LAPORAN PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN TANAMAN

ACARA I

STERILISASI PERALATAN

Oleh:

Hilman Arifin

NIM A1L011045

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS PERTANIAN

PURWOKERTO

2012

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kultur jaringan merupakan suatu teknik budidaya yang dilakukan secara

invitro, tanaman dikembangkan dengan cara dicukupi kebutuhannya secara

lengkap dan diperhitungkan secara tepat kadar kebutuhannya. Dasar dari teknik

budidaya kultur jaringan adalah teori totipotensi sel, suatu teori yang

mengungkapkan bahwa suatu sel mampu berkembang biak menjadi tanaman

yang sempurna apabila diletakkan pada media dan kondisi lingkungan yang

sesuai.

Berdasarkan teori tersebut maka dalam kultur jaringan harus

menggunakan media yang sesuai untuk tanaman yang dikulturkan dan kondisi

lingkungan juga harus sesuai. Kondisi lingkungan yang sesuai meliputi suhu,

kelembaban, pencahayaan dan hal yang paling utama yaitu kondisi harus

aseptis. Keadaan yang aseptis merupakan syarat mutlak dalam kultur jaringan.

Kondisi aseptis tidak hanya sebatas pada kondisi lingkungan, semua bahan dan

sesutu yang berhubungan dengan kegiatan tersebut haruslah dalam kondisi

aseptis.

Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman dilakukan berdasarkan teori

totipotensi sel yaitu kemampuan setiap sel untuk tumbuh menjadi tanaman

sempurna apabila diletakkan pada lingkungan yang cocok dalam keadaan

aseptik.

Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila semua

persyaratan dipenuhi yaitu: media yang cocok, kondisi atmosfer yang sesuai

dan kondisi aseptik. Kondisi aseptik berlaku untuk eksplan (bahan tanam),

ruangan dan peralatan yang digunakan. Apabila kondisi aseptik tidak dipenuhi,

maka kultur akan gagal karena kontaminasi.

Untuk itu perlu dilakukan sterilisasi peralatan yang akan digunakan.

Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclave (pakai kompor atau

listrik), dengan suhu dan tekanan tertentu.

B. Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan untuk meningkatkan keterampilan mahasiswa

dalam melakukan sterilisasi peralatan dengan autoclave.

II. METODE PELAKSANAAN

A. Waktu

Praktikum dilakukan pada tanggal 26 November 2012

B. Tempat pelaksanaan

Praktikum dilakukan di Laboratorium Agronomi Fakultas Pertanian

C. Alat dan Bahan

- Autoclave.

- Kompor.

- Glass ware (botol kultur, erlenmeyer, petridish).

- Dissecting kit (pinset dan skalpel).

- Kertas payung

- Alumunium foil

- Karet gelang

- Pipet

- Pengaduk

- Sabun

- Air.

D. Prosedur Kerja

- Glass ware (botol kultur, erlenmeyer, petridish) dan dissecting kit (pinset

dan skalpel) dicuci bersih dengan sabun, dibilas dengan air lalu

dikeringkan. Setelah kering mulut botol ditutup dengan aluminium foil dan

kertas payung dan diikat dengan karet gelang. Pinset dan skalpel

dibungkus dengan kertas atau aluminium foil.

- Glass ware dan dissecting kit disterilisasi dengan autoclave pada suhu 1200

C pada tekanan 15 psi selama 15-30 menit.

- Selama sterilisasi autoclave ditutup rapat sehingga tekanan didalam

autoclave naik.

- Tekanan tinggi itu dipertahankan selama 30 menit dengan mengecilkan

api.

- Kompor dimatikan setelah proses sterilisasi selesai dan katup dibuka untuk

membuang uap air hingga tekanan 0 psi.

- Autoclave dibuka dan diambil peralatan yang sudah ada di dalamnya

diambil.

- Peralatan yang sudah disterilisasi disimpan ditempat yang bersih.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

No Nama Alat Gambar Fungsi

1 Autoclave Untuk mensterilisasi

peralatan dan media

2 Magnetic Stirer Untuk mengaduk dan

mencampur larutan

3 pH meter Untuk mengukur pH

4 Timbangan

analitik

Untuk menimbang

bahan-bahan kimia

No Nama Alat Gambar Fungsi

5 Laminar Air

Flow

Untuk melakukan

penanaman eksplan

dalam kultur jaringan

6 Erlenmeyer Untuk menampung

larutan

7 Beaker glass Untuk menampung dan

membuat media

8 Botol kultur Untuk tempat kultur

(eksplan)

9 Gelas ukur Untuk mengukur larutan

No Nama Alat Gambar Fungsi

10 Pinset Untuk mengambil

eksplan

11 Scalpel Untuk memotong

eksplan

12 Pipet Untuk mengambil dan

memindah larutan

13 Suntikan Untuk mengambil

larutan dalam jumlah

kecil

14 Hand sprayer Untuk sterilisasi dengan

alcohol

15 Petridish Untuk meletakkan

eksplan

16 Pembakar

Bunsen

Untuk memflamir

eksplan, pinset, scalpel

dan mulut botol

17 Alumunium foil Untuk menutup mulut

botol

18 Rak kultur Untuk meletakkan botol

kultur yang sudah

ditanami eksplan

19 Tisu Untuk mengeringkan

alat

20 Kertas payung Untuk membungkus

petridis dan alat-alat

dari logam untuk

disterilisasi

21 Pengaduk kaca Untuk mengaduk

larutan

B. Pembahasan

Ruang dan alat yang digunakan dalam kutur jaringan harus dalam kondisi

steril. Sterilisasi ruang dapat dilakukan dengan menggunakan lampu UV dan

alcohol 90%. Tujuan dari sterilisasi ruang adalah untuk menghindari kontaminasi

yang disebabkan mikroorganisme yang ada di alat maupun beterbangan di udara

sekitar ruangan. Srerilisasi ruang seperti tersebut mutlak dilakukan pada ruang

penabur atau tempat yang untuk jaringan. Ruang-ruang yang tidak lebih harus

100% steril karena tidak berhubungan langsung dengan media maupun jaringan

yang akan ditanam. Peralatan yang akan digunakan juga harus dalam keadaan

steril juga dapat biasanya menggunakan autoclave untuk sterilisasinya. Tujuan

dari sterilisasi alat ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi oleh mikro

organisme seperti jamur dan bakteri, yang menempel pada alat sehingga dapat

mengggagalkan kultur jaringan (Soebardini M dan Slamet Rachadi, 2011).

Ada beberapa persyaratan yang harus dipenuhi jika kita akan menggunakan

teknik kultur jaringan untuk menumbuhkan suatu tanaman. Persyaratan tersebut

adalah adanya peralatan yang mendukung teknik kultur jaringan dan pengetahuan

dasar mengenai teknik kultur jaringan misalnya teknik aseptik dalam kultur

jaringan. Peralatan minimum yang harus dimiliki oleh suatu laboratorium seperti

alat sterilisasi, laminar atau kotak steril, peralatan untuk membuat media, bahan-

bahan kimia, alat-alat kaca, dan ruang penyimpanan kultur. Teknik aseptik dalam

kultur jaringan berhubungan dengan cara-cara melakukan sterilisasi. Ada

beberapa cara sterilisasi yang digunakan dalam teknik kultur jaringan adalah

sebagai berikut:

Sterilisasi Kering, Sterilisasi ini digunakan untuk peralatan yang terbuat dari

logam, kaca, atau kertas, contohnya pinset, gagang pisau, batang pengaduk, cawan

petri, dan kertas saring. Dalam sterilisasi ini, alat yang akan disteril harus

dibungkus terlebih dahulu dengan menggunakan aluminium foil atau kertas.

Kemudian peralatan tersebut dmasukkan dalam oven bersuhu 120 0 C, dan waktu

yang dibutuhkan minimal 1 jam. Setelah steril, peralatan disimpan di tempat yang

kering dan bersih.

Sterilisasi Basah, Sterilisasi basah sering digunakan untuk peralatan dan

bahan-bahan, seperti media, akuades. Umumnya peralatan yang disterilkan

menggunakan cara ini adalah peralatan logam, kaca, atau peralatan apapun yang

tahan terhadap suhu dan tekanan yang tinggi. Hal ini karena teknik sterilisasi ini

menggunakan Autoclave dengan tekanan 1,5 atm dan suhu 121 0 C dengan waktu

yang dibutuhkan 1-20 menit. Setelah sterilisasi selesai, bahan atau peralatan

disimpan di tempat yang kering dan bersih.

Sterilisasi dengan Sinar Ultraviolet (UV), Sterilisasi ini dilakukan pada

laminar air flow atau kotak alir udara, dengan tujuan agar kotak menjadi steril

sehingga bisa digunakan untuk penanaman. Kotak alir udara dilengkapi dengan

lampu UV. Sebelum lampu UV dinyalakan, permukaan dalam kotak dibersihkan

dengan menggunakan alkohol 70%. Lampu UV dinyalakan minimal 1 jam

sebelum pemakaian, dan pada saat pemakaian jangan lupa untuk mematikan

lampu UV-nya.

Sterilisasi dengan Bahan Kimia, Bahan-bahan yang biasanya digunakan

untuk sterilisasi ini antara lain alkohol, natrium hipoklorit (NaOCl), kalsium

hipoklorit atau kaporit (CaOCl), sublimat (HgCl2 ), dan hidrogen peroksida

(H2O2).

Sterilisasi dengan Menggunakan Filter, Teknik sterilisasi ini adalah dengan

menggunakan sterilisasi filter untuk bahan-bahan yang tidak tahan terhadap panas

seperti antibiotika dan hormon. Sterilisasi biasanya dilakukan dengan filter ukuran

0,2 µm.

Ada beberapa peralatan yang digunakan dan fungsinya dalam teknik kultur

jaringan, antara lain :

1. Aluminium foil : alat ini digunakan untuk meletakkan bahan – bahan kimia

pada saat ditimbang dan juga digunakan untuk menutup serta membungkus

botol erlemeyer agar larutan stok tidak rusak.

2. Plastik dan karet : alat ini digunakan untuk menutup botol kultur agar

mikroba penyebab kontaminasi tidak dapat masuk ke dalam.

3. Petridish : digunakan sebagai tempat untuk meletakkan eksplan pada saat

penanaman.

4. Erlenmeyer : digunakan sebagai tempat untuk menuangkan air suling, sebagai

tempat menampung media maupun stok media. Erlenmeyer juga bisa

digunakan sebagai tempat pananaman karena mempunyai dasar yang lebar

dan mulut yang sempit. Sebab mulut yang lebar memperbesar peluang

kontaminasi.

5. Keras buram : alat ini digunakan untuk membungkus alat – alat kultur dan

petridish sebelum disterillisasikan.

6. Stirrer : digunakan sebagai pengaduk media hingga media menjadi menjadi

homogen secara otomatis.

7. Gelas ukur : untuk mengukur larutan bahan kimia atau larutan stok yang akan

digunakan untuk pembuatan media.

8. Gelas piala :digunakan sebagai tempat untuk pembuatan media Ms.

9. Pinset : untuk mengambil eksplan pada saat eksplan akan ditanam.

10. Kertas label : untuk memberi keterangan pada botol kultur yang digunakan.

11. Panci dan pengaduk : alat ini digunakan untuk memasak media yang akan

digunakan serta untuk mengaduk media.

12. Magnetic stirrer : Alat ini berfungsi untuk menggojog dan pemanas. Alat ini

digunakan dalam pembuatan stok media. Batang pengaduk magnetik

dimasukkan ke dalam erlenmeyer, sehingga pada saat dinyalakan pengaduk

akan bergerak memutar. Sehingga bahan kimia di dalamnya dapat larut

dengan cepat dan baik.

13. Bunsen : digunakan untuk membakar dissecting kit, blade dan pinset pada

saat penanaman eksplan.

14. Tissue : untuk membersihkan alat – alat kultur dan LAF.

15. Sprayer : digunakan sebagai alat penyemprot yang berisi alkohol 70% dan

90% untuk mensterilkan alat dan ruang penanaman.

16. Corong : untuk menuangkan media ke dalam botol kultur.

17. Pipet tetes : untuk mengambil larutan yang akan digunakan atau protoplas.

18. Scalpel :digunakan sebagai tempat untuk meletakkan blade.

19. Blade : untuk memotong eksplan pada saat penanaman.

20. Botol kutur : sebagai tempat yang berisi media yang bernutrisi dan juga

sebagai tempat pertumbuhan serta perkembangan eksplan.

21. pH meter : digunakan untuk mengukur pH larutan stok.

22. Timbangan analitik : untuk menimbang larutan stok yang akan digunakan.

23. LAF : berfungsi sebagai tempat untuk penanaman eksplan. LAF harus selalu

dalam kondisi steril. Sterilisasi LAF dapat dilakukan dengan menyemprot dan

mengelapnya menggunakan alkohol 96 % atau formalin 5 % dan disinari

dengan sinar UV.

24. Rak kultur : untuk meletakkan botol – botol kultur.

25. Kompor gas : untuk memanaskan autoclave dan untuk memasak media.

26. Autoclave : Autoclave digunakan untuk sterilisasi peralatan dan media.

Pemanasan autoclave biasanya digunakan kompor gas. Pengaturan tekanan

dapat dilakukan dengan mengatur katup pada tutup autoclave. Bila tekanan

dalam autoclave naik maka secara otomatis katupnya akan terbuka untuk

mengurangi tekanan. Dengan demikian tekanan akan dapat dipertahankan

disebabkan sebagaian uap keluar (Daisy dan Ari, 2002). Pada praktikum kali

ini . untuk sterilisasi alat dibutuhkan waktu sekitar 30 menit. Suhu dalam

autoclave dipertahankan antara 1200C dan tekanan 17,5 Psi dengan cara

membesar atau mengecilkan nyala api kompor.

Cara kerja menggunakan Autocalve, LAF, pH meter, dan Hot Plate Magnetic

Stirer.

1. Autoclave:

- Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau

aluminium foil (jangan terlalu kencang bila menggunakan aluminium foil).

Untuk botol-botol yang mempunyai tutup yang autoclaveable, jangan tutup

terlalu kencang, karena selama pemanasan terjadi pemuaian.

- Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting,

gagang skalpel, kertas saring, petridish, botol kultur, jarum dan pipet.

- Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh

dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum

dimasukkan dalam autoklaf. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai

pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Alat-alat

sektio seperti pinset, gunting, gagang skalpel, dan jarum, dibungkus dengan

kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap

sukar masuk kedalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

- Petridish akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas

merang.

- Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi botol kultur kosong dan alat-alat

yang akan digunakan untuk menanam eksplan, adalah 121°C pada tekanan 15

psi (pound per square inch) atau 1 atm selama 30-60 menit. Penghitungan

waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan dan temperatur yang diinginkan

tercapai.

2. LAF:

- Nyalakan lampu U.V., minimum selama 30 menit, sebelum laminar air flow

digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.

- Siapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan. Alat-alat yang

dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet, disemprot terlebih dahulu

dengan alcohol 70% atau spiritus.

- Meja dan dinding dalam LAF disemprot dengan alkohol 70% atau spiritus

untuk mensterilkan LAF.

- Blower pada LAF dihidupkan untuk menjalankan air flow.

- Nyalakan lampu dalam LAF.

- LAF sudah siap untuk digunakan.

3. pH meter:

- Meletakkan pH-meter pada keadaan standby  on jika tidak dipakai; jangan

ditekan off.

- Menyiram electrode  dengan aquades perlahan sebelum digunakan. Lalu

masukkan ujung pH meter ke dalam larutan. Menyiram  electrode  dengan

aquades kembali sesudah digunakan dan letakan pada silinder  kembali.

- Jangan dibiarkan  elektrode diluar larutan pada waktu yang lama.

4. Hot Plate Magnetik Stirer:

- Nyalakan Heater, lalu letakkan bekker glass di atas heater.

- Letakkan stirrer di dalam becker glass.

- Masukkan larutan satu per satu ke dalam bekker glass.

- Tunggu beberapa saat sampai larutan menjadi homogen.

IV. PENUTUP

A. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang sudah dilakaukan dapat diketahui, bahwa

Sterilisasi adalah salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan

mikroorganisme. Semua alat – alat dan media yang akan digunakan dalam

kultur jaringan harus disterillisasi dahulu menggunakan autoclave agar mikroba

penyebab kontaminasi hilang dan mati, dan dalam kegiatan kultur jaringan,

semua ruangan dan peralatan kultur harus selalu dalam keadaan steril.

DAFTAR PUSTAKA

Chatimatun Nisa dan Rodinah, 2005. Kultur Jaringan Beberapa Kultivar Buah

Pisang (Musa paradisiaca L.) Dengan Pemberian Campuran Naa Dan

Kinetin. Volume 2, Nomor 2, Juli 2005, Halaman 23-36.

Rahardja, P. C. 1995. Kultur Jaringan : Teknik Perbanyakan Tanaman Secara

Modern. Penerbit Swadaya, Jakarta.

M, Soebardini dan Slamet Rochdi. 2011. “Handout Kultur Jaringan Tanaman

Hortikultura”. Fakultas Pertanian Universitas Jenderal Soedirman,

Purwokerto.

Murashige, T. 1974. Plant propogation through tissue culture. Ann. Rev. Plant

Physiology.Pierik, R. L. M. 1975. Callus multiplication of Aunthurium

andraenum L. in liquid media. Neth. J. Agric. Sci.: 229.

Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan : Pengenalan

dan Petunjuk Perbanyakan Tanaman Secara Vegetatif-Modern. Kanisius,

Yogyakarta.

Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemuliaan Tanaman Secara In-Vitro. Kanisius,

Yogyakarta.

Widarto, L. 2000. Perbanyakan Tanaman dengan Biji, Stek, Cangkok, Sambung,

Okulasi dan Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta.