iGEM Chiba 2008

Accumulation Timer

入力班：小林あおい、香取崇広送受信班：川崎浩平、冨永将大、井山佳美出力班：福冨浩樹、杉山まい

Accumulation Timer の作成・ 放射線、紫外線、毒性物質… .　一過性であり、被爆量（量×時間）に依存する汚染

　　↓バクテリアによる環境汚染計測　・従来型センサ；入力強度センサ　・我々のセンサ；累積計

　　　　時間軸の付加 タイマーの作成

Quorum SensingSender→Receiver ；化学分子の送信

仮説：十分量の分子が溜まらないと、 Receiver は感知しない

本研究のポイント　話し手（ Sender ）と聞き手（ Receiver ）の通信感度を適正化　　→さまざまな時間タイマーの作成

システム内容

UV

Accumulation Timer の条件①前回の出力が打ち消されない

Time

Accumulated effect

To our body

Input Value

Off時でも前回のonの記録を保存

Accumulation Timer の条件

②on時の出力は一定

③on/offの区切りしっかり

④一定時間を超えたことを提示する

Time

Sig

nal

con

c.on

Time

off

　

入力チーム

SOS Response

小林あおい・香取崇広

入力

Sensor

入力として設定したいもの　・・・　「一過性の情報」　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・　可視光 ( 難 )

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・　紫外線

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・　温度（細胞の成育状況に影響）

UV に曝露された時間を計る！

LexA

UV Sensor(PrecA)

UV

RecA

LexA

OFF

RecA

LexALexA ON

ssDNA

U V

BBa_J22136 を用いた UV 照射実験

RFP 発現観察 Irradiation Time

After Irradiation 0 30sec 30min 1h

0 × × × ×

1h × × × ×

12h × × × ×

24h × × × ×

2.5cm 7.5cm16W

254nm

? J/m2

PrecA の懸案事項

・　 leaky である ・・・ XL10G(recA － ), 48h で RFP発現

・　 UV による switch on 難 .

cI

UV Sensor(PcI)

UV

RecA

cI

OFF

RecA

cIcI ON

ssDNA

U V

Sub Cloning 中

UV による Death Curve 作成＜ BW tdk (RecA+)⊿ ＞

3 ml LB medium

＜ UV Source ＞

UVGL-58 Mineralight Lamp

(multiband UV-254/366 nm; San Gabriel, CA)

100V, 0.16A

7.5 cm

UV による Death Curve 作成

0 10min

30min 1h 2h 4h 6h 8h Irradiation Time

CF

U

105 希釈

104 希釈

－ UV 105 希釈

入力を UV にすることの懸案事項

HN

O O

O

O

・　２ｈで大腸菌全滅　・・・　２ｈ以上のタイマー不可 .

・　 AHL が UV で分解される !? ・・・　 NOW　 GOING

Ex. 3OC6HSL

モデルとしてアラビノースプロモーターを用意する .

　

送受信チーム

SOS Response

冨永将大・川崎浩平・井山佳美

全体像

送受信システムの作成

AHL

目標 :1h では光らないが　　一定時間 ON が続くと光る

Receiver(AHL 感受性 ) 変更通信

1 hour

1 hour 4 hours…

Still inactive

通常 AHL 通信

ON

ON ON

OFF

Still inactive

AHL

①AHL 合成量（合成速度）を下げる

②感受性を下げる

5 hours…

→RBS の調整

→シグナル分子の変更

シグナル伝達： Quorum sensing

lasI

cinI

RhlI

LuxI

lasR

cinR

RhlR

LuxR

Autoinducer synthase

Recepter Protein

V.Fisheri

P.aeruginosa

R.leguminosarum

P.aeruginosa

由来生物AHL基本構造

luxI(OHHL)

LasI(OdDHL)

RhlI(BHL)

cinI

シグナル分子 (=AHL) の変更

lasI

cinI

RhlI

LuxI

lasR

cinR

RhlR

LuxR

Autoinducer synthase Recepter Protein

《 Cross talk を利用した実験》

実験の流れ

テスト準備（ 8/17~ ）

CrossTalk テスト（ 9/2~ ）LuxLasRhlCin

LuxLasRhlCin

バラバラなパーツの組み直し

タイムディレイテスト（ 9/8~ ）

Today

今週の成果 1 : パーツ合成

RhlI+LVA

CinI+LVA

RhlI

LasI

Ligation

RhlI, CinI

RBS + CinI+LVA, RhlI+LVA

Plac+RBS

Plac

Biobrick から新たなパーツを合成

今週の成果 2 : Cross-talk の確認

RhlI+LVA

cinI+LVA

RhlI LuxR

Autoinducer synthase Recepter Protein

LasI

未実施：LuxI, luxI+LVA, CinI, LasI+LVA

Cross-talk テスト 1 Sender Receiver = LuxR

8H (Sender:Receiver=1:1) 8H:Spindown→ 12H

Cross-talk テスト 2 Sender Receiver = LuxR

5H (Sender:Receiver=1:1) 5H TM

タイムディレイテスト

Sender : Receiver

Sender : Lux, Las, Cin, RhlReciever : Lux

1 : 1

一定時間ごとに蛍光強度測定

LuxI

LasIRhlI

CinI

時間 / hour

今後の予定１、タイムディレイテスト

２、遺伝子発現数の制御　　→プラスミドベクターの変更

３、転写量の制御 →RBSの交換

出力チーム

SOS Response

福冨浩樹・杉山まい

どのような出力が必要？出力となるタンパクの発現から、発色などを確認できるまでの時間が短い出力

出力

出力

蛍光タンパク質 Luciferase LacZ

見える？

スイッチング

時間（※） ～

?

?

?※時間は固体培地上で目視で来るまでの時間

Response Test

Glucose 0.2%

Glucose 0.2% M9, IPTG 0.1mM(X-Gal 80μg/mL)

コロニーリフトIPTG 0.1mM(X-Gal 20μg/mL)

Pickwash

UV で励起して観察

テスト結果

GFPuv Venus LacZ mcherry0min X X X X

30min X X X X

1hour X X X X

1.5hour ○ X X X

2hour ○ ○ ○ ○

2.5hour ○ ○ ○ ○

3hour ○ ○ ○ ○

3.5hour ○ ○ ○ ○

GFPuv が最も早く発現

Note ：蛍光たんぱく

• GFPuv が最も早く発現しているように見えた– 適切な励起光で励起していたために早かっ

た？

• Venus や mCherry も適切な励起光であれば、さらに早く観察されることが考えられる

Note:LacZ

• LacZ-Xgal の出力までが遅いのは Xgal 濃度が低いため？– Xgal 20μg/mL を 40μg/mL,80μg/mL にしてレス

ポンスタイム計測

20mM 40mM 80mM0min X X X

1hour X X X

2hour X X ○

3hour X ○ ○

4hour ○ ○ ○

40mM 　○

80mM 　○IPTG なし

3hour

Note:Luciferase

• Renilla Luciferase の反応：ルシフェリンの酸化

• Coelenterazine: 膜透過性があるβ-Cyclodextrin を加えると 10 倍水に溶ける

HO

NH

N N

OOH

O2HO

N

N N

O

OH

Light

β-Cyclodextrin

Coelenterazineλ=480nM

RenillaLuciferase

まとめ

• 現在一番早いもの・・・ GFPuv ( 発色まで1.5h)

• LacZ や Luciferase は基質濃度に左右される– 基質濃度を上げることで 1.5h より早く発色すること

は考えられる。

To Do• Luciferase のタイムレスポンスの比較

ルシフェリンの濃度を上げて実験

いつ終わるのか？

• UV を入力とする場合、 UV に耐えられる安定な出力が求められる– ある程度候補を挙げたら UV に対する安定性

を調べたい。• 来週までには大まかな結果を出し、採用

する出力を決定したい。