ACCIÓ DELS ANDRÒGENS EN EL TESTICLE UN PAPER PER A LA … · 76 C. A. SUAREZ-QUIAN et al. que continua essent desconegut el mecanisme pel qual els andrògens actuen en aquest pro-cés

DOI: 10.2436/20.1501.02.7 Endocrinologia molecular(Jaume Reventós, ed.)

Treballs de la SCB. Vol. 56 (2005) 75-89

ACCIÓ DELS ANDRÒGENS EN EL TESTICLE..UN PAPER PER A LA MEIOSI

Carlos A. Suarez-Quian,1 Javier Regadera,2 Manuel Nistal,2,3

Pilar González-Peramato,2 Álvaro Serrano,4 Oscar M. Tirado,5 David M. Selva,5

Núria Toran,6 Francina Munell5 i Jaume Reventós 5

1 Department de Biologia Cell. ular, Georgetown University Medical Center.2 Departament de Morfologia, Universitat Autònoma de Madrid.3 Departament d’Urologia, Hospital de Guadalajara.4 Departament de Patologia, Hospital La Paz.5 Unitat de Recerca Biomèdica, Institut de Recerca de l’Hospital Universitari Vall d’Hebron.6 Departament de Patologia, Hospital Universitari Vall d’Hebron.

Adreça per a la correspondència: Carlos A. Suarez-Quian. Department of Cell Biology,Georgetown University Medical Center. 3900 Reservoir Road NW,Washington DC, 20057, EUA. Adreça electrònica: [email protected].

RESUM

La funció que duen a terme els andrògens en l’espermatogènesi és, encara en certa mesura,enigmàtica: mentre que llur implicació és absolutament vital en la iniciació i en el manteni-ment del procés espermatogènic normal, la seva funció específica encara no està definida demanera precisa. Els andrògens, com les altres hormones esteroïdals, actuen a través del seucorresponent receptor anomenat receptor d’andrògens (AR). Fins avui, no hi ha gaire evidèn-cia que recolzi l’existència de diverses isoformes de l’AR com en el cas del sistema estrògens-receptor d’estrògens. Per tant, la pregunta de com els andrògens duen a terme la seva accióen l’espermatogènesi s’ha d’abordar definint dos processos: en primer lloc, s’han d’identifi-car amb total certesa els tipus cell. ulars testiculars capaços de respondre directament a l’esti-mulació androgènica. De manera específica, la qüestió per resoldre és quins són els tipus cel-lulars que expressen l’AR en el testicle. En segon lloc, sabent també que el complex del lli-gand unit a l’AR actua com a factor de transcripció, caldrà determinar quins són els gens queestaran activats o reprimits en les cèll. ules que tenen AR en resposta a l’estimulació androgè-nica. Fins que aquestes dues preguntes no estiguin contestades amb tota certesa, el mecanis-me pel qual els andrògens regulen l’espermatogènesi serà, en el millor dels casos, especula-tiu. En aquesta revisió presentem evidència que els andrògens actuen únicament a les cèll. ulessomàtiques del testicle, com són les cèll. ules de Sertoli, les de Leydig, les mioides peritubu-lars i les cèll. ules del múscul llis que envolten els vasos sanguinis. A més a més, també dis-cutim la possibilitat que els andrògens siguin indispensables per a l’inici de la meiosi, encara

76 C. A. SUAREZ-QUIAN et al.

que continua essent desconegut el mecanisme pel qual els andrògens actuen en aquest pro-cés.

Paraules clau: receptor d’andrògens, testicle, cèll. ula de Sertoli, cèll. ula de Leydig, cèll. ula ger-minal, meiosi.

SUMMARY

The role that androgens play in spermatogenesis still remains enigmatic: whereas their in-volvement is absolutely vital to the initiation and maintenance of the normal spermatogenicprocess, their specific role is yet to be defined. Androgens, like other steroid hormones, act viatheir corresponding receptor termed the androgen receptor (AR). To date, there is little evidenceto support the notion that there are multiple forms of AR as is the case for the estrogen-estrogenreceptor system. Thus, the question of how androgens manifest their action on spermatogenesisbecomes one of defining two processes: First, the cell types within the testis that are capable ofresponding directly to androgen stimulation must be identified with absolute certainty. Specif-ically, this question can be stated as what cell types in the testis express AR. Second, given thatthe ligand-bound AR serves as a transcription factor, the question then becomes what are thegenes turned on or off in AR positive cells in response to androgen stimulation? Until these twoquestions are unequivocally answered, the mechanism of how androgens regulate spermato-genesis will remain speculative at best. In this review we present evidence that androgens actsolely at the level of the somatic cells of the testis, including Sertoli cells, Leydig cells, peritubu-lar myoid cells and smooth muscle cells surrounding blood vessels. In addition, we discussthe likely possibility that androgens are indispensable for the onset of meiosis, albeit how theyaccomplish this remains a mystery.

Keywords: androgen receptor, testicle, Sertoli cell, Leydig cell, germinal cell, meiosis.

ANDRÒGENS I ESPERMATOGÈNESI

L’objectiu del procés espermatogènic ésconvertir espermatogònies arrodonides en es-permatozoides aerodinàmics capaços de fe-cundar òvuls. Atesa la complexitat del procésespermatogènic, de seguida vénen al cap duespreguntes: primer, com es regula aquest extra-ordinari procés?; segon, quines són les rutesindispensables que ajuden a mantenir el fun-cionament normal d’aquest procés?

Pel que fa a la primera qüestió, durant ladarrera cinquantena d’anys s’han publicat mi-lers d’articles, i se’n continuen publicant, quedescriuen les rutes particulars de les hormo-nes i els factors de creixement implicats enla regulació de l’espermatogènesi. Les evidèn-cies són més convincents per a uns que per

a altres, però atesa aquesta abundància d’in-formació, resta clar que encara no coneixemgaire el nombre de mecanismes que regulenl’espermatogènesi. Tanmateix, i pel que fa ala segona qüestió, hi ha proves experimentalsconvincents que mostren que una ruta de se-nyalització és realment indispensable per alprocés espermatogènic, i aquesta és la ruta an-drogènica.

Es coneix de fa temps que l’espermatogè-nesi normal en mamífers suposa un balançdelicat entre la proliferació cell. ular i la mortcell. ular programada (Print i Loveland, 2000),un fenomen governat pels andrògens de lescèll. ules de Leydig sota la regulació de la LHde la pituïtària (vegeu la figura 1) (Zirkin,1998). La testosterona de les cèll. ules de Leydigactiva al seu torn els receptors d’andrògens,

ACCIÓ DELS ANDRÒGENS EN EL TESTICLE.. UN PAPER PER A LA MEIOSI 77

Hipotàlem

Pituïtària

GnRH

LH

cel. Leydig

T

T-ABP

ABP

T

EDS

TFM/AISFlutamida

Fecunditat compromesa

ARAR

ARAR

ARAR

Figura 1. Esquema simplificat del control hormonal de l’es-permatogènesi mitjançant andrògens. La inducció de testosteronaa la cèll. ula de Leydig (T) és regulada per la LH de la pituïtàriaque, al seu torn, és controlada per la GnRH de l’hipotàlem. Latestosterona s’uneix al receptor d’andrògens (AR), localitzat enles cèll. ules de Leydig, Sertoli i les mioides peritubulars, i l’acti-va. La testosterona de les cèll. ules de Leydig també s’uneix a laproteïna d’unió a andrògens (ABP), que regula la concentraciólliure de T a través de la unió (T-ABP). El tractament de les ra-tes adultes amb EDS destrueix les cèll. ules de Leydig i provoca ladisminució de la T intratesticular i una disminució de la fertilitat.Quan es suprimeix l’activitat de l’AR, ja sigui per insensibilitatandrogènica o per tractament amb flutamida, la fertilitat es veuseriosament malmesa.

que actuen com un factor de transcripció pera iniciar una certa quantitat de programescell. ulars (Wilson et al., 2002). La regulació an-drogènica de l’espermatogènesi no es limitaal control dels nivells d’andrògens en circu-lació, sinó que també suposa una homeòstasiandrogènica definida i complexa que necessi-ta andrògens, la proteïna d’unió als andrògens(ABP) i el receptor d’andrògens (AR). Cal te-nir en compte també que la concentració ade-quada de testosterona per a mitjançar i man-tenir els efectes androgènics no depèn de latestosterona total, sinó de la testosterona lliure(probablement en funció dels nivells d’ABP)disponible dins l’epiteli seminífer (Munell etal., 2002). Qualsevol pertorbació d’aquesta ho-meòstasi, tant si és deguda a la disminució de

la producció de testosterona de les cèll. ules deLeydig —per exemple, amb el tractament ambEDS que les elimina (Henriksen et al., 1995;Nandi et al., 1999; Woolveridge et al., 1999)—,com a l’increment dels nivells d’ABP —comen el ratolí transgènic per a ABP que té nivellsdisminuïts de testosterona lliure (Selva et al.,2000, 2004)—, o a la disminució de l’activitatde l’AR —com en la síndrome d’insensibili-tat parcial als andrògens (Lamb, 1995; Lamb etal., 2001; Mifsud et al., 2001)—, o a l’exposicióa agents que disminueixen experimentalmentl’activació de l’AR —per exemple, flutamida(Meachem et al., 1997; O’Donnell et al., 1999;Kassim et al., 1997; Omezzine et al., 2003)—,posa en perill la fertilitat masculina. Així, unaconclusió que es pot extreure del gran nom-bre d’evidències acumulades durant els dar-rers trenta anys és que una espermatogènesinormal suposa un procés que només podràavançar si es manté una homeòstasi androgè-nica normal. Tanmateix, tot i que hi ha consensgeneral en el fet de que els andrògens tenenun paper essencial, si no el principal, en l’inicii el manteniment de l’espermatogènesi quan-titativa, el mecanisme mitjançant el qual aixòes duu a terme encara és bastant desconegut(Zirkin, 1998).

Els andrògens, com qualsevol altra hor-mona esteroïdal, actuen sobre les cèll. ulesquan s’uneixen al seu receptor respectiu, mo-ment en el qual el complex hormona-recep-tor migra al nucli, on actua com a factorde transcripció (Beato et al., 1995). Llavors,suposadament, un mecanisme mitjançant elqual els andrògens controlen l’espermatogè-nesi és la regulació de la síntesi de novo deproteïnes en les cèll. ules que responen alsandrògens. Atesa la necessitat de mantenirl’homeòstasi androgènica perquè l’esperma-togènesi avanci, i coneixent com funcionenels andrògens, per tal d’entendre com regu-len aquest procés cal respondre dues pre-guntes: primera, quins són els gens concretsdel testicle regulats pels andrògens?, i sego-na, quins són els tipus cell. ulars del testicle


Mioide peritubularCèl·lules de Leydig

SMC

Lumen

Cèl·lules de Sertoli

Figura 2. Localització immunohistoquímica del receptor d’andrògens (AR) enel testicle. L’AR és present al nucli de les cèll. ules de Sertoli, les cèll. ules mioidesperitubulars i les cèll. ules de Leydig. Les espermàtides allargades de l’estadi 11 (adins) també mostren tinció específica. (Figura basada en Vornberger et al., 1994.)

capaços de respondre directament als andrò-gens?

La resposta a la primera pregunta és forçasimple. Tot i que ha estat el tema de recer-ca de diversos grups des de fa anys, els gensregulats pels andrògens no s’han començat aconèixer fins fa poc (Zhou et al., 2005). Tan-mateix, encara no coneixem bé com encaixenaquests gens en la regulació androgènica del’espermatogènesi. Així, la resposta més sim-ple per a aquesta qüestió és que totes lesproves menen a considerar que l’homeòsta-si androgènica és imprescindible per a l’es-permatogènesi normal, però encara no sabemcom es regula tot el procés. En contrast ambaixò, ja fa uns quants anys, ens vam propo-sar d’investigar la resposta més accessible ala segona pregunta cercant com s’expressa-va el receptor d’andrògens en el testicle. Enaquesta revisió proporcionem els nostres re-sultats, que confirmen que l’acció androgènicaen l’espermatogènesi és mitjançada a travésdel component somàtic testicular, i que és pocprobable que vinculi directament la poblacióde cèll. ules germinals.

LLOCS D’ACCIÓ ANDROGÈNICA

La història d’on exerceixen els andrògensl’efecte directe en el testicle és llarga i con-trovertida. Basada sobretot en consideracionsteòriques (dutes a terme per la genetista MaryLyons, en el treball de la qual dos ratolins qui-mèrics de tipus tfm/salvatge resultaven fèrtilsi capaços de passar el gen tfm a la descen-dència, suposadament perquè les cèll. ules deSertoli de tipus salvatge podien compensarla manca d’AR funcional de l’esperma tfm),Fritz va suggerir que els andrògens manifes-taven els seus efectes únicament a les cèll. ulessomàtiques (Fritz, 1978). Els estudis immuno-histoquímics (IHC) inicials portats a terme perWilson, French i coll. aboradors semblaven cor-roborar les destacades hipòtesis de Fritz (Saret al., 1990). Els estudis següents, tant en elnostre laboratori com en el d’altres, però, tor-naren a plantejar la controvèrsia sobre si lescèll. ules germinals mostraven immunopositi-vitat per a AR (Vornberger et al., 1994). Vamutilitzar un anticòs específic per a un pèp-tid d’AR, purificat per afinitat, generat perGail Prins (1991) i, mentre que les cèll. ules so-màtiques testiculars mostraven tinció nuclear,vam demostrar també que hi havia immuno-tinció específica en el nucli de l’estadi 11è de


Estadis 2-3

Estadi 5

Estadi 8

Figura 3. Immunolocalització d’AR específi-ca d’estadi en l’epiteli seminífer de rata. Laintensitat de la immunotinció d’AR en els nuclisde cèll. ules de Sertoli dels estadis 2-3 al 8. Els es-tadis 9-14 no mostren tinció d’AR en les cèll. ulesde Sertoli. (Figura basada en Vornberger et al.,1994.)

les espermàtides allargades (cèll. ules que hanexperimentat l’elongació nuclear però enca-ra han de completar la condensació; vegeu lafigura 2). Així, en teoria, les cèll. ules germi-nals que mostraven tinció AR positiva podienser encara actives transcripcionalment.A més,la tinció AR es va detectar també en el ci-toplasma de les espermàtides allargades delsestadis 12-19 (vegeu la figura 2). De mane-ra significativa, una sèrie extensiva d’estudiscontrol, incloent-hi anàlisis per Western blot,va demostrar que els resultats de l’IHC erenespecífics (Vornberger et al., 1994). Altres in-vestigadors, utilitzant diferents antisèrums iprotocols d’IHC, no van obtenir resultats sem-blants (Bremner et al., 1994; Zhou et al., 2002),encara que cal destacar que el nostre grup nova ser l’únic que va informar que les cèll. ules

germinals eren immunoreactives per a AR :Kimura et al. (1993) i Zhou et al. (1996), fentservir anticossos diferents dels nostres, vandetectar immunopositivitat per a AR en cèl-lules germinals, encara que en estadis menysdiferenciats. El que calia per a deixar resoltaquest assumpte era una hibridació in situ d’à-cids nucleics completa, però, tot i que diversosinvestigadors ho van provar (Shan et al., 1995),la interpretació sense ambigüitats dels resul-tats d’aquesta aproximació experimental no esva aconseguir. De fet, avui dia encara està perfer la hibridació in situ de l’àcid nucleic del’mRNA de l’AR al testicle.

Probablement, l’observació més fascinantsobre la tinció nuclear de les cèll. ules de Serto-li fou que la intensitat de la tinció variava enfunció del cicle de l’epiteli seminífer (vegeu lafigura 3). Per exemple, en estadis primerencsdel cicle, la intensitat de la immunotinció del’AR era feble, però esdevenia més forta enestadis més tardans, i finalment culminavaamb el senyal més fort en l’estadi 8è, momenten què tenia lloc l’espermiació. És interes-sant veure com la intensitat de tinció tambécoincidia amb els estadis que semblaven méssusceptibles a la pertorbació de l’homeòstasiandrogènica. És a dir, si destruïm les cèll. ulesde Leydig amb EDS, el primer estadi que de-mostraria la mort de les cèll. ules germinals perapoptosi seria el 8è.

El desenvolupament d’un protocol d’IHC(basat en l’amplificació amb biotina) que aug-mentava la sensibilitat del senyal de tinció iminimitzava el soroll de fons potencial, ens vaportar a reconsiderar si la tinció d’AR de lescèll. ules germinals podia ser un artefacte (Sua-rez-Quian et al., 1999). En aquest protocol l’an-ticòs primari es dilueix fins a un nivell en quèes conserva el senyal intens i específic, a costade perdre el senyal no específic. Els resultatsde la utilització d’aquest mètode ens van por-tar a concloure que la tinció citoplasmàtica deles cèll. ules germinals de què s’havia informatprèviament era probablement el resultat d’unsenyal no específic (vegeu la figura 4).


Figura 4. Immunolocalització d’AR en l’epiteli seminífer de la rata amb lautilització d’un mètode d’IHC millorat. La distribució d’AR en el túbul seminíferfou reavaluada utilitzant un mètode d’amplificació amb biotina (Suarez-Quian etal., 1999). Els plafons a-e representen la immunotinció d’AR amb l’antisèrumcada cop més diluït. Noteu que en els plafons a i b el senyal d’immunotinció es potdetectar al lumen, que es correspon amb la localització de les cèll. ules germinals,juntament amb la tinció positiva per a AR en els nuclis de les cèll. ules de Sertoli ide les cèll. ules peritubulars. Quan la concentració d’antisèrum es redueix, nomésles cèll. ules de Sertoli i les peritubulars conserven la tinció positiva per a l’AR.

L’alta sensibilitat del protocol IHC d’ampli-ficació amb biotina ens va portar a investigarsi la intensitat de la remarcable immunotinciód’AR observada en rates que variava en fun-ció del cicle de l’epiteli seminífer també erapresent en el testicle humà. De fet, s’ha treba-llat molt sobre el fet que l’espermatogènesi enrosegadors està altament organitzada d’acordamb un sistema d’associacions cell. ulars ano-menades estadis, i aquests s’organitzen alhoraen el temps i en l’espai. Tal com es mostra a la

figura 3 per a l’AR, i en molts altres estudis,altres gens i proteïnes s’expressen de manerasemblant amb especificitat d’estadi en el tes-ticle dels rosegadors, i aquestes observacionssón d’importància inqüestionable (Parvinen,1982). No és clar, però, que aquest fenomentingui lloc en totes les espècies, ja que no s’haobservat en els testicles de primats.

El testicle humà està organitzat, semblant-ment, en associacions específiques de cèll. ules,i tret de la secció transversal en un túbul


Figura 5. Localització immunohistoquímica de l’AR en el testicle humà. Utilitzant una altaconcentració d’antisèrum, tots els nuclis de les cèll. ules de Sertoli es tenyeixen positivament pera AR (plafó a). A concentracions antisèriques limitants, la tinció AR del nucli de les cèll. ulesde Sertoli apareix en funció del cicle de l’epiteli seminífer. (Figura basada en Suarez-Quian etal., 1999.)

únic, es detecten diferents associacions cel-lulars. Mitjançant una aproximació immuno-histoquímica, vam investigar si l’expressió del’AR en testicles adults depenia del cicle de l’e-piteli seminífer. Quan s’utilitzaven concentra-cions saturants d’anticòs per a detectar l’AR,tal com es veu a la figura 4a, cada nucli deles cèll. ules de Sertoli que es trobava en unasecció particular del teixit esdevenia positiuper a AR, cosa que suggeria que, al contrarique en els rosegadors, no hi havia especifi-citat d’estadi en l’expressió de l’AR. En con-trast amb això, quan s’utilitzava el mètodeIHC d’amplificació amb biotina, estenent lesconcentracions funcionals de l’antisèrum, espodia determinar que en la mateixa secció,fins i tot dins els mateixos túbuls, la tincióper l’AR era diferencial en les cèll. ules de Ser-toli humanes, en parall. elisme estret amb laintensitat de tinció d’AR observada en rose-gadors. Per a coneixença nostra, aquesta era laprimera vegada que s’informava de l’existèn-cia d’especificitat d’estadi per a una proteïnaconeguda en l’epiteli seminífer humà. Així, elnostre estudi confirma que la ruta de senyalit-zació indispensable que es necessita per a unaespermatogènesi normal s’expressa de mane-ra semblant, específica d’estadi, en el testiclehumà, tal com té lloc en tots els testicles derosegadors estudiats fins al moment (Suarez-Quian et al., 1999).

AR EN EL TESTICLE HUMÀCRIPTÒRQUID

La incidència del criptorquidisme en hu-mans és un fenomen progressivament crei-xent. La seva etiologia encara és molt descone-guda, encara que s’ha associat a la interrupcióde les rutes androgèniques normals durant elsestadis fetals provocades per tòxics ambien-tals (Skakkebaek et al., 2001). En contrast ambaixò, en rosegadors, un informe recent propor-ciona evidències que la disrupció del gen Insl-3 condueix al criptorquidisme bilateral (Nefi Parada, 1999). Utilitzant una coll. ecció únicad’arxiu de testicles criptòrquids solts de tren-ta-set pacients, vam examinar la distribució del’AR en cèll. ules de Sertoli humanes (Regade-ra et al., 2001). Els resultats eren clars pel fetque la intensitat de la tinció per a AR en lescèll. ules de Sertoli era funció de la intensitatde la disgènesi de les cèll. ules de Sertoli (vegeula figura 6). Era poc probable que les cèll. ulesde Sertoli que mostraven més disgènesi fossinpositives per aAR (vegeu la figura 6d). Més in-teressant encara era el fet que la immunotinciód’AR per a les cèll. ules de Sertoli coincidia ambla maduració de les cèll. ules germinals en elstúbuls positius per a AR. És a dir, en general,els espermatòcits en fase de paquitè es detec-taven clarament en els túbuls que mostravenimmunotinció per a AR, però eren absents en


Figura 6. Localització immunohistoquímica en testicles humans criptòrquids. Es vanrecollir diversos testicles criptòrquids solts i es van examinar mitjançant immunotinció pera l’AR. Dins el mateix testicle es podien distingir àrees focals amb gran disgenèsia de lescèll. ules de Sertoli (plafons a i b). La tinció nuclear d’AR en les cèll. ules de Sertoli en elstesticles criptòrquids era una funció del desenvolupament de la cèll. ula; els túbuls que mostravencèll. ules de Sertoli positives a l’AR contenien cèll. ules germinals, algunes tan madures comels espermatòcits en fase de paquitè (caps de fletxa). En contrast amb això, l’absència detinció d’AR coincidia significativament amb l’absència de cèll. ules germinals (plafó d). (Figuraadaptada de Regadera et al., 2001.)

els túbuls negatius per a AR. Encara que elprocés espermatogènic no s’assolia completa-ment en els testicles criptòrquids, la presènciad’AR podia permetre el desenvolupament al-menys fins a l’estadi de paquitè. Aquest va serel nostre primer indici d’un paper potencialper a una homeòstasi androgènica apropiadaen el testicle; és a dir, era necessari perquè lescèll. ules germinals poguessin assolir la prime-ra divisió meiòtica.

Aquests resultats ens van fer concloure queel criptorquidisme humà, almenys en el casdels testicles criptòrquids únics, no és proba-ble que sigui ocasionat per la pèrdua d’unsol gen, tal com ocorre en el ratolí genoanul-lat per al gen Insl3. A més, aquests resultats

suggereixen que el criptorquidisme humà ésprobablement un esdeveniment multifactoriali que, des d’un punt de vista pràctic, aques-tes observacions poden justificar l’existènciad’una infecunditat major en el testicle descen-dent de l’individu criptòrquid per a un testicle(Skakkebaek et al., 2001). Tanmateix, aquestrequisit multifactorial per a l’espermatogène-si normal també pot destacar un altre puntrellevant pel que fa a la ruta androgènica enl’espermatogènesi. És a dir, que la ruta andro-gènica normal també pot estar deteriorada i,fins i tot si es duu a terme l’orquidopèxia, l’es-permatogènesi normal no s’esdevindrà.


Figura 7. Assaig de TUNEL en el testicle del ratolí transgènicper a l’ABP. Les cèll. ules germinals que moren per apoptosi s’evi-dencien amb la tècnica de TUNEL en el testicle del ratolí control(a) i del transgènic (b). L’increment de l’apoptosi és evident en elplafó b. La identitat de les cèll. ules que moren per apoptosi es cor-respon a espermatòcits primaris en fase de paquitè en els plafonsd i e. (Figura adaptada de Selva et al., 2000.)

LA PROTEÏNA D’UNIÓALS ANDRÒGENS

Tal com es va comentar a la figura 1, lamarca distintiva de l’espermatogènesi normalés el fet que el procés només pot avançar sies manté l’adequada homeòstasi androgèni-ca. Aquest procés comporta el funcionamentapropiat de la testosterona de les cèll. ules deLeydig amb l’AR de les cèll. ules de Sertoli. Laconcentració de testosterona local, tanmateix,és regulada probablement en part per l’ABPde les cèll. ules de Sertoli. Qualsevol pertorba-ció en l’homeòstasi androgènica posa en perillla fertilitat. Amb aquesta finalitat, es va desen-volupar un model animal de ratolí en quèel gen ABP de la rata s’incorporava especí-ficament dins les cèll. ules de Sertoli, i es vautilitzar per a avaluar-ne els efectes en cèll. ulesespermatogèniques (Selva et al., 2000, 2004).En aquest model, el transgèn ABP de la ratafa que el nivell de testosterona lliure disminu-

eixi. El més aparent en aquest ratolí transgènicera que la terminació de la primera divisiómeiòtica es veia significativament perjudica-da, tal com es demostrava amb l’increment dela tinció per l’assaig de TUNEL en el testicledel ratolí transgènic (vegeu la figura 7). A mésaugment, es veia clarament que la tinció perTUNEL marcava preferentment espermatò-cits que no havien pogut completar la primeradivisió meiòtica. Això ens va fer especular quela sobreexpressió del gen ABP en els testiclesde ratolí comportava canvis en la concentraciólocal de testosterona lliure i s’associava ambuna terminació defectuosa de la primera di-visió meiòtica dels espermatòcits en fase depaquitè (Selva et al., 2000).

Hi ha proves addicionals que demostrenque l’homeòstasi androgènica té un paper im-portant en l’assoliment de la primera divisiómeiòtica, com és la distribució de la immu-notinció d’AR en cèll. ules de Sertoli postnatals(vegeu la figura 8). Tal com s’ill. ustra en aques-ta figura, l’AR no s’expressa en les cèll. ulesde Sertoli fins aproximadament els dies 15 a20 postnatals, precisament el temps en quèla barrera hematotesticular permet l’escomesameiòtica. Més recentment, i de manera con-sistent amb aquesta hipòtesi, dos grups hanmostrat, fent servir un model de ratolí geno-anull. at condicional per l’AR en les cèll. ulesde Sertoli, que l’espermatogènesi es bloquejaa l’acabament de la primera divisió meiòtica(De Gendt et al., 2004; Holdcraft i Braun, 2004).

Tanmateix, agafades conjuntament, aques-tes quatre línies d’evidència —a) la tinció po-sitiva d’AR en testicles criptòrquids s’asso-cia a la maduració de les cèll. ules germinalsfins a la primera divisió meiòtica, b) els ani-mals transgènics per a l’ABP mostren unaapoptosi incrementada en cèll. ules germinals itambé un acabament malmès de la primera di-visió meiòtica, c) els estudis d’immunolocalit-zació de l’AR en testicle postnatal demostrenque no apareix en cèll. ules de Sertoli fins queno comença la meiosi i d) el ratolí genoanul-lat condicional de l’AR en cèll. ules de Sertoli


Figura 8. Immunotinció d’AR en testicles postnatals. Es mostra la distribució d’AR durant eldesenvolupament dels túbuls seminífers en els dies 5, 10, 15 i 20 postnatals. Noteu que l’AR éspresent en les cèll. ules peritubulars en totes les edats, però no apareix en les cèll. ules de Sertolifins aproximadament el dia 15, i no és prominent fins el dia 20. En aquesta darrera edat, labarrera hematotesticular és present i es pot completar la meiosi.

mostra una incapacitat per a completar la pri-mera divisió meiòtica— porten a la conclusióque una de les accions de la ruta androgènicanormal és ajudar a l’acabament de la primeradivisió meiòtica.

Concloure que l’AR de les cèll. ules de Serto-li és necessari per a l’acabament de la meiosi,tanmateix, no ens ha de portar a extrapolarque la presència d’AR en altres cèll. ules somà-tiques del testicle no és igual d’important. Defet, es pot especular que la presència d’AR enaquests altres tipus cell. ulars, en particular lescèll. ules mioides peritubulars, pot ser necessa-ri per a la seva formació i diferenciació. L’AR,per exemple, és present en cèll. ules mioidesperitubulars des del moment en què es formena l’úter, i els nivells sembla que es mantenenconstants durant la vida adulta (vegeu la figu-ra 8). A més, sembla que no hi ha cap variacióen els nivells d’AR en funció del cicle semi-

nífer (compareu les figures 3, 4 i 8). De fet, ésclar que fins i tot si arribéssim a entendre com-pletament com funciona l’AR en les cèll. ulesde Sertoli, la comprensió completa de com re-gula l’AR l’espermatogènesi hauria d’esperarfins que l’activitat d’altres cèll. ules intratesti-culars que responen a l’AR fos més coneguda.En relació a aquest punt, hem començat a uti-litzar recentment models animals per tractarde desxifrar els papers addicionals de l’home-òstasi androgènica en el testicle.

DISRUPCIÓ DE L’ACTIVACIÓ DE L’ARAMB ÀCID METOXIACÈTIC

L’àcid metoxiacètic és el metabòlit tòxicprincipal del metoxietanol (ME), un èter glicolmolt usat en pintures, tints tèxtils, tintes d’im-pressió, líquid de frens i, més recentment, en la


*

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

L’MAA altera l’expressió de l’mRNA d’AR i ABP de manera específica segons l’estadi

Abso

rbàn

cia

AR

/L19

0 12Temps (h) 0 12Temps (h)

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

Estadis 7-8

Abso

rbàn

cia

AB

P/L

19

AR ABP

Control

12 h MAA

*

Figura 9. Disrupció de l’expressió normal d’AR i ABP a causa d’un tòxic ambiental. Es vanaïllar túbuls seminífers en estadi 8 mitjançant microdissecció i captura amb làser; els nivells demRNA d’AR i ABP es van analitzar en animals control i tractats amb MAA. La disminució del’mRNA de l’AR és parall. ela a la de la proteïna analitzada per immunohistoquímica. L’mRNAd’ABP augmenta en resposta a l’MAA, mentre que el de l’AR disminueix. (Figura adaptada deTirado et al., 2002.)

fabricació de xips per a ordinadors personals.Els estudis en animals mostren una toxicitatreproductiva considerable per a l’ME i l’MEEen mascles, que comporta atròfia testicular ialteració de la fertilitat. A causa del seu efectetan profund sobre la fertilitat masculina, i dela creença que els tòxics que afecten tan marca-dament la fertilitat masculina han de perjudi-car la ruta androgènica d’alguna manera, ensvam centrar en l’anàlisi de la possible alteracióde l’expressió d’AR en rates adultes masclestractades de manera aguda amb MAA.

En els testicles adults, una dosi única deMAA provoca la mort per apoptosi dels es-permatòcits en fase paquitè en determinatsestadis del cicle seminífer, un resultat que espot interpretar com una indicació que l’MAAés tòxic per als paquitens en certs estadis delcicle. Per identificar altres mecanismes poten-cials d’acció de l’MAA en l’espermatogènesivam començar a treballar amb el mètode re-

lativament nou de microdissecció per capturaamb làser (Suarez-Quian et al., 2000, 2002),dissecant túbuls seminífers en diferents esta-dis del cicle, per tal d’analitzar l’expressió del’mRNA de l’AR i l’ABP. Es van recollir cin-quanta seccions transversals de túbuls delsestadis més representatius i es va examinarels efectes de l’MAA en els nivells de mRNAd’AR i d’ABP en cada estadi i en funció deltemps transcorregut després de l’administra-ció del tòxic. Els resultats van indicar que enestadis control caracteritzats per nivells altsde mRNA d’AR i baixos d’ABP, l’MAA dis-minuïa els nivells de mRNA d’AR però aug-mentava els d’ABP, respectivament (vegeu lafigura 9). El nivell de proteïna d’AR, analitzatper immunohistoquímica, va mostrar canvisparall. els als de mRNA d’AR. (No es podenfer experiments semblants per a l’ABP perquèno hi ha cap anticòs disponible per a exami-nar si els nivells de proteïna ABP canvien de


L’MAA altera l’expressió de l’mRNA d’AR i ABP de manera específica segons l’estadi

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2Abs

orbà

ncia

AR

/L19

0 12Temps (h)

AR

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

Abs

orbà

ncia

AB

P/L

19

0 12Temps (h)

Estadis 11-12 ABP

Control

12 h MAA

*

*

Figura 10. Disrupció de l’expressió normal d’AR i ABP mitjançant un tòxic ambiental. Esvan aïllar túbuls seminífers corresponents als estadis 11 i 12 mitjançant microdissecció i capturaamb làser i es van analitzar els nivells de mRNA d’AR i d’ABP en animals control i tractats ambMAA. L’augment en l’mRNA de l’AR era parall. el al de proteïna analitzada per immunohisto-química. En teixits control, en els estadis 11 i 12, les cèll. ules de Sertoli no eren mai positivesper a AR. L’mRNA d’ABP disminuïa en resposta a MAA, mentre que el d’AR augmentava.(Figura adaptada de Tirado et al., 2002.)

manera parall. ela amb els de mRNA). Inver-sament, en els estadis control caracteritzatsper un nivell baix de mRNA d’AR i un nivellalt d’ABP, l’MAA va incrementar els nivellsde mRNA d’AR i va disminuir els d’ABP. Demanera semblant, el nivell de proteïna d’ARdetectat en nuclis de cèll. ules de Sertoli canvi-ava de manera parall. ela a l’mRNA (vegeu lafigura 10).

El que és clau en aquesta informació és quel’MAA va mostrar la capacitat d’actuar a lescèll. ules de Sertoli i alterar dràsticament, demanera específica per a cada estadi, el balançhomeostàtic de les dues proteïnes, AR i ABP,el nivell normal d’expressió de les quals és im-prescindible per a l’espermatogènesi. Així, enl’adult, es demostra que un mecanisme d’ac-ció de l’MAA és malmetre l’homeòstasi delreceptor d’andrògens i això proporciona unabase per a entendre com l’exposició a MAAafecta la fertilitat. De nou, el trencament de

l’homeòstasi per a l’AR és incompatible ambla viabilitat dels espermatòcits paquitens.

Quins altres efectes té l’MAA? De fet, vo-líem veure si l’MAA actuava com un anti-androgen o com un estrogen (Tirado et al.,2003, 2004). La raó per a això era clara: qual-sevol compost que altera l’activitat androgè-nica altera l’homeòstasi i porta a una fertilitatmalmesa. Per assolir aquest objectiu, vam pre-parar un assaig de transcripció en el qual unaconstrucció que contenia el promotor del re-ceptor d’andrògens o estrògens juntament ala seqüència reportadora luciferasa es trans-fectava establement a una línia cell. ular. Vamobservar que l’MAA no tenia activitat andro-gènica per si mateix, però que tenia activitattant sobre ERα com sobre ERβ. Potser el mésinteressant de tot era el fet que l’MMAmostra-va la capacitat de potenciar l’activació de l’ARper DHT i també potenciava la d’ERα i ERβ.És a dir, aquest compost, introduït dins la ruta


Cèl·lula

Nucli

Pro/ERE

Luciferasa

AR/ERT/E Activitat de laLuciferasa (baixa)

Activitat de laLuciferasa (alta)

– MAA

+ MAA

AR/ERT/E

ERbeta activation by MAA

0100200300400500600700800900

nh E2 (-8) A 5mM B 5mM C 5mM E2(-8)/ A 5mM

E2(-8)/ B 5mM

E2(-8)/ C 5mMCC

Concentració MAA

Luci

fera

sa n

orm

alit

zad

a

Activació i potenciació d’ERαmitjançant MAA

ERalpha activation by MAA

0500

100015002000250030003500400045005000

nh E2 (-8) A 5mM B 5mM C 5mM E2(-8)/ A 5mM

E2(-8)/ B 5mM

E2(-8)/ C 5mMConcentració

concentració MAA

Luci

fera

sa n

orm

alitz

ada

Activació i potenciació d’ERβmitjançant MAAMAA Effects on DHT Induction of Probasin-Luciferase

in L929 Cells

0

10000

20000

30000

40000

NH

0.1 m

M MAA

1 mM

MAA

5 mM

MAA

5 mM

MAA/C

A

1 nM

DHT

DHT/CA

DHT/0.1 m

M MAA

DHT/1 mM

MAA

DHT/5 mM

MAA

DHT/5 mM

MAA/C

A

Act

ivit

at lu

cife

rasa

L’MAA potencia la inducció de DHT de la probasina-luciferasa

* * **

*

* *

** *

* *

+ MAA

Figura 11. Interrupció de l’activitat transcripcional d’AR mitjançant un tòxic ambiental. Es va analitzar la capacitat del’MAA de modular l’activitat transcripcional d’AR, ERα i ERβ en cèll. ules transfectades amb construccions que contenienl’inici de la transcripció d’AR, ERα i ERβ unides a molècules reportadores (luciferasa), en presència dels corresponentslligands o de MAA. L’MAA no mostrà efectes androgènics, però va potenciar significativament la inducció per DHT.L’MAA tampoc no va mostrar activitat ERα específica, però sí activitat de transcripció per a ERβ i capacitat de potenciarsignificativament les activitats tant d’ERα com d’ERβ. (Figura adaptada de Tirado et al., 2002, 2004).

androgènica, malmetia de manera significati-va l’homeòstasi androgènica. Estudis posteri-ors han demostrat que el mecanisme d’accióde l’MAA sembla ser la inhibició de l’activi-tat desacetilasa responsable d’inhibir la trans-cripció dels receptors d’esteroides (Jansen etal., 2004). Aquestes molècules tan simples po-den representar una classe de compostos queafecten de manera molt profunda la reproduc-ció masculina mitjançant l’alteració de la rutahomeostàtica androgènica durant el desenvo-lupament.

AGRAÏMENTS

M’afalaga que m’hagin demanat d’escriu-re un article de revisió per honorar José Sáezd’ençà que la seva prematura mort privà lacomunitat científica d’un mentor tan inspira-dor, coll. ega i amic. Quan encara era a l’institut,vaig conèixer José en un Testis Workshop a Bal-timore (EUA), i en els anys següents sempreprovava de retrobar-lo, tant a Europa com als

EUA, en les nombroses trobades a què acu-díem. Sempre estava disposat a oferir ajudaals investigadors joves i era molt obert dis-cutint la seva recerca pròpia amb ells, encaraque quan les àrees d’investigació coincidisssinla informació que generosament oferia haguéspogut ser utilitzada per als seus avenços pro-pis. José fou de la generació en què donar lamà o una paraula significaven quelcom entreamics: el trobarem a faltar.

BIBLIOGRAFIA

Beato, M.; Herrlich, P.; Schutz, G. (1995). «Steroid re-ceptors: many actors in search of a plot». Cell, 83: 851-857.

Bremner, W. J.; Millar, M. R.; Sharpe, R. M.; Saun-ders, P. T. (1994). «Immunohistochemical localization ofandrogen receptors in the rat testis: evidence for stage-dependent expression and regulation by androgens».Endocrinology, 135(3): 1227-1234.

De Gendt, K.; Swinnene, J. V.; Saunders, P. T.; Schoon-jans, L.; Dewerchin, M.; Devos, A.; Tan, K.; Ata-nassova, N.; Claessens, F.; Lecureuil, C.; Heyns,W.; Carmeliet, P.; Guillou, F.; Sharpe, R. M.; Ver-hoeven, G, (2004). «A Sertoli cell-selective knockout


of the androgen receptor causes spermatogenic arrestin meiosis». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 1327-1332.

Fritz, I. B. (1978). «Sites of action of androgens and fol-licle stimulating hormone on cells of the seminiferoustubule». Biochem. Actions Horm. 5: 249-281.

Henriksen, K.; Hakovirta, H.; Parvinen, M. (1995).«Testosterone inhibits and induces apoptosis in rat semi-niferous tubules in a stage-specific manner: in situ quan-tification in squash preparations after administrationof ethane dimethane sulfonate». Endocrinology, 136(8):3285-3291.

Holdcraft, R. W.; Braun, R. E. (2004). «Androgen recep-tor function is required in Sertoli cells for the terminaldifferentiation of haploid spermatids». Development, 131:459-416.

Jansen, M. S.; Nagel, S. C.; Miranda, P. J.; Loben-hofer, E. K.; Afshari, C. A.; McDonnell, D. P. (2004).«Short-chain fatty acids enhance nuclear receptor activ-ity through mitogen-activated protein kinase activationand histone deacetylase inhibition». Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 101(18): 7199-7204.

Kassim, N. M.; McDonald, S. W.; Reid, O.; Bennett, N.K.; Gilmore, D. P. Payne, A. P. (1997). «The effects ofpre- and postnatal exposure to the nonsteroidal antian-drogen flutamide on testis descent and morphology intheAlbino Swiss rat». J. Anat., 190(4): 577-588.

Kimura, N.; Mizokami, A.; Oonuma, T.; Sasano, H.;Nagura, H. (1993). «Immunocytochemical localizationof androgen receptor with polyclonal antibody in paraf-fin-embedded human tissues». J. Histochem. Cytochem.,41: 671-678.

Lamb, D. J. (1995). «Genes involved in testicular develop-ment and function». World J. Urol., 13(5): 277-284.

Lamb, D. J.; Weigel, N. L.; Marcelli, M. (2001). «Andro-gen receptors and their biology». Vitam. Horm., 62: 199-230.

Meachem, S. J.; Wreford, N. G.; Robertson, D. M.;McLachlan, R. I. (1997). «Androgen action on therestoration of spermatogenesis in adult rats: effects ofhuman chorionic gonadotrophin, testosterone and flu-tamide administration on germ cell number». Int. J. An-drol., 20(2): 70-79.

Mifsud, A.; Sim, C. K.; Boettger-Tong, H.; Moreira, S.;Lamb, D. J.; Lipshultz, L. I.; Yong, E. L. (2001). «Trin-ucleotide (CAG) repeat polymorphisms in the androgenreceptor gene: molecular markers of risk for male infer-tility». Fertil. Steril., 75(2): 275-281.

Munell, F.; Suarez-Quian, C. A.; Selva, D. M.; Tirado,O. M.; Reventos, J. (2002). «Androgen-binding proteinand reproduction: where do we stand?». J. Androl., 23(5):598-609.

Nandi, S.; Banerjee, P. P.; Zirkin, B. R. (1999). «Germ cellapoptosis in the testes of Sprague Dawley rats follow-ing testosterone withdrawal by ethane 1,2-dimethane-sulfonate administration: relationship to Fas?». Biol. Re-prod., 61(1): 70-75.

Nef, S.; Parada, L. F. (1999). «Cryptorchidism in mice mu-tant for Insl3». Nat. Genet., 22(3): 295-299.

O’Donnell, L.; Pratis, K.; Stanton, P. G.; Robertson,D. M.; McLachlan, R. I. (1999). «Testosterone-depen-dent restoration of spermatogenesis in adult rats is im-paired by a 5-alpha-reductase inhibitor». J. Androl., 20(1):109-117.

Parvinen, M. (1982). «Regulation of the seminiferous ep-ithelium». Endocr. Rev., 3(4): 404-417.

Prins, G. S.; Birch, L.; Greene, G. L. (1991). «Androgenreceptor localization in different cell types of the adultrat prostate». Endocrinology, 129: 3187-3199.

Print, C. G.; Loveland, K. L. (2000). «Germ cell suicide:new insights into apoptosis during spermatogenesis».Bioessays, 22(5): 423-430.

Regadera, J.; Martinez-Garcia, F.; Gonzalez-Per-mato, P.; Serrano, A.; Nistal, M.; Suarez-Quian, C.A. (2001). «Androgen receptor expression in Sertoli cellsas a function of seminiferous tubule maturation in thehuman testis». J. Clin. Endocrinol. Metabol., 86: 413-421.

Selva, D. M.; Tirado, O. M.; Toran, N.; Suarez-Quian,C. A.; Reventos, J.; Munell, F. (2000). «Meiotic ar-rest and germ cell apoptosis in androgen-binding proteintransgenic mice». Endocrinology, 141(3): 1168-1177.

— (2004). «Increased estrogen receptor-α expression inspermatocytes undergoingapoptosis in mice over -ex-pressing a rat androgen-binding protein transgene». Biol.Reprod., 71: 1461-1468.

Shan, L. X.; Zhu, L. J.; Bardin, C. W.; Hardy, M. P. (1995).«Quantitative analysis of androgen receptor messengerribonucleic acid in developing Leydig cells and Sertolicells by in situ hybridization». Endocrinology, 136: 856-862.

Sharpe, R. M.; Millar, M. ; McKinnell, C. (1993). «Rel-ative roles of testosterone and the germ cell complementin determining stage-dependent changes in protein se-cretion by isolated rat seminiferous tubules». Int. J. An-drol., 16(1): 71-81.

Skakkebaek, N. E.; Rajpert-De Meyts, E.; Main, K. M.(2001). «Testicular dysgenesis syndrome: an increasinglycommon developmental disorder with environmentalaspects». Hum. Reprod., 16: 972-978.

Suarez-Quian, C. A.; Goldstein, S.; Bonner, R. F.(2000). «Laser capture microdissection (LCM): a newtool for reproductive biology research». J. Androl., 21:601-608.

Suarez-Quian, C. A.; Martinez-Garcia, F.; Nistal, M. ;Regadera, J. (1999). «Androgen receptor distribution inadult human testis». J. Clin. Endocrinol. Metab., 84(1): 350-358.

Suarez-Quian, C. A.; Tirado, O. M.; Munell, F.; Reven-tós, J. (2002). «Laser capture microdissection to assessdevelopment». A: Conn, P. M. [ed.] Methods in enzymol-ogy. Vol. 356. San Diego: Academic Press, p. 145-156.

Tirado, O. M.; Martínez, E.; Rodríguez, O. C.; Da-nielsen, M.; Selva, D. M.; Reventós, J.; Munell,F.; Suarez-Quian, C. A. (2003). «Short-term effects of


methoxyacetic acid on androgen receptor and androgen-binding protein expression in adult rat Sertoli cells». Biol.Reprod., 68: 1437-1446.

Tirado, O. M.; Selva, D. M.; Toran, N.; Suarez-Quian,C. A.; Jansen, M.; McDonnell, D. P.; Reventos, J.;Munell, F. (2004). «Increased expression of estrogenreceptor-β in pachytene spermatocytes after short-termmethoxyacetic acid (MAA) administration». J. Androl.,25: 84-94.

Turner, K. J.; Morley, M.; MacPherson, S.; Millar, M.R.;Wilson, J. A.; Sharpe, R. M. Saunders, P. T. (2001).«Modulation of gene expression by androgen and oestro-gens in the testis and prostate of the adult rat followingandrogen withdrawal». Mol. Cell. Endocrinol., 178(1-2):73-87.

Vornberger, W.; Prins, G.; Musto, N. A.; Suarez-Quian, C. A. (1994). «Androgen receptor distributionin rat testis: new implications for androgen regulation ofspermatogenesis». Endocrinology, 134(5): 2307-2316.

Wilson, J. D.; Leihy, M. W.; Shaw, G.; Renfree, M. B.(2002). «Androgen physiology: unsolved problems at themillennium». Mol. Cell. Endo., 198: 1-5.

Woolveridge, I.; De Boer-Brouwer, M.; Taylor, M. F.;Teerds, K. J.; Wu, F. C.; Morris, I. D. (1999). «Apopto-sis in the rat spermatogenic epithelium following andro-gen withdrawal: changes in apoptosis-related genes».Biol. Reprod., 60(2): 461-470.

Zirkin, B. R. (1998). «Spermatogenesis: its regulation bytestosterone and FSH». Semin. Cell. Dev. Biol., 9(4): 417-421.

Zhou, X.; Kudo, A.; Kawakami, H.; Hirano, H. (1996).«Immunohistochemical localization of androgen recep-tor in mouse testicular germ cells during fetal and post-natal development». Anat. Rec., 245(3): 509-518.

Zhou, Q.; Nie, R.; Prins, G. S. ; Saunders, P. T. ;Katzenellenbogen, B. S. ; Hess, R. A. (2002). «Local-ization of androgen and estrogen receptors in adult malemouse reproductive tract». J. Androl., 23: 870-881.

Zhou, Q.; Shima, J. E.; Nie, R.; Friel, P. J.; Griswold,M. D. (2005). «Androgen-regulated transcripts in theneonatal mouse testis as determined through microarrayanalysis». Biol. Reprod., 72: 1010-1019.

Documents

ACCIÓ DELS ANDRÒGENS EN EL TESTICLE UN PAPER PER A LA … · 76 C. A. SUAREZ-QUIAN et al. que continua essent desconegut el mecanisme pel qual els andrògens actuen en aquest pro-cés