creased the estrogenicity of E2 With 30min of

sonication before the exposure Ag-S Ag-C ZnO and Al2O3 NPs

showed significant impacts in reducing estrogenic activity of E2 in

mER-yeast at 05 05 1 and 5 mgL respectively In cell viability

assay results at lower concentrations of silver NPs (lt01 mgL for

Ag-S and lt 10 mgL for Ag-C) there was no significant difference

of yeast viability between the control and the exposures There was

also high correlation (r2gt09) between yeast viability (as of

control) and estrogenic activity of E2 in yeast (as of control) The

viability test also showed that cell counts were reduced significantly

in the exposure of Al2O3 and ZnO NPs with concentrations ranged

from 50 to 500 mgL The results suggested that the toxicity level

can be sorted as Ag-S NPs gt Ag-C NPs gt ZnO NPs gt Al2O3 NPs

After the exposure of other 26 chemicals dose response curves

were obtained and used to calculate the relative potency of each

chemical to E2 Dose response curve of E2 was also used to

calculate the EEQ concentration of estrogenic compounds in the

environmental samples The results showed that the sensitivity of

- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

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34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

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① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

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- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

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L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- xi -

mER is higher than that of hER in yeast system EEQ

concentrations detected in environmental samples of the 1st sampling

were ranged from less than 1 microgL (surface water samples) to 18

microgL (influents of wastewater treatment plant) when using mER

yeast These values in hER system were lower than those of mER

system It showed the consistent results with pure chemical test

Similar results were obtained in the samples of the 2nd sampling

Estrogenic compounds in the environmental samples were also

monitored by chemical analysis method using LCMSMS The

concentration of target compounds in the environmental samples

were relatively correlated with estrogenic activity by yeast two-hybrid

assays (R2=068) Statistical analysis of estrogenic activity and

SUVA index also showed the relatively high relationship with

R2=057 and 065 in the samples of the 1st and the 2nd sampling

respectively

The dose-response curve of target compounds was also obtained

by MCF-7 assays and applied to estimate the estrogenic activity in

the environmental samples

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

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① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

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L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

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20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

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① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

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그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

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352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- xii -

목 차

요 약 문 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot i

Abstract middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot ix

목 차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xii

그림 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xv

표 목차 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xvii

약어 목록 middotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddotmiddot xviii

Ⅰ 서 론 1

Ⅱ 연구내용 및 방법 4

1 E-screen에 의한 EDCs 평가 4

2 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가 6

Ⅲ 연구결과 및 고찰 10

1 국내외 내분비계장애물질 연구동향 10

가 구조활성상관법(QSAR) 10

나 In vivo assay 11

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

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社オーム社

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- xiii -

다 In vitro assay 12

라 거동연구 13

2 E-screen assay 기법확립 14

가 실험세포 및 배양방법 14

나 Cell Seeding 15

다 계대배양 방법 17

라 물질 노출 시험 20

마 SRB assay 22

3 E-screen에 의한 활성도 측정 26

가 정량적 평가 26

4 Yeast two-hybrid assay 기법 확립 28

가 환경시료의 전처리 28

나 Yeast two-hybrid assay 배지 제조 29

다 Yeast 배양액의 준비 31

라 단계희석 시험 31

마 유전자조작 효모의 보존방법 33

5 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경수의 분석 36

가 30종 화학물질의 dose-response 곡선 36

나 나노물질의 bioassay 결과 44

다 환경시료의 bioassay 결과 47

- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

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352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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- xiv -

라 환경시료의 내분비계장애물질 농도결과 51

Ⅳ 결 론 66

Ⅴ 참 고 문 헌 67

- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

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5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

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(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

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34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

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- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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- xv -

그 림 목 차

그림 1 E-screen의 기본적인 원리 5

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리 8

그림 3 E-screen assay 실험순서 16

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①～⑩) 18

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰 20

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 27

그림 7 환경시료의 전처리 순서 29

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서 35

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선 36

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 37

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 37

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 38

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선 40

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선 40

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선 41

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선 42

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- xvi -

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 45

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선 46

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도 49

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도 50

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리 53

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도 54

그림 27 환경시료에서 프탈레이트의 전처리와 정제 59

그림 28 물 시료중 알킬페놀과 비스페놀-A 전처리 63

그림 29 상반기(좌) 하반기(우) 내분비계장애물질의 활성도와 유기물

지표와의 관계 65

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표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

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약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

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QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

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의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

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화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

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오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

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그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

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3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

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312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

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3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

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안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

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32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

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에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

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7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

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354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- xvii -

표 목 차

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가 6

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가 9

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative activity) 43

표 4 환경시료의 각 지점별 내용 47

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건 52

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계 52

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 55

표 8 프탈레이트 분석을 위한 GCMS 조건 57

표 9 프탈레이트 및 아디페이트의 정량한계 58

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 60

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GCMS 분석조건 62

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율 62

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL) 64

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- xviii -

약어 목록 (Abbreviation Lists)

AhR Aryl hydrocarbon Receptor (Aryl hydrocarbon 수용체)

BPA Bisphenol A (비스페놀A)

DMEM Dulbeccos modified eagles medium (세포배지)

E1 Estrone (천연호르몬 에스트론)

E2 17β-estradiol (천연호르몬 에스트라디올)

E3 Estriol (천연호르몬 에스트리올)

ECACC European collection of cell culture (유럽 세포주 은행)

EDCs Endocrine Disrupting Chemicals (내분비계장애물질)

EE2 17α-Ethynylestradiol (합성호르몬 에티닐에스트라디올)

EEQ Estradiol Equivalent Concentration (에스트라디올 등가농도)

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (효소면역검사법)

ER Estrogen Receptor (에스트로겐 수용체)

FBS Fetal bovine serum (세포배지)

GN Genistein (식물성에스트로겐 제니스틴)

hER human Estrogen Receptor (human 에스트로겐 수용체)

MCF-7 Michigan Cancer Foundation 7 cell line (포유류유방암 세포)

mER Japanese medaka Estrogen Receptor (Japanese medaka

에스트로겐 수용체)

NP Nonylphenol (노닐페놀)

OP Octylphenol (옥틸페놀)

PBS Phosphate Buffer Saline (인산완충식염수)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

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環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- xix -

QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship (구조-활성 예측프로그램)

REC10 10 relative effective concentration (10영향농도)

rER rat Estrogen Receptor (rat 에스트로겐 수용체)

SRB assay Sulforhodamin B assay (세포증식 검색법)

TIF2 Transcriptional mediators Intermediary Factor 2 (co-activator)

YES Yeast Estrogen Screening (효모에스트로겐 시험)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 69 -

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국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 1 -

1 서 론

내분비계장애물질 (Endocrine Disrupting Chemicals EDCs)은 생물체

외부로부터 유입되어 생물체내 호르몬의 생산 분비 이동 대사활동

상호작용 제거 등과 같이 내분비계의 정상적인 기능을 방해하는 물질로서

마치 호르몬과 같은 작용을 하여 일명 ldquo환경호르몬rdquo이라고도 불리고

있다 일찍이 1962년 미국의 Rachel Carson이 ldquo침묵의 봄rdquo에서 농약

등에 의한 환경오염으로 인하여 인류에 미칠 위기를 지적한지 벌써

반세기에 이르고 있다 내분비계장애물질에 의한 물질별 인체 및 생태계에

미치는 영향에 관하여 수많은 연구가 진행되어 왔으며 그 관리대책 또한

어느 정도 틀을 잡아온 것이 사실이다

최근 각 종 산업분야의 발달로 인해 화학물질의 유통량 증가 신규

화학물질의 개발 첨단산업 등 산업구조의 다변화 등으로 인한 신규의

수질 유해유발물질 발생량은 크게 증가할 것으로 예산되고 있다

국내에서 2007년도 기준으로 유통되고 있는 화학물질의 수는 3만8천여

종에 이르고 매년 300종 이상의 신규 화학물질이 국내시장에 진입하

고 있으며 국내 유통량도 급격히 증가하고 있다 환경 중에 미량으로

존재하면서 오랜 시간동안 세대를 거치면서 나타날 수 있는 장애현상에

대하여 명확하게 검증된 연구결과들이 많지 않으며 이러한 결과들은

개별물질에 대한 것으로 한정되어 있다 그러나 내분비계장애물질로

추정되는 수십～수백 종의 물질이 혼재하여 환경에 노출되기 때문에

생태 및 인체에 대한 위해의 정도를 규명하는 것은 매우 어려운 실정

이다

- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

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6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

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활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

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① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

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L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

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20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

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① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

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그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

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352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 2 -

우리나라 환경부에서도 1999년부터 내분비계장애물질 조사연구사업이

진행되어 전국을 대상으로 환경매체 및 어류의 생체 중 모니터링 조사

원인규명 및 위해성평가와 관련한 연구를 진행하여 왔다 그 결과

환경 중 잔류실태는 점차 감소추세에 있고 농도수준 역시 외국과

비교하여 우려할 수준이 아닌 것으로 보고되고 있다 매년 지속적으로

국내 환경 중 검출되는 내분비계장애물질은 10여 종에 불과한 것으로

나타나고 있다 그러나 어류의 생체 중에서는 이성생식세포의 발현 등

내분비계장애현상이 여전히 확인되고 있는 실정이다 (국립환경과학원

2002 국립환경과학원 2007)

내분비계장애물질은 환경 중에 존재하는 여러 가지 물질이 동시에

생체에 노출되는 경우가 대부분이다 따라서 개별물질의 내분비계장애

영향을 규명하는 것만으로는 명확한 인과관계를 설명하는데 그 한계

가 있으므로 복합적 노출에 따른 내분비계장애의 정도를 파악할 수

있는 기법의 필요성이 대두되고 있다 현재 E-screen assay 등 수 종의

bioassay 기법은 이러한 영향을 신속하게 평가할 수 있는 장점을 가지며

환경 중의 다양한 물질에 대하여 통합적으로 영향을 측정하는데 이용

되고 있다 (Cunningham amp Shah 2007 Lee et al 2008)

내분비계장애 현상을 유발하는 물질에 대한 모니터링 결과는 여러

연구자들에 의하여 보고되고 있다 천연호르몬 (E1 E2) 및 인공합성호르몬

(NP BPA EE2 등 7종) 내분비계장애물질이 대부분의 하천수에서 28

~ 211 ngL로 검출되고 있으며 퇴적물에서는 31 ~ 289 μgkg로 검

출되는 것으로 보고하고 있다 이때 생물체 내에서는 EE2와 NP가 72

~ 240 ngg 범위로 검출되었다 물에서는 E2와 EE2가 평균 25 ngL

EEQ (estradiol equivalent concentration)로서 가장 기여도가 큰 물질로

- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 3 -

나타났고 침전물에서는 합성 내분비계장애물질인 EE2가 평균

71 μgkg EEQ로 검출되어 기여도가 가장 큰 물질로 보고되고 있다

(Pojana et al 2007) 한편 내분비계장애물질의 영향을 평가하기 위한

bioassay 연구는 신속하고 간편하게 분석할 수 있는 in vitro assay가

많이 연구되고 있다 특히 기존의 Yeast estrogen system으로부터 발

전시킨 Yeast two-hybrid system을 이용한 연구가 지속되고 있다 이

기법의 특징은 화학물질 또는 환경시료의 에스트로겐 활성을 평가하기

위하여 96 well plate 상에서 배양측정하여 상대적인 활성도를 나타내고

있다 (Shiraishi et al 2000 Kamata et al 2008)

최근에는 내분비계장애물질 현상을 나타내는 원인물질로서 기존에

관심대상이었던 농약 중금속 등의 화학물질 뿐 아니라 자연 중 존재하는

식물성 에스트로겐 및 사람 또는 가축에 의료처방용으로 사용되는

호르몬제로 인해 나타날 수 있는 내분비계교란현상에 더욱 주목할

필요가 있다

기존에는 내분비계장애물질영향을 기기분석에 주로 의존하였으나

본 연구에는 내분비계장애현상을 복합적 통합적으로 평가할 수 있는

in vitro bioassay 기법을 이용하여 화학물질을 비롯하여 수질 중의

내분비계장애 영향을 평가할 수 있는 기법을 구축하고자 한다 또한

향후 기존 관심대상이었던 화학물질 중심의 내분비계장애물질에서

의약품 나노물질 페놀류 프탈레이트 및 식물성 에스트로겐성 물질까지

그 범위를 확대하여 현재 환경 중에 나타나는 내분비계장애 영향을

확인하고 그 원인을 규명하는데 기여하고자 한다

- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

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34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

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① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

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L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

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20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

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① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 4 -

2 연구내용 및 방법

생물학적 방법으로 분석하는 bioassay는 내분비계장애 영향을 확인하기

위하여 화학물질 하수처리장 방류수 하천수 등에 존재하는

내분비계장애물질의 영향을 종합적으로 평가한다 내분비계장애물질의

영향을 평가하는데 주로 사용되는 방법으로는 in vitro 시험법과

in vivo 시험법이 있다 In vivo 시험은 장기간 수행되는 실험으로서

비텔로제닌 다세대번식 시험 등이 있으며 선택된 물질의 영향을 확인하기

위하여 최종적으로 수행된다 In vitro 시험은 내분비계장애물질의

영향을 확인하기 위한 것으로서 단기간에 간단하고 저비용으로 수행할

수 있는 장점을 가진다 내분비계장애 영향을 평가하는 in vitro

bioassay에는 Yeast two-hybrid system E-screening MVLN-screening

ER-binding assay 등의 방법이 주로 사용되고 있다 특히 E-screen

방법이 가장 민감한 기법으로 평가되고 있으며 (Chultis et al 2004)

민감도를 나타내는 sensitivity가 10-12M으로 낮은 농도에서 반응하고

있다 Yeast two-hybrid system은 일본에서 개발된 방법으로 간편하고

민감하게 하수처리장이나 하천수 같은 환경수를 평가할 수 있도록

지속적으로 개량되고 있다

21 E-screen에 의한 EDCs 평가

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS cell

(Michigan Cancer Foundation 7 cell line)로서 미국 Tuft university

- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 5 -

의 A Soto 교수로부터 분양받은 세포를 이용하였다 E-screen assay

는 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포가 에스트로겐 작용이 있는 화학물질

에 의해 성장이 촉진되고 항에스트로겐 작용이 있는 화학물질에 의해

서는 세포성장이 저하되는 효과를 이용한다 이 시험법은 어느 정도의 실

험물질 대사 반응도 관찰이 가능하여 생체 내 실험과의 관련성이 높은

평가기법으로서 내분비계장애물질 검색법으로서 적합하다고 알려져

있다

E-screen의 기본적 원리는 그림 1의 모식도와 같다 일반배양 배지는

10 FBS의 DMEM을 이용하였고 assay용 배지로는 5 charcoal과

05 dextran으로 처리된 10 FBS 의 DMEM을 이용하였다 배양은

24 well plate에서 104 cellwell 기준으로 배양한다

그림 1 E-screen의 기본적인 원리

- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 6 -

화학물질 상대증식능 (RPP)

17β-estradiol (E2)

17α-estradiol

Estriol (E3)

Estrone (E1)

DES(diethylstelbestrol)

4-Octylphenol

4-Nonylphenol

25-Dichloro-4-hydroxy BP

246-Trichloro-4-hydroxy BP

223366-Hexachloro BP

op-DDT

pp-DDT

100 (30 pM) 1)

10

10

1

1000

003 (100 nM) 2)

0003

0001

001 (100 nM) 2)

00001

00001

00001

표 1 E-screen (MCF-7 cell의 증식)의 에스트로겐 활성도평가

1)최대증식을 나타내는 최저농도 2)시스템의 최대농도

(출처 화학물질안전정보연구회 1995)

22 Yeast two-hybrid assay에 의한 EDCs 평가

Yeast two-hybrid system은 효모에 포유류의 에스트로겐 수용체

(estrogen receptor ER)를 도입시켜 형질 전환함으로써 에스트로겐

활성을 측정하는 방법으로 내분비계장애물질의 영향을 포괄적으로

측정하는데 중요한 방법으로 인식되고 있다 Cell line은 Y190 cell로서

- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 7 -

오사카대학 Nishihara J 교수와 일본 국립환경연구소 Shiraishi F

박사가 공동 개발한 것으로 본 연구를 위하여 일본국립환경연구소에서

세포를 분양받아서 실험을 수행하였다

그림 2에 나타낸 모식도와 같이 이 실험법은 receptor에 내분비계

장애물질이 결합되면 그 정보가 기본전사인자 (transcription machinery)에

전해지게 되는데 이때 전달역할을 하는 단백질로서 co-activator TIF2가

이용되었고 민감도가 낮았던 기존의 YES (Yeast Estrogen Screening)

법으로부터 co-activator를 도입함으로써 민감도가 향상되었다 즉

효모에 co-activator와 ER 단백질의 발현유전자를 도입시켰다

Reporter 유전자로는 β-galactosidase를 이용하였다

표 2에서 나타낸 것은 Nishikawa J 등(1999)이 Yeast two-hybrid

assay로부터 구한 연구결과로서 REC 10 (10 relative effective

concentration) 값으로 화학물질간의 에스트로겐 활성도를 비교하여

나타내고 있다 이때 기준으로 사용된 물질은 10-7M의 E2로서 이 물질이

가지는 최대활성값의 10 값을 기준으로 상호 비교하였다

- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

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2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 8 -

그림 2 Yeast two-hybrid system의 기본적인 원리

- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

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354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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- 9 -

화학물질 REC 101) 비고

17α-estradiol

Apigenin

Coumestrin

Coumestrol

Estriol

Estrone

Genistein

Naringenin

DES(diethylstelbestrol)

17α-Ethinylestradiol

Ethyl 4-hydroxybenzoate

Methyl 4-hydroxybenzoate

n-Buthyl 4-hydroxybenzoate

n-Propyl 4-hydroxybenzoate

2-Hydroxy benzo[a]pyrene

2-Hdoxy fluorene

Benzo[a]pyrene

4times10-9

1times10-5

1times10-5

3times10-7

3times10-7

3times10-10

1times10-7

3times10-5

2times10-10

2times10-10

1times10-4

4times10-4

3times10-6

1times10-5

5times10-5

1times10-4

gt1times10-4

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Phytoestrogen

E2 metabolite

E2 metabolite

Phytoestrogen

Phytoestrogen

Medicine

Medicine

Paraben

Paraben

Paraben

Paraben

PAH metabolite

PAH metabolite

PAH

표 2 Yeast two-hybrid assay에 의한 에스트로겐 활성도평가

1)10 relative effective activity (Nishihara et al 2000)

- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 10 -

3 연구결과 및 고찰

31 국내외 내분비계장애물질 연구동향

일본후생노동성 및 국립환경연구소에서는 내분비계장애물질의 시험은

In silico In vitro In vivo로 평가를 하여 우선연구 대상물질을 선정한후

에 확정시험 (상세시험)을 하도록 한다 따라서 In silico (컴퓨터 가상실험

예측) 세포계 및 무세포계를 이용한 In vitro (시험관실험) 그리고 난

소적출동물 또는 어린동물을 이용한 In vivo (생체실험)로 확인하여

데이터를축적할 것을제안하고 있다

다음 단계인 확정시험 (상세시험)에서는 생체의 성장과정 (태아기

신생아기 사춘기)이나 생체반응 (신경계 내분비계 면역계 등에 미치는

변화)을 포괄적으로 평가하는 시험법 개발을 진행하고 있다 이러한

시험방법은 다음과 같다

311 구조활성상관법 (QSAR)

다양한 화학물질 중에서 내분비계장애 영향이 있는 화학물질을 선별하기

위하여 화학물질과 내분비계장애물질 수용체의 결합자유에너지를

조사하여 결합성을 예측하는 기법이다 즉 화학물질의 구조로부터

에스트로겐활성의 유무 및 강약을 판단할 수 있다 식물성 천연

합성 에스트로겐 알킬페놀류 Raloxifene 4-Hydroxytamoxifen 등이

에스트로겐활성을 탐색하기 위하여 응용되고 있다

- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 11 -

312 In vivo assay

내분비계장애영향을 파악하기 위하여 화학물질 또는 시료를 생체 내에

직접 투입하여 검색하는 방법으로서 상대적으로 장시간 수행되며

많은 비용이 소요되는 단점이 있다 또한 실험동물 보호차원에서

실험동물의 수를 최소화해야 하는 문제점도 내포하고 있다 여기에는

자궁비대 반응시험 (Uterotrophic assay) 성선비대반응시험

(Hershberger assay) 반복투여독성시험 (TG407) 어류의 비텔로제닌

측정법 기형성 시험 등이 있다

3121 자궁비대반응시험

자궁비대반응시험은 rat나 난소를 적출한 rat의 자궁이 에스트로겐

작용에 의하여 비대하게 되는 것을 이용한다 에스트로겐작용이나

항에스트로겐 작용을 검색할 수 있는 시험법이다 화학물질을 rat 또

는 난소적출 rat에 3일간 또는 7일간 투여한 후 자궁중량변화를 측정

하여 투여하지 않은 대조군과 통계적으로 차이가 있으면 양성으로

판단한다

3122 성선비대반응시험

거세한 rat의 전립선 등이 남성호르몬의 작용으로 비대하게 되는 것을

이용하는 것으로서 안드로겐 작용 또는 항안드로겐 작용을 스크리닝하는

시험방법이다 OECD에서 스크리닝 시험법으로서 개발 중에 있으며

화학물질을 10일간 연속 투여한 후 부생식기관 중량이 종말점이다

원칙은 대조군과 통계적으로 유의한 차가 있는 경우 양성이 되지만

최종적으로 독성학적으로 고찰하여 판단한다

- 12 -

3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

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352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

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그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

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2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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3123 기형성 시험

일반적으로 기형 발생의 기작을 발생생물학적으로 볼 때 증식 이동

정착 분화의 모든 과정에서 화학적인 물질이 작용하여 이상이 발현하는

것을 말한다 작용은 단백질 핵산 DNA 또는 이러한 물질의 전사과정

번역과정 단백질 성숙과정 등 작용하는 시점은 매우 많다 실제

in vivo 실험에서는 통상적으로 1세대의 암컷 또는 암컷수컷에 약물을

투여하고 포육 중에도 계속 투여하여 태자 또는 새끼인 2세대에 대한

영향을 조사하게 된다(화학물질 안전정보연구회 1999)

313 In vitro assay

In vitro assay 시험은 정도 감도에서 단기간으로 간단하게 수행

가능한 기법이다 현재 개발된 주요한 in vitro assay에는 세포핵 내의

수용체와의 결합성에 기초를 두고 있다

In vitro 시험법에서 가장 단순한 방법은 호르몬 수용체로 불리는

단백질의 결합성을 시험하는 lsquo호르몬 수용체 결합성시험rsquo이다 MCF-7

이라는 사람 유방암세포를 사용한 E-screen법은 MCF-7세포가 에스트로겐

활성을 가진 물질의 결합으로 세포수가 증식되는 방법을 이용한 것이다

또한 E-screen 법의 결점을 개량한 reporter assay가 있다 이것은

Reporter 유전자를 배양세포나 효모균에 도입시켜 발현시키는 것으로서

전사활성화능을 효소활성으로 측정 가능하도록 reporter 유전자를

도입시킨 세포를 이용하는 것이다 이외에도 YES (Yeast Estrogen

Screening)법 Yeast two-hybrid system법 등이 연구되고 있다 (화학물질

- 13 -

안전정보연구회 1999)

314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 13 -

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314 거동연구

내분비계장애물질로 분류되는 NP BPA E1 E2 EE2와 같은 물질을

제거하기 위하여 광산화 흡착 등의 공정에서의 제거효율에 관한 연구를

비롯하여 하폐수처리 공정인 물리화학적 처리 생물학적 처리 고도산화

처리막여과 등에 따른 제거효과를 연구제시하고 있다 특히폐수처리

공정에서 내분비계장애물질을 제거하는데 가장 경제적인 공정으로는

활성슬러지법을 이용한 생물학적 분해공정인 것으로 보고하고 있다 또한

오염물질의 효과적인 제거도 중요하지만 지구환경 변화에 대응하여 에너

지 효율적인 공정의 중요성을 강조하고 있다 (Liu et al 2009 Lee et al

2008 Bolong et al 2009)

향후 연구방향은 각 시험에 대한 가이드라인 및 평가기준을 정비하고

더욱 민감한 스크리닝 기법을 개발하여 저용량으로 화학물질 폭로에

따른 영향 순위를 매기고 목록 작성을 계속하는 것에 초점이 맞춰져

있다 이를 위한 구체적인 방법은 신경계 내분비계 면역네트워크의

발생 발달 성숙 노화를 고려한 시험법을 개발하는 것이다 마지막

단계는 위해성평가를 통해 인체에 대하여 내분비계장애 가능성이 있는

물질에 대하여 노출 실태를 조사하여 용도제한 등 필요한 법적 조치

또는 행정조치를 준비하는 것이다

- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 14 -

32 E-screen assay 기법확립

In vitro Bioassay는 내분비계장애물질의 작용기전에 근거하여 환경

중에 존재하는 내분비계장애물질의 영향을 신속하고 정확히 측정할

수 있는 방법이다 환경시료 중의 내분비계장애물질 함유여부를

스크리닝하고 생태영향을 정량적으로 평가할 수 있는 장점이 있다

본 연구의 E-screen assay에서 사용한 세포주는 유방암 세포의

한 종류인 MCF-7 세포이며 이외에도 일부 변형 세포주로서 BUS

SOP UCL 등이 있다 MCF-7 BUS는 다른 세포주에 비하여 에스트로겐에

대하여 민감도가 좋기 때문에 가장 많이 사용되고 있다 일반적으로

MCF-7 세포와 이를 변형한 세포주 배양에는 ECACC를 비롯한 많은

세포주 은행에서 권고하고 있는 10 FBS가 첨가된 DMEM을 사용하고

있으므로 본 연구에서도 동일하게 사용하였다 세포의 증식을 위해서는

충분한 면적이 필요하므로 충분한 부착면을 제공할 수 있는 24 well

plate를 사용하였다 또한 주입하는 세포량이 너무 적을 경우 세포의

성장을 정량화하기 어려우므로 1times104 cellswell을 이용하였다 그리고

세포성장을 정량화하는 방법은 비교적 실험이 단순하고 시간도 상대적으로

적게 드는 SRB assay를 이용하였다 (Lee et al 2008 Park et al 2008)

321 실험세포 및 배양방법

E-screen에 사용된 세포는 사람 유방암 세포인 MCF-7 BUS로

- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 15 -

에스트로겐 수용체가 많이 발현되어 있는 세포이다 이 세포는 Dr

Soto (Tuft University)에 의해 공급받아 사용하였다 세포배양은 10

FBS charcoal-dextran 처리한 FBS를 함유한 phenol red free DMEM으로

5 CO2가 공급되는 37 배양기에서 이루어졌다 E-screen의 실험방법

및 순서는 그림 3과 같다

322 Cell Seeding

1) 액체 질소통에 냉동보관 중인 stock을 꺼내 water bath에 넣어서

신속히 해동한다

2) Cryogenic vial을 water bath에서 꺼낸 후 70 에탄올로 뿌려

소독하고 clean bench로 이동한다 vial 안에 내용물을 1 mL 피펫을

이용하여 모두 꺼내고 이를 15 mL conical tube에 넣는다 10 mL

정도의 phenol red가 함유된 DMEM을 conical tube에 넣어준다

3) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한다

4) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다

5) 1 mL의 phenol red 가 함유된 DMEM을 conical tube에 첨가하고

20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때 가능한

한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

6) Pippetting 후 1 mL 전부를 취하여 25 cell culture flask에 넣고

4 mL 정도의 배지를 첨가한다

- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 16 -

7) CO2 incubator (CO2 5 37)에서 3일 동안 배양한다

MCF-7 BUS Cell Seeding

darr

Chemical Treatment

(10 CD FBS - phenol red free DMEM)

darr

Incubation for 144 hrs

darr

Cell proliferation Measurement

darr

Cell Fixation (10 TCA)

darrwashing DW amp dry

Cell Staining(SRB)

darrwashing 1 acetic acid amp dry

Dissolves in 10mM Tris-base sol

darr

ELISA Reader (560nm)

그림 3 E-screen assay 실험순서

- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 17 -

323 계대배양 방법

1) Incubator에서 3일 배양 한 cell culture flask를 꺼낸다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 주입 되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용하여 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA 용액 (with phenol red)을 주입한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench로 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이때 거품이 많이 생기고 밖으

로 튀기 때문에 주의한다 떼어낸 세포는 조심하여 DMEM과 함께

conical tube로 옮긴다

6) 3500 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 conical tube를 꺼내어 에탄올로

소독한 후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur

피펫과 펌프를 이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가

제거되지 않도록 주의 하고 상등액 상부에 거품이 있으니 이를

먼저 제거하고 상등액을 제거 하는 것이 작업에 용이하다

7) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

거품이 가능한 한 생기지 않도록 가볍게 pippetting한다

- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 18 -

8) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL를 뽑아내어 70 알코올로 소독한

hemocytometer 격자위에 주입한다

9) 현미경을 이용하여 세포를 관찰하고 세포수를 센다 (그림 5)

10) 각 cell culture flask마다 2times105 cell이 주입되도록 해야 한다 그리고

cell culture flask를 사용할 경우 5 mL의 DMEM 배지를 주입하고

계산된 셀 양만큼 주입한다

11) CO2 incubator (5 37)에서 3일간 배양한다

12) 1)~11)과정을 3일에 한번씩 동일하게 반복한다

① DMEM PBS 등 해동 ② DMEM 배지 제거

③ DMEM 주입 후 세포 탈착 ④ 원심분리

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 19 -

⑤ 원심분리 후 세포 ⑥ 세포 풀기

⑦ Homocytometer에 주입 ⑧ Cell counting

⑨ DMEM 주입후계산된양주입 ⑩ CO2 Incubator 배양

그림 4 MCF-7 cell 계대배양 실험순서(①~⑩)

- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 20 -

그림 5 증식된 MCF-7 BUS 세포관찰

324 물질 노출 시험

1) 계대배양 ①～⑩ 과정까지 끝난 계대배양 No 3～8 중에 선택한

cell culture flask를 꺼낸 후 안에 있는 오래된 배지를 pasteur 피펫과

펌프를 사용하여 제거한다

2) PBS 10 mL을 가볍게 주입하고 몇 차례 흔든 후 주입한 PBS를

pasteur 피펫을 이용하여 제거한다 이때 세포가 안 떨어지도록

가볍게 주입한다

3) DMEM (with 10 Charcoal-dextran treated FBS without phenol

red) 4 mL를 25 cell culture flask에 가한다 이 과정에서도

세포가 안 떨어지도록 가볍게 주입한 후 incubator (5 375)에서

24 hr 동안 배양한다

4) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

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L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

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20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

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① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

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그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

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352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

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그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

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2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

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표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 21 -

5) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 5 mL을 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 강하게

PBS가 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

6) 몇 차례 가볍게 흔든 후 PBS를 pasteur 피펫을 이용해 제거하고

025 1 mL trypsin (without phenol red) 용액을 주입 한 후

trypsin이 잘 퍼지도록 몇 차례 흔들어 준다

7) 2~3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

8) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with 10 Charcoal-dextran

treated FBS without phenol red)을 가하고 바닥에 남아 있는

세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여 3~4회 정도 flask

바닥을 씻어준다 떼어낸 세포는 15 mL conical tube로 옮긴다

9) 원심분리기에 15 mL conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간

원심분리한다

10) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 에탄올로 소독한 후

clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과 펌프를

이용하여 모두 제거한다 이때 바닥에 있는 세포가 제거되지 않도록

주의한다 상등액 상부에 거품이 있으니 이를 먼저 제거하고 상등액을

제거하면 편리하게 작업할 수 있다

11) 1 mL의 DMEM (10 FBS with phenol red)을 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다

이때 가급적 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting한다

12) 풀어진 세포현탁액 중에서 10 μL을 뽑아내어 hemocytometer

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 22 -

(00025 ) 격자 위에 주입한다

13) 현미경을 이용하여 세포수를 센 후 (E-screen에서는 104 cell을

각 24 well plate의 well에 주입함) well 당 주입해야 하는 세포

현탁액의 양을 결정한다

14) 400 μL의 DMEM (10 CD-FBS treated without phenol red)을

각 24 well plate의 well에 주입한다

15) 13)에서 계산된 세포 현탁액 양 만큼 각 well에 주입한다

16) 가볍게 20회 정도 흔들어 세포가 잘 분산되게 한 후 CO2

incubator (5 37)에서 24 시간동안 배양한다

17) 24 well plate를 꺼낸 후 원래 있던 배지를 제거한다

18) EDCs가 포함된 배지 400 μL을 각 well에 주입한다

19) CO2 incubator (5 37)에 넣고 6일간 배양한다 6일 후 SRB

assay를 실시한다

325 SRB (sulforhodamin B) assay

1) 배지를 넣고 6일 배양한 24well plate를 꺼낸 후 배지를 pasteur

피펫을 이용하여 제거한다

2) 300 μL 10 TCA (trichloroacetic acid)를 각 well에 주입한다 이때

세포가 떨어지지 않도록 가볍게 주입한다

3) 냉장고에 40분간 넣어둔다

4) 냉장고에서 꺼낸 후 증류수를 넣어 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

well을 5회 세척한다

5) 상온에서 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어서 완전히 건조시킨다

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6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

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6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

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활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

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여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

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일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

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34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

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① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

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- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

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L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

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DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

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20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

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① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

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35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

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그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

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그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

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그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

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그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

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ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

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352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

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그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 23 -

6) 300 μL의 04 SRB를 각 well에 주입한다

7) 상온에서 1시간 정도 둔다

8) 1 acetic acid를 이용하여 well을 5회 세척한다

9) 5시간 이상 뚜껑을 연 상태에서 뒤집어 건조한다

10) 400 μL 10 mM tris solution을 각 well에 주입하고 shaker

(150-200 rpm)를 이용하여 30분 정도 흔들어 준다

11) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) reader를 이용하여

560 nm에서 흡광도를 측정한다

(참고 1) 냉동세포 만들기 (계대배양 횟수 No 3 ~ 8 사용)

1) Incubator에서 cell culture flask를 꺼내 온다

2) Cell culture flask 내의 배지를 pasteur 피펫과 펌프를 사용하여

제거하고 PBS 10 mL를 가한다 이때 세포가 붙어 있는 벽면으로

직접 PBS가 주입되지 않도록 옆으로 기울인 다음에 주입한다 PBS가

강하게 주입될 경우 세포가 떨어질 수 있다

3) 몇 차례 가볍게 흔든 후 pasteur 피펫을 이용해 PBS를 제거하고

025 1 mL trypsin-EDTA (with phenol red)용액을 주입한 후

trypsin이 잘 펴지도록 몇 차례 흔들어 준다

4) 2 ~ 3분 정도 CO2 incubator에 넣어 두어 trypsin에 의해 세포가

바닥에서 떨어질 수 있도록 하고 다시 clean bench에 가져온다

5) Cell culture flask에 10 mL의 DMEM (with phenol red)을 가하고

바닥에 남아 있는 세포를 떼어내기 위해서 10 mL 피펫을 사용하여

3 ~ 4회 정도 flask 바닥을 씻어준다 이를 conical tube에 넣는다

- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

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- 24 -

6) 원심분리기에 conical tube를 넣고 3500 rpm에서 5분간 원심분리

한다

7) 원심분리가 끝나면 conical tube를 꺼내어 70 에탄올로 소독한

후 clean bench로 옮긴다 뚜껑을 열어 상등액을 pasteur 피펫과

펌프를 이용하여 모두 제거한다

8) 700 μL의 DMEM (10 FBS with phenol red)를 conical tube에

첨가하고 20회 정도의 pippetting을 통하여 세포를 풀어 준다 이때

가능한 한 거품이 안 생기도록 가볍게 pippetting을 한다

9) 현탁액 700 μL을 전부 뽑아내어 cryogenic vial에 넣고 DMSO 100 μL

FBS 200 μL을 같이 넣는다

10) Cryogenic vial을 가볍게 흔든 후 솜으로 싸고 킴타올로 한 번 더

싸서 충분히 두껍게 한다

11) -70 냉장고에서 하루 정도 보관 후 액체 질소통으로 옮긴다

(참고 2) PBS 제조 방법

KCl 02 g KH2PO4 02 g NaCl 80 g Na2HPO4 142 g를 1L 증류수에

녹여서 Autoclave를 이용하여 멸균시킨다

(참고 3) Charcoal-dextran FBS 제조방법

1) 멸균한 뚜껑 있는 테프론 병 150 mL에 FBS 100 mLtimes11인 증류수

(110 mL)의 위치를 표시한다

2) 활성탄의 무게를 잰다

- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 25 -

활성탄 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 5 = 55 g

3) 무게를 잰 활성탄을 1)의 테프론 병에 넣고 표시지점 (110 mL)까지

증류수를 넣은 후 충분히 흔들어 주면서 잘 섞는다

4) 250 rpm에서 2분간 원심 분리한다

5) 상층액에 부유해 있는 입자를 pasteur 피펫과 스포이드용 고무를

이용하여 활성탄이 끌려오지 않을 정도로 증류수를 제거한다

6) 다시 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 충분히 흔들어 주어 잘 섞어

준다

7) 250 rpm에서 2분간 원심분리를 해준다

8) 5)~7)을 3~4회 반복하여 액이 투명해지면 dextran을 가한다

dextran 양(g) = FBS 100 mL times 11 times 05 = 055 g

9) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

10) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 5)와 동일한 방법으로 부유입자와

물을 모두 다 제거한다

11) 표시지점까지 3차 증류수를 넣고 잘 섞이도록 충분히 흔든다

12) 600 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 9)~11)을 액이 투명해 질 때까지

1 ~ 2회 반복한다

13) FBS 혈청을 표시지점 110 mL까지 가하고 잘 섞이도록 흔든다

14) 37로 고정한 shaking water bath에서 1시간 30분 동안 로링

배양을 하면서 10분마다 꺼내서 흔들어 준다

15) 3000 rpm에서 25분간 원심 분리한다

16) 활성탄이 올라오지 않도록 조심스럽게 상층액을 취해 50 mL

falcon tube에 옮긴다

17) 무균대 안에서 멸균시킨 045 μm 주사기 필터를 사용하여 여러 번

- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 26 -

여과한다

18) 17)의 여과액을 02 μm 주사기 필터를 사용하여 한번 더 여과한다

19) 미리 멸균해 놓은 15 mL falcon tube에 넣는다

20) -20에서 보관하여 사용한다

33 E-screen에 의한 활성도 측정

331 정량적 평가

1) EDCs Dose-Response curve 작성

E-screen에서 세포의 성장은 배양조건 세포의 성장 상태 세포의

분주번호 등 여러 가지 인자에 의해서 영향을 받는다 위에서 언급된

변수의 영향을 최소화하기 위하여 negative control과 positive control를

각 well plate마다 두었으며 다음 식을 이용하였다

여기서 positive control은 10-10M 17β-estradiol을 주입한 것이고

negative control은 10 charcoal-dextran FBS가 첨가된 DMEM이

주입된 것이다 17β-Estradiol (E2) Estrone (E1) Bisphenol A 등

내분비계장애물질 6종에 대하여 농도-반응 곡선은 다음과 같다

(그림 6)

- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 27 -

일반적으로 에스트로겐 활성도가 높은 것으로 알려진 17β-Estradiol

(E2)와 17α-Ethynylestradiol (EE2)의 경우 10-11M의 농도에서 최대

성장률을 보였으며 Estrone (E1)은 E2에 비해 10배 정도 높은 농도인

10-10 M에서 최대 성장률을 나타냈다 알킬페놀류인 Bisphenol A와

4-octylphenol (OC)과 genistein (GE)은 상대적으로 높은 농도 범위인

10-5 ～ 10-6 M에서 가장 높은 세포성장률을 보였으며 E2에 비해 낮

은 에스트로겐 활성도를 가지는 것으로 나타났다

그림 6 내분비계장애물질의 농도-반응 곡선

- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 28 -

34 Yeast two-hybrid assay 기법 확립

Yeast two-hybrid assay에 의한 시험방법은 아직 OECD Test

guideline으로 제정된 방법은 아니나 내분비계장애물질의 bioassay를

위해 추천하고 있는 방법이다 특히 일본을 중심으로 하여 세계의

많은 연구자들이 도입하고 있으며 실험방법을 점차적으로 간편화시키고

있는 추세이다 (F Shiraishi et al 2000 R Kamata et al 2008)

341 환경시료의 전처리

시료의 전처리는 국립환경과학원 내분비계장애물질 측정분석 방법

(2002)과 일본 환경성 외인성 내분비계교란 화학물질조사 잠정매뉴얼을

기초로 하였다(일본 환경성 1998)

시료 채수병은 비이온계면활성제로 초음파 세척한 후 에탄올 증류수의

순서로 세척하여 사용하였다 시료를 채취한 후 아이스박스로 운송한

후 바로 4에서 냉장보관하여 전처리 및 Bioassay를 수행하였다

채취한 시료 2 L을 GFC (045 μm Whatman UK)로 여과한 후 추출

전까지 4에서 시료를 냉장 보관하였다 여과에 사용된 GFC도

메탄올과 증류수로 20분간 초음파 세척 후 건조하여 사용하였다

전처리는 고상 추출법 (Solid Phase Extraction SPE)으로 추출하였으

며 카트리지는 1 g HLB cartridge (Oasis Island)를 사용하였다 (그림 7)

- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 29 -

① 여과 ② 시료의 주입

③ 휘발 ④ 용출

그림 7 환경시료의 전처리 순서

342 Yeast two-hybrid assay 배지 제조

1) Modified synthetic medium (MSD) 배지 (-Trp -Leu) 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Dextrose(hER medER RXR TR YA) 75 g (075 glu)

(RAR YA) 10 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 30 -

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

- 한천배지는 15 ~ 20 gL (45 g250 mL) 농도로 작성하여

pH 58로 조정하여 사용한다

2) 15 GAL MSD 배지 제조

Yeast Nitrogen Base wo Amino Acids 58 g

Galactose 15 g (10 glu)

5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 174 mL

Purified Water final 1000 mL

- 작성된 배지는 100 mL 또는 200 mL씩 병에 분주하여 121에서

20분간 autoclave로 멸균한 후 냉장 보관한다

3) 10 glycerol첨가 MSD 배지 (075) 제조

075 glucose MSD 배지 100 mL와 125 g glycerol을

혼합한다

4) 5x Dropout Solution (-Trp -Leu) 제조

L-Isoleucine 300

L-Valine 1500

L-Arginine HCl 200

L-Adenine hemisulfate salt 200

L-Histidine HCl monohydrate 200

L-Methionine 200

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 31 -

L-Phenylalanine 500

L-Threonine 2000

L-Lysine HCl 300

L-Tyosine 300

L-Uracil 200

- 위의 아미노산을 초순수 2 L에 용해하여 121에서 20분간

autoclave로 멸균한 후 4 냉장 보관한다

343 Yeast 배양액의 준비

1) 각종 수용체도입 효모를 Dextrose농도를 변경한 개량배지 (MSD)에

배양하여 OD=595 nm 에서의 탁도를 165 ~ 18 (ABS 00 ~ 30)로

조정한다

(참고) 분광광도계에서 탁도의 측정은 ABS=04 정도까지만

직선성을 얻을 수 있으므로 10배 희석하여 측정한다

2) 시험전일 동결 보존된 (-80) 효모액의 약 05 ~ 06 mL을

MSD 배지 30 mL에 접종하여 30 Incubator(air)에서

shaking 하면서 배양한다 (24 hr)

(참고) plate 1매당 6 mL정도를 준비하고 6매의 경우에는

40 mL이상 준비한다

344 단계희석 시험

1) MSD 배지를 (plate 1열) 60 μL씩 주입하고 2~8열까지는 2

- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 32 -

DMSOMSD 배지를 60 μL씩 자동분주희석장치로 주입한다

참고) 2 DMSOMSD 배지 제조 DMSO 10 mL + MSD 배지

49 mL (plate 7매)

2) 100 DMSO 100 μL을 주입하고 시료를 용해하여 voltex 한다

DMSO에 용해한 시료 20 μL을 시험관 (12times75 mm)에 취한 후

MSD 배지 480 μL을 첨가 (25배로 희석 4 DMSO)하고

OD 595 측정하고 (MSD를 blank) 10배 희석하여 측정하여

0175 ~ 0180이 되도록 한다

3) 혼합 희석한 시료는 1열에 60 μL 첨가한다 (DMSO농도 4)

시료는 20 μLDMSO 시료에 480 μL의 MSD배지를 넣는다

각 시료에 대하여 2열씩 2회 반복 시험을 한다

각 플레이트와 플레이트의 실험의 개시는 5 ~ 7분간 여유를

둔다

4) 자동분주희석장치(60 μL)로 2배 희석을 pippetting으로 제 1열

로부터 7열까지 하여 pippetting 후의 7열째의 60 μL은 버린다

Pippetting에 의한 혼합은 4회로 하고 다음 well로 이동한다

8열째는 무첨가 대조군이므로 그대로 한다

5) 조정한 균액을 교반한 후 다종분주희석장치를 이용하여 60 μL

씩 well에 첨가한다 각 well의 최종 DMSO 농도는 1가 된다

6) 균액을 첨가한 플레이트는 voltex로 40초간 교반하여 30에서

4시간 배양한다

7) Lysis 액 (zymolyase 100T Z-buffer) 7 mL과 Aurora RB

(Aurora Kit Reaction buffer) 3 mL을 혼합하여 각 well에

자동분주 희석장치로 80 μL씩 첨가하고 voltex한 후 37 1시간

- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 33 -

정치한다

Lysis 액 (zymolyase 100T 2 mg + Z-buffer 7 mL)은 미리

작성하여 두며 -80의 냉동고에 보존한다 (플레이트 1매 당

7 mL 6매인 경우 42 mL을 플라스틱 원심관 (50 mL용)에

넣어 동결보존)

8) 촉진액 (Light Emission Accelerator)을 발광측정장치의 펌프에

50 μL씩 첨가하면서 3초 후부터 1초 간의 적산발광량을 발광

측정장치에서 측정한다

촉진액은 필요량만 용기에 분주하여 실온에 방치하여 따뜻하게

한다 (1시간)

펌프의 튜브에 시약 충진을 위해 16 well에 해당하는 양인

800 μL의 촉진액을 예비의 플레이트에 흘려보낸다

Z buffer 제조

　 Na2HPO412H2O 215　g

　 NaH2PO42H2O 62　g

　 KCl 075 g

　 MgSO47H2O 0246 g 1L PW

345 유전자조작 효모의 보존방법

플레이트에서의 냉장보존도 가능하지만 시험의 재현성을 고려하여

-80에서 동결 보존하는 것이 좋다

1) 15 mL용 튜브에 넣어 동결 보존한 효모 부유액 (약 03 mL)을

- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

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표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 34 -

20 mL의 MSD 배지 (075 Dextrose)를 넣은 100 mL이상의

배양병에 접종한다

2) 30의 항온기에서 진탕하면서 (100 Smin) 20 ~ 24시간 정도

배양한다

3) 증식한 효모액의 탁도를 분광광도계 (OD 595 nm)에서 측정한다

10배 희석한 탁도가 약 04이상 (대수증식기)이면 충분하다

4) 10 glycerol 첨가 MSD 배지에 10분의 1을 첨가하여 1 mL

씩 냉동튜브에 분주하여 -80에서 동결 보존한다

배양한 효모 부유액 5 mL을 10 glycerol MSD 배지 45 mL에

첨가 (50개 제조)

10 glycerol 첨가 MSD 배지의 제조법

MSD 배지 100 mL

Glycerol 125 g를 잘 용해시켜 autoclave로 멸균

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 35 -

① 균체배양 ② 균체량 측정

③ 검체주입 ④ DMSO전용

⑤ well plate배양 ⑥ Luminometer측정

그림 8 Yeast two-hybrid assay 측정순서

- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

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그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

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그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

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2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

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354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

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표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

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③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

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Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

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표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

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구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 36 -

35 Yeast two-hybrid assay에 의한 화학물질과 환경시료

분석

351 30종 화학물질의 농도-반응곡선

그림 9 ～ 12는 human의 에스트로겐 수용체 (estrogen receptor

hER)를 도입한 Yeast two-hybrid assay로부터 작성된 내분비계장애물질의

농도-반응곡선 결과이다 즉 그림 9는 Estrone (E1) 17β-Estradiol (E2)

Estradiol(E3) 17α-Ethinylestradiol (EE2) Genistein(GEN)에 대하여

나타냈고 그림 10은 의약품인 Ibuprofen Acetaminophene Lyncomycin에

대한 농도-반응곡선을 보여준다 그림 11과 그림 12는 각각 알킬페놀류와

프탈레이트류에 대한 농도-반응곡선이다 그림 9 그림 10 표3의

결과로부터 대부분의 화학물질에서 hER보다 mER가 더욱 민감하게

에스트로겐 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 37 -

그림 9 hER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 10 hER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

그림 11 hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 38 -

그림 11(계속) hER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

그림 12 hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 39 -

그림 12(계속) hER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

그림 13 ～ 그림 16은 medaka의 에스트로겐 리셉터 (mER)를 이용

한 결과를 나타냈다 표 3에는 내분비계장애물질 항생제 페놀류 프탈레이트

류 등의 각 화학물질의 농도-반응 곡선으로부터 E2의 최대활성도의 10

를 나타내는 몰농도를 REC10(M)으로 규정하였다 이로부터 계산된 상대

적인 활성도(Relative potency) 값을 나타냈다

- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 40 -

그림 13 mER효모에 의한 내분비계장애물질의 농도-반응곡선

그림 14 mER효모에 의한 의약품류의 농도-반응곡선

- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 41 -

그림 15 mER효모에 의한 페놀류의 농도-반응곡선

- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 42 -

그림 16 mER효모에 의한 프탈레이트류의 농도-반응곡선

- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 43 -

ChemicalsmER(medaka ER) hER(human ER)

REC10(M) R Potency REC10(M) R PotencyE2(17β-Estradiol) 5E-10 1E+00 5E-10 1E+00E1(Estrone) 2E-08 3E-02 1E-08 3E-02E3(Estriol) 1E-08 5E-02 7E-08 6E-03Genistein 2E-08 3E-02 2E-05 2E-05EE2(17α-ethinylestradiol) 2E-10 3E+00 6E-10 7E-01Ibuprofen 3E-04 2E-06 9E-04 5E-07Acetaminophene 8E-05 7E-06 1E-04 4E-06Lyncomycin 7E-05 8E-06 9E-05 5E-064-t-butylphenol 1E-07 5E-03 6E-05 7E-064-n-butylphenol 3E-07 2E-03 1E-04 4E-064-n-pentylphenol 5E-06 1E-04 2E-03 3E-074-n-hexylphenol 1E-06 5E-04 5E-06 9E-054-t-octylphenol 1E-03 4E-07 2E-07 2E-034-n-heptylphenol 1E-06 3E-04 2E-05 3E-054-n-nonylphenol 1E-06 4E-04 9E-07 5E-044-n-octylphenol 1E-05 5E-05 9E-06 5E-05bisphenol-A 4E-07 1E-03 5E-06 1E-04diethyl phthalate 1E-03 3E-07 4E-04 1E-06dipropyl phthalate 7E-04 7E-07 5E-04 9E-07di-n-butyl phthalate 1E-06 5E-04 7E-05 7E-06dipentyl phthalate 1E-05 4E-05 3E-05 2E-05di-n-hexyl phthalate 4E-05 1E-05 9E-05 5E-06butyl benzyl phthalate 9E-04 6E-07 5E-04 9E-07dicyclohexyl phthalate 7E-05 8E-06 2E-04 2E-06di-2-ehylhexyl phthalate 7E-06 7E-05 5E-06 9E-05bis(2-ethylhexyl) adipate 1E-02 5E-08 3E-04 2E-06

표 3 Yeast two-hybrid assay에 의한 내분비계장애물질의 상대활성도

(Relative potency)

- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 44 -

352 나노물질의 bioassay 결과

표 3의 결과와 같이 hER보다 mER의 반응성이 더 민감하였으므로

4종류의 나노물질의 에스트로겐 활성도 측정은 mER를 이용하여

분석하였다 이때 세포의 viability 측정은 YPD agar plate method를

이용하였다 대상 나노물질은 은나노물질 2종인 Ag-B(bare sigma aldrich)와

Ag-C(citric acid 코팅 ABC nanotech OECD 제조나노물질 안전성시험사업

지원물질)를 사용하였다 또한 Al2O3 ZnO의 에스트로겐 활성도를

조사하였으며 각각의 나노물질이 E2와 공존할 때 에스트로겐 활성도의

변화를 조사하였다

그림 17 ~ 20에 나타낸 바와 같이 일정한 농도(10-6M)의 E2를 다양한

나노물질과 공존할 때 에스트로겐 활성도를 측정하였다 여기서 주목할

만한 점은 Ag-C를 002 01 02 05 1 mgL등으로 증가시켰을 때

002 ~ 02 mgL 범위에서 공존할 때 E2가 나타내는 에스트로겐 활성도가

E2만 존재할 때의 에스트로겐 활성도보다 높은 값을 나타냈다 또한

Ag-B가 002 005 01 02 mgL로 공존할 때 002 ～ 02 mgL의 농도로

Ag-B가 공존하는 조건에서 E2의 에스트로겐 활성이 증가하는 현상을

발견하였다

이러한 현상은 나노물질이 효모의 세포벽 손상을 일으킴으로서 E2가

나노물질과 결합하여 효모 내부로 이동하여 에스트로겐활성을 증가시키는

것으로 예측된다 Ag-B에서 에스트로겐 활성이 Ag-C보다 급격하게

감소하는 것은 세포의 viability가 급격하게 감소했기 때문이다 Ag2O3는

에스트로겐활성도 변화에 영향이 거의 없으며 ZnO는 02 mgL에서

약간 증가하는 경향을 나타냈다

- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 45 -

그림 17 mER에 의한 Ag-C 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 18 mER에 의한 Ag-B 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 46 -

그림 19 mER에 의한 Al2O3 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

그림 20 mER에 의한 ZnO 및 E2 공존에 의한 활성도변화 곡선

- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 47 -

353 환경시료의 bioassay 결과

1)시료채취및전처리

표 4에는 2009년도 5월과 9월 상하반기 2회 채취한 15지점에 대한

내용을 나타냈다 각 지점별 시료를 최대 100배까지 농축하여 고상추출

하였다 고상추출 시의 용출 용매는 HexaneDCM = 31비율(소수성)

AcetoneDichloromethane (AcDCM) = 11비율(약소수성) Methanol(친수성)의

3종류로 나누어 순차적으로 용출하여 각각을 분석하였다 이때 시료중의

입자성 물질에 흡착된 내분비계장애물질을 동시에 분석하여 나타냈다

표 4 환경시료의 각 지점별 내용

지점 내용

1 중랑하수처리장 유입수 1-1 중랑하수처리장 방류수2 군자교(중랑하수처리장방류수 합류 전)3 성동교(중랑하수처리장방류수 합류 후)4 성수대교(중랑천 한강 합류 전)5 한남대교(중랑천 한강 합류 후)6 시화공단 유입수

6-1 시화공단 방류수

7 반월공단 유입수

7-1 반월공단 방류수

8 왕궁축산폐수 유입수

8-1 왕궁축산폐수 방류수

9 익산천(왕궁처리장 합류전)10 왕궁처리장 방류수 배수로

11 익산천(왕궁처리장 합류후)

- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 48 -

2)환경시료의에스트로겐활성도

그림 21 ~ 24에는 입자성 에스트로겐 활성도 및 각 용매 추출시료의

에스트로겐 활성도를 나타냈다 그림 21과 22의 결과와 같이 1차 시료

의 분석결과 특이사항으로서 왕궁축산폐수처리장의 경우에는 방류수

가 유입수보다 높게 나타났다 이러한 경향은 생체에서 배출된 포합체

상태의 내분비계장애물질이 하수처리과정 중의 미생물에 의한 분해로

증가하는 것으로 예측이 되며 국내외의 하수처리장에 관한 연구결과에

서도 보고되고 있다(Lee 2007) 2차 시료의 분석결과 중랑하수처리장

시화공단 폐수처리장 반월공단 폐수처리장 왕궁축산폐수처리장에서의

활성도 제거율이 각각 545 816 806 918로서 평균 771의 제거율을

나타냈다 유입수와 유출수의 평균은 127 19 μgL as E2를 나타냈으

며 한강수계에서는 16 μgL of E2를 보였다 모든 지점에서 하폐

수처리장의 방류수의 유입으로 하천수에서의 에스트로겐 활성도가 증

가하는 것을 확인할 수 있었다 화학물질의 bioassay 결과와 유사하게

mER 활성도가 hER 활성도보다 높게 검출되어 더욱 민감하게 분석

가능한 것으로 보인다 입자상과 용해성 물질의 에스트로겐활성도는 약

30와 70를 나타내어 입자상 중의 활성도도 검토되어야 할 것으로 나

타났다 2차 시료에서 9번 지점(141 EEQ)과 11번 지점(117 EEQ)에서

는 전체 활성도 중 입자상물질의 비율이 46 48를 나타냈으며

전체지점평균은 28를 나타내어 입자상에 흡착된 내분비계장애물질

도 지속적으로 검토되어야 할 것으로 나타났다 추출 용매별 기여율을

확인한 결과 AceDCM 혼합용매을 이용한 추출시료가 약 65의 활

성을 나타냈으며 MeOH 혼합용매의 용출시료가 약 12 HxDCM

혼합용매에서 추출된 시료에서 23의 활성도를 나타냈다

- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 49 -

그림 21 mER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 22 hER에 의한 상반기 시료의 에스트로겐활성도

- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 50 -

그림 23 mER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

그림 24 hER에 의한 하반기 시료의 에스트로겐활성도

- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 51 -

354 환경시료 중의 내분비계장애물질 농도 분석 결과

1)에스트로겐성물질

①분석조건

채취된 시료중의 에스트로겐 물질의 농도를 확인하기 위해 E1 E2

E3 EE2 genistein을 LCMSMS로 분석하였다 분석을 위하여 사용된

분석기기는 LCMSMS를 이용하였으며 사용한 컬럼은 Gemini C18

column(150mm x 2mm 5μm) guard column(security Guard 4mm x

2mm 5μm)이고 이동상 용매는 초순수와 메탄올을 사용하였고 유량은

03 mLmin으로 시료는 10 μL를 주입하여 분석하였다 MS분석조건으로

capillary는 35 kV source 온도는 120 desolvation gas의 온도는

420 로 하였으며 gas flow는 desolvation gas 650 Lhr와 cone gas

50 Lhr로 하였다 물질의 정성과 정량에 사용한 이온은 E1

2693gt1452 E2 2714gt1451 EE2 2953gt1450 E3 2873gt1450

genestain 2691gt1331을 multiple reaction monitoring(MRM)으로 분석

하였다 물질별 이온화 에너지 조건인 cone voltage와 collision energy를

E1의 경우 각각 60 36 eV E2의 경우 각각 60 42 eV EE2의 경우

각각 65 40 eV E3의 경우 각각 65 48eV genistein의 경우 각각 50

31 eV로 하였고 dwell time은 01s로 하였다 분석조건은 표 5에 정리

하였다

- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 52 -

표 5 에스트로겐성물질의 LCMSMS 분석기기조건

operating parameters

LC

ColumnGemini C18 column(150mm times 2mm 5um)

guard column(security Guard 4mm times 2mm 5um)

Mobile phase A Water B Methanol

Flow rate 300uLmin

Mobile gradient

Time 0min 95 A 5 B

Time 4min 0 A 100 B

Time 12min 0 A 100 B

Time 15min 95 A 5 B

Time 20min 95 A 5 B

MS

MS

Source temp 120oC

Desolvation temp 420oC

Capillary voltage 35kV

Detection mode Multiple Reaction Monitoring(MRM)

Ionization mode Electrospray negative(ESI)

②정량한계및회수율

수질 시료의 정량한계 및 회수율을 작성하기 위하여 증류수 500 에

표준물질을 각각 2 5 L로 spike 한 후 내부표준물질을 100 를

첨가한 다음 전처리 과정에 따라 실험하였다 실험 결과 정량한계는

E2 EE2에서 15 L E1 genistein에서 01 L E3에서 08 L였

고 회수율은 83~117 이었다 (표 6)

표 6 에스트로겐성물질의 회수율 및 정량한계

Compounds MRM Concentration(L) MDL(L) Recovery()

E1 2693gt1452 02 01 1175

E2 2714gt1451 2 15 1159

EE2 2953gt1450 2 15 1139

E3 2873gt1450 2 08 1014

genistein 2691gt1331 02 01 836

- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 53 -

③시료의전처리

시료 전처리를 위해 물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GF-C)를

이용하여 부유물을 제거하였다 내부표준물질로서 estrone-d4 50 μL를

주입한 후 메탄올과 증류수로 안정화한 HLB 카트리지(20 cc)에 통과시켰

다 시료를 통과시킨 카트리지는 펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거하

였다 건조된 카트리지에 MeOHMTBE(1090) 10 mL를 넣어 용출시

키며 용출액을 15 mL 튜브에 담은 후 원심농축기에 넣고 완전 농축

시킨 다음 MeOH 1 mL로 재용해하여 LCMSMS로 분석하였다

Sample 500mL

larrestrone-d4 50μL

HLB cartridge(20cc)

ConditionEquilibration

10mL MeOH10mL DW

Load sample(500mL)

Elution

10mL MeOHMTBE(1090)

원심감압농축(40)

LCMSMS 측정

그림 25 에스트로겐성물질의 전처리

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 4종류의 내분비계장애물질을 분석한 결과 E3와

- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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- 54 -

Genistein은 모든 시료에서 검출되지 않았으며 E1 E2 EE2는 일부

지점에서 간헐적으로 검출되었다 검출된 지점 중 왕궁처리장 방류수가

유입된 지점의 시료에서 E1 농도가 최대 339 μgL로 가장 높은 농도로

검출되었다 대부분의 하폐수처리장에서 유입수 보다 유출수에서

크게 감소하는 경향을 나타냈으나 왕궁축산폐수처리장에서는 방류수가

오히려 증가하는 경향을 나타냈다 이러한 이유는 처리장에서 체류시간에

의한 시료채취 시간의 차이와 미생물분해로 인하여 포합체가 분해되어

오히려 증가하는 것으로 판단된다

그림 26 내분비계장애물질의 환경 중 검출농도(2차시료)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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매뉴얼

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 55 -

표 7 에스트로겐류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 E1 E2 EE2 E3 genistein

1상반기 48 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND ND ND

하반기 12 ND ND ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND

하반기 488 ND 488 ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND ND ND

하반기 568 ND 48 ND ND

7-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 16 ND ND ND ND

8상반기 96 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND

하반기 952 164 1096 ND ND

9상반기 ND ND ND ND ND

하반기 133 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND

하반기 339 ND 60 ND ND

11상반기 ND ND ND ND ND

하반기 177 ND ND ND ND

- 56 -

2)프탈레이트류

①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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①분석조건

분석대상 물질은 Phthalates 8종과 di-2-ethylhexyladipate이다 조사

대상 Phthalates 8종은 Diethyl Phthalate(DEP) Di-2- ethylhexyl

Phthalate(DEHP) Dipropyl Phthalate(DprP) Di-n-butyl Phthalate(DBP)

Di-n-pentyl Phthalate(DPP) Dihexyl Phthalate(DHP) Dicyclohexyl

Phthalate(DCHP) Butyl benzyl Phthalate(BBP)였다 내부표준물질은

Fluoranthene-d10 Pyrene-d10(Aldrich Millwau kee WI USA)을

사용하였다 분석용 표준용액은 각 표준품을 n-Hexane에 녹여 1000

mgL의 원액으로 조제한 후 표준원액을 n-Hexane으로 희석하여 100

10 1 mgL로 만들어 사용하였다 내부표준물질의 경우

Fluoranthene-d10 은 각 표준품과 같은 방법으로 n-Hexane에 녹여

1000 mgL의 표준원액을 만들고 n-Hexane으로 희석하여 10 mgL의

표준액을 만들었다 내부표준물질 Pyrene-d10은 n-Hexane과

iso-octane으로 1000 mgL의 표준원액을 만들고 각각 10 mgL의

표준액을 만들어 사용하였다 모든 표준원액 및 표준액은 -5 이하의

암소에서 보관하였다 GC-MS의 SIM를 사용하여 분석하였으며 자세한

분석 조건은 표 8에 나타내었다

- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

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環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

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- 57 -

구분 분석조건

GC

Column

Ultra-1 cross linked 100

dimethylsiloxane fused-silica capillary

column(25mtimes02times033)Carrier gas He(999999) at 07mLmin

Injection port temp 250

Injection mode Splitless 1μL Injection

Oven temp

programing

100(0min)rarr(10min)rarr 220(2min)

rarr(1min)rarr 230(2min)rarr(10min)rarr

300(5min)

MS

Transfer temp 270Ionization mode Electron impact(EI)Electron energy 70eVIon source temp 230 or noneAnalyzer QuadrupoleDetection mode SIM Solvent delay 8min

표 8 Phthalates 분석을 위한 GCMS 조건

②정량한계

정량한계는 표준물질을 농도별로 증류수에 spike 한 후 내부표준물질을

일정량 첨가한 다음 실험하여 산출하였다 정량한계는 표 9와 같다

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

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- 68 -

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국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 58 -

Compounds Ion(mz) Conc range(L) PQLs(L)

DEP 149 010-2000 01

DprP 149 010-2000 01

DBP 149 010-2000 01

DPP 149 010-2000 01

BBP 149 010-2000 01

DHP 149 010-2000 01

Adipate 129 010-2000 01

DCHP 149 010-2000 01

DEHP 149 010-2000 01

표 9 Phthalates 및 Adipate의 정량한계

③시료의전처리

시료 200 mL을 250 mL 분액깔대기에 취하여 내부표준물질

(Fluoranthene-d10 10 mL) 100 μL와 염화나트륨(NaCl) 40 g

n-Hexane 10 mL을 넣고서 교반기에서 20 분간 교반시킨다

N-Hexane 추출액을 분취하여 무수황산나트륨을 2 g 정도 넣어서

탈수한 후 질소 가스를 불어 넣어 용매를 완전히 건조시키고 다시

n-Hexane 100 μL로 용해시켜서 GCMS에 주입하였다 전처리과정을

그림 27에 나타내었다

④에스트로겐성물질의검출농도

15개 지점에서 8종의 프탈레이트와 Adipate를 분석한 결과 DBP와

DEHP의 농도가 다른 대상물질에 비해 상대적으로 높게 검출되었다

DBP의 경우 중랑천의 성동교지점에서 가장 높은 농도(5616 μgL)를

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

Lee B Ra J Kim S Kawai H Lee C (2007) Evaluation of the

Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 59 -

보였으며 하폐수종말처리장 보다는 일반하천에서 상대적으로 높은

농도가 검출되고 있어 오염원의 존재가 DEHP와 같이 하폐수처리장에서

높은 결과를 보인 DEHP와는 다른 양상을 보이고 있었다

Water Sample 200mLlarr100μL 10ppm ISTD Fluoranthene-d10

larrNaCl 40g

n-Hexane 10mLlarrShaking for 20min

larrLayer Separation

Aqueous Hexane layer

Sodium sulfate

N2 dry

Hexane 100μL

GCMS Analysis

(1μL injection)

그림 27 환경시료에서 Phthalates의 전처리와 정제

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

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Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 60 -

표 10 프탈레이트류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점 BBP DBP DCHP DEHP DEP DHP DEHA DPP DprP

1상반기 ND ND ND 1596 083 ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 854 138 ND ND ND ND

1-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 1483 ND ND ND ND ND

2상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 2372 ND ND ND ND ND ND ND

3상반기 ND ND ND 067 ND ND ND ND ND

하반기 ND 5616 ND 247 ND ND 047 ND ND

4상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1657 ND ND ND ND ND ND ND

5상반기 ND ND ND 1124 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND 211 ND ND

6상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 924 ND 787 111 ND ND ND ND

6-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 1866 ND ND ND ND ND ND ND

7상반기 ND ND ND 247 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

7-1상반기 ND 1831 ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 157 ND ND ND ND ND ND ND

8상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

8-1상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 157 ND ND ND ND ND

9상반기 ND ND ND 337 ND ND ND ND ND

하반기 ND 3262 ND 045 055 ND ND ND ND

10상반기 ND ND ND ND ND ND ND ND ND

하반기 ND 5529 ND 225 ND ND ND ND ND

11상반기 ND ND ND 966 ND ND ND ND ND

하반기 ND ND ND 921 ND ND 867 ND ND

BBP butyl benzyl phthalate DBP di-n-butyl phthalate DCHP dicyclohexyl

phthalate DEHP di-2-ethylhexyl phthalate DEP diethyl phthalate DHP

di-n-hexyl phthalate DEHA bis(2-ethylhexyl)adipate DPP dipentyl phthalate

DprP dipropyl phthalate

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

Lee B Ra J Kim S Kawai H Lee C (2007) Evaluation of the

Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

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Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

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copper complexation on the estrogenic activities of

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Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

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and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

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- 69 -

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assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

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국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 61 -

3)알킬페놀류및비스페놀 A

①분석조건

분석대상 물질은 알킬페놀류 8종인 4-t-Butylphenol 4-n-Butylphenol

4-n-Pentylphenol 4-n-Hexylphenol 4-t-Octylphenol 4-n-Heptylphenol

Nonylphenol 4-n-Octylphenol과 Bisphenol-A였으며 내부표준물질은 Aldrich

사의 Bisphenol-A-d16을 구입하여 사용하였다 유도체화 시약은 N O-bis

(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA) trimethylchlorosilane(TMCS)을 각각

1001(vv) 의 비율로 혼합한 용액(Pierce사 Rockford IL USA)을 사용하였다

알킬 페놀류 8종과 Bisphenol-A는 혼합표준용액을 만들어 사용하였다

분석대상물질을 각각 50 mg씩 취해 메탄올 50 mL로 녹인 표준액을

25 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹인 후 단계적으로 100 10 1

01 mgL을 만들었다 Nonylphenol은 따로 50 mg을 취해 혼합표준용액과

같은 방법으로 100 10 1 01 mgL을 만들어 사용하였다

Bisphenol-A-d16 표준액은 25 mg을 취해 메탄올 25 mL로 녹인 후

5 mL를 분취하여 메탄올 25 mL에 녹여 20 mgL을 만들었다 분석에

사용한 장비는 Agilent 사의 GC 6890N과 Agilent 5973 MSD를 결합

한 모델을 이용하였다 이온화에 사용한 전자에너지는 70 eV이었고

electron multiplier는 autotune 값보다 400 V 더 증가시켜 사용하였으며

dwell time은 100 msec로 조절하였고 기타 GC-MS의 자세한 분석

조건들은 표 11에 나타내었다

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

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activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

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Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

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of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

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Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

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Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 62 -

구분 분석조건

GC

∙ Column DB-5MS(30mtimes025times025μm)

∙ Carrier gas He(999999) at 20mLmin

∙ Injection port temp 250oC

∙ Injection mode Splitless 2μL injection

∙ Oven temp

programing

120oC(2min)rarr(5min)rarr280

oC (5min)rarr

(10oCmin)rarr 300

oC(5min)

MS

∙ Transfer temp 250oC

∙ Ionization mode Electron impact(EI)

∙ Electron energy 70eV

∙ Ion source temp 250oC

∙ Analyzer Quadrapole

∙ Detection mode Selected Ion Monitoring(SIM)

표 11 알킬페놀 및 비스페놀-A의 GC-MS 분석조건

② 정량한계 및 회수율

정량한계를 작성하기 위하여 표준물질을 농도별로 spike 한 후

내부표준물질을 일정량 첨가한 다음 실험하였다 시험에 사용된 시료의

양은 500 mL를 사용하였다 시료의 정량한계 및 회수율은 표 12에

나타내었다 정량한계는 약 001 ~ 003 μgL 수준의 값을 보였으며

회수율의 경우 77 ~ 102 로 나타나 양호한 값을 보였다

표 12 알킬페놀 및 비스페놀-A의 정량한계 및 회수율

분석항목 검출한계 정량한계 회수율()

4-t-Butylphenol 0009 0029 10173

4-n-Butylphenol 0008 0027 9256

4-n-Pentylphenol 0010 0034 8355

4-n-Hexylphenol 0003 0012 7696

4-t-Octylphenol 0006 0019 7699

4-n-Heptylphenol 0004 0012 8181

Nonylphenol 0006 0019 8373

4-n-Octylphenol 0003 0012 8419

Bisphenol A 0005 0018 9811

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

Lee B Ra J Kim S Kawai H Lee C (2007) Evaluation of the

Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 63 -

③ 전처리 과정

물 500 mL를 비이커에 담고 여과지(GFC)를 이용하여 부유물을

제거한다 내부표준물질인 Bisphenol-A-d16 20 μL를 주입한 후 메탄올과

증류수로 안정화시킨 카트리지에 통과시킨다 시료를 통과시킨 카트리지는

펌프를 사용하여 수분을 완전히 제거한다 건조된 카트리지는 메탄올

10 mL를 넣어 용출시키며 용출액을 트리에틸아민 50 mL를 넣은

15 mL 튜브에 담는다 원심농축기에 넣고 완전 농축시킨 후 유도체화

시약 50 μL를 넣고 오븐에 넣어 60 에서 30분간 보관한다 유도체화

된 시료를 2 mL 바이알에 넣고 GCMS로 분석한다 전처리 과정은

그림 27에 나타내었다

시료 수질 500ml

내부표준물질 (Bisphenol-A-d16 20) 첨가

HLB 카트리지(20CC) 추출

메탄올 10ml 첨가(2회 반복)

트리메칠아민 50 첨가

농축 (Tem40)

유도체화 시약 (BSTFA 50) 첨가

오븐 (Tem60 30분 )

측정용 시료 50

GCMS 측정

그림 28 물 시료 중 Alkylphenols과 Bisphenol-A 전처리

④ 알킬페놀 및 비스페놀-A의 검출농도

14개 지점에서 9종의 페놀류를 분석한 결과 4-t-octylphenol과 비스페놀 A가

가장 높은 빈도로 검출되었다 비스페놀 A의 경우 하수종말처리장의

유입수에서 가장 높은 농도를 보이고 있었으며 방류수에서의 농도는

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

Lee B Ra J Kim S Kawai H Lee C (2007) Evaluation of the

Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 64 -

상대적으로 낮은 것으로 나타났다 전반적으로 하폐수종말처리장에서

검출되고 있었으며 축산폐수나 생활하수보다는 산업폐수와 관계된 지역에서

상대적으로 높은 농도를 보이고 있었다

표 13 페놀류의 지점별 분석결과 (unit μgL)

지점4-n-

But P

4-n-

H e p t

P

4-n-

H e x

P

4-n-

Oct P

4-n-

P e n t

P

4-t-

But P

4-t-

Oct PBPA NP

1상반기 ND ND ND 004 ND ND 007 022 076

하반기 ND ND ND ND 075 010 018 018 084

1-1상반기 ND ND ND 004 ND ND 005 024 046

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 003 019

2상반기 046 ND ND 004 046 ND ND 009 021

하반기 ND ND ND 002 ND ND 004 003 007

3상반기 ND ND ND ND ND ND 004 012 022

하반기 ND ND ND ND ND ND 005 004 018

4상반기 ND ND ND 004 ND ND 004 007 ND

하반기 ND 003 ND ND ND ND 004 003 ND

5상반기 ND 004 ND 004 ND ND 004 007 016

하반기 ND ND ND 002 ND 016 015 031 040

6상반기 ND ND ND ND ND ND 005 856 ND

하반기 ND ND ND ND ND 185 102 205 339

6-1상반기 ND ND ND ND ND 043 ND 020 054

하반기 ND ND ND 003 ND ND 007 ND ND

7상반기 ND ND ND 005 ND 402 110 3462 840

하반기 ND ND ND 019 ND 033 024 102 146

7-1상반기 ND ND ND ND ND 032 ND 018 027

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 004 004 014

8상반기 ND ND 005 ND ND ND ND 074 ND

하반기 ND ND ND 559 ND ND ND 007 ND

8-1상반기 ND 012 007 ND ND ND 015 017 ND

하반기 ND ND ND 395 ND 040 010 007 ND

9상반기 ND 007 ND ND ND ND ND 021 ND

하반기 ND ND ND 089 ND ND 006 007 ND

10상반기 ND 004 ND 006 ND 007 ND 010 035

하반기 ND 003 ND 002 ND ND 003 003 012

11상반기 ND ND 003 ND ND ND 004 012 ND

하반기 ND ND ND 002 ND ND 005 008 ND

4-t-But P 4-t-butylphenol 4-n-But P 4-n-butylphenol 4-n-Pen P

4-n-pentylphenol 4-n-Hex P 4-n-hexylphenol 4-t-Oct P 4-t-octylphenol

4-n-Hep P 4-n-heptylphenol 4-n-Oct P 4-n-octylphenol BPA bisphenol-A

NP 4-n-nonylphenol

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

Lee B Ra J Kim S Kawai H Lee C (2007) Evaluation of the

Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 65 -

5) 일반유기물과의 상관관계

에스트로겐활성도와 SUVA(DOCUV254) 값과의 상관성을 조사하였다

상반기와 하반기 모두 상관성이 05이상으로 나타냈다 유기물질의

효과적인 제어는 에스트로겐활성도의 감소에 영향을 미칠 수 있음을

간접적으로 알 수 있었다

그림 29 상반기(상) 하반기(하) 내분비계장애물질의 활성도와

유기물지표와의 관계

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

Lee B Ra J Kim S Kawai H Lee C (2007) Evaluation of the

Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 66 -

IV 결 론

1 에스트로겐 수용체에 대한 영향을 평가할 수 있는 in vitro

screening 기법으로서 E-screen과 Yeast two-hybrid assay를 이용할

수 있는 cell line을 확보하고 배양 및 분석기법을 확립하였다

2 MCF-7 cell을 이용하는 E-screen 및 Human medaka의 estrogen

receptor를 이용하는 Yeast two-hybrid assay로 30종의 화학물질(페

놀류 9종 프탈레이트류 9종 에스트로겐 5종 의약품 3종 나노물질 4종)의

농도-반응곡선과 Relative potency를 작성하였다

3 Yeast two-hybrid assay로 화학물질과 환경시료의 에스트로겐 활성도를

측정한 결과 mER가 hER보다 활성도를 민감하게 측정할 수 있었으며

항생제에서도 에스트로겐 활성도가 검색되었다 나노물질은 그

자체로는 에스트로겐 활성도가 없었으나 E2와 공존시에 E2의 활성이

증가하는 경향을 나타내어 향후 추가연구가 필요한 것으로 나타났다

4 하폐수처리장 및 하천수 15지점에서 에스트로겐 활성도와

에스트로겐성 물질의 농도를 분석하였다 하수처리장의 평균

에스트로겐활성도 제거율은 771으로 나타났으며 입자상 물질에

의한 영향이 전체 활성도의 30(2차시료)를 나타내고 있었다

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

Lee B Ra J Kim S Kawai H Lee C (2007) Evaluation of the

Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 67 -

V 참 고 문 헌

Bolong N Ismail AF Salim MR Matsuura T (2009) A review

of the effects of emerging contaminants in wastewater and

options for their removal Desalination 239 pp 229~246

Chultis T and Metzger JW (2004) Determination of estrogenic

activity by LYES-assay (yeast estrogen screen-assay assisted by

enzymatic digestion with lyticase) Chemosphere 57 pp

1649-1655

Cunningham MJ and Shah M (2007) Chapter 31

ldquoToxicogenomicsrdquo in Handbook of Pharmaceutical

Biotechnology John Weily amp Sons Inc

Kamata R Shiraishi F Nishikawa J Yonemoto J Shiraishi H

(2008) Screening and detection of the in vitro agonist activity

of xenobiotics on the retinoic receptor Toxicology in Vitro 22

pp 1050~1061

Lee B Ra J Kim S Kawai H Lee C (2007) Evaluation of the

Estrogenic Activity by Yeast Two-hybrid Assay and

Enzyme-linked Immunosorbent Assay in Sewage Treatment

Plant Korean Society of Environmental Engineers 29(7) pp 771~777

Lee JH Lee BC Ra JS Cho J Kim IS Chang NI Kim HK

and Kim SD (2008) Comparison of the removal efficiency of

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

국립환경연구원(2002) 내분비계장애물질 측정분석 방법

川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

化學物質安全情報硏究會(1999) 環境ホルモンの問題とその對策 株式會

社オーム社

環境廳 水質保全局水質管理課(1998) 外因性內分泌攪亂化學物質調査暫

定メニュアル(水質 底質 水生生物)

- 68 -

endocrine disrupting compounds in pilot scale sewage treatment

processes Chemosphere 71 pp 1582~1592

Liu Z Kanjo Y Mizutani S (2009) Removal mechanisms for

endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater

treatment -physical means biodegradation and chemical

advanced oxidation A review Science of the total environment

407 pp 731~748

Nishihara T Nishikawa J Kanayama T Dakeyama F Imagawa

M Takatori S Kitagawa Y Hori S Utsume H (2000)

Estrogenic activities for 517 chemicals by yeast two-hybrid

assay Journal of Health Science 46(4) pp 282~298

Nishikawa J Saito K Goto J Dakeyama F Matsuo M

Nishihara T (1999) New screening methods for chemicals with

hormonal activities using interaction of nuclear hormone

receptor with coactivator Toxicology and applied pharmacology

154 pp 76~83

Park JY Lee BC Ra JS Lee JH Kim SD (2008) Effect of

copper complexation on the estrogenic activities of

endocrine-disrupting compounds using E-screen bioassay

Environmental Toxicology and Chemistry 27(3) pp 535~541

Pojana G Gomiero A Jonkers N Marcomini A (2007) Natural

and synthetic endocrine disrupting compounds (EDCs) in

water sediment and biota of a coastal lagoon Environment

- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

(2000) Development of a simple operational estrogenicity

assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

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- 69 -

International 33 pp 929-936

Shiraishi F Shiraishi H Nishikawa J Nishihara T Morita M

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assay system using the yeast two-hybrid system Journal of

environmental chemistry 10(1) pp 57~64

국립환경과학원(2002) 내분비계장애물질 생태영향 정밀조사의 표준화

매뉴얼

국립환경과학원(2007) 내분비계장애물질에 의한 생태영향 정밀조사Ⅰ

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川合 眞一郞(2004) 環境ホルモンと水生生物 (株)成山堂書店

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定メニュアル(水質 底質 水生生物)